Por qué avanzar hacia la detección

MS/MS en las aplicaciones de

toxicología forense

Jaume C. Morales

MS Product Specialist

Agilent Technologies Spain

Octubre 2011

MAD/BCN

2

GC/MS QQQ ¿Qué es GC - MS/MS?

Esta técnica se está convirtiendo en la herramienta de análisis preferida en

el análisis de compuestos de interés en matrices complejas (restos de

incendio, sangre, plasma, etc…).

La técnica MS / MS es una técnica de espectrometría de masas altamente

selectiva, gracias a la cual los analitos se detectan con independencia de la

matriz de la muestra o interferencias coeluidas.

Con GC - MS/MS la matriz es virtualmente eliminada. Es ideal para el

análisis de compuestos de interés en diversas matrices como :

Complejas muestras ambientales

Plaguicidas en los alimentos

Metabolitos de drogas

Residuos de medicamentos en fluidos biológicos

y otras pruebas de trazas forenses.

3

GC/Triple Cuadrupolo Proporciona Alta

Sensibilidad y Selectividad para análisis complejos

Cuad. MS1 y

Post-Filtro

Celda de

Colisión

Pre-Filtro y Cuad.

MS2 Detector Fuente

EI/CI

7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases

¿Cómo funciona?

4

GC/MS QQQ Cómo funciona

Cuad. MS1 y

Post-Filtro

Celda de

Colisión

Pre-Filtro y Cuad.

MS2 Detector Fuente

EI/CI

7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases

Después de la separación por cromatografía de gases, los compuestos son

ionizados en la fuente de EI/CI.

El Cuad. MS1 opera seleccionando en primer lugar el Ion Precursor de elección

en la primera etapa de la MS/MS, que separa los iones del fondo químico de la

matriz.

GC/MS QQQ Cómo funciona

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Espectro con todo

lo ionizado en la

Fuente EI/CI Q1 deja pasar

solamente el

ión m/z 210

190 210

210

6

GC/MS QQQ Cómo funciona

Cuad. MS1 y

Post-Filtro

Celda de

Colisión

Pre-Filtro y Cuad.

MS2 Detector Fuente

EI/CI

7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases

Estos iones precursores seleccionados son entonces inducidos (RF) para

disociar por colisión con las moléculas de helio. La resultante es un espectro de

fragmentos único del producto que proporciona la confirmación del analito

objetivo.

GC/MS QQQ Cómo funciona

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Espectro con todo

lo ionizado en la

Fuente EI/CI Q1 deja pasar

solamente el

ión m/z 210

190 210

210

La Celda de

Colisión rompe

el ion m/z 210

en fragmentos

150 170 190 210

210 158

191

8

GC/MS QQQ Cómo funciona

Cuad. MS1 y

Post-Filtro

Celda de

Colisión

Pre-Filtro y Cuad.

MS2 Detector Fuente

EI/CI

7000 B MS/MS System Optimizado para cromatografía de gases

De los fragmentos iónicos, el Cuad.MS2 selecciona aquellos que son

característicos para cada analito tal como se ha programado en el método

dando lugar a las llamadas transiciones. El detector cuantifica éstos iones que

ha dejado pasar el Cuad. MS2

GC/MS QQQ Cómo funciona

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Espectro con todo

lo ionizado en la

Fuente EI/CI Q1 deja pasar

solamente el

ión m/z 210

190 210

210

La Celda de

Colisión rompe

el ion m/z 210

en fragmentos

150 170 190 210

210 158

191

Q3 sólo deja pasar

los fragmentos

característicos del

ion mz/ 210 :

158 y 191 para

cuant y cual.

160

158

190

191

no hay ruido químico

10

GC/MS QQQ

Mayor selectividad que en SIM

El aumento de la selectividad de MS/MS también se traduce en una mejora de

la relación señal / ruido, lo que permite niveles de detección más bajos.

Por otra parte GC-MS/MS proporciona una identificación inequívoca en los

casos en que los espectros GC/MS de los compuestos son difíciles de

interpretar.

Por lo tanto, incluso si la matriz contiene otro compuesto con la misma masa

que los iones de los padres para el analito de interés, es muy poco probable

que los iones de interferencia den el mismo espectro hijo que la sustancia

analizada, por lo tanto GC-MS/MS es más específica.

