TECNOLOGA QUMICA Vol. XXVIII, No. 1, 200880

POLIGALACTURONASAS DE LEVADURAS: UN PRODUCTOBIOTECNOLGICO DE GRANDES POTENCIALIDADES

Odalys Rodriguez Gmez, Manuel Serrat DazCentro de Estudios de Biotecnologa Industrial, Universidad de Oriente

Las pectinasas microbianas son de gran inters comercial, y tienen mltiples aplicaciones en laindustria de alimentos, fundamentalmente, en el procesamiento de frutas y vegetales. Actualmente,las enzimas pcticas para uso comercial se producen a partir del hongo Aspergillus nger. Estaspreparaciones comerciales estn compuestas por una mezcla compleja de diferentes enzimas conactividad pectinoltica, y otras enzimas no pcticas con efectos indeseables. En este sentido, lospreparados enzimticos de poligalacturonasas de levaduras pudieran ser una excelente alterna-tiva. En este trabajo, se tratan algunas de las cuestiones ms importantes relacionadas con lasenzimas pcticas, y particularmente con las poligalacturonasas. Se aborda su produccinmicrobiana, sus potencialidades y sus principales aplicaciones.Palabras clave: pectinasas, poligalacturonasas, levaduras, enzimas pectinolticas.

Microbial pectinases are of commercial interest and they are used in many industrial foodapplications, particularly in fruit and vegetable processing. Until now the main source of pecticenzymes for industrial use is the mold Aspergillus nger. These commercial preparations of fungalorigin contain a complex mixture of differents enzymes with pectinolytic activity and other non-pectic enzymes with no suitable effect. In this sense, yeast polygalaturonases could offer a goodalternative to fungal enzymic preparations. This work is about some more important questionsrelated with pectic enzymes, particularly polygalacturonases. Microbial production, potentialitiesand principal applications are deatt.Key words: pectinases, polygalacturonases, yeast, pectinolitic enzyme.

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Introduccin

Las enzimas producidas por los microorganismospueden ser un producto deseado.

Cada organismo produce una gran variedad deenzimas, la mayora de las cuales estninvolucradas en procesos celulares. Sin embargo,ciertas enzimas son producidas en cantidadesmayores para luego ser excretadas al medio don-de tienen, entre otras, la funcin de digerirnutrientes insolubles, tales como celulosa, almi-dn y pectina. /1/

Algunas de estas enzimas extracelulares seproducen en grandes cantidades por sntesismicrobiana para ser utilizadas en la industria dealimentos, farmacutica y textil. Entre las enzimasde mayor aplicacin industrial se encuentran lasenzimas pcticas o pectinasas. /2/

Las pectinasas microbianas cuentan con el25 % de la venta global de enzimas para ali-mentos /3/, y son particularmente importantesen el procesamiento de productos agrcolas.

Intervienen en los procesos de extraccin, cla-rificacin y macerado de frutas y vegetales,degradando la molcula de pectina. /4/

La pectina es un polisacrido de estructuracompleja, cuya modificacin o completa degrada-cin requiere de la participacin de diferentesenzimas. Entre ellas se encuentran las esterasasy las depolimerasas, estas ltimas se clasificansegn su mecanismo de accin en hidrolasas yliasas. /5/ Dentro de las hidrolasas se encuentranlas poligalacturonasas, que son las encargadas depromover la ruptura de la molcula de pectinamediante un ataque a la cadena principal depoligalacturonano. /6,7/

Hasta el presente, la totalidad de las pectinasasque se comercializan se producen a partir dehongos, pero su produccin por levaduras consti-tuye una opcin a la que se viene prestandoespecial atencin en los ltimos aos, pues a pesarde que su productividad se considera baja /8/,presentan mayor velocidad de crecimiento y es-tructura unicelular, cualidades que le confierenimportantes ventajas respecto a los hongos para

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el cultivo sumergido a gran escala. Otra excelen-cia de las levaduras es que slo producenendopoligalacturonasas, a diferencia de los hon-gos, los cuales originan una compleja mezcla deenzimas pcticas y otras carbohidrasas. /9/

