Parte_IV

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351Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

PARTE IV

Métodos de propagación

y conservación de germoplasma



352 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II




IV. Capítulo 1

Micrrgción

Sofía Olmos, Gabriela Luciani yErnestina Galdeano

1 InrdcciónLa micropropagación consiste en la propa-

gación de plantas en un ambiente articial con-trolado, empleando un medio de cultivo ade-cuado. El cultivo es así una herramienta muyútil en los programas de mejoramiento, ya quetiene el potencial de producir plantas de calidaduniforme a escala comercial, a partir de un ge-notipo selecto y con una tasa de multiplicación

ilimitada. Esto es posible gracias a la propie-dad de totipotencia que tienen las células ve-getales; esto es la capacidad de regenerar unaplanta completa cuando están sujetas a los es-tímulos adecuados. Así, las células somáticasde cualquier tejido podrían formar tallos, raíceso embriones somáticos de acuerdo con la com-petencia que posea y al estímulo que reciban .

Dependiendo de las características de laplanta que se pretenda propagar y del objetivoperseguido, la micropropagación puede rea-

lizarse a través de tres vías de regeneración:brotación de yemas adventicias preexistentes,producción de yemas de novo y embriogénesissomática.

2 Es de micrrgciónLa micropropagación presenta cuatro etapas

principales: 1) establecimiento del cultivo, 2)desarrollo y multiplicación de vástagos o em-briones, 3) enraizamiento y 4) aclimatación

de las plántulas. Generalmente, las etapas deenraizamiento y aclimatación pueden combi-narse en condiciones ex vitro. En el caso dela embriogénesis somática, el enraizamientoes reemplazado por una etapa de maduracióny germinación de los embriones para la dife-renciación de los ápices caulinar y radicular.En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0) que es la etapa depreparación de los explantos para el estableci-miento.

E 0: prerción de meri vegeLa correcta elección y preparación del ex-

planto incide directamente sobre la calidad delmismo y su respuesta frente a los dos principa-les problemas que afectan al establecimientodel cultivo, que son la contaminación con mi-croorganismos y la oxidación del explanto.

Los factores que inuyen sobre la calidad delexplanto son: el tipo de órgano que sirve comoexplanto, la edad ontogénica y siológica del

mismo, la estación en la cual se colecta el ma-terial vegetal, el tamaño y el estado sanitariogeneral de la planta donante.

La planta donante debe elegirse en base auna selección masal positiva para las caracte-rísticas agronómicas deseables. Una vez se-leccionados los individuos, es preciso denir el

tipo de explanto a establecer en condiciones in

vitro. En general, los órganos jóvenes o bienrejuvenecidos son los que tienen mejor res-puesta en el establecimiento que los obtenidosa partir de materiales adultos.

El empleo de explantos que se encuentranexpuestos a bajos niveles de patógenos puederesolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimientodel cultivo in vitro.

Se recomienda colectar explantos primariosa campo durante la estación primaveral y esti-val, cuando existe una brotación activa de lasyemas, ya que el empleo de yemas en esta-do de dormición ocasiona serios problemas decontaminación.

A n de lograr explantos de óptima calidad

es conveniente hacer crecer las plantas donan-tes por un tiempo mínimo en condiciones deinvernáculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la ca-lidad de los explantos mediante el control de la

intensidad lumínica, temperatura y reguladoresde crecimiento. Para especies ornamentalestropicales y subtropicales se recomienda man-tener las plantas donantes en condiciones dealta temperatura (25ºC) y baja humedad rela-tiva (75%) a n de reducir la proliferación de

patógenos.Los procesos morfogénicos de oración,

dormición y bulbicación son controlados por el

fotoperíodo y la temperatura. Controlando es-tos factores también es posible obtener plantas




donantes y explantos más homogéneos duran-

te todo el año. Pueden aplicarse además pre-

tratamientos con reguladores de crecimiento a

las plantas donantes, así como también a los

explantos mismos. En especies leñosas suele

utilizarse como pretratamiento la inmersión de

los explantos primarios en soluciones con cito-

cininas a n de inducir la brotación de yemas.

E 1: Esblecimieno del culivo

El objetivo de esta etapa es establecer culti-

vos viables y axénicos. El éxito está determina-

do por la calidad del explanto a utilizar. En esta

etapa los principales procesos a controlar son

la selección, el aislamiento y la esterilización de

los explantos.

Los materiales que demuestran tener mayor

capacidad regenerativa son los obtenidos detejidos meristemáticos jóvenes, ya sean yemas

axilares o adventicias, embriones o semillas en

plantas herbáceas y aquellos tejidos meriste-

máticos que determinan el crecimiento en gro-

sor, como el cambium en las plantas leñosas.

