Genere Potyvirus

Classificazione

Gruppo IV (+ssRNA) Ordine Potyviridaes Genere Potyvirus. Il genere Potyvirus, la cui specie tipo è Potato virus Y (PVY), comprende le seguenti specie: 1. Algerian watermelon mosaic virus (AWMV) 2. Alstroemeria mosaic virus (AlMV) 3. Amaranthus leaf mottle virus (AmLMV) 4. Apium virus Y (AVY) 5. Araujia mosaic virus (ArjMV) 6. Arracacha virus Y (AVY) 7. Artichoke latent virus (ArLV) 8. Asparagus 1 virus (AV1) 9. Banana bract mosaic virus (BBMV) 10. Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) 11. Bean common mosaic virus (BCMV) 12. Bean yellow mosaic virus (BYMV) 13. Beet mosaic virus (BtMV) 14. Bidens mosaic virus (BiMV) 15. Bidens mottle virus (BiMoV) 16. Brugmansia mosaic virus (BruMV) 17. Caladenia virus A (CalVA) 18. Canna yellow streak virus (CaYSV) 19. Cardamom mosaic virus (CdMV) 20. Carnation vein mottle virus (CVMV) 21. Carrot thin leaf virus (CTLV) 22. Cassava brown streak virus (CBSD) 23. Cassia yellow spot virus (CasYSV) 24. Celery mosaic virus (CeMV) 25. Chickpea bushy dwarf virus (CpBDV) 26. Chickpea distortion mosaic virus (CPDMV) 27. Chilli ringspot virus (ChiRSV) 28. Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) 29. Clitoria chlorosis virus (CCV) 30. Clover yellow vein virus (ClYVV) 31. Cocksfoot streak virus (CSV) 32. Colombian datura virus (CDV) 33. Commelina diffusa virus (ComMV) 34. Commelina mosaic virus (ComMV) 35. Cowpea green vein-banding virus (CGVBV) 36. Cowpea Moroccan aphid-borne mosaic virus (CABMV) 37. Cowpea rugose mosaic virus (CPRMV) 38. Crinum mosaic virus (CriMV) 39. Daphne Y virus (DVY)

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40. Dasheen mosaic virus (DsMV) 41. Datura distortion mosaic virus (DDMV) 42. Datura necrosis virus (DNV) 43. Datura shoestring virus (DSTV) 44. Dendrobium mosaic virus (DeMV) 45. Desmodium mosaic virus (DesMV) 46. Dioscorea alata virus (DAV) 47. Dioscorea green banding mosaic virus (DGBMV) 48. Eggplant green mosaic virus (EGMV) 49. Euphorbia ringspot virus (EuRV) 50. Ficus carica virus (FicCV) 51. Freesia mosaic virus (FreMV) 52. Groundnut eyespot virus (GEV) 53. Guar symptomless virus (GSLV) 54. Guinea grass mosaic virus (GGMV) 55. Hardenbergia mosaic virus (HarMV) 56. Helenium virus Y (HVY) 57. Henbane mosaic virus (HMV) 58. Hippeastrum mosaic virus (HiMV) 59. Hyacinth mosaic virus (HyaMV) 60. Iris fulva mosaic virus (IFMV) 61. Iris mild mosaic virus (IMMV) 62. Iris severe mosaic virus (ISMV) 63. Japanese hornwort mosaic virus (JHMV) 64. Johnsongrass mosaic virus (JGMV) 65. Kennedya Y virus (KVY) 66. Leek yellow stripe virus (LYSV) 67. Lettuce mosaic virus (LMV) 68. Lily mottle virus (LMoV) 69. Maize dwarf mosaic virus (MDMV) 70. Malva vein clearing virus (MVCV) 71. Marigold mottle virus (MaMoV) 72. Narcissus degeneration virus (NDV) 73. Narcissus late season yellows virus (NLSYV) 74. Narcissus yellow stripe virus (NYSV) 75. Nerine virus (NV) 76. Onion yellow dwarf virus (OYDV) 77. Ornithogalum mosaic virus (OrMV) 78. Papaya mosaic virus (PapMV) 79. Papaya ringspot virus (PRSV) 80. Parsnip mosaic virus (ParMV) 81. Passiflora ringspot virus (PFRSV) 82. Passiflora South African virus (SAPV) 83. Passiflora virus Y (PVY) 84. Passionfruit Sri Lankan mottle virus (SLPMV) 85. Passionfruit woodiness virus (PWV) 86. Patchouli mosaic virus (PaMV) 87. Pea mosaic virus (PMV) 88. Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV) 89. Peanut green mosaic virus (PeGMV) 90. Peanut mottle virus (PeMoV)

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91. Pepper Indian mottle virus (PIMV) 92. Pepper mottle virus (PepMoV) 93. Pepper severe mosaic virus (PeSMV) 94. Pepper vein banding virus (PVPB) 95. Pepper veinal mottle virus (PVMV) 96. Plum pox virus (PPV) 97. Pokeweed mosaic virus (PkMV) 98. Potato A virus (PVA) 99. Potato virus V (PVV) 100. Potato virus Y (Potato virus Y) - specie tipo

101. Primula mosaic virus (PrMV) 102. Ranunculus mottle virus (RanMV) 103. Shallot yellow stripe virus (SYSV) 104. Sorghum mosaic virus (SrMV) 105. Soybean mosaic virus (SMV) 106. Statice virus Y (SVY) 107. Sugarcane mosaic virus (SCMV) 108. Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) 109. Sweet potato virus G (SPVG) 110. Sweet potato latent virus (SPLV) 111. Swordbean distortion mosaic virus (SBDMV) 112. Sunflower chlorotic mottle virus

113. Tamarillo mosaic virus (TamMV) 114. Telfairia mosaic virus (TeMV) 115. Tobacco etch virus (TEV) 116. Tobacco vein-banding mosaic virus (TVBMV) 117. Tobacco vein mottling virus (TVMV) 118. Tobacco wilt virus (TWV) 119. Tomato Peru virus (PTV) 120. Tradescantia mosaic virus

121. Tradescantia mosaic virus

122. Tradescantia-Zebrina virus (TZV) 123. Triteleia mosaic virus (TriMV) 124. Tropaeolum 1 virus (TV1) 125. Tropaeolum 2 virus (TV2) 126. Tuberose mild mosaic virus (TuMMV) 127. Tuberose mild mottle virus (TuMMoV) 128. Tulip band-breaking virus (TBBV) 129. Tulip breaking virus (TBV) 130. Tulip chlorotic blotch virus (TCBV) 131. Turnip mosaic virus (TuMV) 132. Ullucus mosaic virus (UMV) 133. Vallota mosaic virus (ValMV) 134. Vallota speciosa virus (VSV) 135. Vanilla mosaic virus (VanMV) 136. Vanilla distortion mosaic virus (VDMV) 137. Vanilla necrosis virus (VNV) 138. Voandzeia distortion mosaic virus (VDMV) 139. Watermelon mosaic virus (WMMV) 140. Watermelon mosaic 1 virus (WMV1) 141. Watermelon mosaic 2 virus (WMV2)

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142. Welsh onion yellow stripe virus (WOYSV) 143. Wild potato mosaic virus (WPMV) 144. Wisteria vein mosaic virus (WVMV) 145. Yam mosaic virus (YMV) 146. Zucchini yellow fleck virus (ZYFV) 147. Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

Virus aggiuntivi. Virus non ancora caratterizzati, ma appartenenti al genere Virus 148. Alstroemeria streak virus (AlSV) 149. Amaranthus mosaic virus (AMV) 150. Amazon lily mosaic virus (ALiMV) 151. Anthoxanthum mosaic virus (AntMV) 152. Aquilegia virus (AqV) 153. Asystasia gangetica mottle virus (AGMoV) 154. Bramble yellow mosaic virus (BrmYMV) 155. Brinjal mild mosaic virus (BrMMV) 156. Broad bean V virus (BBVV) 157. Bryonia mottle virus (BryMV) 158. Canary reed mosaic virus (CRMV) 159. Canavalia maritima mosaic virus (CnMMV) 160. Carrot mosaic virus (CtMV) 161. Celery latent virus (CLV) 162. Celery yellow mosaic virus (CeYMV) 163. Chickpea filiform virus (CpFV) 164. Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) 165. Chrysanthemum spot virus (ChSV) 166. Cypripedium calceolus virus (CypCV) 167. Datura mosaic virus (DTMV) 168. Dioscorea latent virus (DLV) 169. Dioscorea trifida virus (DTV) 170. Dock mottling mosaic virus (DMMV) 171. Eggplant severe mottle virus (ESMV) 172. Endive necrotic mosaic virus (ENMV) 173. Habenaria mosaic virus (HaMV) 174. Helenium Y potyvirus (HVY) 175. Holcus streak virus (HSV) 176. Hungarian Datura innoxia virus (HDIV) 177. Kalanchoe mosaic virus (KMV) 178. Konjak mosaic virus (KMV) 179. Launaea mosaic virus (LMoV) 180. Melilotus mosaic virus (MeMV) 181. Melon vein-banding mosaic virus (MVBMV) 182. Melothria mottle virus (MeMoV) 183. Mung bean mottle virus (MMTV) 184. Nasturtium mosaic virus (NasMV) 185. Nerine virus Y (NeVY) 186. Nothoscordum mosaic virus (NoMV) 187. Palm mosaic yvirus (PalMV) 188. Parsley green mottle virus (PGMV) 189. Parsnip virus 3 (ParV3) 190. Patchouli mottle virus (PatMV)

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191. Peanut top paralysis virus (PTPV) 192. Pecteilis mosaic virus (PcMV) 193. Perilla mottle virus (PerMV) 194. Plantain virus 7 (PlV7) 195. Pleioblastus chino virus (PleMV) 196. Poplar decline virus (PV) 197. Primula mottle virus (PrMoV) 198. Shamrock chlorotic ringspot virus (SCRV) 199. Soybean virus Z (SVZ) 200. Sunflower mosaic virus (SuMV) 201. Sweet potato latent virus (SwPLV) 202. Sweet potato vein mosaic virus (SPVMV) 203. Teasel mosaic virus (TeaMV) 204. Tomato mild mottle virus (TomMMoV) 205. Trichosanthes mottle virus (TrMV) 206. Welsh onion yellow stripe virus (WOYSV) 207. Zinnia mild mottle virus (ZMMV) 208. Zoysia mosaic virus (ZMV)

Potyvirus è il più grande genere di virus delle piante, con 208 determinati o possibili membri che causano perdite significative in una vasta gamma di piante coltivate. I Potyvirus sono trasmessi da afidi in modo non persistente e, alcuni di loro, sono anche trasmessi attraverso le sementi. L'organizzazione del genoma RNA a singolo filamento di potyvirus è mostrato in figura 1.

