Practica 1 to e Identificacion de Hongos

Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos sustratos

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS LABORATORIO DE MICOLOGA GENERAL Y MDICA


Grupo 3QM2 Equipo 5

Seccin 2

Yong Mendoza Samantha Blancas Napoles Citlali Margarita Ubaldo Lazcano Adolfo Ernesto

SEPTIEMBRE 2010

Septiembre 2010

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NDICEObjetivos Introduccin Diagramas de flujo Resultados Morfologa colonial y microscpica cepas tipo Alternaria sp. Aspergillus flavus Aspergillus niger Aspergillus terreus Cladosporium sp. Curvularia sp. Fusarium sp. Geotrichum sp. Mucor sp. Paecilomyces sp. Pestalotia sp. Penicillium sp. Rhizopus nigricans Neurospora sp. Trichoderma sp. Ulocladium sp. Cunninghamella sp. Syncephalastrum sp. Zigorrhynchus sp. Pichia sp. Candida albicans Saccharomyces cerevisiae Hansenula sp. Rhodotorula sp. Cryptococcus neoformans Muestras clnicas Muestras clnicas (uas, pelo o escamas de piel) Exudado farngeo Morfologa colonial y microscpica cepas identificadas Hongo 1 Hongo 2 Hongo 3 Hongo 4 Discusin de resultados Conclusiones Referencias 03 04 06 09 09 09 10 10 10 11 11 12 13 13 14 14 15 16 16 17 18 18 19 19 19 20 20 20 21 21 21 21 22 23 23 24 26 28 31 35 36

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OBJETIVOS1) Objetivo general: Mediante la aplicacin de diversas tcnicas llevar a cabo el aislamiento de algunos gneros de hongos para su posterior identificacin. a. Objetivo Particular 1: A partir de muestras clnicas como uas, pelo o escamas de piel; aislar hongos dermatofitos causantes de algunas micosis superficiales. i. Objetivo especfico 1.1: Obtener bajo los cuidados apropiados, muestras clnicas de por lo menos dos pacientes. ii. Objetivo especfico 1.2: Conocer diferentes medios de cultivos tiles en el asilamiento de hongos dermatofitos (Sabouraud y Micobiotic). b. Objetivo Particular 2: Mediante un exudado farngeo, llevar a cabo el aislamiento de hongos levaduriformes, en especial del gnero Candida. i. Objetivo especfico 2.1: Implementar la tcnica apropiada para la realizacin de un exudado farngeo. ii. Objetico especfico 2.2: Aprender y aplicar la tcnica de siembra por estra cruzada y estra abierta. c. Objetivo Particular 3: Mediante la siembra de diferentes tipos de sustratos naturales asilar hongos saprobios para su posterior identificacin. i. Objetivo especfico 3.1: Poner en prctica diferentes tipos de tcnicas de aislamiento segn el tipo de sustrato empleado (por impronta, siembra por punto, siembra masiva, por exposicin de placas y por diluciones). ii. Objetivo especfico 3.2: Conocer la aplicacin de algunos tipos de medios de cultivo como Rosa de Bengala (RB) y Papa Dextrosa Agar (PDA). iii. Objetivo especfico 3.3: Obtener colonias puras mediante una resiembra en tubo para su posterior descripcin colonial. iv. Objetivo especfico 3.4: Comparar la morfologa colonial de cepas tipo. v. Objetivo especfico 3.5: Conocer e implementar las dos tcnicas de microcultivo y poner de manifiesto las ventajas y desventajas de cada una de ellas. vi. Objetivo especfico 3.6: Llevar a cabo la observacin microscpica tipo de algunos gneros de hongos saprobios. vii. Objetivo especfico 3.7: Realizar la observacin microscpica de las preparaciones obtenidas mediante la tcnica de microcultivo para la identificacin de, al menos, el gnero de los hongos problema.

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INTRODUCCINLos hongos constituyen un grupo muy numeroso de organismos, actualmente se han descrito aproximadamente 500 000, sin embargo se estima que pueden llegar a existir hasta 1.5 millones de especies. Presentan una gran distribucin en la naturaleza, contribuyendo a la descomposicin de la materia orgnica y participando en los ciclos biolgicos. Slo un pequeo nmero de ellos son patgenos de animales y plantas1. La denominacin de hongos proviene de sus representantes ms sobresalientes, los hongos con sombrerillo (griego, mykes; latn, fungus)2. Inicialmente, los hongos fueron clasificados dentro del Reino Plantae, ya que fueron considerados como organismos inmviles presentando estructuras que se asientan firmemente en el sustrato sobre el que crecen. Sin embargo, al haber sido aplicada la biologa molecular en los estudios taxonmicos se ha observado que los hongos se encuentran ms prximos al reino Animalia que al Plantae3. En el sistema actual de clasificacin, los hongos se encuentran clasificados en el dominio Eukarya4 y constituyen el Reino Fungi, que se divide en cuatro Phyla denominados: y y y y Ascomycota. Es el ms extenso y comprende el 50% de los hongos conocidos y aproximadamente el 80% de los hongos patgenos. Basidiomycota. Zygomycota. Chytridiomycota5.