Recientemente, se ha demostrado que losoligmeros de pectina con grado de polimerizacinentre 9 y 16, presentan actividad biolgica(reguladora) en plantas, y prometen ser de granutilidad en la agricultura /10/. Tambin se lesatribuye actividad benfica sobre lasbfidobacterias (valor prebitico), y constituyenuna importante fuente de fibras dietticas /11/.Los prebiticos combinan los efectos estimulan-tes, tanto de la flora bacteriana endgena como delos probiticos (nuevos microorganismos) incor-porados habitualmente en alimentos vegetalescon mnimo grado de procesamiento, y represen-tan las perspectivas de las tendencias futuras dela biotecnologa alimentaria en el mercado deproductos vegetales /4,12/. En la medida que seconozcan con ms profundidad las propiedadesde los oligogalacturnidos, el uso de preparacio-nes de poligalacturonasas purificadas ser nece-sario para las producciones a gran escala envariados campos de aplicacin. /7/

Por todo lo anterior, en este trabajo se descri-birn algunas de las principales caractersticas delas enzimas poligalacturonasas, su produccinmicrobiana y sus aplicaciones.

Desarrollo

Sustancias pcticas. Localizacin yestructura de la pectina

Las sustancias pcticas constituyen un grupode polisacridos ricos en cido galacturnico y, enmenor medida, ramnosa, arabinosa y galactosa.Forman parte de los polisacridos estructuralesde los tejidos vegetales, los cuales constituyenhasta el 90 % de la pared celular de las plantas, yse pueden dividir en tres grupos: celulosa,hemicelulosa y pectina. /5/ La pectina se encuen-tra en todos los vegetales superiores en cantida-des variables, y se localiza en la lmina media, la

capa intercelular aglutinante y en la pared prima-ria celular de las plantas. La principal funcinbiolgica de estas sustancias es de carcter es-tructural, y su grado de esterificacin vara enfuncin del vegetal del cual la sustancia pctica esextrada: la pectina de manzana presenta un gradode esterificacin de un 8090 % y la pectinactrica se sita entre el 4560 %. La sntesis de lassustancias pcticas ocurre durante los estadiosiniciales de desarrollo de la fruta, y su concentra-cin vara de acuerdo con el tipo y la variedad desta. La mayora de las frutas, excepto los ctri-cos, presentan una concentracin de pectina en-tre 0,5 y 1,0 %. /13/

Tabla 1Contenido de pectina en algunas frutas

Frutas Pectina (%) Melocotn 0,1-0,9 Mango 0,6-0,7 Uva 0,2-1,0 Pera 0,5-0,8 Pltano 0,7-1,2 Manzana 0,5-1,6 Fresa 0,6-0,7 Cereza 0,2-0,5

Estructura de la pectina

Las pectinas son heteropolisacridos comple-jos, los cuales presentan dos regiones diferentesbien definidas. Las regiones lisas consisten enun esqueleto formado por residuos de cido D-galacturnico unidos por enlaces -1,4 glicosdicos,que forman cadenas de homogalacturonano, loscuales pueden estar acetilados en el O-2 o en elO-3, o metilados en el O-6. Constituyen la frac-cin principal de la molcula de pectina.

Esta estructura alterna con regiones ramificadaspeludas, en las cuales se identifican dos estructu-ras diferentes, un xylogalacturonano, que consisteen un esqueleto de galacturonano sustituido con D-xilosa y el ramnogalacturonano I. En elramnogalacturonano I, los residuos de cido D-galacturnico en el esqueleto estn interrumpidospor residuos de L-ramnosa unidos por enlaces -1,2glicosdicos, a los cuales pueden estar atadas largas

Fuente: /3/

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Fig. 1 Regin lisa de la pectina.

cadenas de arabinano y galactano por el O-4. Tam-bin contiene grupos acetilo esterificando los O-2 y

O-3, de los residuos de cido galacturnico delesqueleto /5/.

Fig. 2 Regin peluda de la pectina.