En este sentido, es importante señalar que el

empleo de yemas adventicias (también llama-

das yemas formadas de novo) está asociado

con una mayor probabilidad de ocurrencia de

variantes somaclonales respecto de los siste-

mas de propagación basados en la regenera-

ción a partir de yemas axilares o embriones

somáticos.

La obtención de cultivos axénicos puede lo-

grarse trabajando tanto sobre aspectos preven-

tivos como curativos. Una acción preventiva la

constituye el empleo de métodos de verica-

ción de patógenos en los explantos. Esto puede

realizarse mediante análisis especícos para

las enfermedades del cultivo, tales como DAS-

ELISA o PCR, análisis generales para patóge-nos cultivables como el empleo de medios de

cultivo para el crecimiento de bacterias y hon-

gos y métodos especícos para la detección e

identicación de patógenos intracelulares como

virus, viroides y bacterias. La realización de

estos análisis directamente sobre las plantas

donantes, previo establecimiento, presenta dos

ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos

maduros permite visualizar los síntomas más

marcados de la enfermedad, en segundo lugar,

la carga de patógenos es mayor y por lo tanto

la precisión del sistema de detección aumen-

ta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden

tratarse con técnicas adecuadas para la elimi-

nación de patógenos como la termoterapia, la

quimioterapia a través de la aplicación de anti-

bióticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo

de meristemas.La desinfección supercial incluye varios pa-

sos: el lavado de los explantos con agua co-

rriente, el empleo de etanol al 70% por 1 mi-

nuto, seguido de concentraciones variables de

hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo)

con unas gotas de tensoactivos para favorecer

su penetración y actividad. Posteriormente, los

explantos deben ser enjuagados al menos tres

veces con agua destilada estéril.

Algunos patógenos permanecen latentes y

se expresan cuando son transferidos a un me-dio de cultivo nuevo. En general, estos pató-

genos incluyen los patógenos superciales del

material vegetal, los patógenos endógenos y

los patógenos propios del manejo en laborato-

rio. En la Etapa 1 también pueden observarse

infecciones por bacterias y hongos asociados a

trips que sobreviven a los tratamientos de este-

rilización y por patógenos endógenos latentes

dentro del sistema vascular, resultado de una

esterilización inefectiva de los explantos. Estos

patógenos latentes podrían manejarse median-

te el empleo de bacteriostáticos o antibióticos

en el medio de cultivo.

E 2: Mulilicción

El objetivo de esta etapa es mantener y au-

mentar la cantidad de brotes para los nuevos

ciclos de multiplicación sucesivos (subcultivos)

y poder destinar parte de ellos a la siguiente

etapa de producción (enraizamiento, bulbica-

ción, etc.). Ambas vías de regeneración, orga-nogénesis y embriogénesis, pueden darse en

forma directa o indirecta. Esta última implica la

formación de callo. En general, la organogéne-

sis conduce a la producción de vástagos unipo-

lares que enraízan en etapas sucesivas, mien-

tras que por embriogénesis somática se forman

embriones bipolares a través de etapas onto-

génicas similares a la embriogénesis cigótica.

Es importante señalar que cualquiera sea lavía de regeneración empleada, es convenien-




te evitar la formación de callo para disminuir el

riesgo de variación somaclonal. Los medios de

cultivo, los reguladores de crecimiento como

auxinas, citocininas y ácido giberélico y las con-

diciones de crecimiento juegan un papel crítico

sobre la multiplicación clonal de los explantos.

La organogénesis puede darse por inducción

de yemas axilares o adventicias. La inducciónde yemas axilares comprende la multiplicación

de yemas preformadas, usualmente sin forma-

ción de callo. La inducción de yemas adventi-

cias comprende la inducción de tejido meriste-

mático localizado mediante un tratamiento con

reguladores de crecimiento, conduciendo a la

diferenciación del primordio y desarrollo del

vástago, esto último generalmente en ausencia

del regulador de crecimiento que indujo la orga-

nogénesis.

La principal desventaja del primer métodoes que el número de yemas axilares por ex-

planto limita la cantidad de vástagos. Esto se

ve compensado, sin embargo, por un aumento

en la tasa de multiplicación con los sucesivos

subcultivos. La formación de yemas adventicias

ofrece mayor potencial para la producción de

vástagos, ya que ocurre en sitios distintos al de

los meristemas.