Los hongos en los que no se conoce su reproduccin sexual, constituyen un grupo heterogneo denominado Deuteromicetos, hongos imperfectos o mitospricos, que representan el segundo grupo ms numeroso y que tambin incluye patgenos humanos6. Todos los hongos son organismos eucariotas y poseen varios cromosomas como Candida albicans con siete cromosomas, Aspergillus nidulans con ocho o como el caso de Saccharomyces cerevisiae con diecisis cromosomas. Tienen un nuclolo rico en RNA y organelos citoplsmicos, como mitocondrias, vacuolas, retculo endoplsmico, aparato de Golgi y ribosomas 80 S. Su citoplasma est limitado por una membrana de fosfolpidos. Aunque comparten muchas estructuras, las clulas de los hongos se diferencian de las de las plantas en la composicin de la pared celular y en la carencia de cloroplastos y clorofila; y de las animales en la presencia de ergosterol en la membrana citoplsmica7. Aunque la celulosa se encuentra presente en ciertos hongos, muchos de ellos poseen paredes no celulsicas. La quitina, un polmero de N- acetil- D- glucosamina es un constituyente comn de las paredes celulares fngicas. En algunas especies existen otros polmeros como mananos, galactanos o quitosn8.Hongos y Actinomicetos alergnicos. Revista Iberoamericana de Micologa. Schlegel, Hans G. Microbiologa General. 3 dem 1. 4 Brock, Biologa de los microorganismos. 5 dem 1. 6 Ibdem. 7 Ibdem. 8 dem 4.1 2

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Los hongos son tpicamente quimioorganotrofos y tienen pocos requerimientos nutricionales. Muchas especies pueden crecer en ambientes extremos con bajos PH o altas temperaturas hasta de 62C y esto, junto con la ubicuidad de las esporas fngicas, hace que sean los contaminantes ms frecuentes de alimentos, medios de cultivo microbianos, etc9. Este grupo de organismos presentan bsicamente dos tipos de morfologas: una denominada filamentosa y otra unicelular o levaduriforme. Al microscopio ptico, los hongos filamentosos presentan unas estructuras tubulares que se denominan hifas10. Las hifas crecen en masa formando el micelio que puede verse fcilmente sin ayuda del microscopio11. En la mayora de los hongos filamentosos, las hifas son tabicadas y presentan septos que delimitan las diferentes clulas. Sin embargo, los hongos del Phylum Zygomycota presentan hifas que carecen de septos y se denominan cenocticas12. La mayora de los hongos presentan reproduccin sexual y asexual. El estado sexual se denomina teleomorfo o meisosprico, y el asexual anamorfo o mitosprico. Es relativamente comn que un mismo hongo tenga dos nombres, el del estado anamorfo y el del estado teleomorfo, ya que suelen haberse descubierto y nombrado de forma independiente13. A partir del micelio, algunas hifas buscan la superficie donde forma esporas o conidios. Los conidios son esporas asexuales, a menudo muy pigmentadas y resistentes a la desecacin, que sirven como forma de dispersin del hongo en nuevos hbitat. Cuando se forman los conidios, cambia el color blanco del micelio adquiriendo el de stos que puede ser negro, rojo, azul-verdoso, amarillo o marrn14. Las esporas sexuales se producen tras la fusin de los ncleos de dos hifas sexualmente compatibles o de dos levaduras y posterior meiosis. La morfologa de las esporas sexuales es muy variada y tiene gran inters para la identificacin fngica15. Los hongos que presentan crecimiento levaduriforme generalmente dan lugar a colonias lisas que recuerdan a las bateras en medios de cultivo slidos. Dichas colonias se encuentran formadas por agregados de clulas individuales denominadas levaduras que se dividen por gemacin o por fisin binaria. En algunos casos las clulas hijas no se separan de la clula madre, formndose cadenas cortas denominado pseudomicelio. Un pequeo grupo de hongos, pero de gran importancia en Micologa clnica, presentan tanto un crecimiento levaduriforme como micelial que se denominan dimorfos16

Ibdem. dem 1. 11 dem 4. 12 dem 1. 13 Ibdem. 14 dem 4. 15 dem 1. 16 Ibdem.9 10

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Aislamiento e identificacin de sustratos .