Por su grado de pol imer izac in yesterificacin, las sustancias pcticas se clasi-fican en protopectinas, un precursor de lassustancias pcticas insoluble en agua y alta-mente esterificado y polimerizado; los cidospectnicos (pectinatos), se les llama as a loscidos poligalacturnicos que tienen una pe-quea porcin de grupos metilo; y los cidos

pc t icos (pec ta tos ) que son c idospoligalacturnicos libres de grupos metilo. Aten-diendo nicamente al contenido en metoxilo, seles considera pectina de alto metoxilo (HM) siel grado de esterificacin es superior al 50 %;por el contrario, las pectinas de bajo metoxilo(LM) tienen un grado de esterificacin igual omenor al 50 %. /14/

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a)

b)

Fig. 3 Clasificacin de la pectina de acuerdo con el contenido de metoxilo: a) pectina HM b) pectina LM.

Enzimas pcticas. Generalidades

Bajo esta denominacin se agrupan aquellasenzimas que tienen a las sustancias pcticascomo sustratos naturales. Estas enzimas desem-pean un importante rol en la maduracin de losfrutos, por este motivo se han desarrollado variasaplicaciones industriales de las mismas. /9/

Las diferencias estructurales entre la cade-na principal de las regiones lisas y peludasde la pectina tienen implicaciones para lasenzimas involucradas en la degradacin deestas regiones. /5/

De acuerdo con su mecanismo de accin, pue-den ser clasificadas en esterasas, depolimerasaseliminativos (liasas) y las depolimerasas hidrolticas(poligalacturonasas). La pectina esterasa cataliza lahidrlisis de los grupos ester carboxlicos metiladosde la pectina en cido pctico y metanol. La pectinaliasa corta los enlaces -1,4 glicosdicos por unmecanismo de -eliminacin (transeliminacin), for-mando en el galacturnido un doble enlace entre loscarbonos 4 y 5 en el extremo no reductor. Lasendopoligalacturonasas realizan una hidrlisisrandomizada del polmetro, mientras que lasexopoligalacturonasas actan secuencialmente porel extremo no reductor. /5, 15/

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Fig. 4 Mecanismo de accin de las distintas pectinasas.

Poligalacturonasas

Los hongos saprofticos y fitopatgenos y bacte-rias fitopatgenas producen una gran cantidad deenzimas, capaces de degradar las complejas estruc-turas de carbohidratos presentes en la pared celularde las plantas. Son muchas las enzimas involucradasen el rompimiento de la pectina: pectina metilesterasas, pectina y ramnogalacturonanoacetilesterasas, pectato, pectina yramnogalacturonano liasas, ramnogalacturonanohidrolasas y poligalacturonasas. /16/

Las enzimas poligalacturonasas [poli(1,4--D-galacturonido)] glicanohidrolasa hidrolizan los enla-ces -1,4 glicosdicos entre residuos de cido D-galacturnico adyacentes, y actan especficamenteen el homogalacturonano o en las partes lisas dela molcula de pectina /16/. Su ataque ocurre al azar,promoviendo una rpida disminucin del pesomolecular de la pectina (25-360 kDa) con unamnima liberacin de extremos reductores. /2/

Son la clase ms abundante y estudiada deenzimas pcticas, encontrndose ampliamente dis-tribuidas en plantas y microorganismos.

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Funcin biolgica

Estudios realizados en hongos fitopatgenos hanpermitido describir los genes PG de un gran nmerode ellos. En la mayora de los casos, los anlisisgenticos revelan la existencia de verdaderas fami-lias de estos genes, lo que ha permitido esclareceralgunas de sus funciones biolgicas: en Aspergillusflavus; los genes PG se inducen en medios quecontienen pectina, no ocurriendo as en presencia deglucosa. La endoPG en Fusarium oxysporum esttambin regulada a nivel transcripcional. Es inducidapor tejido vascular de tomate y pectina ctrica, y seexpresa tambin en tejidos vivos infectados. Lostranscritos se han detectado tambin durante lapatognesis en Colletotrichum lindemuthiamun;adems, se ha observado que la activacintranscripcional ocurre rpidamente cuando el hongoentra al estado parastico. Estos hallazgos apoyan latesis de que las endoPG participan en la penetracindel hospedero por la degradacin de la capa depectina. La induccin es slo detectada durante lainfeccin de la planta hospedera en algunos hongos,mientras que la PG constitutiva ha sido descrita enA. parasiticus. /11/