La embriogénesis somática es una vía más

conveniente porque permite saltar las etapas

de formación de yemas y enraizamiento, rege-

nerando plantas en una forma mucho más rá-

pida y eciente. A su vez, la disponibilidad de

protocolos para la obtención de embriones so-

máticos es clave para la automatización de la

micropropagación y la consecuente reducciónde costos para su implementación a escala

comercial. Los biorreactores son equipos que

contienen aproximadamente 2 litros de medio

de cultivo líquido estéril y donde los embriones

somáticos pueden regenerar y madurar a partir

de suspensiones celulares, sustentados por la

circulación permanente de nutrientes y de aire

(Fig.1). Hoy en día, el empleo de biorreactores

para la micropropagación a gran escala está

limitado por dos motivos críticos. En primer

lugar, el declinamiento de las líneas celulares(clones) por efecto de la variación somaclonal

y segundo, por los altos costos asociados con

la conversión de estos embriones somáticos enplántulas.

Las condiciones culturales en las cuales cre-ce el explanto son el resultado de la interacciónde tres factores: el estado del explanto o ma-terial vegetal, determinado en parte por el me-

Figr 1: Embriogénesis somática en zanahoria. A partir de cé-lulas del oema se obtienen los embriones somáticos que son

un excelente sistema de propagación clonal. Los bioreactorespermiten el cultivo a gran escala de los mismos.

dio de cultivo, el recipiente decultivo y el ambiente externoo condiciones de crecimientodel cuarto de cultivo. La capa-cidad de respuesta de los ex-plantos a un mismo medio decultivo cambia con el númerode subcultivos, el tipo de ex-planto subcultivado y el méto-do del repique. Por esto mis-mo, el medio de cultivo debeoptimizarse a n de lograr la

mayor tasa de multiplicaciónvegetativa. Comúnmente seemplea como medio basal elmedio MS completo sugeridopor Murashige & Skoog (1962)suplementado con 3% de sa-carosa como fuente de carbo-no. A este medio se le adicio-nan además reguladores decrecimiento, tanto del tipo deauxinas como de citocininas.




La etapa de multiplicación generalmentecomprende dos períodos, la fase de induccióny la fase de multiplicación propiamente dicha.La primera implica, generalmente, el empleode concentraciones elevadas de reguladoresde crecimiento (generalmente de auxinas másque citocininas) para favorecer la desdiferen-

ciación. La segunda etapa requiere del empleode un balance hormonal adecuado para fa-vorecer los procesos de diferenciación y mul-tiplicación celular. En este caso el sistema esmás dependiente de reguladores del tipo delas citocininas. En algunos casos, como ocu-rre en la formación de embriones somáticos,se requiere de una tercera y cuarta etapa, de-nominadas de maduración y de germinaciónrespectivamente, cuya duración varía entre 1a 2 semanas. Para la etapa de maduración se

adiciona ABA (ácido abscícico) al medio basalen rangos de 5 a 20 μM, seguido del subcultivo

a un medio basal conteniendo AG (ácido gibe-rélico) en concentraciones de 0,1-1 μM, cuyo

n es lograr la germinación de los embriones

obtenidos.Los tipos de auxinas más empleados son

IBA, 2,4-D, AIA, ANA y picloram, y las citoci-ninas BA, CIN, ZEA, 2ip y TDZ. El rango deconcentración empleado varía con el regulador del crecimiento, así es que el 2,4-D, por ejem-plo se utiliza en concentraciones de 4-35 µMmientras que otra auxina como el IBA, tiene unrango de 0,1 a 2 µM.

Los tipos de reguladores, sus combinacionesy rangos de concentraciones deben ser optimi-zados para cada especie, genotipo y etapa demultiplicación determinada. Las condicionesde incubación de los cultivos in vitro dependende las especies con que se trabaje. En el casode las especies subtropicales, por ejemplo, los

cultivos se incuban en luz a 27±2º C con 14horas de fotoperíodo e intensidad lumínica mo-derada (100 μmol m-2 s-1).

La presencia de compuestos fenólicos oxi-dados se encuentra asociada con tejidos vege-tales sometidos a situaciones de estrés, talescomo aquel provocado por el daño mecánicoproducido durante el aislamiento del explantode la planta madre o durante la transformación.Los compuestos fenólicos liberados al mediopueden inhibir el crecimiento e incluso matar

al explanto. Para minimizar el daño de estoscompuestos se emplean agentes adsorbentesde fenoles en el medio de cultivo, tales comoel carbón activado y la polivinilpirrolidona o an-tioxidantes como el ácido ascórbico, la modi-cación del potencial redox con agentes reduc-tores, la inactivación de las fenoloxidasas con

agentes quelantes o la reducción de su activi-dad o anidad por el sustrato utilizando un bajo

pH, ó bien cultivando in vitro en condiciones deoscuridad.