Medios de cultivo : Papa Dextrosa Agar (PDA) Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) Rosa de Bengala (RB)

REVISIN DE CAJAS Tenemos que observar hongos que esten aislados para realizar una resiembra con el fin de obtener un cultivo axenico .

EN EL FONDO COLOCAR GLICEROL PARA MANTENER LA HUEMDAD DEL AGAR Y FAVORECER EL CRECIMIENTO DE L HONGO

SIEMBRA DE SUSTRATOS Obtencin de muestra proveniente de productos comestibles . En este caso *Tortilla *Pan *Madera RESEMBRAR POR PUNTO LOS HONGOS AISLADOS

*COLOCAR SOBRE LA VARILLA DE VIDRIO EL CUBO DE 1 cm CBICO. INOCULAR POR PUNTO EL CUBO POR LAS CUATRAS CARAS . COLOCAR UN CUBREOBJEETOS ENCIMA DEL CUBITO .

Criterios a considerar para eleccin de hongo: *que sea un hongo uniforme *Preferentemen te aislado

Si l a muestra llegara a a ser de suelo podremos encontrar un sistema de diluciones

iNCUBARA A 28C POR 2 DAS

METODO TRADICIONAL NECESITAMOS MATERIAL ESTERIL *UNA CAJA DE PETRI DE VIDRIO * UN PORTAOBJETOS *VARILLA DE VIDRIO *CUBOS DE AGAR DE 1cm3

.

TCNICAS DE AISLAMIENTO *Por punto *Por estria *Por impronta *Por exposicion de placa

Incubar las cajas a 28C DURANTE 2 DAS

REVISIN DE MEDIOS, PARA ESTE MOMENTO TENDREMOS UN CULTIVO AXENICO , ES DECIR, PURO CON UN SOLO HONGO . HABREMOS LOGRADO PARA ESTE PASO EL AISLAMIENTO DE NUESTRO HONGO.

PARA LA IDENTIFICACIN TENEMOS QUE REALIZAR UN MICROCULTIVO QUE EN ESTA OCASION LO REALIZAREMOS POR DOS TECNICAS : TRADICIONAL Y ACTUAL

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TCNICA ACTUAL

COLOCARLO EN LA PARTE OPUESTA AL CORTE DEL AGAR. INOCULAR EN LAS CUATRO PAREDES DEL CUBO POR PUNTO .CUBRIR CON UN CUBREOBJETOS.

SE INCUBAN LOS MICROCULTIVOS A 28C POR DOS DAS

OBSERVAMOS EN EL MICROSCOPIO, PARA LA IDENTIFICACION DE ESTRUCTURAS DE REPRODUCCIN QUE NOS LLEVE COMO MNIMO A GNERO.

NECESITAMOS : *CAJA DE SABOURAUD DEXTROSA AGAR * BISTURI *CUBREOBJETOS (2)

AL TERMINAR EL MICROCULTIVO POR ESTA TCNICA SE ASEMEJARA A UNA CARITA FELIZ .

EN EL CASO DEL MICROCULTIVO SE DEBE DE TENER EN CUENTA EL TIEMPO DE INCUBACIN

PARA LA SEGUNDA PREPARACIN RETIRAMOS EL CUBO DE AGAR Y LO COLOCAMOS EN FORMOL DICHO CUBO . COMOCAMOS EN EL PORTA UNA GOTA DE AZUL LACTOFENOL Y ENCIMA UN CUBREOBJETOS . FIJAMOS CON BARNIZ

CON AYUDA DEL BISTURI EN UNO DE LOS EXTREMOS DE LA CAJA MARCAR UNA LINEA QUE TENGA CUADRITOS DE Icm POR LADO Y CORTARLOS .

REALIZAR PREPARACIONES

PARA LA PRIMERA COLOCAMOS EN UN PORTAOBJETOS UNA GOTA SE AZUL ALGODON LACTOFENOL Y ENCIMA EL CUBREOBJETOS , POSTERIORMENTE SELLAR CON BARNIZ.

LEVANTAR DOS DE ESOS CUADRITO ( SI ES NECESARIO 2) PARA TENER AL FINAL DOS CUBITOS DE Icm POR LADO.