Figura 1 - I potyvirus hanno genomi RNA a singolo filamento, di circa 10 kb. L’RNA è

poliadenilato al terminale 3’ [poli(A)] ed hanno una proteina legata al genoma codificata dal virus (VPg) e legata covalentemente al terminale 5’. L’RNA codifica una singola poliproteina (box ombreggiato) che subisce un clivaggio (una separazione) proteolitico ad opera di una proteasi autocodificata (pro), con formazione di proteine funzionali. L'unica proteina strutturale è la proteina del capside (CP). Altre funzioni identificate includono: 1) la proteasi del componente helper della trasmissione virale operata dagli afidi (HC-

Pro), che ha anche un'attività di soppressore del silenziamento genico, 2) la proteina dell’inclusione cilindrica (CI) che assiste il movimento virale, 3) la proteina della combinazione VPg-proteasi (NIa; inclusione nucleare a), 4) la replicasi di RNA (NIb; inclusione nucleare b).

Sono stati compiuti notevoli progressi negli ultimi anni nella comprensione della biologia molecolare delle interazioni tra i potyvirus ed i loro ospiti. Questi risultati sono stati resi possibili grazie alla conoscenza della sequenza completa dei genomi virali, attraverso la generazione di molecole infettive in vitro e in vivo da cDNA virali clonati e attraverso le tecniche di mutagenesi e la costruzione di virus ibridi ricombinanti.

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Inoltre, l’uso di geni per visibilizzare le molecole reporter clonate nei genomi virali infettivi sono stati cruciali. In particolare, questi hanno incluso il gene uidA che codifica β-glucuronidasi (GUS, ad esempio) e il gene gfp di Aequorea victoria che codifica la proteina fluorescente verde (GFP, ad esempio). Quindi, i geni sono stati clonati per dare una fusione con una proteina virale o sono stati tali che la scissione proteolitica rilascia la proteina reporter libera dalla poliproteina potyvirale. In quest’ultimo caso, clonando il gene reporter e una nuova inclusione nucleare è stata particolarmente efficace un sito di separazione specifico della proteina (NIa) adiacente alla proteinasi del componente helper (HC-Pro). La nuova tecnologia ha contribuito in modo significativo ai recenti progressi. I sistemi a due ibridi di lieviti per l’analisi delle interazioni proteina-proteina nel nucleo sono commercialmente disponibili e la rapida espansione delle risorse genetiche e bioinformatiche ha significato che l'identificazione e la caratterizzazione dei geni ospiti (in particolare per Arabidopsis thaliana) è possibile e diventerà una routine in pochi anni. Questa revisione si concentra su questi nuovi progressi, in particolare sui fattori molecolari dell’ospite e virali mostrati per avere un ruolo significativo durante l’infezione virale. Ciò è importante per la descrizione dei determinanti molecolari coinvolti nell’infezione sistemica (amplificazione del genoma, movimenti da cellule a cellule e movimenti da lunghe distanze), espressione dei sintomi, trasmissione da parte degli afidi vettori e ad opera del seme, resistenze genetiche naturali e ingegnerizzate verso i potyvirus.

Infezione sistemica. L’infezione sistemica avviene quando un virus è in grado di muoversi, dopo l’amplificazione del genoma, dal punto dove è avvenuta l’infezione primaria verso i punti di invasione delle regioni distali della pianta. Ciò richiede che l’unità infettiva si sposti localmente da cellula a cellula attraverso i plasmodesmi e quindi su distanze più lunghe attraverso il floema. Per la maggior parte dei gruppi di virus delle piante, il processo di movimento coinvolge una o più proteine specializzate del virus codificato, chiamate proteine di movimento (MP). Queste proteine sono di solito caratterizzate da mutagenesi quando il movimento cellula-cellula dalla cellula primaria infetta è alterato senza influenzare la replicazione del virus. I potyvirus non codificano un MP dedicato, ma le funzioni di movimento sono state assegnate a diverse proteine, tra cui la proteina del capside (CP), HC-Pro, la proteina di inclusione cilindrica (CI) e la proteina legata al genoma (VPg). In alcuni di questi casi, la definizione basata sulla mutazione è stata supportata da osservazioni ultrastrutturali ed esperimenti di microiniezione per dimostrare che le proteine influenzano una funzione del plasmodio. Amplificazione del genoma. L’amplificazione genomica del potyvirus richiede due processi fondamentali: 1. la traduzione virale di RNA per la sintesi di proteine specifiche del virus, compresa la

replicazione virale; 2. la replica di RNA stessa. L'interrelazione di questi due processi rende difficile attribuire funzioni particolari in modo univoco alla replicazione di RNA. Quindi, molte proteine dei potyvirus codificate influenzano il livello cellulare dell'aggregazione del virus. Superficialmente, le proprietà di legame di RNA di P1, HC-Pro, proteina CI, NIa, proteina di inclusione nucleare b (NIb; replicasi) e CP possono suggerire che tutte queste proteine funzionino nel processo di replicazione di RNA. Tuttavia, la possibilità del coinvolgimento di proteine virali, nelle caratteristiche distintive della traduzione di RNA dei potyvirus e del potenziale di traslocazione da cellula a cellula di RNA virale, rendono difficile l’allocazione precisa delle funzioni. Quasi certamente, i processi di replica e traduzione di RNA sono integrati nello spazio e nel tempo. L’RNA potyvirale differisce dagli mRNA dell’ospite per l’assenza di un rivestimento 5’. Come è noto, il rivestimento in 5’ (detto anche cappuccio in 5’, o 5’ cap in inglese) è un nucleotide alterato speciale sull'estremità 5’ dell'RNA messaggero precursore e di altri trascritti primari di RNA trovati negli eucarioti. Il processo del cosiddetto capping ("rivestimento") in 5’ è vitale nella creazione di

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RNA messaggero maturo, in grado poi di avviare il processo di traduzione del mRNA in proteina. Il rivestimento assicura la stabilità dell’RNA messaggero, mentre avviene la traduzione durante la sintesi proteica, ed è un processo altamente regolato che avviene nel nucleo cellulare. Poiché avviene solo nel nucleo, l’mRNA dei mitocondri e cloroplasti non viene rivestito. Il 5’ cap si trova all'estremità 5’ di una molecola di mRNA e consiste in una guanina collegata all’mRNA tramite un inusuale ponte trifosfato 5’-5’. Questa guanina in vivo viene metilata da una metil-transferasi. Ci si riferisce così ad essa come a un cap 7-metilguanilato, abbreviato m7G. Ritornando al concetto che l’RNA potyvirale manca di un rivestimento 5’, nel virione questo viene sostituito dalla VPg. La struttura del rivestimento 5’ dell’RNA potyvirale associato ai polisomi non è nota. Entrambi gli mRNA dell’ospite e l’RNA del potyvirus sono 3’-poliadenilati. Poiché la traduzione efficace della maggior parte degli mRNA eucariotico richiede che il 5’-cap e il 3’-poli(A) agiscano in concerto, un meccanismo alternativo deve operare per i potyvirus. Si è dimostrato per il Tobacco etch virus (TEV) che la lunga regione non trascritta 5’ (NTR) sostituisce il 5’-cap nell’interazione con il 3’-poli(A) e può agire come un enhancer traslatorio, un esaltatore della translazione, quando posto a monte di ORF eterologhi. Un ruolo per il 5'-cap è il legame dei fattori di traduzione prima dell’assunzione di ribosomi. Quindi, il 5' NTR e/o VPg devono fornire questo ruolo specifico. Un certo sostegno a ciò proviene dalla dimostrazione di un’interazione bidirezionale di lieviti tra VPg del Turnip mosaic virus (TuMV) e eIF(iso)4E di Arabidopsis thaliana. Per alcuni membri della famiglia di virus Picornaviridae, che hanno tutti 5’VPg, l’ingresso di ribosomi è stato collegato alla presenza di una struttura complessa di RNA nel 5’ NTR, chiamato sito di ingresso ribosomiale

interno (IRES, acronimo di internal ribosome entry site). Esiste qualche evidenza che il potyvirus 5’ NTRs potrebbe agire in modo analogo, anche se non è stata identificata una struttura come IRES. Plum pox virus (PPP) 5’ NTR presenta una complicazione aggiunta, in quanto contiene un ulteriore AUG interno, a monte del codone d’inizio della poliproteina. Questo sembra essere gestito attraverso un meccanismo di translazione della "perdita di scansione" di indipendenza del cap. Per la replica RNA, la dimostrazione di attività dell’RNA polimerasi di NIb, l’associazione di complessi di replicazione TEV, con membrane endoplasmiche simili al reticolo, ed il potenziale per la proteina 6K di agire come ancoraggio alla membrana, sono risultati importanti. Inoltre, la funzione cis-replicativa di NIa e l’interazione fisica tra NIa e NIb potrebbero iniziare a definire i componenti del complesso di replicazione virale. Studi di mutazione hanno anche dimostrato che P1, HC-Pro e P3 sono coinvolti nell’amplificazione del genoma potyvirale. Eccezionalmente, CP non sembra necessaria, sebbene la traduzione in una posizione tra i codoni 138 e 189 di TEV CP ed una sequenza RNA cis-attiva tra i codoni 211 e 246 di TEV CP, sono assolutamente necessari. Recentemente, sono state mostrate anche strutture secondarie che coinvolgono sia la codifica di CP, sia le sequenze di 3’ NTR che conferiscono la funzione replicativa. Movimento da cellula a cellula. Per il movimento del potyvirus esiste la prova genetica che CP (coat protein) è indispensabile. La CP del potyvirus è una proteina a tre domini con regioni variabili N e C terminali esposte sulla superficie delle particelle e un dominio nucleo conservato che interagisce con l’RNA virale che hanno prodotto mutanti nel dominio CP-core di TEV-GUS. Tutti i mutanti erano difettosi nel movimento cellula-cellula e nell’assemblaggio di virioni. L'effetto di tali mutazioni sull’assemblaggio era stato precedentemente osservato per il Johnsongrass mosaic

virus (JGMV). Anche questa analisi mutazionale ha mostrato che il dominio N-terminale della CP ha un ruolo accessorio in questo processo di movimento, poiché i mutanti rimossi con questo dominio hanno mostrato movimenti lenti tra cellula e cellula, in foglie inoculate. Diversi studi hanno implicato la proteina CI, un’elicasi di RNA necessaria per la replicazione del genoma, nel movimento da cellula a cellula dei potyvirus. Con la microscopia elettronica, la proteina CI viene vista formare aggregati (chiamati pinwheel o inclusioni cilindriche, CI) nel citoplasma delle cellule infette. Queste inclusioni vengono spesso viste posizionate sopra l’apertura