Es recomendable además lograr que la tasade intercambio gaseoso entre los ambientesdel recipiente y externo sea óptima, evitándosela acumulación de CO

2y de etileno. En este

sentido el sellado del recipiente es importante,el intercambio gaseoso es más limitado con elempleo de una tapa de plástico que con un lm

de polietileno extensible. La utilización de unatapa perforada con tapón de gomaespuma esaltamente recomendable (Fig. 2).

El principal problema que puede presentarsedurante los sucesivos subcultivos in vitro es lavitricación. La cual consiste en un proceso de

morfogénesis anormal con cambios anatómi-cos, morfológicos y siológicos que producen

Figr 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro enun recipiente de vidrio con tapa metálica perforaday tapón de gomaespuma, que evita la acumulaciónde CO

2, etileno y excesiva humedad en el ambiente

de cultivo.




hojas de una apariencia vidriosa. Este fenóme-no está regulado por dos factores clave queson la humedad relativa y el potencial agua, yafecta a dos procesos siológicos fundamen-tales, la fotosíntesis y la transpiración. Debidoa la disfunción metabólica asociada, las plan-tas se vuelven completamente heterótrofas

y transpiran excesivamente debido a un malfuncionamiento estomático y a cambios estruc-turales en las paredes celulares. La principalconsecuencia de la vitricación es la baja su-pervivencia de las plántulas obtenida durantela aclimatización ex vitro. Por ello, es funda-mental conocer el rol de los distintos factoresque inciden negativamente sobre el desarrollomorfogénico normal (parcialmente autótrofo) in

vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo,los componentes orgánicos e inorgánicos del

medio, los reguladores de crecimiento, la luzy la temperatura. Una baja humedad relativa,elevada irradiación, la remoción de la fuente decarbohidratos del medio de cultivo y la defo-liación de las plantas para estimular la forma-ción de hojas nuevas estimulan la fotosíntesisy otras actividades metabólicas de las hojasen forma normal. Otras estrategias para lograr un óptimo crecimiento implican el empleo deretardantes del crecimiento para estimular laformación de hojas nuevas después del trans-plante. O bien, el empleo de altos niveles deCO

2(antagonista del etileno) para estabilizar la

vía de lignicación y prevenir la vitricación a

través de la inhibición de la hiperhidratación, lahipolignicación y la formación de aerénquima.

E 3: Enrizmien y cimizciónEn esta etapa se produce la formación de

raíces adventicias. En las especies herbáceases relativamente fácil mientras que en muchas

especies leñosas resulta más complicada por su limitada capacidad rizogénica.El enraizamiento puede realizarse tanto en

condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de subs-tratos y reguladores de crecimiento (principal-mente auxinas) para promover la rizogénesis.Los substratos incluyen: medio solidicado con

agar, perlita y/o vermiculita humedecidas conmedio nutritivo o agua. En un medio solidica-do con agar, los nutrientes se reducen de ½

a ¼ de la composición original, y la sacarosase reduce a una concentración nal de 1-2%.

Medios con baja concentración salina, como elWPM (Lloyd & McCown, 1981) y GD (Gresshoff & Doy, 1972) incrementan el porcentaje de en-raizamiento de vástagos axilares en plantaslatifoliadas. El empleo de agar presenta ven-

tajas y desventajas sobre la rizogénesis. Por un lado, el enraizamiento de especies fores-tales en agar se favorecería al producirse unarizogénesis más sincrónica como resultado delcontacto íntimo de las estacas con el medio decultivo. Sin embargo, las raíces producidas por este método son usualmente engrosadas y noposeen pelos radiculares. Adicionalmente, elempleo de agar está asociado con la formaciónde callo en la base de las estacas, que condu-ce al establecimiento de conexiones vascula-

res interrumpidas entre raíces y vástagos.Comúnmente, a n de proceder a su enrai-

zamiento, los vástagos de buen tamaño prove-nientes de la etapa de multiplicación y provis-tos de al menos 4-5 yemas, se colocan duranteperiodos cortos en soluciones con concentra-ciones elevadas de auxinas. La auxina másutilizada es el IBA, que puede utilizarse a con-centraciones de 1-10 μM durante pocas horas.

Alternativamente se pueden emplear nivelesmás bajos de auxinas (0,1 a 1 μM), pero mante-niendo la inducción por un periodo más prolon-gado (3 a 7 días). Luego los vástagos se trans-eren a un medio de cultivo basal desprovisto

de reguladores de crecimiento para permitir eldesarrollo de las raíces. Aproximadamente 20días después del tratamiento de inducción, esposible la obtención de una adecuada cantidadde raíces funcionales que permitan continuar hacia la etapa de aclimatización.