SE REALIZARA UN MICROCULTIVO POR CADA HONGO DEL CUAL SE TENGA UN CULTIVO PURO.

TCNICA TRADICIONAL *RETIRAR EL GLICEROL *AGREGAR FORMOL AL 10% PARA MATAR AL HONGO Y FIJAR ESTRUCTURAS POR HORA Y MEDIA .

REALIZAREMOS DOS PREPARACIONES UNA CON EL CUBREOBJETOS Y OTRA CON EL PORTAOBJETOS QUE SOPORTABA EN CUBO DE AGAR .

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CADA UNA DE LAS COLONIAS DE LOS CULTIVOS PUROS QUE OBTUVIMOS SE DESCRIBIRN EMPLEANDO PARAMETROS COMO COLOR, TEXTURA, SUPERFICIE.

Muestras de la Cabeza: recoger las escamas, los pelos (con raz).

Muestras de las Uas: tomar fragmentos pequeos de las uas.

SE SEMBRARAN LAS MUESTRAS DE UAS, PELO Y PIEL EN MYCOBIOTIC, POR LA TCNICA DE PUNTO .

COLOR *ANVERSO *REVERSO ESTE PARAMETRO ES MUY IMPORTANTE PARA PODER PREDECIR UN HONGO CON MICELIO HIALINIO O MELANICO

Muestras de la Piel: se deben recoger abundantes escamas de la zona lesionada, preferiblemente de los bordes o bien pasar un trozo de moqueta especial y estril varias veces por la lesin.

Lesiones en mucosas: se recoger un exudado mediante una torunda. Se tomarn preferiblemente dos muestras, una para examen microscpico y otra para la siembra en un medio de cultivo.

SE REALIZARA UN EXUDADO FARINGEO Y SE SEMBRAR EN BIGGY PARA DESCARTAR PRESENCIA DE LEVADURAS Y EN GELOSA SANGRE .

TEXTURA *ALGODONOSA *VELLOSA *ATERCIOPELADA *GRANULOSA *PULVERULENTA *CREMOSA

TOMA DE MUESTRA

LA MUESTRA PODR SER DEPOSITADA EN UNA CAJA PETRI O EN PORTAOBJETOS.

SE INCUBAN POR 15 DIAS A 28C

SUPERFICIE *LISA *ACUMINADA *PLEGADA *CEREBRIFORME *UMBILICADA *CRATERIFORME

Tratamiento de muestras clnicas

ELECCIN DEL MEDIO DE CULTIVO BIGGY MYCOBIOTIC GELOSA SANGRE PARA EXUDADO FARINGEO

NO SE OBSERVO CRECIMIENTO ALGUNO EN LOS TUBOS Y DEL CRECIMIENTO DE BIGGY SE REALIZA UN FROTIS QUE SE TIE CON LA TCNICA DE GRAM .

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RESULTADOSy Morfologa colonial y microscpica de cepas tipo

Alternaria sp.

17

Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio

Vellosa Plana Negro con bordes blancos Negro No

18

19

Doctor Fungus (http://www.doctorfungus.org ) Fecha de consulta: 13/septiembre/2010. dem 17. 19 MYCOTA Les contaminants fongiques du patrimoine culturel (http://mycota-crcc.mnhn.fr ) Fecha de consulta: 13/septiembre/2010.17 18

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Aspergillus flavus Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio. Pulverulenta X Verde olivo Blanco No

Aspergillus niger Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Pulverulenta X Negro Blanco No

Aspergillus terreus Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Aterciopelada Plegada Blanco- caf claro Blanco No

20

20

Ibdem.

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Cladosporium sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Aterciopelada Plegada Negro Negro No

21

Curvularia sp. Descripcin de morfologa colonial no realizada

22

21 22

Ibdem. dem 17.

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Fusarium sp.

23


Vellosa X Blanco Violeta Violeta

24

23 24

Ibdem. Ibdem.

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Geotrichum sp. Aspecto Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Seco Plegada Blanco Blanco No

25

Mucor sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Algodonosa Invade todo el medio Blanco Blanco No

26

25 26

Ibdem. Ibdem.

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Paecilomyces sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Vellosa X Blanco Blanco No

27

Pestalotia sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Vellosa X Blanco Blanco con puntos negros Durazno

28

27 28

Ibdem. Danish Seed Health Centre. Faculty of Life Sciences. (http://www.dshc.life.ku.dk ) Fecha de consulta: 13/septiembre/2010.

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Penicillium sp.