GC/MS QQQ Mayor selectividad que en SIM

Ion Analito

Precursor

Producto 1 Producto 3

Producto 2

EI-SIM Selectividad proporcional a

la resolución espectral

Sin selectividad para iones

con la misma m/z

EI-MS/MS Selectividad del precursor como SIM Alta probabilidad de que al menos un ión

fragmento sea único del analito y no de la

Interferencia interferencia

analito

interferencia

El ión precursor no debe utilizarse para cáculos

de ratios ni cuantificación

unit mass resolution

12

Scan Ion 315

Scan Ion 230

Scan Ion 70

SIM Ion 315

SIM Ion 316 SIM Ion 230

NPD

4.7 4.8 4.9 5.0

Respuesta MS y NPD de Oxycodone

en extracto de sangre por GC/NPD/MSD/DRS

9.55 9.6 9.65 9.7 9.75

MRM 315 -> 230.1

MRM 315 -> 258

MRM 230 -> 215.3

MRM 201 -> 186.1

La alta selectividad sobre las interferencias en la matriz de

sangre permite la confirmación con tres iones cualificadores en

~ 60 pg de Oxycodone en columna.

Respuesta GC/QQQ MS de Oxycodone

en el mismo extracto de sangre

¿Porqué GC/MS/MS?

Una imagen vale más que mil palabras …

GC/MS/MS QQQ MRM

GC/MS Single Quad SIM

EI 100fg HCB in “DIRTY”

Matrix

S/N: 116:1 RMS

100 fg HCB

MS SIM

MS/MS MRM

A chromatographer’s

dream: single peak on

flat baseline

¿Porqué GC/MS/MS?

Una imagen vale más que mil palabras …

GC/MS/MS QQQ MRM

GC/MS Single Quad SIM

EI 100fg HCB in Matriz

SUCIA

S/N: 116:1 RMS

100 fg HCB

MS SIM

MS/MS MRM

El sueño del analista:

Un pico en una linea de

base plana

SIM vs MRM para HCB

100 fg HCB in disolución acuosa

Sin

gle

MS

: S

IM 2

83.8

M

S/

MS

: 283.8

:213.9

S/N=37:1 RMS

S/N=26:1 RMS

Inyección de 100 fg de

Hexaclorobenzeno (HCB)

por SIM.

Inyección de 100 fg de

Hexaclorobenzeno (HCB)

por MRM.

Mismo orden de S/N !!!

SIM vs MRM para HCB

100 fg HCB in disolución acuosa 300 fg HCB en Diesel

Sin

gle

MS

: S

IM 2

83.8

M

S/

MS

: 283.8

:213.9

S/N=6:1 RMS

S/N=86:1 RMS S/N=37:1 RMS

S/N=26:1 RMS

La propuesta de Agilent : GCQQQ 7000B

Agilent aprovecha la mejor tecnología del líder en el mercado de GC/MS, la serie 597X :

– Cuadrupolos monolíticos de cuarzo, recubiertos de oro y calefactados

– Demostrado diseño y rendimiento de fuente EI/CI

– AUTOTUNE

Así como de la serie LC/QQQ 64XX :

– Celda de colisión con aceleración lineal

– Optica iónica de filtrado QQQ

– Mass Hunter software

7000B GCQQQ Diseño basado en el rendimiento y la robustez de la aplicación Niveles de sensibilidad de femtogramos en columna y MRM de alta velocidad accesibles para un amplio rango de usuarios

– Sensibilidad: 100 fg OFN a 500:1 RMS S/N

– Alto rendimiento SRM (MRM) con hasta 500 transiciones/s

– Celda de colisión hexapolar patentada

– Cuadrupolos de cuarzo recubiertos de oro para una segura operación en rutina

– Agilent 7890 GC con Tecnología de Flujo Capilar

– MassHunter Software

Agilent 7000B Triple Quadrupole GC/MS Gold Plated Hyperbolic Quartz Quadrupole

230°C

275°C

300°C

325°C

350°C

Sensibilidad. Fuente iónica a alta temperatura

Respuestas mejoradas para un amplio rango de compuestos

– Operación más robusta para matrices sucias

– Mejor respuesta para compuestos con “tailing”