Es importante acentuar que el uso de auxi-

nas a elevadas concentraciones es contrapro-ducente porque induce la formación de calloen la base de las estacas. Por ello para cadacultivo es necesario optimizar un protocolo derizogénesis que minimice la formación de calloy maximice la tasa de rizogénesis y supervi-vencia de las plantas.

El enraizamiento ex vitro permite que el en-raizamiento y aclimatización se logren simultá-neamente y que raramente se forme callo enla base de las estacas, asegurando así una




conexión vascular continua entre el vástago yla raíz. Sin embargo, el estrés asociado a latranspiración acelerada de las plantas durantelas etapas iniciales del trasplante puede reducir considerablemente la tasa de supervivencia.Por ello, es conveniente contar con instalacio-nes de invernadero o cámaras de crecimiento

adecuadas para brindar temperatura y hume-dad relativa moderadas que permitan lograr larusticación de las plantas en forma progresiva.Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentessubstratos, mezclas de tierra y arena y/o abo-nos, los cuales convienen que estén debida-mente desinfectados.

3 prgción de esecies eñssEl empleo de clones en programas de refo-

restación de muchas especies genera al menos

un 10 % de incremento en ganancia genéticaen relación al empleo de plantas regeneradaspor semillas de árboles selectos. Sin embargo,la máxima ganancia genética puede ser obte-nida mediante el empleo conjunto de propaga-ción sexual y agámica. La reproducción sexuales importante para la introducción de genesnuevos, prevenir los efectos de la endogamia yel mejoramiento de características controladaspor efectos aditivos de genes. La reproducciónasexual por otro lado permite la multiplicaciónde individuos o grupos de individuos seleccio-nados de una población elite, que exhiben unasignicativa ganancia genética debida a efec-tos no aditivos de genes.

Tradicionalmente, las especies forestalesfueron propagadas vegetativamente medianteel enraizamiento de estacas, de braquiblastosen coníferas, así como por injertos. La propa-gación por estacas de Cryptomeria japonica (cedro japonés), Populus spp. (álamos) y Salix

spp. (sauces) ha sido llevada a cabo durantesiglos en Asia y Europa. Sin embargo, para lamayoría de los árboles propagados por estacasse observa una rápida pérdida de capacidadde rizogénesis al aumentar la edad de la plantadonante de las estacas. En este sentido, unade las principales ventajas de la micropropa-gación es la capacidad potencial de desarrollar protocolos de multiplicación optimizados paramultiplicar árboles adultos que han demostra-do ser fenotípicamente superiores.

Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos

cambiales de especies forestales condujeron,

en el año 1940, a la formación de yemas ad-

venticias en Ulmus campestris. Durante la dé-

cada del 40 se publicaron logros adicionales en

al producción separada de vástagos y raíces

en especies latifoliadas. En 1950 se publicó

por primera vez la obtención de organogéne-sis en coníferas, con la formación de vástagos

a partir de callos de Sequoia sempervirens. En

la década 1970-80 se obtuvieron las primeras

plantas de álamo (Populus tremuloides) y Pin-

us palustris. En ambos casos la formación de

plántulas se logró vía organogénesis. Luego del

año 1975 la micropropagación de especies la-

tifoliadas se realizó a través de la regeneración

indirecta, pasando por una etapa de callo.

El principal método utilizado para especies

latifoliadas es la brotación de yemas adventi-cias, empleando ápices de vástagos, yemas

laterales y microestacas. En las coníferas, la

elongación de las yemas axilares a partir de

braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy

exitosa. En latifoliadas de clima templado los

mejores explantos los constituyen las yemas y

vástagos en activo crecimiento más que las ye-

mas en estado de dormición. Los vástagos se

colectan en primavera y a principios del verano

a n de obtener material con reducido nivel de

contaminación. Alternativamente las yemas en

dormición pueden ser colectadas y brotadas en

condiciones ambientales controladas.

Para la inducción de vástagos, tanto en gim-nospermas como en angiospermas, se requie-re el empleo de citocininas. La más usada esla N6-benciladenina (BA) o también llamada6-bencil amino-purina (BAP) y el tidiazurón(TDZ).

Los medios basales más usados para an-

giospermas son el MS (Murashige & Skoog,1962) o el WPM (Lloyd & McCown, 1981). Parael caso de gimnospermas, el empleo de me-dios reducidos en sales minerales y baja can-tidad de nitrógeno resulta mucho mejor que elempleo de un medio altamente salino y nitroge-nado como el MS.