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Aterciopelada o pulverulenta Plegada Verde Blanco No

30

31

dem 17. dem 19. 31 dem 17.29 30

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Rhizopus nigricans Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Algodonosa Invade superficie del medio Blanco con puntos negros Blanco No

32

Neurospora sp.


Granulosa X Anaranjado Blanco No

32

Ibdem.

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Trichoderma sp.

33


Vellosa X Blanco/ Sectorizacin verde Blanco Amarillo

34

33 34

Ibdem. Ibdem.

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Ulocladium sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Vellosa/Aterciopelada Plana Negro- Blanco Negro No

Cunninghamella sp. Descripcin de morfologa colonial no realizada

35

35

Ibdem.

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Syncephalastrum sp. Descripcin de morfologa colonial no realizada

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Zigorrhynchus sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Algodonosa Invade medio de cultivo Blanco Blanco No

Pichia sp. Aspecto Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Seco Lisa Blanco Blanco No

36

Ibdem.

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Candida albicans Elevacin Aspecto Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Convexa Hmedo/ Cremoso Lisa Blanco Blanco No

Saccharomyces cerevisiae Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Cremosa Lisa Blanco- Beige Blanco No

Hansenula sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Cremosa Lisa Beige Beige No

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Rhodotorula sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Cremosa Lisa Salmn Salmn No

Cryptococcus neoformans Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio Mucoide Lisa Blanco Blanco No

y Muestras clnicas.o Muestras de uas, pelo o escamas de piel.

Una vez llevado a cabo la siembra de las muestras clnicas de ambos pacientes se obtuvieron los siguientes resultados:

Paciente 1 Tipo de muestra Escamas de piel Siembra Por punto Temperatura de incubacin 28C Tiempo de incubacin 15- 30 das Medio de Sabouraud Sin crecimiento Medio Micobiotic Sin crecimiento

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Paciente 2 Tipo de muestra Ua Siembra Por punto Temperatura de incubacin 28C Tiempo de incubacin 15- 30 das Medio de Sabouraud Crecimiento bacteriano. Medio Micobiotic Crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano fue confirmado mediante un frotis teido por la tcnica de Gram. Exudado farngeo.

o

Una vez realizado el exudado farngeo para ambos pacientes, la muestra fue inoculada en dos placas con diferentes medios de cultivo y aislados mediante la tcnica de estra cruzada. Los resultados fueron los siguientes:

Paciente 1: Samantha Yong M. Exudado farngeo Por estra cruzada 28C 24- 48 h Crecimiento bacteriano. Contaminacin por hongos filamentosos. Medio de Gelosa Sangre Crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano fue confirmado mediante un frotis teido por la tcnica de Gram. Tipo de muestra Siembra Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin Medio de Sabouraud Paciente 2: A. Ernesto Ubaldo L. Tipo de muestra Exudado farngeo Siembra Por estra cruzada Temperatura de incubacin 28C Tiempo de incubacin 24- 48 h Medio de Sabouraud Crecimiento bacteriano Medio de Gelosa Sangre Crecimiento bacteriano Medio de Biggy Sin crecimiento El crecimiento bacteriano fue confirmado mediante un frotis teido por la tcnica de Gram.

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y Morfologa colonial y microscpica de cepas identificadaso Hongo 1Morfologa colonial Sustrato Tortilla Medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) Temperatura de incubacin 28C Textura Granulosa Superficie X (cultivo en tubo) Color Anverso Anaranjado/Durazno Color Reverso Blanco Pigmento difusible al medio No De acuerdo con la morfologa colonial podemos deducir que se trata de un hongo filamentoso, con micelio macrosifonado, septado hialino. Los cul deber ser confirmado con la morfologa microscpica.

Morfologa microscpica Tcnica de microcultivo Actual Colorante empleado Azul de algodn lactofenol Temperatura de incubacin 28C Micelio Macrosifonado, septado, hialino Conidios Artroconidios irregulares Posibles gneros identificados Neurospora sp. Y Geotrichum sp. La presencia de artroconidios nos lleva a pensar en ambos gneros, sin embargo la forma irregular que poseen nos obligan a inclinarnos por Neurospora sp. lo cual deber confirmarse con la morfologa colonial. Una vez comparadas, tanto la morfologa colonial como la microscpica, con las descripciones de las cepas tipo podemos confirmar que el hongo 1 se trata de Neurospora sp. Sin embargo estas observaciones nos impiden determinar la especie de la cual se trata.

