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Práctica 4. Determinación del Número más Probable: Número de Bacterias Coliformes

Laura Afanador

Introducción:

El agua contiene una gran cantidad de bacterias que pueden perfectamente asegurarse para beber. Esta consideración es importante, desde el punto de vista microbiológico, es el tipo de microorganismos que se encuentren presentes. El agua de ríos y lagos que contienen una gran cantidad de autótrofos y saprófitos heterótrofos es potable, siempre y cuando los patógenos para los seres humanos sean insuficientes. Los agentes patógenos intestinales, como los que causan la fiebre tifoidea, el cólera y la disentería bacilar es una preocupación primordial (Cappuccino & Sherman, 2008).

El examen de rutina de agua para detectar la presencia de patógenos intestinales sería una tediosa y difícil, si no imposible, tarea. Es mucho más fácil de demostrar la presencia de algún patógeno intestinal tipos tales como E. coli o Streptococcus faecalis. Dado que estos organismos se encuentran siempre en los intestinos, y normalmente no están presentes en el suelo o el agua, se puede suponer que su presencia en el agua indica que la materia fecal se ha contaminado el aguala oferta. Dado que ambos organismos no son formadores de esporas, su supervivencia en el agua no es extensa. E. coli y S. faecalis son completamente diferentes organismos. E. coli es una bacteria gram-negativos no formadores de esporas varilla; S. faecalis es un coco gram-positivos. El primero se clasifica como un coliformes, este último es un enterococos. Fisiológicamente, son también completamente diferente (Benson, 2001).

Método De Numero Más Probable (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililística (Fuentes & Massol, 2002).

“Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros” (Fuentes & Massol, 2002).

Materiales & Equipos:

• Muestras ambientales (2 humedales) (2 muestras)

•3 tubos de Durham con Caldo lactosa (2X)

•6 tubos de Durham con Caldo lactosa (1X)

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• Placas Petri con medio de crecimiento (Mac Conkey y EMB)

• Micropipetas de 100 y 1000 uL

• Puntas para micropipetas

• Incubadora a 37°C

Nota: 2X designa caldo de lactosa doble concentración. Contiene lactosa dos veces tanto como

X (caldo de lactosa sola concentración).

Procedimiento:

1. Etiquetar 3 tubos con Caldo Lactosa (2X) y 6 con Caldo Lactosa (1X) tubos como se ilustra en la figura para cada muestra. Etiquete cada tubo de acuerdo con la cantidad de agua que se va a dispensar a la misma: 10 ml ml, 1,0 ml, y 0,1, respectivamente.

2. Mezclar la botella de agua de la muestra por agitación 25 veces.

3. Con una pipeta de 10 ml, transferir 10 ml de agua a cada uno de los tubos de 2X.

4. Con una pipeta 1,0 ml, la transferencia de 1 ml de agua a cada una de la serie medio de tubos, y 0,1 ml a cada uno de los tubos X tres últimos.

5. Incubar los tubos a 37 ° C durante 24 horas. Observar y luego volverlos a observar a las 48h.

6. Examinar los tubos y registrar el número de tubos en cada conjunto que tienen 10% o más de gas.

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7. Determinar el mecanismo nacional de prevención al referirse a la tabla VI, Apéndice A. Considere lo siguiente:

Ejemplo: Si usted tuviera gas en los tres primeros tubos de gas y sólo en uno de los tubos de la segunda serie, pero ninguno en los últimos tres tubos, la prueba podría ser leído como 3-1-0. Tabla VI indica que el NMP para esta lectura sería 43. Esto significa que este ejemplo particular de agua tendría aproximadamente 43 organismos por 100 ml con 95% de probabilidad de que haya entre 7 y 210 organismos. Tenga en cuenta que la cifra de 43 NMP es sólo una figura de probabilidad estadística.

8. Anote los datos en el informe del laboratorio.

Preguntas:

1. ¿Qué tiempo de incubación de sería el más apropiado?

2. ¿Cuáles son algunas desventajas del método de NMP?

3. ¿Qué otras aplicaciones tiene este método?

4. Si luego de preparar diluciones en serie de 10-2 hasta 10-6 de una muestra de una laguna usted obtuvo un patrón de respuestas positivas 3-2-0, ¿Cuál es la densidad poblacional del humedal?

5. ¿Qué tendría usted que hacer si luego de incubar los resultados son 3-3-3?

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Bibliografía

Benson, Harold. 2001. Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology, Eighth Edition, McGraw-Hill Companies. 496 pages.

Cappuccino, James G. & Sherman Natalie. 2008. Microbiology a laboratory manual. 8th edition. Pearson Benjamin Cummings, San Francisco, CA. 569 pages.

Fuentes, Francisco & Massol-Deyá, Arturo.2002. Manual de laboratorios: ecología de microorganismos. Universidad de Puerto Rico Bibliografía

http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4-nmpenumeracion.pdf(1)