– Picos más estrechos para compuestos de alto punto de ebullición

Diseño óptimo para el rendimiento de la fuente. El rendimiento de la lente

de entrada elimina la necesidad del pre-filtro

Problemas de la fuente de ionización en GC-MS: Contaminación en las zonas frías

Moléculas neutras a alta temperatura provenientes del GC se “pegan” a las partes frías de la fuente. La presencia de iones Helio ayudan a que estos iones se “peguen” a esas partes frías

Contaminacion de partes “frías” de la fuente (frío ≈ 200ºC)

Contaminacion de un analizador “frío”

Rods del cuadrupolo < 100ºC

- Capacidad de programación de temperatura Hot/cold S/SL (pulsed mode), temperature programmed vaporization (PTV), solvent vent.

- Flexibilidad en los volúmenes de inyección Análisis de muestras termolábiles y mínima discriminación en la inyección para compuestos con alto peso molecular

- Mayor sensibilidad en inyecciones de gran volumen

- Compatibilidad con Tecnología de flujo Capilar Venteo de disolventes y uso de Backflush

- Totalmente integrado con Chemstation, EZChrom y MassHunter

Inyector Multimodo MMI

Ambient In-vial Small-Volume Derivatization Dilution Internal Standard Heating/Mixing Headspace Extraction Sampling Addition Bar Code

GC/QQQ Analyzer

Inert, high

temp source (same as 5975)

Triple-Axis

detector (same

as 5975)

Two gold plated quartz,

hyperbolic analyzers (same as 5975)

GC/QQQ Analyzer

Shown with shields for

analyzers and collision cell

New high performance,

hexapole collision cell

with patent technology

Edwards

Split Flow Turbo

Analyzer Details

Hinges

Collision cell cradle

September, Pag

Analyzer Doors Open

Triple-Axis

Detector

Inert, 350ºC

Source

Collision Cell Details

Quadrupole post-

filter

Quadrupole pre-

filter

Support cradle

(Cell housing and 2 rods removed for clarity)

Sensibilidad. Celda de colisión con gas de quenching

Celda de Colisión

Entrada Precursor He* +

Disociación por colisión

1 ml/min N2 Gas Colisión

La transmisión de helio metastable

hacia el detector se reduce de modo

notable. Además el TAD reduce aún más el ruido de

neutros

Fuente Detector

Cuadrupolo Cuadrupolo

He Buffer Gas

He* + He → 2 He + Q

Salida Producto

+ He*

Efecto del “Helium Quench”

S/N 341:1 Helium Quench Gas OFF

tested with

hexachlorobenzene

Efecto del “Helium Quench”

S/N 1294:1 Helium Quench Gas ON

S/N 341:1 Helium Quench Gas OFF

Almost 4 X

Increase in S/N

Efecto del “Helium Quench”

Noise Comparison

S/N 1294:1 Helium Quench Gas ON

S/N 341:1 Helium Quench Gas OFF

tested with

hexachlorobenzene

The increase in

S/N was due to

reduction of noise.