La inducción de yemas adventicias es elmétodo más empleado para gimnospermas yangiospermas. En este caso, las yemas se in-ducen directamente sobre el explanto en ge-




neral sin previo pasaje por una etapa de ca-llo. En general, cuanto más joven es el tejido,tanto mayor es la respuesta a los tratamientosque conducen a la organogénesis de novo. Los explantos más frecuentes son embrionescigóticos maduros, seguido de cotiledones yepicótilos de plántulas. Generalmente se uti-

liza BA a concentraciones mayores o igualesa 5 ppm como única fuente de inducción o encombinación con otras citocininas. La adiciónde auxinas puede ser beneciosa, aunque en

coníferas se ha encontrado que promueve laformación de callo y reduce el proceso de or-ganogénesis.

En algunos casos, como en Populus spp.,la formación de yemas adventicias se logra apartir de un callo originado a partir de tejidocambial.

El método llamado multiplicación mediantenódulos meristemáticos es un método tambiénutilizado para Pinus radiata y álamo. En estecaso se obtiene básicamente un tejido meris-temático (no un verdadero callo) usando re-laciones altas de auxina/citocinina para luegoinducir la producción de vástagos.

La disponibilidad de protocolos vía embriogé-nesis somática para especies forestales es aúnlimitada. En la angiospermas los primeros em-briones somáticos se obtuvieron de Santalum

album, donde sin embargo no fue posible la ob-tención de plantas completas. Recién 20 añosdespués pudieron lograrse plantas completasde abeto (Picea abies), una gimnosperma. Enlas gimnospermas los mayores éxitos se lo-graron empleando como explantos embrionescigóticos maduros e inmaduros. En la mayoríade los casos los embriones se originan en for-ma indirecta a partir de callos embriogénicoso bien, directamente desde el explanto. En las

coníferas puede ocurrir un proceso de poliem-brionía previa formación de callo que condu-ce a una alta tasa de multiplicación inicial. Engeneral, los medios de cultivo más efectivospara estos nes contienen elevados niveles de

sales y suministran nitrógeno tanto como NH4

+ y NO

3-. Las auxinas más comúnmente emplea-

das en el medio de inducción son el 2,4-D y elANA, en concentraciones mayores de 2 μM. En

algunos casos es necesario además el empleode alguna citocinina, generalmente en concen-

traciones mayores a 1 μM si se trata de BA y

entre 0,1-1 μM en el caso del TDZ.

Los explantos jóvenes de especies leñosas,particularmente angiospermas, a menudo se-cretan al medio de cultivo polifenoles oxidados,visibles como pigmentos marrones y/o negros.Se observa también, que en los explantos de

árboles adultos el problema se acentúa. Por ello se recomienda el empleo de explantos pri-marios juveniles.

Los tipos de explantos más utilizados para elestablecimiento in vitro son los segmentos no-dales de explantos juveniles, las yemas axila-res obtenidas por rejuvenecimiento de plantasadultas, y los embriones cigóticos y plántulasobtenidas de semillas de origen sexual.

La desinfección de los mismos se logra me-diante inmersión en etanol al 70 % (1 a 2 mi-

nutos) seguido de una solución de lavandinacomercial conteniendo de 0,8 a 2,4 % de cloroactivo durante 5-30 minutos. En la mayoría delos casos se emplean agentes tensoactivos, ta-les como Triton ó Tween 20, adicionados enla solución de lavandina. En todos los casoslos explantos son lavados nalmente varias ve-ces con agua destilada estéril.

Los medios basales más empleados son elMS, formulado por Murashige & Skoog (1962),diluido a la mitad o a un cuarto de su formula-ción original o el WPM, formulado por Lloyd &McCown (1981). Como medios de multiplica-ción se emplean además el BTM (broadleavedtree medium, Chalupa, 1983) y el medio de Pé-rinet y Lalonde (1983). Los reguladores de cre-cimiento más utilizados son ANA y BA. Tam-bién han sido efectivas auxinas como IBA y2,4-D, y citocininas como 2iP, CIN, ZEA y TDZ.

En la Fig. 3 se muestran las etapas de la mi-cropropagación de plantas de paraíso gigante,

Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al .,2002).

3.1 prbems scids micrr-gción de esecies eñss

Es mucho más difícil propagar material adul-to que juvenil ya que los primeros son recalci-trantes, es decir, difíciles de regenerar. Sin em-bargo, aún en estos casos es posible extraer explantos de mayor capacidad regenerativamediante dos formas: 1) seleccionando los te-




jidos más juveniles dentro de un árbol o, 2) in-duciendo el rejuvenecimiento del árbol donanteantes de aislar los explantos.