En el caso de bacterias fitopatgenas como Erwiniacarotovora, tambin se ha estudiado intensamente elpapel de los genes PG en la patognesis. /17,18/

A estas enzimas se les atribuyen numerosasfunciones en plantas. Se considera que estn

asociadas a los procesos de abscisin de rganos/19,20/, apertura de vainas y anteras /21/, madu-racin de los granos de polen, crecimiento del tubopolnico /22/, y a la maduracin y deterioro defrutos. /23/

Se plantea que tambin estn involucradas en losprocesos de crecimiento /24/ y en los mecanismosde defensa de las plantas frente a patgenos. /25/

Produccin de poligalacturonasas pormicroorganismos

Las enzimas poligalacturonasas son producidaspor una amplia variedad de organismos como hon-gos, bacterias, algunas levaduras, plantas superioresy algunos nematodos parsitos de plantas, tal es elcaso de las endopoligalacturonasas. Lasexopoligalacturonasas, por su parte, aparecen endiferentes frutas y vegetales, y pueden ser produci-das por hongos y algunas bacterias. /26/ General-mente, se encuentran presentes en consorcio conotras pectinasas, y proveen la maquinaria enzimticanecesaria para degradar la compleja estructura de lapectina a carbohidratos fcilmente asimilables.

Las preparaciones comerciales de pectinasasson en su mayora de origen fngico, fundamental-mente, de Aspergillus /27/ y Penicillium, y secaracterizan por exhibir alta actividad deendopoligalacturonasa y de pectina liasa.

Tabla 2Poligalacturonasas en hongos saprofticos

aa, aminocidos;- dato no asequibleFuente: /11/

Organismo PG Caractersticas

Aspergillus carbonarius Endo PGI (61kDa), PGII (42kDa), PGIII (42kDa) Aspergillus nger

Endo/Exo

pgaI (35kDa), pgaII (38kDa), pgaA (370 aa), pgaB (362 aa), pgaC (383 aa), pgaD (495 aa), pgaE (378 aa)

Aspergillus oryzae Endo PG (37.5 kDa) Aspergillus tubigensis Exo/Endo PgaX (78 kDa), pgaII (362 aa) Aspergillus ustus Endo 36 kDa Kluyveromyces marxianus Endo EPGI (34kDa) Neurospora crassa Endo 37 kDa Penicillium frequentans

Exo (I,II,III)/ Endo (I,II,III)

-

Saccharomyces cerevisiae Endo PGLI (361aa, 37kDa)

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El hongo Aspergillus niger produce mltiplesformas de poligalacturonasas con masasmoleculares que varan entre 30 y 60 kDa. En estehongo, se ha reportado la presencia de genes quecodifican para una familia de sieteendopoligalacturonasas. /28/ Todos y cada uno deellos han sido clonados, secuenciados ysobreexpresados. /16/ Las endopoligalacturonasasdifieren en su actividad especfica (varan desde25-4 000 U/mL), en la sensibilidad a la metilacindel sustrato y en el modo de actuar. Estos hongostambin producen exopoligalacturonasas, que rom-pen la cadena por los extremos no reductores, a

diferencia de las endopoligalacturonasas queescinden la cadena mediante un mecanismo deataque aleatorio en la regin lisa de la pectina. /5/

Entre las levaduras, la actividad pectinoltica esuna cualidad relativamente rara, y est restringida aunas pocas especies de los gneros Kluyveromyces/29/, Cndida , Deberomyces, Pichia,Sacharomyces, entre otras /2, 30/. La mayora deestas levaduras se han aislado de las fermentacionesdel cacao, caf, uvas e higos, y asociados al deterio-ro de algunos alimentos y frutas en conserva, /8/ y secaracterizan por producir exclusivamenteendopoligalacturonasa extracelular. /31/