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o Hongo 2Morfologa colonial Sustrato Hoja Medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) Temperatura de incubacin 28C Textura Aterciopelado /Pulverulento Superficie Plana Color Anverso Verde Color Reverso Blanco Pigmento difusible al medio No La morfologa colonial nos indica la presencia de un hongo filamentoso, segn a sus caractersticas podemos pensar en la posible presencia de un micelio macrosifonado, septado, hialino; lo cual deber ser corroborado con microscopa.

Tcnica de microcultivo Colorante empleado Temperatura de incubacin Micelio Conidios Posibles gneros identificados

Morfologa microscpica Tradicional Azul de algodn lactofenol 28C Macrosifonado, septado, hialino Fialoconidios Penicillium sp.

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Penicillium sp. Hongo ambiental con micelio areo tipo fialoconidios, emite pigmentos de color blanco algodonosos o azul verdoso. Hifas septadas que se ramifican y dan lugar a los conidiforos que originan las filides que portan microconidios lisos o rugosos37.

38

37 38

dem 19. Ibdem.

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o Hongo 3Morfologa colonial Sustrato Madera Medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) Temperatura de incubacin 28C Textura Vellosa Superficie Plana Color Anverso Blanco con sectorizacin de color verde Color Reverso Blanco Pigmento difusible al medio Amarillo La morfologa colonial de ste hongo nos indica que se trata de un hongo filamentoso, macrosifonado, septado, hialino; los cual ser corroborado mediante la observacin microscpica.


Morfologa microscpica Tradicional y Actual Azul de algodn lactofenol 28C Macrosifonado, septado, hialino Microconidios Tichoderma sp.

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La forma caracterstica de los conidios de Trichoderma sp., en conjunto con su peculiar morfologa colonial debido a la sectorizacin que sufre en medida que la colonia envejece; nos llevaron a identificar ste hongo bajo el gnero antes mencionado. Sin embargo, la determinacin de la especie no fue posible bajo las tcnicas aplicadas. Para tales fines ser necesario recurrir a pruebas bioqumicas y de biologa molecular.

Trichoderma sp. Es un hongo filamentoso imperfecto que pertenece a la clase de los Deuteromicetes. La forma sexual se encuentra dentro Phylum Ascomycota. ste gnero posee alrededor de 2 especies distintas39. Sus colonias son vellosas o lanosas, de crecimiento rpido, suelen ser de color blanco, verde amarillento o verdes. Los conidiforos son hialinos y septados. Las filides pueden ser ovoides o elipsoidales, aisladas o agrupadas en pequeos grupos de 2 o 3. Los conidios son unicelulares, redondos, lisos o rugosos, se producen en masas mucilaginosas formando aglomerados en la punta de las filides40. Trichoderma es un hongo cosmopolita y ubicuo, es considerado un hongo saprobio en el medio exterior y es un contaminante muy comn aunque es poco patgeno. Se encuentra implicado en alergias de tipo I y III, y algunos casos raros de micosis en individuos inmunodeprimidos. Diversas especies producen metabolitos antifngicos y numerosas micotoxinas41. El gnero Trichoderma posee un inters agro- alimentario en la produccin de celulosa y hemicelulosa y como un potenciador de sabores. Algunas especies son utilizadas en la lucha biolgica por la proteccin de arboles y cultivos vegetales contra el ataque de agentes fitopatgenos42.

Filide

Microconidios

Micelio hialino septado

Ibdem. Ibdem. 41 Ibdem. 42 Ibdem.39 40

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o Hongo 4Morfologa colonial en placa Medio ambiente Papa Dextrosa Agar (PDA) 28C 48 h Aterciopelada Acuminada Verde amarillento Rojo Rojo

Sustrato Medio de cultivo Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio

Sustrato Medio de cultivo Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento difusible al medio

Morfologa colonial en tubo Madera Papa Dextrosa Agar (PDA) 28C Ms de 72 horas Pulverulenta Plana Caf ocre Caf Rojo pardo

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Morfologa microscpica Actual Azul de algodn lactofenol 28C Macrosifonado, septado, hialino Fialoconidios Aspergillus sp.