Para seleccionar el material más juvenil enuna planta adulta hay que considerar el fenó-meno de topófsis. Este es un proceso por elcual el tipo de crecimiento de un nuevo indivi-

Figr 3: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L.

(Olmos et al ., 2002): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad, provin-

cia de Misiones, Danzer Forestación S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas

para generar una población de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparación del material ve-

getal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas

como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vástagos desarrollados a partir de

meristemas luego de 30 días sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog, 1962

(MS) suplementado con 2,22 μM 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 μM ácido giberélico (GA3) + 0,25 μM

ácido 3-indolbutírico (IBA). D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobre medio de multi-

plicación (medio MS suplementado con 2,22 μM BAP, estos vástagos fueron empleados como explantos

para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la

etapa de multiplicación con problemas de vitricación y presencia de callo. En estos casos, el medio de

multiplicación para los cultivos subsiguientes fue modicado reduciendo la concentración de BAP a 0,44

μM. F) Vástago enraizado en medio de MS con la concentración salina reducida a la mitad, suplementado

con 9,89 μM IBA durante 2 días, seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo

para pasar a la etapa de aclimatización.

duo está determinado por la posición que ocu-paba en la planta adulta. Esto es ocasionadopor efecto del envejecimiento siológico e im-plica que los explantos más reactivos in vitro seencuentran en las yemas de las áreas basalesdel tronco y raíces.

A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso

de reversión temporaria de las características




adultas que permite lograr material vegetal en

estado de juvenilidad. En general, a n de con-

trarrestar los efectos debidos a la topósis, se

recomienda emplear tejidos juveniles, y un ta-

maño de explanto muy pequeño.

La juvenilidad puede lograrse por dos méto-

dos. En primer lugar, mediante el empleo de ór-

ganos juveniles separados de plantas adultas, lautilización de estacas enraizadas o bien de bro-

tes epicórmicos. En segundo lugar mediante el

rejuvenecimiento de partes adultas, la iniciación

de yemas adventicias y embriones (en este caso

se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de

un nuevo ciclo ontogénico), del injerto de yemas

adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con

reguladores de crecimiento (como citocininas

como el BA), por la poda severa (recepado de

árboles adultos) y, a través del cultivo in vitro de

meristemas.Tanto los atributos de supervivencia a campo,

como la tasa de crecimiento, el plagiotropismo y

la susceptibilidad a enfermedades de las plan-

tas, tienen una correlación directa con la cali-

dad de los vástagos durante el cultivo in vitro.

Un problema crucial a resolver en cada sistema

de propagación es la calidad diferencial de las

raíces de las plantas regeneradas en relación a

aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las

plantas regeneradas de Pinus elliottii suelen te-

ner una raíz principal no ramicada y gruesa. Encambio, las plantas obtenidas a través de semi-

llas tienen raíces más delgadas y de mayor cre-

cimiento lateral que permiten comparativamente

un mejor anclaje y una mayor resistencia a los

vientos.

4 progción de esecies herbáces

La micropropagación de especies herbáceas

está orientada a proveer material libre de pató-

genos, propagar material seleccionado por su

mayor rendimiento o por su mayor resistenciaa enfermedades y estreses ambientales, con-

servar la diversidad especíca en bancos de

germoplasma, obtener material para estudios

siológicos y genéticos y sentar las bases para

la aplicación de técnicas de ingeniería genética.

Existe una gran variedad de protocolos, de-sarrollados en función de la especie y de losobjetivos de la propagación. Existen protocolosgenerales para monocotiledóneas como en elcaso ciertos cereales (trigo, maíz, cebada, ave-

na, arroz), pasturas (pasto bermuda, festucaalta, raigrás, pasto llorón) y hortícolas (cebo-lla, ajo, puerro); protocolos generales para di-cotiledóneas que incluyen especies hortícolas(tomate, papa, pimientos y zanahorias) y legu-minosas forrajeras (alfalfa, maní, trébol blanco)y protocolos para especies modelo como Ara-

bidopsis y tabaco.En todos los casos, las formas de propaga-

ción son las mismas. Se emplean vías de re-generación por formación de yemas axilares,yemas adventicias y embriogénesis somática.En los dos primeros casos, el sistema de pro-pagación a través de la organogénesis directaasegura la estabilidad genética de las plantasregeneradas y se emplean cuando el objeti-vo es la propagación clonal a gran escala. Laembriogénesis u organogénesis indirecta, con

formación de callo, se emplea en cambio paragenerar variabilidad en programas de mejora-miento.