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plasmodesmale. L’analisi mutazionale della proteina TEV CI ha identificato due mutanti, alterati nella regione N-terminale, che erano difettosi nel movimento da cellula a cellula, ma si replicavano ancora a livelli equivalenti a quelli osservati per il virus parentale. Altri mutanti della proteina TEV CI non sono stati o sono stati debolmente replicati nei protoplasti infetti, sostenendo l’ipotesi che la proteina CI ha anche un ruolo importante nel processo di replicazione del virus. Gli studi ultrastrutturali dei tessuti in una fase iniziale di infezione, combinati con l’immunogold

labeling o immunogold staining (IGS) di proteine specifiche di potyvirus, hanno ulteriormente supportato il ruolo della proteina CI e CP nei movimenti cellula-cellula. L’immunogold labeling è una tecnica di colorazione usata nella microscopia elettronica. Questa tecnica di colorazione segue gli stessi schemi dell’immunofluorescenza indiretta per cui le particelle di oro colloidale sono spesso collegate ad anticorpi secondari che a loro volta sono collegati ad anticorpi primari, progettati per legare un antigene specifico o un altro componente cellulare. L’oro viene utilizzato per la sua elevata densità di elettroni che aumenta l’espansione degli stessi elettroni per dare un contrasto elevato (“macchie scure”). La tecnica può essere adattata per distinguere più oggetti, utilizzando particelle di oro diversamente dimensionate. Le osservazioni su tabacco, con foglie infette da Tobacco vein mottling virus (TVMV), o di cellule con avanzata infezione di Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV) nei cotiledoni di piselli, ha mostrato che il CI immunolabellato, per la proteina CI e CP, sono stati fissati alla membrana plasmatica, vicino o sopra l’apertura dei plasmodesmi. La più notevole è stata l’osservazione di un canale continuo attraverso il centro dei CI e del plasmodesma. Questo canale conteneva CP e, nel caso delle cellule di tabacco, RNA di TVMV, identificato mediante ibridazione in situ. Nel caso dell’infezione di PSbMV, i CI non erano più associati alla parete cellulare, o con CP e CI, ed erano accumulati come le strutture caratteristiche del pinwheel (delle inclusioni cilindriche) nel citoplasma. Entrambi gli studi hanno proposto che i CI potrebbero funzionare transitoriamente per trasferire complessi virali da cellula a cellula attraverso il plasmodesma. È stato anche suggerito che VPg potrebbe avere un ruolo nel movimento dei potyvirus da cellula a cellula. Attraverso la mutagenesi sito-diretta e la costruzione di TVMV chimerici, il determinante della rottura della resistenza virale in Nicotiana tabacum cv. TN 86 gene di resistenza, va, è stato identificato come VPg. L’espressione fenotipica di questa resistenza recessiva è il confinamento dell’infezione alle cellule inizialmente infette, suggerendo un movimento ristretto del virus. Negli esperimenti di co-inoculazione con ceppi di TVMV virulenti e avirulenti, solo i ceppi virulenti sono stati rilevati in foglie infettate sistemicamente. Questi dati trattano: 1. contro l’elicitazione di una generale reazione che limita il movimento in cv. TN 86 del ceppo

avirulento, 2. contro una mediazione non specifica di trasporto, attraverso i plasmodesmi, del ceppo virulento.

Tuttavia, il ceppo avirulento replica nei protoplasti della cv. TN 86 a un livello inferiore rispetto a una cultivar suscettibile di tabacco, forse indicando che la risposta alla difesa della pianta può limitare la replica di questo ceppo e ridurre la sua capacità di invadere più di poche cellule. Le analisi genetiche del coinvolgimento di HC-Pro durante il processo di trasporto da cellula a cellula è meno. Diversi HCPro mutanti di TEV sembravano muoversi da cellula a cellula in modo meno efficiente, rispetto al virus parentale e un mutante TVMV HC-Pro non è stato in grado di diffondersi nelle foglie inoculate. Poiché il plasmodesma nelle cellule del mesofillo fogliare hanno un limite di esclusione di dmensioni (SEL, dall’acronimo size exclusion limit) di circa 1.000 Da per il trasporto passivo di molecole, alcuni effetti dele proteine di movimento (MP) potyvirali sul SEL plasmodesmale potrebbero essere previsti. Gli effetti di delle proteine di Bean common mosaic necrosis virus e di Lettuce mosaic virus espressi su Escherichia coli sull’ingresso plasmodesmale sono stati misurati dopo la microiniezione in cellule. Sia CP che HC-Pro hanno indotto un aumento del SEL plasmodesmale e mediare il movimento di RNA virale (approssimativamente 1 kb codifica la CP virale) da cellula a cellula. La microiniezione di proteina CI o NIa (che contiene il dominio VPg) non ha indotto questi effetti. Questi sono i primi esperimenti progettati per analizzare il ruolo delle

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proteine di movimento (MP) dei potyvirus nel processo complessivo dei movimenti da cellula a cellula, anche se non lo fanno strettamente mimano le infezioni naturali del potyvirus. Collettivamente, questi studi dimostrano che almeno due proteine potyvirali, CI e CP, potrebbero essere considerate proteine di movimento. A partire dal modello del movimento cellula-a-cellula dei potyvirus proposto da Carrington et al. (1998), la proteina CI può dirigere la traslocazione intracellulare di un complesso di trasporto virale che include il CP. Quindi, CP può interagire con i plasmodesmi per aumentare il SEL e la proteina CI può funzionare per posizionare il complesso virale per la traslocazione attraverso le strutture CI, nei plasmodesmi e, infine, nelle cellule adiacenti. Una domanda importante per avere un indirizzo nei prossimi anni, riguarda la natura del trasporto del complesso virale. La forte correlazione tra competenza per l’assemblaggio dei virioni e per il movimento cellula-a-cellula nel caso di TEV ed il materiale fibrillare (simile alle particelle di PSbMV) osservate, in pisello, all'interno del plasmodesma può essere preso come un’indicazione che i potyviruses si spostano da cellula a cellula come i virioni. Tuttavia, mancano ancora prove dirette. Movimento a distanza. Il movimento a lunga distanza è il movimento dell’agente infettivo dal mesofillo attraverso la cellule legnose, il floema e le piastre cribrose, la traslocazione passiva nel phloem e lo scarico in un sito remoto per stabilire ulteriori foci di infezioni. Uno specifico esempio di questo movimento a lunga distanza è dato dal movimento nelle piante di Capsicum annuum di Pepper mottle virus (PepMoV). In questo caso, il virus è stato visto seguire il percorso del percorso dalla “fonte al lavandino” per la traslocazione dei fotoassimilati. Questo ha coinvolto il trasporto discendente attraverso il fiore esterno nel fusto dalla foglia inoculata, ingresso in flusso interno e rapido trasporto ascendente ai giovani tessuti della pianta. Generalmente, la complessità dei tipi di cellule, le loro connessioni e la difficoltà di analizzare il movimento a lunga distanza, indipendentemente dal movimento da cellula-a-cellula, significa che i ruoli delle proteine dei potyvirus in questo processo non è ben definito. Almeno tre proteine potyvirali (CP, HC-Pro e VPg) sembrano coinvolte nel movimento a lunga distanza. Per i mutanti CP, TEV-GUS con delezioni nei domini CP N- o C-terminale hanno prodotto virioni in vivo, ma il virus presenta difetti nel movimento a lunga distanza nelle piante. Inoltre, l’analisi mutazionale ha dimostrato che le modifiche a Ser47 della CP di PSbMV CP e Asp5 nel motivo DAG del dominio N-terminal della CP di TVMV possono modulare la capacità del virus a muoversi sistematicamente in Chenopodium quinoa e in piante di tabacco, rispettivamente. Altre analisi con TEV-GUS hanno mostrato anche che HC-Pro ha un ruolo nel movimento a lunga distanza dei potyvirus. Il movimento a lunga distanza del virus mutante TEV-GUS/CCCE difettoso (sostituzione di Cys293, Cys294, Cys295 e Glu299, altamente conservati all’interno della regione centrale di HC-Pro) è stato analizzato per la sua capacità di infettare una serie di innesti di piante composte da varie combinazioni di innesti e portinnesti transgeniche e non transgeniche di HC-Pro. L’infezione sistemica è stata osservata solo quando entrambi l’innesto e portainnesto possono fornire una funzione complementare da un transgene HC-Pro di tipo selvatico. Ciò ha indicato che HC-Pro è richiesto sia nei tessuti inoculati che non inoculati per un efficiente movimento a lunga distanza e, di conseguenza, presumibilmente per entrare e uscire dal sistema vascolare della pianta ospite. Sono state inoltre analizzate altre mutazioni nel dominio centrale di HC-Pro e hanno mostrato lo stesso effetto negativo sul movimento a distanza. Una inserzione nel cuscinetto mutante nella parte dell’N-terminale di TVMV, HC-Pro anche non ha prodotto infezioni sistemiche. Il coinvolgimento di VPg nel movimento a lunga distanza è stato proposto dall’analisi dei ricombinanti TEV, effettuati tra i ceppi che differivano nella loro capacità di invadere Nicotiana tabacum cv. V20 sistemicamente. Il ceppo HAT di TEV mostra un fenotipo di movimento cellula-a-cellula limitato nella cv. V20, ma un'infezione sistemica nella cv. Havana 425. Il ceppo Oxnard di TEV è in grado di infezioni sistemiche in entrambe le cultivar. Per identificare i determinanti di movimento degli ospiti specifici di TEV, sono stati costruiti genomi virali chimerici tra TEV-HAT

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e TEV-Oxnard. I virus chimici contenenti il dominio TEV-Oxnard VPg erano in grado di infettare la cv. V20 sistemicamente. Nonostante gli esperimenti sopra descritti, il modello dettagliato per i movimenti a distanza dei potyvirus deve essere speculativo. Poiché CP è una proteina strutturale e VPg è covalentemente legata all’RNA virale, queste due proteine sono probabilmente incluse in un complesso di trasporto virale e può interagire con fattori ospiti per un movimento efficiente attraverso la pianta ospite. Questi fattori dell’ospite rimangono sfuggenti anche se la complessità del processo significa che molte proteine dello stesso ospite possono essere coinvolte. Almeno tre fattori sono suggeriti dalle analisi genetiche degli ospiti. Quindi, la segregazione risultante dall’incrocio tra la cv. V20 e la cv Havana 425 di Nicotiana tabacum ha suggerito che la limitazione di TEV nella cv. V20 è dovuta a due geni recessivi. Un locus monogenico, dominante (RTM1) di Arabidopsis thaliana, conferendo un fenotipo di infezione da TEV limitato, identifica il terzo fattore. La clonazione e la caratterizzazione molecolare di questo gene dominante può essere il più trattabile sperimentalmente e potrebbe fornire le prime informazioni dettagliate sulle proteine dell’ospite coinvolte nel movimento a lunga distanza dei potyvirus.

HC-Pro, un soppressore virale di silenziamento del gene. Un recente sviluppo nella nostra comprensione del ruolo di HC-Pro può significare che è necessario osservare molti aspetti del trasporto a lunga distanza in un modo diverso. L’analisi delle infezioni sinergiche che coinvolgono potyvirus ha dimostrato che HC-Pro può agire come un enhancer, un esaltatore della patogenicità generale, interferendo con una risposta di difesa dell’ospite che normalmente limita l’infezione virale. In diversi lavori paralleli, tre gruppi hanno dimostrato che HC-Pro ha la capacità di sopprimere il silenziamento del gene post-trascrizionale (PTGS, post-

transcriptional gene silencing) e che la conseguenza di ciò è l’ aumento della replicazione dei virus. Essenzialmente, due sono le strategie che hanno portato a questa conclusione: a. Gli incroci tra le linee transgeniche che esprimono il potyvirus P1/HC-Pro (una proteina

capace di auto clivaggio, di frazionarsi e dividersi, per rilasciare HC-Pro libero) e le linee che presentano PTGS dei geni reporter (uidA o gfp) risultano nella progenie in cui la funzione del gene reporter è stata ripristinata.

b. I vettori di Virus potato X (PVX) che esprimono HC-Pro replicati ad un livello più elevato di PVX selvatici e l’espressione del gene reporter ripristinata sulle piante silenziate di uidA o gfp.