High Performance Triple-Axis Detector

Ultra low neutrals noise

Long life and high linearity

“Gain Normalization” corrects tune file for detector aging to

allow repeatable long term method sensitivity

Same design as used in the 5975C GC/MSD

Triple-Axis Detector

hyperbolic quartz

transmission

quadrupole

analyzer

triple channel

electron

multiplier

high energy

dynode

steering rod

ion beam

X

Y

Offset

Z shield for

secondary

particles

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

495 500 505 510

MS2 502 Peak Shape

• Formas de pico mejoradas a alta masa

• Sensibilidad mejorada a masas

medias/altas

Mass Iris (V) Signal

Increase

69 -1 1.0X

131 -8 1.1X

264 -13 1.5X

414 -20 2.5X

502 -30 2.8X

614 -35 4.0X

Sensibilidad. Ramped Detector Iris

Backflush Tecnología de Flujo Capilar

S/SL Inlet

Capillary Flow Device

2 psi

60 psi

Detector/es

Split Vent

Durante GC Run

Después GC Run

S/SL Inlet

Capillary Flow Device

25 psi

4 psi

Detector/es

Aux EPC Split Vent

Aux EPC

Backflush al final de cada inyección

Backflush 20 sec Flujo

Backflush 30 sec Flujo

Backflush 40 sec Flujo

Backflush 60 sec Flujo

Columna Inlet

Fin del run Flujo

La finalidad es eliminar componentes pesados al final de cada inyección

Sin opción de backflush Un problema serio

Abundance

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 0

2000000

4000000 6000000

8000000 1e+07

1.2e+07 1.4e+07

1.6e+07 1.8e+07 2e+07

2.2e+07 2.4e+07

2.6e+07 2.8e+07

3e+07 3.2e+07

3.4e+07 3.6e+07

3.8e+07 4e+07

4.2e+07 4.4e+07

4.6e+07

Time

B

A

Superposición de dos cromatogramas correspondientes a un blanco inyectado antes y después de una secuencia de tres

inyecciones sin BACKFLUSH

Tras solo 3 muestras, el fondo es claramente mayor debido al

aumento de ruido quimico a nivel espectral

Con opción de backflush Sin incrementos de fondo y RTs repetitivos

Tiempos de retención totalmente estables y línea de base casi libre de ruido químico

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 0

2000000

4000000

6000000

8000000

1e+07

1.2e+07

1.4e+07

1.6e+07

1.8e+07

2e+07

2.2e+07

2.4e+07

2.6e+07

2.8e+07

3e+07

3.2e+07

3.4e+07

3.6e+07

3.8e+07

4e+07

4.2e+07

4.4e+07

4.6e+07

Time

Abundance

Superposición de dos cromatogramas correspondientes a un blanco inyectado antes y después de una secuencia de tres inyecciones con BACKFLUSH

Nueva Purged Ultimate Union. Modo Analítico

Venteo

Presión / Control

de Flujo

15-m HP-5ms

(0.25mm id x0.25um)

15-m HP-5ms

(0.25mm id x0.25um)

Dispositivo

de Flujo

Capilar

5975C MSD

EI mode

7890A GC

Split/Splitless Puerto

de Inyección

Y ml/min

Y+Z ml/min

Z ml/min

Pueden usarse columnas de fases y dimensiones diferentes

Purged

Ultimate

Union

Reproducibilidad* en RT para Trifluralin en 100 Inyecciones, 3 minutos backflush. Secuencia de 21 horas

Min 6.070

Max 6.075

Mean 6.073

Std Devn 0.00186

% RSD 0.0306 RT (mins)

* Agilent 2x RTL Pesticide Method

5.950

5.970

5.990

6.010

6.030

6.050

6.070

6.090

6.110

6.130

6.150

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 Injection Number

P1

5-20E-5 Torr

P2

8E-5 Torr

Rough Pump

He or H2 (1-8 sccm)

CH4 (0-2 sccm)

Edwards

Split Flow Turbo

Collision Cell

N2

Source Analyzer

High Performance Differentially Pumped

Manifold

Herramientas para optimización automatizada con MassHunter

Proporcionar una serie de herramientas que asisten al usuario en la CREACION y OPTIMIZACION del método de adquisición MS/MS

Dynamic MRM para GC/MS es una parte del flujo de trabajo que incluye la generacion del método (basado en RTs/transiciones conocidas y LA OPTIMIZACION DE LOS PARÁMETROS DE ADQUISICIÓN MRM

Design Experiments Assistant Analyze Experiments Assistant DynamicMRM Assistant

- MassHunter Quant - MassHunter Qual - Microsoft Excel ©

Herramientas de optimización. ¿Generación manual de segmentos?

Zonas de baja densidad de picos permiten una division manual sencilla

En zonas de gran densidad de compuestos es casi imposible. Problema

clásico del campo de residuos

¿Como funciona Dynamic MRM para GC/MS a la hora de optimizar métodos MS/MS?

Dynamic MRM optimiza scan cycle time, dwell times, y el orden de adquisición (generación automatizada de segmentos) para conseguir:

1. Maxima señal

2. Mínimo ruido

3. %RSD bajas

4. La mayor velocidad de análisis

5. La mayor robustez en el método La aproximación tiene en cuenta la integración de picos y el ruido de línea de base en el proceso de optimización del valor de dwell time.