La morfologa tan peculiar encontrada en numerosos conidiforos nos ha llevado a la bsqueda de la probable especie, para ello se realizo una comparacin, tanto de morfologa colonial como microscpica, para varias especies de Aspergillus. Encontrando las siguientes dos opciones:

Aspergillus versicolorMorfologa microscpica: Micelio macrosifonado, hialino, tabicado (2-4micras). Cabezas aspergilares que miden de 40-50 micras de dimetro, con conidiforos largos cenocticos, con vesculas subesfericas de 10-20 micrmetros, con dos series ( pequeas y grandes ) en un ngulo aproximado de 180 de conidios redondos equinulados de 2030 micrmetros. Clulas de Hlle pueden estar presentes43. Morfologa colonial: Colonia de lento crecimiento en comparacin con otras especies del mismos gnero, de textura pulverulenta a granulosa, de color verde amarillento al inicio, tornndose caf oscuro u ocre con el paso del tiempo; al reverso se observa una pigmentacin rojiza tornndose rojo fardo a caf debida a al pigmento secretado que es difusible al medio44.

45

46

Bonifaz A. Micologa Mdica Bsica. Ibdem. 45 dem 19.43 44

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Aspergillus glaucus chevalieri

47

Ibdem. Biotechnologie, vues pdagogiques. ltima actualizacin: 05/07/2006. (http://py.guillaume1.free.fr/site%20microbiologie/page_microscopie/microscopie.htm )46 47

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DISCUSIN DE RESULTADOSy Morfologa colonial y microscpica de cepas tipoPara la determinacin de la morfologa colonial de una cepa determinada, es importante considerar diferentes variables, ya que la alteracin de una de ellas puede afectar de manera significativa la morfologa colonial observada. Entre las variables a considerar se encuentra el medio de cultivo, para lo cual es recomendable llevar a cabo la descripcin colonial en placas de Papa Dextrosa Agar (PDA) o Sabouraud. Usar otros medios de cultivo como Czapek, Malta Agar (MA) o Czapek Yeast Agar (CYA) pueden interferir con el crecimiento fngico, alterando significativamente la morfologa colonial. Adems el empleo de medios en tubo inclinado, en la mayora de las ocasiones, dificulta la observacin en cuanto a la superficie colonial. Para ello, siempre es recomendable llevar a cabo la descripcin morfolgica en placa. Otro factor muy importante a considerar es la temperatura de incubacin, ya que el crecimiento colonial puede verse alterado, en especial en hongos dimrficos. Finalmente, la edad del cultivo es otro factor importante, se recomienda llevar la descripcin despus de 72 horas de incubacin con la finalidad de poder observar el desarrollo de conidios y la produccin de posibles pigmentaciones. Para poner de manifiesto las variaciones que pueden ocasionar la alteracin de alguno de los factores antes mencionados, podemos observar el caso de Aspergillus niger para el cual tenemos que48: Medio de cultivo MA Temperatura de incubacin 26C Morfologa colonial (Anverso) Morfologa colonial (Reverso)

48

dem 19.

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MA

37C

Czapek

26C

Czapek

37C

CYA

26C

CYA

37C

Resulta evidente la diferencia que existe entre cada uno de los medios de cultivo y la temperatura de incubacin; es justamente all, donde radica la importancia que tiene el control de estos factores. De igual forma los aspectos a describir en la morfologa colonial son totalmente subjetivos, es decir, dependen totalmente del individuo que los observe; mientras que un sujeto describe, por ejemplo, una colonia como aterciopelada otra persona puede considerar que se trata de una Septiembre 2010 Pgina 32


colonia pulverulenta. Pero cul de las dos descripciones es la correcta?, eso depende de la apreciacin de cada persona y nicamente la experiencia puede dotarnos de la habilidad para realizar descripciones ms exactas.

y Muestras clnicasLas muestras clnicas merecen un tratamiento especial por diversas situaciones, la primera de ellas refiere a las medidas de bioseguridad que debemos tener al manejarlas, ya que son una posible fuente de infeccin. Por otro lado, al trabajar una muestra clnica, tenemos en nuestras manos la salud de otra persona; por ello es muy importante que cada procedimiento sea realizado con el mayor cuidado posible para poder ofrecer un diagnstico correcto. Por otro lado la toma de muestras es un paso determinante en el proceso de diagnstico, ya que una mala toma de la misma puede alterar completamente los resultados. Tal es el caso del exudado farngeo realizado al paciente 1, el cual fue contaminado por hongos filamentosos. Las causas posibles de dicha contaminacin son: y y y y Exposicin de la placa fuera del rea de seguridad ofrecida por el mechero. Empleo excesivo de tiempo en la realizacin del exudado farngeo. No proporcionar al paciente la comodidad y confianza requerida para dicho procedimiento. Desconocimiento total sobre las indicaciones del procedimiento a realizar por parte del paciente.