Tabla 3Poligalacturonasas en levaduras

Organismo Peso mol. Tipo de enzima Referencia (Da) pctica S. fragilis PG /32/ Rhodotorula sp PE, PG /33/ S. fragilis (K. fragilis) I-46000 Endo-PG /34/ (3 isoenzimas) II-50000 III-30000 F. macedoniensis U-480 28000 PG /35/ K. fragilis IFO 0288 33000 Endo-PG /36/ (4 isoenzimas) S. chevalieri Endo-PG /37/ T. candida Endo-PG C. norvegensis Endo-PG K. fragilis Endo-PG C. macedoniensis Endo-PG /38/ C. albidus 41000 Endo-PG /39/ K.marxianus NCYC587 I-29600 Endo-PG /40/ (4 isoenzimas) II-29800 III-36000 IV-21900 G lactis 53000 Exo-PG /41/ S. cerevisiae 1389 I-22000 Endo-PG /42/ II-31000 Endo-PG S. cerevisiae IMI-8b 36000 Endo-PG /43/ S. pastorianus 43000 PG /44/

Potencialidades de las poligalacturonasasde levaduras

Los preparados pectinolticos comerciales queexisten en la actualidad son de origen fngico, y

Fuente: /8/

estn constituidos por mezclas complejas de va-rias enzimas pcticas y no pcticas. La presenciaen ellos de actividades indeseables se ha conver-tido en una limitante para muchas de sus aplica-ciones. Muchas levaduras que slo producen

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poligalacturonasa como nica enzima pctica,podran erigirse en una interesante alternativa alas pectinasas de hongos. /2/ En la elaboracin depreparados de pectina, que slo requieren delconcurso de actividad endopoligalacturonasa ydonde la presencia de otras actividades repercutenegativamente sobre el rendimiento y la pureza,es indiscutible la superioridad de preparados pu-ros como los sintetizados por levaduras.

Por otro lado, el hecho de que algunas levadu-ras sean capaces de sintetizar constitutivamenteenzimas poligalacturonasas /8/, constituye unaventaja desde el punto de vista productivo, ya quepueden ser obtenidas como un producto colateralde otra produccin (p.e. biomasa, vino cerveza,etctera), contribuyendo a aminorar los costes.

Otra excelencia de las levaduras es que, a pesarde que su productividad, se considera baja /8/,presentan mayor velocidad de crecimiento y estruc-tura unicelular, cualidades que les confieren impor-tantes ventajas respecto a los hongos para el cultivosumergido a gran escala. /2/

Aplicaciones de las enzimas pectinolticas

La aplicacin de las enzimas pectinolticas enlos ltimos aos se ha extendido considerable-mente. En la industria de los alimentos, paraincrementar la eficiencia de procesos extractivos,estabilizacin de productos y perfeccionamientodel sabor; tienen adems una considerable aplica-cin comercial en la desintegracin de tejidos deplantas, particularmente, en el procesamiento defrutas y vegetales. /13/

Clarificacin de jugos de frutas y vinos

La moderna tecnologa de los zumos de frutasexige una degradacin rpida e intensa de la pectina,responsable de las propiedades coloidales, alta vis-cosidad, turbidez, dificultad de filtracin y miscelasvoluminosas, es por ello, la gran importancia del usode las pectinasas, debido a su capacidad de mejorarel prensado, la clarificacin y la filtracin de los jugosde frutas concentrados. La cantidad de energarequerida para este proceso puede disminuirse por elempleo de estas enzimas. /5/

En su mayora, las preparaciones enzimticascomerciales utilizadas, estn derivadas delAspergillus ssp, y son tradicionalmente mezclas depoligalacturonasas, pectato liasas y pectinesterasas./7/ El tratamiento de los zumos de frutas con estospreparados resulta en la descaracterizacin del sa-bor de la fruta, puesto que al ocurrir la ruptura de lapectina y su desesterificacin, ocurre la volatiliza-cin de los steres responsables del sabor. A esto seaade la inestabilidad del zumo por la precipitacinde los derivados de la pectina desesterificada con losiones calcio presentes y la liberacin de metanol. /45/