Alcune prove dimostrano che è la regione centrale di HC-Pro che media gli effetti sinergici nella coinfezione con altri virus e la soppressione del silenziamento genico e che questa proprietà di HC-Pro è stata migliorata dalla presenza della proteina potyvirale P1. C’è sempre più evidenza che PTGS può essere diviso funzionalmente nelle fasi di iniziazione e mantenimento. In uno studio comparativo tra HC-Pro e il soppressore codificato dal Cucumber mosaic virus (CMV; 2b proteina), HC-Pro ha soppresso PTGS nei tessuti somatici, tra cui la foglia inoculata, mentre CMV 2b era solo attiva all’apice del germoglio. L’interpretazione era che solo CMV 2b ha influenzato la fase di iniziazione di PTGS, mentre HC-Pro potrebbe influenzare sia la sola manutenzione, sia l’iniziazione e la manutenzione. Infezioni sinergiche tra CMV e PepMoV in Capsicum annum cv. Avelar suggeriscono che CMV 2b e HC-Pro non sono antagonisti funzionali. Possiamo vedere PTGS come un potenziale meccanismo di difesa contro i virus che potrebbero limitare l’accumulo dei virus nelle cellule infette e, quindi, ritardare il movimento virale. Pertanto, un blocco completo del movimento a lunga distanza potrebbe rappresentare l ‘effetto indiretto di PTGS, permettendo ad altri meccanismi di resistenza di subentrare nel gioco. Questo può spiegare perché gli studi genetici dei movimenti a lunga distanza sembrano spesso difficili da interpretare, in quanto riflette l’equilibrio tra la potenziale replica del virus, la neutralizzazione di PTGS ed ulteriori risposte di resistenza.

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Sintomatologia indotta dal virus. La maggior parte dei potyvirus induce sintomi cospicui, spesso causando gravi perdite nella resa produttiva delle colture interesate. I sintomi consistono in striature longitudinali clorotiche o necrotiche nelle foglie di specie monocotiledoni e clorosi nervale, arresto nella crescita, necrosi e/o distorsioni delle foglie nelle specie dicotiledoni. Anche i fiori, i semi ed i frutti sono interessati da numerosi potyviruses. La natura e l’entità dei sintomi per il genotipo di un ospite specifico dipende dal virus e dal particolare ceppo virale, dalle condizioni ambientali, probabilmente attraverso la loro influenza sulla fisiologia e sullo sviluppo dell’ospite. I sintomi sono il risultato di interazioni complesse cellulari e tissutali dell’ospite con il virus. Gli effetti possono essere la conseguenza della modifica delle risorse vegetali causata da virus-specifici, acidi nucleici e proteine, o gli effetti distruttivi di specifici virus prodotti sui processi cellulari normali (ad esempio, comunicazione cellula-a-cellula). Generalmente, per qualsiasi combinazione ospite/virus compatibile, la gravità dei sintomi rifletterà il livello di replicazione e accumulazione virale. Pertanto, i soppressori di PTGS (ad esempio, HC-Pro) potrebbero avere un grande impatto sull’espressione del sintomo in infezioni singole o infezioni combinate con altri virus. Negli ultimi anni, diverse regioni del genoma potyvirale hanno dimostrato di avere un ruolo nella sintomatologia. L’analisi mutazionale del genoma di TVMV ha dimostrato che la regione codificante P1/ HC-Pro ed in particolare la regione di codifica 5' di HC-Pro, è coinvolta nell’espressione dei sintomi sul tabacco. Costruendo ibridi ricombinanti di due ceppi di PSbMV è stato dimostrato che il segmento del genoma che codifica il PSbMV, NIa e NIb, ha un’influenza notevole sulla gravità del sintomo in Pisum sativum. Due segmenti genomici separati di TEV, uno che comprende il terzo 3’ della regione codificante P3 ed un altro che comprende il terminale 3’ del CI, la 6K e il terminale 5’ delle regioni codificanti NIa, sono responsabili insieme della risposta dell’avvizzimento della specie Capsicum frutescens. Inoltre, le mutazioni introdotte nella sequenza del sito di scissione di PPV P3-6K causa l’attenuazione dei sintomi o sintomi più gravi. Un ulteriore studio del PPV, ha mostrato che un mutante manca dei nucleotidi da 127 a 145 del terminale 5’ NTR ha indotto solo sintomi molto lievi su Nicotiana clevelandii. Nel terminale 3’ NTR di TVMV, quattro ripetizioni di 14 residui di adenina e uracile sono stati responsabili dell’attenuazione dei sintomi su tabacco. Purtroppo, nonostante tutte queste informazioni, non è ancora possibile individuare principi unificanti per spiegare la formazione e l’induzione dei sintomi. Anche se per altri generi di virus ci sono esempi di particolari prodotti genetici virali che agiscono come induttori del sintomo in assenza di infezione, non ci sono prove di questo tipo per gli esempi di potyvirus di cui si è detto. In una certa misura l’inadeguata comprensione dell’espressione del sintomo riflette la mancanza di conoscenza delle proteine dell’ospite che interagiscono con le proteine virali.Ad oggi, sono state identificate solo due potenziali interazioni: 1. l’interazione tra VPg di TuMV e eIF(iso)4E descritto in precedenza; 2. identificazione di una proteina da 37 kD, mediante anticorpi anti-idiotipici, localizzata nel

cloroplasto che interagisce con la coat protein (CP) di TuMV. Il significato di queste interazioni per la replicazione virale o l’espressione del sintomo non sono noti. Deducendo quali cambiamenti biochimici portano all’espressione dei sintomi, distinguendoli dalle conseguenze della produzione del sintomo è una sfida importante, complicata dalla natura progressiva delle infezioni virali nelle piante dove, al contrario, per sviluppare un'infezione sistemica completa occorre un periodo di diversi giorni fino a settimane, mentre la fase esponenziale della replicazione nelle singole cellule non può prendere più di poche ore. Quindi, dal catalogo dei cambiamenti biochimici registrati per i tessuti sistematicamente infetti è impossibile distinguere la causa dalla conseguenza.

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Un approccio che può fornire maggiori informazioni è quello di mettere le modifiche in una sequenza di eventi dopo l’inizio della replicazione virale. Attraverso analisi spaziali dei cambiamenti nell’espressione genica dell’ospite di fronte dell'infezione, questo approccio è stato applicato all’infezione PSbMV dei tessuti di pisello. Questo ha rivelato una progressione dei cambiamenti indotti che hanno incluso la regolazione verso il basso di molti geni dell’ospite prima in una zona ristretta dell’infezione e poi in una zona coincidente, ma più ristretta, dove altri geni ospiti (ad esempio hsp70, poliubiquitina) sono stati indotti in modo selettivo. Alcuni di questi cambiamenti erano simili ai cambiamenti indotti da stress a seguito di variazione di calore, ma un’analisi relativa dell’espressione del fattore di shock termico (hsf, acronimo di heat shock factor) ha mostrato che lo stress da calore e lo stress del virus utilizzano percorsi di controllo indipendenti. Questi effetti che portano a cambiamenti biochimici e l’espressione dei sintomi non sono stati studiati per i potyvirus. La natura transitoria della replicazione del virus e delle risposte dell’ospite osservate negli esperimenti PSbMV/pisello solleva interessanti domande circa le cellule adulte dietro il fronte dell’infezione. Queste cellule contengono quantità massicce di progenie virali che non mostrano più i cambiamenti indotti nell’espressione genica e possono essere suscettibili all'infezione da virus eterologi. Concettualmente, questo stato è equivalente alla latenza nelle infezioni da virus animali. Sembra possibile che questa condizione possa essere mantenuta da PTGS, che impedirebbe ulteriormente la replicazione ma non ha alcun effetto sul virus incapsulato. Il pool virale incapsulato fornisce un serbatoio per la stabilizzazione di una successiva infezione mediata da insetti vettori.

Trasmissione dei potyvirus. I potyviruses sono trasmessi da afidi e, in alcuni casi, da sementi, in modo non-persistente. I determinanti virali della trasmissione da parte degli afidi sono ormai ben noti. Sono stati ottenuti nuovi risultati anche per la trasmissione da parte di sementi. Trasmissione da parte degli afidi. La trasmissione da parte degli afidi dei potyviruses avviene con sondaggi brevi e superficiali delle piante. Due processi codificati da potyvirus sono coinvolti in questo processo: CP e HC-Pro. Nella maggior parte dei casi, una tripletta di aminoacidi conservata, Asp-Ala-Gly (DAG) nel terminale N della CP e complesso della lisina costituito da lisina-isoleucina-treonina-cisteina (KITC) situato all’interno del dominio HC-Pro ricco di cisteina all’interno del terminale-N è stato dimostrato essenziale per il successo di una trasmissione virale. Un altro motivo in HC-Pro, chiamato PTK (prolina-treonina-lisina), sembra anche necessario. Recenti esperimenti hanno confermato questo punto poiché i mutanti di Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), con la mutazione nel motivo PTK, non sono stati trasmessi dagli afidi. La trasmissione afidica dei potyvirus dipende dall’acquisizione di HC-Pro, prima o insieme al virus. Sulla base di queste osservazioni, è stato suggerito che HC-Pro possa fungere da ponte tra la CP del virione e un recettore putativo nell’apparato boccale dell’insetto vettore. Attraverso la microscopia elettronica di trasmissione e l’autoradiografia microscopica leggera, i virioni di TVMV sono stati rilevate nel canale alimentare dello stiletto degli afidi, ma non quando i domini DAG di CP e HC-Pro della lisina sono stati mutati. Evidenza diretta per la necessità di una specifica interazione tra CP e HC-Pro nella trasmissione di afidi è stata dimostrata in vitro nel legame tra la TVMV HC-Pro e un dominio di 7-aminoacidi che comprende il motivo DAG della CP di TVMV. Ulteriori studi con il dot-blotting, hanno mostrato un legame di HC-Pro con i virioni di ZYMV. Questo legame è stato osservato per molti potyvirus. Una buona correlazione tra l’efficienza della trasmissione da parte di afidi ed il legame HC-Pro/CP è stata anche dimostrata in tutti gli studi. Inoltre, i mutanti non trasmessi di ZYMV con un motivo PTK alterato non sono riusciti a legarsi ai virioni, suggerendo, in primo luogo, che il motivo PTK sia coinvolto in questo legame e, in secondo luogo, che l’interazione HC-Pro/virioni sia necessaria per trasmettere l‘infezione da ZYMV. Gli esperimenti più recenti puntano alla regione N-terminale di HC-Pro, incluso il motivo KITC, che sembra essere coinvolto nell’interazione con lo stiletto dell’apide. Tutti questi dati supportano un modello a “ponte” per la funzione di HC-Pro nella