Comparación DynamicMRM vs. Tradicional 250 ppb, 123 compuestos, 298 transiciones

Original

17 segmentos

Dynamic MRM

60 segmentos

Resultados: %RSD Comparación CompoundName

Expert-optimized

RSD

Dynamic MRM

RSD Improved?

Acetochlor 1.4 1.2 Y

Aclonifen 15.7 12.4 Y

Alachlor 2.4 0.8 Y

Allethrin 16.8 11.2 Y

Ancymidol 7.5 7.1 Y

Azaconazole 5.3 4.6 Y

Azinphos-methyl 71.1 25.3 Y

Benfuracarb 14.1 7.4 Y

Benodanil 10.1 8.8 Y

Benzoylprop ethyl 2.7 3.6

Biphenyl 11.6 9.7 Y

Bromacil 19.7 15.2 Y

Bromocyclen 8.1 6.0 Y

Bromopropylate 10.4 11.6

Bromuconazole I 6.1 5.7 Y

Bromuconazole II 5.7 5.7 Y

Buprofezin 6.2 6.1 Y

Butachlor 8.7 8.3 Y

Butralin 16.8 15.7 Y

Captafol 44.7 46.6

Carbofuran 68.3 57.1 Y

…. … …

Average %RSD 11.1 9.3

RSD Std Dev. 12.0 8.8

1. dMRM proporciona un RSD medio 15% menor que el método tradicional 2. La distribución de %RSD es notablemente menor

La ventaja más importante de todas

es el TIEMPO INVERTIDO

POR EL USUARIO.

Notablemente menos en el caso de dMRM

Detección de anómalos

1. Más de 20 criterios posibles

2. Tolerancias establecidas en el método de análisis

3. Avisos & Herramientas de filtrado

4. Report de Anómalos

Batch-at-a-Glance Comprobación de tolerancias para transiciones cualificadoras

Tolerancias definidas

Batch-at-a-Glance Navegación + Informacion

Análisis de Esteroides en Orina por GC/QQQ

Sports Doping

Investigación para la sustitución de un sistema de GC/HRMS por un sistema GC/QQQ

Sample Results: Clenbuterol (9.3 min)

Blank

25pg/ml (higher than

blank) 250pg/ml

Ions LOD

GC/MS 335(t) 337 86 500pg/ml

GC/MS/MS 335 -> 300, 262, 227(t) 30pg/ml*

GC/HRMS 335 337 30pg/ml

*Could detect down to 25 pg/ml but was present in blank.

Methandienone M1: (12.6 Min)

Blank

25 pg/ml

625 pg/ml

Ions LOD

GC/MS 358(t) 143 1000 pg/ml

GC/MS/MS 358 ->301(t) 196, 169 25 pg/ml

GC/HRMS 358 130 pg/ml

Notas de aplicación recientes

5990-7234EN

Fast and Comprehensive Doping Agent Screening in Urine by Triple

Quadrupole GC/MS

5990-7535EN

Rapid, Robust and Sensitive Detection of 11-nor-∆9-

Tetrahydrocannabinol-9-Carboxylic Acid in Hair

5990-6577EN

Separation of Oxymorphone and Oxycodone Hydroxyl-imino Tri-methy

Silyl Derivatives Using an Agilent Fast Toxicology Analyzer and an

Agilent J&W DB-35ms Ultra Inert Capillary GC Column

5990-5748EN

Longterm Detection of Anabolic Steroid Metabolites in Urine

Ejemplo

Rapid, Robust and Sensitive Detection of 11-nor-∆9-Tetrahydrocannabinol-

9-Carboxylic Acid in Hair

LOD of 0.002 pg/mg

0.01 pg/mg LOQ

Figure 3. MRM traces for the quantifying transition (left) and

both the quantifying and qualifying transitions (right) for the

0.002 pg/mg LOD of THCA (upper panel) and the deuterated

standard (lower panel) spiked into a hair sample. Figure 5. MRM traces for the quantifying transition (left) and

both the quantifying and qualifying transitions (right) for the

0.01 pg/mg LOQ of THCA (upper panel) and the deuterated

standard (lower panel) spiked into a hair sample.

Gracias por su

atención

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Jaume C. Morales

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901.11.68.90

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