Por ello, actualmente existen procesos queutilizan un tipo especfico de enzimas pectinasas,como la preparacin de jugos de ctricos y naran-jas, donde las endopoligalacturonasas son prefe-ridas para mantener su turbidez y el aspectoopaco. /46/

Se ha demostrado que en las fermentacionesde vinos realizadas con poligalacturonasas deS.cerevisiae, los procesos de clarificacin sefacilitan, y el tiempo de filtracin se reduce hastaun 50 % en algunos casos. /43/

Tratamiento de fibras

En la industria textil, las pectinasas han sidoempleadas en la maceracin y el tratamiento defibras textiles brutas: lino (Linum usitassimum),camo (Cannabis sativa) y yute (Carchues sp).Tambin han sido utilizadas en la preservacin demaderas, aumentando la permeabilidad de stas alos preservantes tradicionales. /45,47/

Fermentacin del t y el caf

Las pectinasas son de gran utilidad para aumen-tar la productividad y la eficiencia en las fermenta-ciones naturales. As, por ejemplo, aceleran la fer-mentacin del te y eliminan la espuma que formanlos granos debido a la destruccin de la pectina. Porotra parte, en la fermentacin hmeda de las semi-llas de caf, la adicin ex profeso de preparados depectinasa proveniente de levadura, permite reducira aproximadamente la dcima parte el tiempo defermentacin previa del caf para lograr la separa-

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cin final de las partculas de pericarpio an adheri-das a las semillas. /3/

Alimento animal

Pueden ser usadas conjuntamente con otrascelulasas y carbohidrasas en la formulacin dealimento animal para facilitar la asimilacin de losnutrientes por los animales. /8/ Reducen la visco-sidad del alimento, lo cual incrementa la absorcinde los nutrientes, al liberarlos por la hidrlisis delas fibras no biodegradables. /48/

Otras aplicaciones

Las pectinasas son utilizadas en la elaboracinde alimentos infantiles (purs y compotas) en losque se prefieren preparaciones homogneas depoligalacturonasas, ya que permite la separacinde clulas enteras intactas, con lo cual se preser-van las vitaminas y los compuestos responsablesdel color y el aroma. /11/

Son utilizadas en la produccin deoligogalacturnidos (oligournidos). Los fragmen-tos de pectina con grado de polimerizacin entre7-16 inducen la respuesta defensiva en plantasfrente a patgenos, estimulan el crecimiento celu-lar y la maduracin de frutos, entre otras aplica-ciones. /10, 49/

La liberacin enzimtica de los monosacridosque constituyen la estructura de la pectina tienendiferentes aplicaciones dentro de la industria delos alimentos y otros campos, y estos compuestosconstituyen importantes herramientas en los pro-cesos industriales: la arabinosa es un precursor deL-fructosa y L-glucosa, los cuales pueden serutilizados como edulcorantes, y tambin transfor-mados a 5-deoxi-L-arabinosa, un compuesto quetiene propiedades antiparkinsonianas. El cidogalacturnico puede ser enzimticamente con-vertido en cido L-ascrbico, o puede ser usadopara producir agentes surfactantes poresterificacin con varios cidos grasos, y laramnosa puede ser transformada qumicamenteen aromas usados en sabores de caramelos yfrutas. /5/

Conclusiones

La produccin de enzimas derivadas demicroorganismos es un sector importante de laBiotecnologa Industrial. Los preparadospectinolticos que se comercializan actualmente,estn constituidos por mezclas complejas de variasenzimas pcticas con actividades indeseables, quelimitan su aplicacin en muchos casos. Por ello, laobtencin de preparados puros de poligalacturonasas,los cuales no tienen esta limitante, va cobrandoespecial inters, por las ventajas que representarasu utilizacin en la obtencin de alimentos de mayorcalidad. En tal sentido, la produccin a partir delevaduras que producen de forma exclusivaendopoligalacturonasa extracelular, constituye unapromisoria alternativa. En el caso de Cuba, resultaparticularmente atractiva debido a que el pas cuentacon la infraestructura (planta de torula y alcohol) yexperiencia tcnica para el cultivo de levaduras aescala comercial.

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TECNOLOGA QUMICA Vol. XXVIII, No. 1, 200890

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