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trasmissione da parte degli afidi, ma manca ancora la dimostrazione di un’interazione diretta di HC-Pro con un recettore nel distretto degli afidi. Il confronto delle combinazioni HC-Pro/vettori che differiscono nella loro capacità di trasmettere i potyvirus (ad esempio, con la specie afidica Myzus ascalonicus, che non trasmette virus), offre nuove opportunità per caratterizzare un recettore HC-Pro nel canale alimentare degli afidi. Trasmissione da parte dei semi. La trasmissione dei potyviruses operata dalle sementi è stata più ampiamente studiata per l’infezione causata da PSbMV del pisello, un’interazione in cui il virus infetta l’embrione immaturo, dopo la fecondazione, piuttosto che attraverso i gameti infetti. Questo meccanismo non è universalmente vero per tutti i potyvirus e alcuni di essi possono essere trasmessi da entrambi i percorsi contemporaneamente. Il fallimento di PSbMV nell’invasione del meristema di pisello potrebbe spiegare perché tale virus non è trasmesso attraverso il polline. Le limitazioni di tessuti precisi nella diffusione di infezioni causate dai potyvirus non sono state studiate. Per PSbMV, nei piselli, determinanti multipli virali e geni multipli espressi nei tessuti materni sembrano essere coinvolti nella determinazione del livello di trasmissione da parte dei semi. La costruzione di ibridi tra gli isolati DPD-1 (trasmissibili) e NY (non trasmissibili) di PSbMV ha localizzato i determinanti nelle regioni del genoma di NTR 5’, HC-Pro e CP. Queste regioni hanno mostrato di essere importanti nella replicazione e nel movimento del virus. Sulla base di un’analisi spaziale dell’accumulazione del virus durante il processo di trasmissione attraverso i semi, è stata proposta l’ipotesi che il virus sfrutti il sospensore embrionale per invadere l’embrione. Poiché il sospensore è una struttura programmata per degenerare all’inizio dello sviluppo, esso fornisce una finestra strutturale di opportunità al processo di trasmissione e potenzialmente potrebbe indicare perché l’efficienza del movimento virale (mediata direttamente o indirettamente da HC-Pro) potrebbe essere importante per l’invasione del seme immaturo e quindi per la trasmissione da parte delle sementi.

Resistenza naturale e ingegnerizzata. La resistenza non-ipersensibile a potyviruses può coinvolgere geni dominanti, incompletamente dominanti o recessivi, mentre la resistenza ipersensibile (HR) è controllata principalmente da singoli geni dominanti. Di tutti i geni di resistenza dei potyvirus noti, il 40% è recessivo. Questo dato è più elevato rispetto a quello di altri gruppi di virus, dove solo il 20% dei casi dà luogo alla resistenza dipendente dai geni recessivi. Mentre la base molecolare della ipersensibilità associata alla resistenza sembra avere caratteristiche comuni per una serie di ospiti e patogeni, poco si sa sulla natura dei geni di resistenza recessiva. Due ipotesi potrebbero spiegare il ruolo delle resistenze recessive: 1. l’ospite resistente manca di una funzione ospite essenziale per passaggi particolari nella

patogenesi virale e, di conseguenza, l’allele dominante codifica un fattore ospite, che è richiesto per replicare e/o spostare il virus nell’ospite suscettibile;

2. l’allele di suscettibilità codifica un regolatore negativo dominante di resistenza.

Il gene mlo recessivo, che conferisce resistenza alla peronospora dell’orzo, sembra adattarsi a quest’ultimo modello. Sono anche possibili scenari più complessi in cui l’effetto semplice o multiplo della dipendenza della dose del gene di resistenza potrebbe essere coinvolto, per cui i loci interagenti potrebbero controllare la resistenza.. Un esempio di resistenza poligenica recessiva, attiva nel peperone, contro diversi potyvirus, è stato recentemente riportato. In diversi studi, i geni di resistenza recessiva sono stati funzionalmente caratterizzati attraverso un’analisi del loro meccanismo di azione. La resistenza recessiva di Capsicum annuum legata ai geni ya e pvr3 ha dimostrato di limitare il movimento del virus Y della patata (PVY) e di Pepino

mosaic virus (PepMV), rispettivamente. Un’inibizione della replicazione di RNA di TEV, PepMoV e PSbMV è una caratteristica dei geni di resistenza recessiva di et

a di Capsicum annuum, di pvr1 di Capsicum chinense e di sbm-1 di Pisum

sativum, rispettivamente.

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Nel caso del gene di resistenza va di Nicotiana tabacum cv. TN 86, sembra che sia la replicazione del virus, sia il movimento di TVMV siano limitati. Meccanismi di resistenza associati a geni dominanti sono stati studiati anche in particolare nell’ambito dei geni per la resistenza alle malattie della patata. In Solanum brevidens e cultivars di patata estremamente resistenti, portando il gene di resistenza Rysto, il movimento dei potyviruses come PVY, PVA e TEV è stato bloccato dopo la replica iniziale ed il movimento ha innescato la risposta HR. Più semplice della clonazione dei geni di resistenza dell'ospite è l'identificazione del determinante avirulento virale. Attraverso l 'analisi di virus ibridi ricombinanti tra virulenti e avirulenti, sono stati fatti progressi per le interazioni PSbMV / sbm-1, TVMV / va e Soybean virus (SMV) / Rsv. Le determinanti di rottura della resistenza PSbMV per il gene sbm-1 sono state localizzate nel dominio di codifica VPg, più in particolare in un dominio centrale di 15 amminici della VPg. Allo stesso modo, la TVMV-S VPg è stata implicata in una resistenza mediata. Il ruolo importante per VPg nella replica virale di RNA potrebbe indicare una funzione associata ai prodotti del Va e della Sbm-1 alleli dominanti. L'interazione di VPg con il fattore di iniziazione traslatore eIF (iso) E fornisce almeno una funzione candidata, anche se il suo ruolo nella resistenza recessiva non è stato segnalato. SMV chimiche sono state fatte tra SMV-N e SMV-G7, ceppi che sono avirulenti e virulenti, rispettivamente, nelle piante di soia contenenti il dominante gene di resistenza Rsv. I determinanti di rottura della resistenza sono stati identificati nella regione 3 ¢ di HC-Pro e nella regione 5 'di domini codificanti P3. Tuttavia, le chimere con SMV-G7 Domini HC-Pro o P3 da soli non erano in grado di superare Rsv. Questo è probabilmente il primo esempio di un potyvirus per cui due determinanti di avirulenza sono necessari per superare un unico gene di resistenza. Un'altra spiegazione potrebbe essere che la rottura della resistenza è una risposta al RNA virale piuttosto che alle proteine virali. Anche se è troppo presto per sfruttare questa resistenza naturale dei geni con biotecnologia, è stato compiuto un notevole progresso nella generazione di resistenza derivata da patogeni attraverso l’espressione transgenica di sequenze di potyvirus quali le sequenze di VP1, P1, P3 e CI della proteina VPg, NIa e CP. La resistenza può essere considerata come un fallimento dell’infezione da stabilire (estrema resistenza) o un fenotipo di recupero in cui, dopo una fase iniziale di suscettibilità, le piante si riprendono e rimangono resistenti alla sfida successiva. In entrambi i casi, il meccanismo predominante è basato su PTGS, che si traduce in un degrado di mRNA nel transgene e di RNA virale nel citoplasma. Come questo meccanismo è innescato non è ancora chiaro, anche se è stato proposto che una molecola di segnalazione sistemica e la metilazione indotta di sequenze transgeniche omologhe possano essere coinvolti. Un conflitto da risolvere in futuro è capire come un virus che codifica un soppressore PTGS (HC-Pro) può aver resistito a un meccanismo basato su PTGS. Per un’estrema resistenza, questo può riflettere il degrado delle sequenze RNA omologhe prima dell’espressione di HC-Pro. La resistenza indotta nel fenotipo di recupero può riflettere la temporizzazione relativa dell'espressione HCPro e la segnalazione a distanza di PTGS in vista dell'infezione.

Produzione di linee di amplicone PPV-NK-GFP

Quando si lavora con le molecole, si usa solitamente non una sola molecola, ma miliardi e miliardi di molecole e l’ibridazione del DNA avviene in miliardi di luoghi simultaneamente e come risultato di tale reazione si producono ampliconi. Un amplicone è un pezzo di DNA o RNA che è la fonte e/o il prodotto di eventi di amplificazione naturale o artificiale o di replicazione. Può essere ottenuto utilizzando vari metodi, tra cui le reazioni a catena della polimerasi (PCR), le reazioni a catena della ligasi (LCR) o la duplicazione genica naturale. In questo contesto,

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“amplificazione” si riferisce alla produzione di una o più copie di un frammento genetico o sequenza bersaglio, in particolare l’amplicone. Come prodotto di una reazione di amplificazione, l’amplicone è usato in modo intercambiabile con termini comuni di laboratorio, come il prodotto di un’analisi PCR. La duplicazione genica, si ricorda, è la comparsa di due copie di uno stesso gene all’interno di un corredo cromosomico funzionalmente aploide. La duplicazione genica può ripetersi più volte, dando origine a un’intera famiglia di geni. Il fenomeno può risultare da una duplicazione dell’intero cromosoma sul quale era localizzato il gene originario, oppure da eventi più localizzati, per esempio, in conseguenza di un cattivo appaiamento dei cromosomi omologhi durante la profase della prima divisione meiotica. Successivamente alla duplicazione, le due copie del gene possono andare incontro a un’evoluzione indipendente. Soltanto una delle copie, spesso, conserva la funzione originaria, mentre l’altra si trasforma in uno pseudogene, perdendo la capacità di codificare una proteina. Per inciso, con il termine pseudogene si intende una sequenza di nucleotidi simile ad un gene (a livello di struttura), ma priva di alcuna espressione all’interno della cellula. Di solito si tratta di geni ancestrali che hanno perso la capacità di essere espressi. In altri casi, entrambe le copie del gene conservano il valore di sequenze codificanti, ma divergono progressivamente tra di loro, con due possibili risultati. Una delle due copie può conservare il significato funzionale che aveva in origine, mentre l’altra si evolve in un gene diverso, che codifica una nuova proteina con altro significato funzionale. Ritornando al discorso sull’amplicone, con riferimento specifico alla produzione di linee di amplicone PPV-NK-GFP, le piante di Nicotiana benthamiana sono state trasformate con la sequenza cDNA completa del potyvirus Plum pox virus (PPV) che trasporta la sequenza codificante della proteina fluorescente verde (GFP, acronimo di protein fluorescent green) come reporter, reperto del gene (PPV-NK-GFP, figura 2). La GFP è espressa dalla medusa Aequorea victoria che vive nelle acque dell’oceano Pacifico; essa assorbe radiazione UV dalla luce solare e la riemette come radiazione verde di minore energia. La proteina è stata largamente utilizzata negli ultimi decenni come marcatore per monitorare in tempo reale l’attività delle proteine e l’espressione dei geni all’interno di una cellula vivente. La scoperta di questa proteina e le sue applicazioni sono valse il premio Nobel per la Chimica a Osamu Shimomura, Martin Chalfie e Roger Yonchien Tsien nell’anno 2008. Lo sviluppo delle piante, l’accumulo virale e l’espressione di GFP sono notevolmente variabili tra i trasformanti primari. In particolare, due piante hanno manifestato sterilità e un’altra ha prodotto pochi semi, la maggior parte dei quali non era vitale. Semi di trasformanti fertili sono germinati in vitro ed il seme ottenuto è stato analizzato per l’espressione di GFP. È interessante notare che GFP è stato rilevato in soli due semenzali, ma nel resto delle altre linee fertili, l’accumulo di GFP è stato osservato solo in alcune piantine. Tuttavia, sebbene teoricamente tutte le cellule delle piante trasformate contengono il transgene virale nei semenzali dove l’espressione di GFP è stata osservata e questa non è uniforme nei cotiledoni e nelle foglie (figura 2B). I dati della segregazione della resistenza alla kanamicina delle diverse linee transgeniche sono compatibili con uno o due loci di inserimento, ma non è stata trovata alcuna correlazione tra i numeri dei loci ed i patterns di espressione di GFP. Le piante da alcune linee sono state trasferite nel terreno e coltivate in una camera di crescita. I modelli di espressione di GFP sono stati molto variabili, non solo tra linee, ma anche tra le piante all’interno della stessa linea. Alcune linee transgeniche hanno mostrato l’espressione più efficace dell'amplicone. Le piante provenienti da queste linee hanno accumulato alti livelli di virus in quanto germogliano, anche se in

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questo caso l’espressione di GFP non è stata distribuita uniformemente sui cotiledoni di ciascuna piantina e un’alta variabilità è stata osservata anche da piantina a piantina (figura 2B).