Es importante remarcar que en este tipo de tcnicas es muy importante la destreza y habilidad, que slo proporcionan la experiencia, para una apropiada manipulacin. Por ello, es necesario tomar en cuenta la carencia de experiencia como un factor determinante en los resultados obtenidos.

y Morfologa colonial y microscpica de cepas identificadasPara el correcto aislamiento de una colonia, el primer paso determinante es seleccionar el sustrato, es importante elegir aquel que no se encuentre sumamente contaminado ya que la presencia de bacterias puede interferir con nuestro trabajo. Tal cual ocurri con uno de los sustratos empleados (durazno), que al encontrarse en tan mal estado result imposible aislar las levaduras observadas gracias a una preparacin en fresco por la constante contaminacin por bacilos Gram negativos. Por otro lado, el sembrar diferentes sustratos en una misma placa ocasion una gran interferencia en el aislamiento, ya que la invasin total de hongos algodonosos contamin colonias que pudieron ser candidatas para la resiembra en tubo y fue necesario su desecho.

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El aislamiento de un hongo no siempre es cosa fcil, una vez realizada la resiembra en tubo podemos enfrentarnos a diversas situaciones, por ejemplo, a una contaminacin o un tubo sin crecimiento lo que invariablemente refleja la falta de cuidado en la tcnica de resiembra. Sin embargo, existen ocasiones en las que nuestro tubo de resiembra muestra seales de posible contaminacin pero no podemos afirmarlo a ciencia cierta, entonces qu debemos hacer?, un tubo del cual no estamos seguros de su pureza es recomendable realizar algunas pruebas a la colonia. Un ejemplo de lo anterior fue lo acontecido con el hongo 3 (que ha sido identificado como Trichoderma sp. ) que al observarse crecimiento de color verde en ciertas regiones de la colonia de color blanco se pens , en primera instancia, que se trataba de una contaminacin. Sin embargo, al llevar a cabo una resiembra en placa a partir de la colonia del tubo, pudimos constatar que esa sectorizacin era propia del hongo aislado y que en ningn momento se trat de una contaminacin. As, est caracterstica de sectorizacin result ser un factor determinante para la identificacin. Una vez conseguido el aislamiento, el primer paso para la identificacin es realizar un microcultivo, para lo cual es importante tomar en cuenta algunos factores importantes como: y y y El tiempo de incubacin. Si se trata de un hongo patgeno o no, para poder decidir si empleamos la tcnica tradicional o la actual. Manejo cuidadoso al realizar las preparaciones con la finalidad de conservar en el mejor estado posible las estructuras de reproduccin asexual, ya que algunos hongos poseen estructuras muy frgiles como Trichoderma sp. y el mal manejo puede dificultarnos la posterior observacin microscpica.

Finalmente es necesario mencionar que para una buena identificacin, es importante considerar en todo momento la descripcin de la morfologa colonial como de la microscpica. Ya que, a veces, podemos confundir alguna caracterstica con otro hongo; sin embargo, al apoyarnos siempre de ambas descripciones podemos estar seguros de nuestros resultados.

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CONCLUSIONESLos hongos se encuentran presentes en cada rincn del planeta, los encontramos en toda la materia en descomposicin, en plantas, en animales y an parasitando otros hongos. Desde la antigedad han desempeado un papel fundamental sobre el planeta Tierra y hoy da continan permitiendo, en gran medida, la vida misma. Para poder llevar a cabo un estudio pleno sobre un hongo en particular, es necesario, en primera instancia, aislar dicho organismo. Mientras que la descripcin de la morfologa colonial como microscpica, nos permiten llevar a cabo una primera identificacin del organismo para su posterior estudio y aplicacin en otras reas del conocimiento. Es por ello que el aislamiento e identificacin de hongos resulta de vital importancia, no slo en el rea mdica, tambin nos puede brindar enormes beneficios en otras reas como la veterinaria, la agricultura, la fitopatologa, la biotecnologa, entre otras. La obtencin de buenos resultados depende, en gran medida, de la eleccin adecuada de las tcnicas y condiciones a emplear segn sea requerido. Es decir, es importante considerar la naturaleza de la muestra a analizar y de los recursos con los que se dispone. A pesar de los buenos resultados que ofrecen las tcnicas empleadas, es una realidad que cada una de ellas requiere del desarrollo de habilidades y destrezas por parte de la persona que las lleva a cabo. Adems, para el estudio ntegro de un organismo, es importante considerar otro tipo de tcnicas para su plena identificacin, como pruebas bioqumicas o de biologa molecular.

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Practica 1 to e Identificacion de Hongos

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