Figura 2 - Piante di amplicone di PPV-NK-GFP. Rappresentazione schematica di p35S-PPV-NK-GFP-NOSt. I box grigi rappresentano le sequenze di codifica delle proteine PPV indicate. Il box verde rappresenta il gene del reporter GFP clonato tra le sequenze di codifica NIb e CP. Le frecce nere indicano i siti di scissione della proteina. 35S: promotore del virus del mosaico del cavolfiore 35S. NOSt: terminatore del gene di sintasi nopalina (A). Piantine della generazione F1 delle diverse linee transgeniche PPV-NK-GFP monitorate per l’espressione di GFP sotto la luce UV (B).

Tuttavia, durante la crescita, tutte le piante delle linee scelte hanno mostrato sintomi di infezione che hanno causato gravi danni allo sviluppo, con persistenza per la vita completa della pianta (figura 3A). Questo modello di infezione è simile a quello di un’infezione normale causata da PPV-NK-GFP nelle piante selvatiche di Nicotiana benthamiana. In contrasto con la linea A, nessuna delle piantine della linea B ha espresso inizialmente GFP. Tuttavia, quando queste piantine sono state trasferite nel suolo, un certo numero di esse ha iniziato ad esprimere GFP dopo alcuni giorni di coltura. L’espressione dell’amplicone e la successiva infezione virale sembrano essere un evento stocastico nella linea e questo fenotipo è stato mantenuto in diversi progenitori F2 di questa linea. La prole di questo fenotipo (generazione F2) è stata utilizzata per i successivi esperimenti. Anche se l’induzione dell'amplicone è avvenuta in diverse piante, a giorni diversi dal trapianto (dpt), l’espressione di GFP ha sempre iniziato ad espandere le foglie secondo la naturale scadenza (figura 3C). Nelle prime foglie che esprimono

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l’amplicone, è stata rilevata la fluorescenza verde in focolai isolati, che non si sono sviluppati notevolmente. L’espressione di GFP si diffonde solitamente per coprire la base delle foglie appena in cima alla prima foglia che esprime GFP, mentre GFP è stato rilevato nell’intera lamina di foglie più giovani (figura 3B). Tuttavia, circa 10 giorni dopo la comparsa delle prime macchie fluorescenti verdi, le isole scure verdi tipiche del recupero virale sono state osservate in foglie di più recente sviluppo.L’induzione del fenotipo di recupero è stata confermata da ulteriore sviluppo di foglie che non hanno mostrato sintomi di infezione o espressione di GFP. A causa del pattern anormale dell’espressione osservata nella linea B, è stato focalizzato ulteriormente lo studio relativo a questa linea specifica.

Figura 3 - Modelli di espressione dell’amplicone PPV-NK-GFP in piante transgeniche rappresentate in A e B. Sono indicate le posizioni delle foglie (dal basso della pianta). Le immagini sono state prese sotto la luce UV a 42 dpt (A e foglie 8-10 di B) e 50 dpt (foglie 11-16 di B). La barra della scala è 0,5 cm. In C sono riepilogati i dati sull’avvio dell’espressione dell’amplicone nelle piante indicate in B. Le piante sono state classificate in diversi gruppi in base al loro numero di foglie all’epoca dell’espressione dell’amplicone. Le barre rappresentano la deviazione standard e la media delle posizioni delle prime foglie che esprimono GFP. Il numero di piante di ogni gruppo è mostrato sulla parte superiore delle barre.

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Accumulazione di siRNA virali-specifici nella linea di amplicone PPV-NK-GFP. Il silenziamento dell’RNA ha dimostrato di mediare la resistenza virale costituzionale e indotta dal virus derivata dai transgeni virali per reprimere l’espressione degli ampliconi virali. Allo scopo di valutare il possibile contributo del silenziamento dell’RNA alla repressione iniziale dell’espressione dell’amplicone e all’eventuale induzione del recupero virale nelle piante, è stata analizzata l’accumulazione di specifici siRNA del transgene virale, caratteristica principale dei processi di silenziamento dell’RNA. Si ricorda che il siRNA è un RNA interferente breve (small interfering RNA o short interfering

RNA) che rappresenta una classe di molecole di RNA a doppio filamento, lunghe tra 19-21 nucleotidi, in grado di svolgere numerosi ruoli biologici. RNA piccolo (o breve) interferente (siRNA) è lo strumento di RNA più diffuso (RNAi) per indurre la silenziosità a breve termine dei geni di codifica proteica. siRNA è un RNA doppio sintetico progettato per specificare un particolare mRNA per la degradazione. Mentre siRNA offre l’opportunità di indurre il silenziamento genico in una varietà di linee cellulari, la loro utilità è limitata a cellule che sono suscettibili di trasfezione di oligonucleotidi sintetici. Poiché i siRNAs ottengono un silenziamento transitorio, gli esperimenti sono limitati a tempi relativamente brevi nell’ordine di 2-4 giorni. I siRNAs possono anche essere usati per eliminare i geni non codificanti di proteine, come ad esempio RNA a lungo non codificanti (lncRNA). Si sa che all’interno di una cellula, le molecole di dsRNA vengono tagliate in piccoli frammenti chiamati siRNA (small interfering RNA) i quali sono in grado di riconoscere l’RNA messaggero complementare alla loro sequenza e di indurne la degradazione attraverso un complesso proteico, chiamato RISC. Successivamente, il silenziamento mediato da RNAi (RNA interference, negli animali; PTGS, Post-

Trascriptional Gene Silencing nelle piante), è stato riconosciuto come un processo naturale. Si è, infatti, scoperto che nelle cellule si trovano sia dsRNA sia piccoli frammenti tradotti da promotori specifici chiamati miRNA (microRNA), coinvolti nella regolazione di numerosi fenomeni cellulari. Si ricorda che l’RNA interference (dall’inglese interferenza dell'RNA, abbreviata comunemente come RNAi) è un meccanismo epigenetico mediante il quale alcuni frammenti di RNA sono in grado di interferire (e spegnere) l’espressione genica. Meccanismo attraverso il quale molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA, double-stranded RNA) innescano il processo di degradazione di RNA bersaglio contenenti sequenze complementari al dsRNA. Tuttavia, il termine RNAi (RNAi, interferance) oggi si riferisce a una serie di fenomeni guidati da molecole di dsRNA che controllano l’espressione dei geni sia a livello della trascrizione (per es., formazione di eterocromatina e metilazione del DNA) sia a livello postrascrizionale (degradazione di RNA messaggeri e inibizione della traduzione). Il meccanismo classico dell’RNAi è suddiviso in due fasi. Nella fase iniziale, lunghe molecole di dsRNA sono digerite dall’enzima Dicer che produce frammenti a doppia elica di circa 19÷26 nucleotidi chiamati piccoli RNA interferenti, siRNA (small interfering RNA). Una delle due eliche, chiamata elica guida, è incorporata in una proteina della famiglia Argonaute, battezzata Slicer, che possiede attività endonucleasica. Nella seconda fase dell’RNAi la proteina Argonaute/Slicer seleziona l’RNA bersaglio mediate formazione di legami idrogeno fra il siRNA guida e sequenze complementari presenti nell’RNA bersaglio. Una volta riconosciuto l’RNA bersaglio, la proteina Argonaute/Slicer lo taglia idrolizzando un singolo legame fosfodiesterico e producendo due frammenti che vengono poi digeriti da ribonucleasi citoplasmatiche. Nel caso di RNA messaggeri, la loro degradazione ha come conseguenza l’inibizione della traduzione di proteine specifiche. È importante notare, tuttavia, che il meccanismo di RNAi diminuisce l’espressione genica ma non l’abolisce. L’RNAi è diventato il metodo più comune per inibire l’espressione dei geni in organismi che, come i Mammiferi, sono difficili da manipolare geneticamente. Dal punto di vista biologico, si ritiene che l’RNAi si sia evoluto come meccanismo

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di difesa contro le infezioni virali e per mantenere la stabilità del genoma, riducendo l’espressione di elementi genetici mobili, come i trasposoni e i retroposoni. Per dimostrare l’accumulazione dei siRNA virali-specifici nella linea di amplicone PPV-NK-GFP, i semi delle piante selezionate sono stati messi a germinare in vitro e le piante risultanti sono state trapiantate e coltivate nel terreno. In questo particolare esperimento, 13 su 64 piante hanno sviluppato un’infezione da amplicone. I piccoli RNA sono stati estratti da tre tipi di foglie delle piante infette: foglie sotto la prima foglia che ha espresso GFP (R1); foglie sottoposte a infezione PPV-NK-GFP (G); e giovani foglie completamente recuperate (R3). I campioni equivalenti, R1, R2 (della stessa età delle foglei G) e R3, sono stati raccolti da piante che non mostravano i sintomi di infezione e che sono state mantenute in condizioni di crescita identiche (figura 4A). I piccoli campioni di RNA sono stati sottoposti ad analisi northen utilizzando sonde derivate dalla sequenza di codifica P1 o NIb di PPV (figura 4B). SiRNA specifici di PPV sono stati rilevati solo nei campioni da foglie esprimenti GFP (G). I siRNA virali non sono stati rilevati nelle foglie sviluppate prima dell’induzione dell'amplicone (R1) né nelle foglie superiori ricuperate (R3) delle piante infette. SiRNA virali non sono stati rilevati in nessuno dei campioni prelevati dalle piante di controllo non infette.

Figura 4 – Accumulo di siRNA nelle piante che hanno sviluppato un’infezione da

amplicone. Rappresentazione schematica dei due tipi di piante. Le foglie verdi e rosse indicano rispettivamente espressione e mancanza di espressione di GFP (A). L’RNA è stato estratto dai campioni di foglie indicati in A e sottoposto ad analisi northen blot con sonde corrispondenti alle sequenze di codifica NIb e P1 di PPV. Campioni di RNA ottenuti da pianta transgenica, che esprimono l’amplicone PPV-NK-GFP dalla germinazione e da piante selvatiche di Nicotiana benthamiana, manualmente infettate con PPV-NK-GFP (PPV-GFP) o non infettate (NI-wt ) sono stati i controlli (B).

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Effetto dei soppressori di silenziamento di RNA sull'espressione dell'amplicone PPV-NK-GFP

delle piante. L‘assenza di siRNA rilevabili nel tessuto delle piante selezionate che non stavano esprimendo l’amplicone di PPV, suggerivano che il silenziamento dell’RNA non fosse attivo in queste piante. Per confermare che il silenziamento dell’RNA non ha avuto un ruolo nella repressione dell’amplicone, le piante che non hanno mostrato segni di infezione di PPV-NK-GFP sono state infiltrate con colture di Agrobacterium tumefaciens che esprimono diversi soppressori di silenziamento virale. L'espressione del soppressore di silenziamento P1b (intatto o con un tag TAP N-terminale) dal Cucumber vein yellowing virus (CVYV) ha dato origine a alcune foglie alla fluorescenza GFP diffusa in tutto il tessuto infiltrato, con alcuni punti verdi più intensi di dispersione (figura 5A ). Solo macchie fluorescenti verdi sono state rilevate in altre foglie agroinfiltrate con questo soppressore di silenziamento (figura 5B) e in una bassa percentuale di foglie agroinfiltrate con i soppressori di silenziamento P19 del Tomato bush stunt virus, TBSV, (figura 5D) o P1-HCPro da Tobacco etch virus, TEV, (figura 5F). Tuttavia, la fluorescenza GFP non è stata rilevata nella maggior parte delle foglie che esprimono TBSV p19 o TEV P1-HCPro (figura 5C e 5E). TBSV P19 tendeva a provocare qualche fluorescenza di ingiallimento, probabilmente indicativa dell’induzione della necrosi (Fig. 5d). La comparsa della fluorescenza GFP è correlata con la rilevazione di GFP e CP di PPV, nella western analisi. La fluorescenza di GFP non è mai stata rilevata nei tessuti infiltrati con colture di Agrobacterium contenenti un vettore di controllo vuoto (figura 4G-H), indicando che l’induzione dell’amplicone è il risultato dell'espressione del soppressore di silenziamento.

Figura 5 - Effetto dei soppressori di silenziamento sulle piante. Tre foglie (posizioni 3-5 dal basso) sono state infiltrate con ceppi di Agrobacterium che esprimono diversi soppressori di silenziamento di RNA o con un Agrobacterium di controllo con un vettore vuoto. Altre due foglie infiltrate sono mostrate sotto luce UV 11 giorni dopo l’infiltrazione. L'area agroinfiltrata è contrassegnata da una linea bianca punteggiata. La scala della barra è di 0,5 cm.

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L’espressione sistemica dell’amplicone non sembra essere migliorata nelle piante agroinfiltrate con i soppressori di silenzia mento, rispetto alle piante agroinfiltrate con il vettore vuoto o non agroinfiltrate, suggerendo che la soppressione locale del silenziamento del RNA non è sufficiente a coadiuvare il PPV nei meccanismi di difesa ed impedire la diffusione degli ampliconi nelle piante.

Suscettibilità dell’amplicone delle piante PPV-NK-GFP all’infezione virale esogena.

Le piante hanno meccanismi di difesa che limitano l’espressione dell'amplicone transgene. Queste attività antivirali sono in grado di interferire con le infezioni esogene e influenzare l’espressione dell’amplicone endogeno di PPV. Le piante che non hanno mostrato segni di infezione da PPV-NK-GFP e le piante selvatiche di Nicotiana benthamiana sono state inoculate manualmente: 1. con il ceppo selvatico di PPV, 2. un secondo potyvirus, il Tobacco vein mottling virus (TVMV) un virus eterologo, 3. il cucumovirus Cucumber mosaic virus (CMV) , 4. o un ceppo virale non virulento. Tutte le piante inoculate con TVMV hanno sviluppato un’infezione sistemica. Le piante transgeniche selezionate non hanno mostrato una maggiore resistenza a CMV, anche se alcune piante selvatiche e alcune piante selezionate non erano infette, probabilmente come conseguenza di una bassa infettività dell’inoculo di CMV utilizzato. La mancanza di resistenza delle piante in selezione contro questi virus è stata confermata dall’analisi western (figura 6).

Figura 6 - Virus e GFP nel tipo selvatico e piante transgeniche di Nicotiana benthamiana inoculate con diversi virus. Estratti di foglie inoculate (inoc.), foglie immediatamente superiori a quelle inoculate (+ 1 foglia) e la quarta foglia sopra quelle inoculate (+ 4 foglie) di linee di piante transgeniche o tipi selvatici di Nicotiana benthamiana inoculate con PPV (A), TVMV (B) o CMV (C) che presentano (S) o non presentano (NS) sintomi dopo 18 giorni dall’inoculazione, sottoposti ad analisi western con gli anticorpi indicati (l’anticorpo TVMV reagisce anche con la CP di PPV). Sono stati analizzati una pianta inoculata della linea 10.6.1, che ha sviluppato un’infezione spontanea (S) ed un pool di tre di queste piante, che non ha mostrato sintomi di infezione derivata da amplicone (NS). Campioni di una pianta transgenica, che esprimono l’amplificazione PPV-NK-GFP dalla germinazione e di una sana pianta di Nicotiana benthamiana (wt Nb) sono stati utilizzati come controlli positivi e negativi. Le macchie ottenute con rosso di ponceau, che mostrano la proteina rubisco (enzima ribulosio-1,5-bifosfatocarbossilasi-ossigenasi), vengono presentate come controlli di caricamento.

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Al contrario, mentre tutte le piante selvatiche sono suscettibili all’infezione del tipo selvatico di PPV , solo 5 su 8 piante selezionate, inoculate con questo virus, hanno mostrato sintomi di malattia. La resistenza parziale di 10,6 piante a PPV è stata ulteriormente supportata dall’analisi western che mostra un accumulo minore di CP di PPV, nelle foglie inoculate e nelle foglie immediatamente superiori delle piante selezionate infette, rispetto alle piante selvatiche (figura 6). È interessante notare che questa resistenza sembra essere superata con il progresso dell’infezione, poiché i livelli di accumulo di PPV sono simili nella quarta foglia superiore a quelli inoculati delle piante selezionate e delle piante infette da virus selvatico (figura 6).

Movimento del virus da e verso il tessuto transgenico PPV-NK-GFP. Per ottenere la comprensione del passaggio dell’infezione, in corrispondenza del quale l’espressione sistemica dell’amplicone è impedita, sono stati effettuati innesti reciproci tra le piante selezionate e le piante selvatiche Nicotiana benthamiana.

Figura 7 - Movimento del virus dall’amplicone, tramite giunzioni di innesto. Gli innesti reciproci sono stati eseguiti con il tipo selvatico di Nicotiana benthamiana e piante transgeniche selezionate. Le foglie del portinnesto e del nesto di piante innestate, costituite da un nesto selvatico su un portinnesto (A) e da un nesto su un portinnesto selvatico, che sono state inoculate con PPV selvatico, dopo l’innesto, sono mostrate sotto luce UV (B); le figure sono state eseguite 22 (A) e 35 (B) giorni dopo l’innesto. L’unico punto rilevato di tracce GFP nel nesto di piante selezionate è indicato con una freccia. La giunzione dell’innesto delle piante R/Swt è anche visualizzata. Si noti che il GFP è visibile solo sulla parte del fusto del tipo selvatico e non nel transgenico. La barra di scala è 0,5 cm.

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Gli innesti di tipo I consistevano in un portainnesto selvatico ed in un tipo selvatico (abbreviato Rx/Swt, dove x è il numero della pianta selezionata). Gli innesti di tipo II consistevano in un substrato di tipo selvatico e in un nesto derivato dalle stesse piante impiegate per l’innesto reciproco di tipo I (abbreviazione Rwt/Sx). Nessuna delle piante ha espresso il GFP al momento dell’innesto. L'espressione dell’amplicone è stata osservata solo in due delle otto piante di innesto di tipo I (R1/wt e R11/Swt). Sorprendentemente, in queste piante innestate, i sintomi della malattia e la fluorescenza GFP sono stati rilevati nei nesti di tipo selvatico, quando ancora non esistevano segni di espressione dell’amplicone nei portinnesti transgenici (figura 7A). Uno di questi portinnesti (R1/Swt) ha mostrato GFP e sintomi di malattia nelle foglie dei rami laterali emergenti, in tempi successivi. GFP non è stato rilevato dall’analisi western nel tessuto del portinnesto che non ha mostrato la fluorescenza verde. Nel caso di R11/Swt, l’RNA virale è stato amplificato mediante IC-PCR ed una debole banda CP è stata rilevata in un’analisi western dal portinnesto asintomatico (figura 8). L’infezione è progredita nei nesti selvatici delle piante R1/Swt e R11/Swt in modo simile alle piante intatte di tipo selvatico e non ha recuperato dall’infezione derivata dall’amplicone. L'espressione dell’amplicone non è stata osservata in nessuna delle altre piante di innesto di tipo I ed i prodotti virali non sono stati rilevati mediante analisi western o IC-PCR (figura 8).

Figura 8 - Virus e accumulo di GFP nelle piante innestate. Estratti di sezioni di foglie dei nesti (S) e di portinnesti (R) delle piante innestate, costituite da un nesto selvatico su un portinnesto di piante selezionate o da nesto di piante selezionate su un portinnesto selvatico inoculato con PPV selvatico, dopo innesto, sono state sottoposte ad analisi western con anticorpi specifici (A), così come IC-PCR, ottenendo frammenti di cDNA di grandezza pari a 511 nt e 1.255 nt, per il tipo selvatico PPV e PPV-NK-GFP, rispettivamente (B). Nel caso della pianta R1/Swt, sono stati analizzati estratti da foglie del portinnesto che mostrava la fluorescenza da GFP (+GFP) o che non la mostrava (-GFP). Le foglie sono state campionate 39 giorni dopo l’innesto. Sono stati utilizzati campioni da una pianta transgenica della linea selezionata (10.1.7), che esprimono l’amplicone PPV-NK-GFP dalla germinazione e da piante selvatiche di Nicotiana benthamiana sane (wt Nb) o infettate con tipo selvatico PPV (con PPV). La colorazione con rosso ponceau mostra la proteina rubisco presentata come controlli di caricamento nelle analisi di blot western.

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I portinnesti selvatici di otto piante di tipo II innestate sono stati inoculati con un cDNA infettivo, per la sua lunghezza totale, del tipo virale selvatico PPV, 4 giorni dopo l’innesto (dpg). Quattro impianti (Rwt/S1, Rwt/S2, Rwt/S4 e Rwt/S10) hanno mostrato un’infezione causata da PPV selvatico nei portinnesti selvatici e due di essi (Rwt/S4 e Rwt/S10) hanno mostrato sintomi lievi da PPV, su poche foglie del nesto, che non si sono diffuse per tutto il resto della pianta. CP di PPV, ma non GFP, è stata rilevata con analisi western nei portinnesti e nesti che presentano sintomi (figura 8). Una banda di CP molto debole è stata rilevata all’analisi western e del nesto asintomatico della pianta Rwt/S2. Sebbene la coat protein (CP) di PPV non viene rilevata all’analisi western nella pianta asintomatica Rwt/S1 (figura 8A), un frammento diagnostico di RNA del tipo selvatico di PPV è stato amplificato mediante IC-PCR da questo nesto e anche lo stesso frammento è stato amplificato nei campioni sintomatici del portinnesto di questa pianta e dal segmento sintomatico di Rwt/S10 (Fig. 8B). Le quattro piante di tipo II innestate che non sono state infettate con la prima inoculazione di cDNA del PPV sono state reinoculate con un estratto greggio di foglie infette da PPV 25 dpg, quando ancora non mostravano prove di espressione dell'amplicone. Tre di essi (Rwt/S6, Rwt/S7 e Rwt/S22) somigliavano alle piante Rwt/S1 nel mostrare malattie e accumulo di CP solo nel substrato (figura 8A), sebbene un frammento di cDNA del tipo selvatico di PPV è stato amplificato sia dal portinnesto sintomatico che dal nesto asintomatico delle piante Rwt/S6 (figura 8B). La fluorescenza di GFP o l’accumulo di proteine GFP non sono state rilevate in nessuna di queste tre piante (figura 8A). In contrasto con il resto delle piante innestate di tipo II, le piante Rwt/S11 hanno sviluppato un'infezione derivata da amplicone, espressa da GFP, in giovani foglie del portinnesto selvatico, mostrando solo una piccola macchia di GFP, su una foglia del nesto transgenico (figura 7B). Grandi quantità di GFP e CP del virus PPV sono state rilevate dall'analisi western nel substrato sintomatico che ha espresso GFP, ma non nel nesto asintomatico di questa pianta (figura 8A). Un frammento di cDNA del tipo selvatico di PPV è stato amplificato da IC-PCR dal portinnesto della pianta Rwt/S11, mostrando che la pianta è coinfettata dal virus derivato dall'amplicone che esprime GFP e dal tipo selvatico esotico del virus PPV (figura 8B). L'IC-PCR degli estratti dal nesto asintomatico transgenico Rwt/S11 ha principalmente amplificato il frammento cDNA del virus derivato dall'amplicone, ma ha anche prodotto una quantità molto bassa del frammento del tipo selvatico di PPV (figura 8B), suggerendo che il virus esogeno potrebbe anche invadere il tessuto transgenico di questa pianta.

Prima di concludere questo capitolo sul genere Potyvirys si ricorda, circa la loro origine, che vi fosse stata una radiazione iniziale di potyvirus circa 7.250 anni fa. La radiazione iniziale ha dato luogo, in rapida successione, a cinque linee basali: 1. il supergruppo PVY (comprendente i gruppi BYMV, ChVMV, DaMV, PRSV, PVY, TEV e

TuMV); 2. il supergruppo CMV (comprendente i gruppi BCMV e BtMV e BRrMV), 3. il gruppo OYDV, 4. il gruppo SCMV, 5. il gruppo PSbMV.

Inclusioni cilindriche. I Potyvirus inducono la formazione di inclusioni cilindriche caratteristiche nel citoplasma delle cellule infette. La caratteristica più interessante di queste inclusioni, osservata in sezione sottile, è la presenza di un tubulo centrale da cui di irradiano bracci curvi per dare un effetto di ruota dentata. La ricostruzione da sezioni seriali mostra che le inclusioni consistono in una serie di piatti e rotoli curvi, con una sottostruttura finemente striata, con una periodicità di circa 5 nm. I fasci, i cilindri, i tubi e le ruote dentate in sezione sono aspetti di strutture geometriche complesse. La struttura generale è stata confermata dall'esame dei preparati congelati e dall'uso di una fase di inclinazione con geometria analitica assistita da computer. Per alcuni potyvirus, le inclusioni cilindriche sono strettamente curvi. Per altri sono più aperti. Le inclusioni indotte dai membri del gruppo possono differire coerentemente in vari dettagli.

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Studi con microscopia a scansione laser confocale mostrano che la struttura tridimensionale delle inclusioni citoplasmatiche di ZYMV è una struttura filamentosa, lineare, di spessore e lunghezza variabile. La lunghezza media varia da 9,4 ± 0,3 a 20,1 ± 0,4 µm e la larghezza media da 2,1 ± 0,1 a 3,7 ± 0,1 µm. Le inclusioni cilindriche originano e si sviluppano in associazione con la membrana plasmatica in siti che si trovano sopra i plasmodesmi. Il tubulo centrale del cerchio è posizionato direttamente sopra i plasmodesmi ed è associato al movimento intercellulare del virus. Il nucleo si estende nel citoplasma, mentre l’inclusione cresce. Più tardi nell’infezione, può diventare dissociato dai plasmodesmi e divenire libero nel citoplasma. Le particelle di virus possono essere intimamente associate con le braccia a ruota dentata in qualsiasi momento e in particolare nelle fasi iniziali dell’infezione.

Poli(A). I potyvirus sono poliadenilati ai loro terminali 3', ma il terminale 5' è attaccato ad un VPg. Il 5' UTR di TEV conferisce un potenziamento indipendente dalla copertura della traduzione dei geni del reporter, reperto, attraverso le interazioni tra il leader e la coda poli (A). In un’analisi di delezione della sequenza leader del nucleotide 143 di TEV, sono state identificate due CIRE centralizzati che promuovono la traduzione indipendente dal capside. Inserendo la sequenza di leader nella regione intercistonica di un costrutto bicistronico aumenta l'espressione del secondo cistrone, aumentando notevolmente anche l'incremento, con l'introduzione di una struttura stabile staminale a monte della sequenza leader del TEV. Si è concluso che i due elementi del leader TEV insieme promuovono l'iniziazione interna e che la funzione di un elemento è facilitata dalla prossimità al terminale 5'. Tuttavia, l'interazione della VPG potyvirali con fattori di iniziazione transazionale eucariotica aumenta la traduzione e concorre alla traduzione dell'hRNA dell'ospite. Proteinasi P1 dei Potyvirus. I potyvirus monopartiti hanno un genoma RNA a singolo filamento a senso positivo che vanno da 8,2 a circa 11 kb, che codifica un'enorme poliproteina di circa 350 kDa che viene elaborata mediante l'azione di proteine codificate virali (P1; HC-Pro; NIa-Pro) per generare i prodotti maturi. Inoltre, è stato descritto che una proteina virale incorporata nel terzo cistrone, è prodotta da un frameshift +2 (aspetti generali della famiglia Potyviridae sono stati recentemente riesaminati. La proteinasi P1 si trova vicino all'N-terminale della poliproteina virale ed è necessaria per l'elaborazione di un sito al proprio C-terminale. Prima della caratterizzazione della sua attività, il P1 è stato nominato principalmente per il suo peso molecolare o è stato identificato come la proteina N-terminale (NT). L'elaborazione tra P1 e HC-Pro è stata prima rilevata in piante transgeniche che esprimono frammenti di troncatura di poliproteine di Tabacco etch potyvirus (TEV). I polipeptidi elaborati sono stati rilevati in assenza di una funzionale proteina HC-Pro, suggerendo che un enzima alternativo fosse responsabile degli eventi di scissione in questo sito. L'attività della proteina P1 è stata ulteriormente caratterizzata dalla traslazione in vitro di trascrizioni TEV e Tobacco vein

mottling potyvirus (TVMV) in presenza di estratti di cariossidi di grano. La metà terminale C di P1 funge da dominio proteolitico e contiene i classici suoi residui conservati His, Asp e Ser conformi ai residui attivi di noti serine-proteinasi. Inoltre, la Ser catalitica si trova all'interno di un motivo Gly-Xaa-Ser-Gly conservato simile a quello delle proteine simili a chimotripsina.

Aspetti biologici della proteasi NIa dei Potyvirus. Alcuni potyviruses (TEV o PPV) inducono la formazione della proteina NIa nei nuclei, mentre ciò non accade per TVMV, TuMV o PStV. Tra i siti di scissione riconosciuti dalla proteasi NIa, i giunti tra P3 e 6K1, tra 6K1 e CI e tra NIb e CP sono noti per essere ceduti in trans, mentre i giunti tra CI e 6K2, tra 6K2 e NIa e tra NIa e NIb sono stati osservati per essere ceduti preferenzialmente in cis. La proteasi di TEV, NIa, si fende a Met218↓Ser219 per generare una proteasi troncata con un’attività fortemente diminuita. L'autoinattivazione della proteasi di NIa di TEV può essere una reazione intramolecolare che è facilitata da un'interazione allosterica tra molecole di proteasi. La proteasi di NIa di TuMV di 27 kDa si schiera a Ser223 ↓ Gly224 e a Thr207↓Ser208 per generare una proteina da 25 kDa (mancanza dei residui del C-terminale 20) o una proteina di 24 kDa (mancante dei residui del C-

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terminale 36), rispettivamente. La proteina troncata di 25 kDa di TuMV conserva un'attività specifica paragonabile a quella della proteina di tipo selvatico, mentre la proteina 24 kDa è inattiva. L'autoscissione della proteina NIa diTuMV 27 kDa, per generare la proteasi di 25 kDa, si è verificata più rapidamente a 25° C rispetto a 12° C. Trp211, Gly212 e Ile217 nella regione C-terminale di TuMV della proteasi di NIa sono dichiarati importanti per la scissione del nonapeptide rappresentante le sequenze di giunzione 6K1-CI e NIb-CP. Le analisi di eliminazione della regione C-terminale della proteasi di NIa TuMV hanno rivelato che almeno 217 aminoacidi dal N-terminale sono necessari per l'attività catalitica della proteina NIa. La fluorescenza intrinseca della proteina NIa di TuMV, in funzione della temperatura, indica che subisce un grande cambiamento conformazionale tra 2° e 42° C e una transizione drastica vicino a 45° C. La proteasi di NIa di TEV è stata dimostrata in possesso di attività di legame RNA, utilizzando macchie di RNA-blot e sondaggi di reticolazione UV. D'altra parte, la proteina NIa del Pepper vein banding virus (PVBV) non degrada in modo specifico il DNA a doppio filamento. Mn+2 era richiesto per l'attività di DNase, in comune con altre DNasi. Il residuo catalitico Asp81 è anche essenziale, ma non His46 o Cys151. L'accumulo di NIa proteasi negli organismi di inclusione nei nuclei durante la fase tardiva di infezione da cellule vegetali può essere importante per il degrado del DNA ospite. La proteina NIa del Turnip mosaic virus (TuMV) elabora la poliproteina con una preferenza per Val-Xaa-His-Gln ↓. La sequenza Val12-His-His-Gln15 si presenta vicino al sito di α-secretasi nel peptide β-amiloide (ABB) e la proteina di NIa abbina ABB in vitro in questo sito mediante analisi di spettrometria di massa. La sovraespressione della NIa proteasi nelle cellule di neuroblastoma B103 ha prolungato la vita cellulare quando ABB è stato generato o aggiunto intracellulare e l'espressione lentivirale di NIa nei topi transgenici ha ridotto i livelli di ABB e le placche nel cervello.

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