En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, lasetapas de la micropropagación incluyen tantola multiplicación de yemas axilares por el culti-vo de meristemas, la formación directa de ye-mas adventicias en explantos obtenidos a par-tir de placas basales o umbelas inmaduras y laformación indirecta de yemas adventicias y/oembriones somáticos obtenidos a partir de ca-llos que provienen de distintos tipos de explan-tos (meristemas, brotes, placa basal ó raíces).En el caso de alfalfa y otras leguminosas comosoja y maní la micropropagación es llevada acabo por la vía de la embriogénesis somática,donde los embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones, cotiledones y pecío-los) como explantos. En algunos casos comopasto llorón (Eragrostis curvula) es posible laregeneración de plantas mediante embriogé-

nesis, organogénesis y regeneración directa apartir de los explantos.

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IV. Capítulo 2

Semi Sinéic

Hebe Y. Rey y Luis A. Mroginski

Cnce:Resulta difícil tratar de determinar el origen

de la idea de la producción de semillas sintéti-cas o articiales. Es uno de los resultados de

la aplicación en la Agricultura de los embrionessomáticos descriptos por primera vez en 1958,por Jakob Reinert y por F.C. Steward y co-laboradores. Sin embargo, un gran propulsor de su utilización para la propagación en granescala de plantas fue Toshio Murashige quienen un Simposio realizado en 1977 en Ghent(Bélgica) presentó formalmente la idea de laproducción de las semillas sintéticas, enten-diendo como tal a un simple embrión somáticoencapsulado. Esta semilla se diferencia de lasemilla verdadera en que el embrión es somáti-co (producido por el fenómeno conocido comoembriogénesis somática) y no cigótico y que sitiene endosperma y cubierta, éstos son arti-ciales (Fig.1a y b). Esta semilla, puesta en con-diciones adecuadas, germina (Fig.1c) y se con-

vierte en una planta (Fig.1d). Muchos gruposde investigación han contribuido al desarrollode las semillas sintéticas. Entre ellos se debendestacar el grupo liderado por Keith Walker dela Compañía Monsanto que a partir de media-dos de la década del 70 trabajaron especial-mente con alfalfa. También hay que mencionar la labor de Robert Lawrence de la Union Car-bide quienes comenzaron los trabajos con es-pecies forestales, lechuga y apio. Otros inves-tigadores como Drew, Kitto y Janick realizaron

sus trabajos con zanahoria. El aporte del grupoliderado por Keith Redenbaugh de la Plant Ge-netic Inc. fue muy importante, especialmentepor su descubrimiento de que hidrogeles comoel alginato de sodio podían ser utilizados paraproducir semillas articiales que podían germi-nar en condiciones de invernadero.

Hay que aclarar que además del conceptode semilla sintética denido más arriba, tam-bién es factible que en lugar de encapsular em-briones somáticos, se encapsulen yemas. Este

tipo de “semillas sintéticas” - de una utilizaciónmuy restringida- no será tratado en este capí-tulo.

tis de semis sinéicsLas semillas sintéticas pueden fabricarse de

diferentes maneras (Fig.2). Básicamente sepueden usar embriones hidratados (tal comoresultan de la embriogénesis somática) o bienpueden ser desecados. En algunos casos es-

tos embriones están protegidos por cubiertasprotectoras. De esta manera se pueden distin-guir 5 tipos básicos de semillas sintéticas.

1) Semis sinéics cn embrines de-secds (ti 1 de Fig. 2) sin cbier:Es un sistema muy simple, los embriones sondesecados hasta alcanzar porcentajes de hu-medad de 8- 20%. En este caso los embrionesno están provistos de ningún tipo de cubiertaprotectora. Embriones de alfalfa sometidos aldesecamiento mostraron porcentajes de con-

Fig. 1.- a) Partes de una semilla sintética .b,c y d)Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30)mediante semillas sintéticas (las barras verticalesindican 3 mm)




versión en plantas de hasta el 95% (Cuadro1), además es posible mantenerlos viables por cerca de un año en condiciones de laboratorio.

5) Semis sinéics cn embrines s-máics hidrds y rviss de n c-bier recr (ti 5 de Fig. 2). Es el

Cdr 1: Semillas sintéticas de algunas especies basadas en la desecaciónde embriones sin cubierta protectora

2) Semis sinéics cn embrines s-máics desecds y rviss de cbierrecr (ti 2 de Fig. 2). Los embrio-nes de zanahoria y apio fueron recubiertos con

polyoxietileno y luego desecados. Los resulta-dos han mostrado que si bien es factible lograr que los mismos sobrevivan, la conversión enplantas es realmente baja.

3) Semis sinéics cn embrines hi-drds sin cbier (ti 3 de Fig. 2).Es el sistema más simple, consiste en utilizar los embriones somáticos tal como resultan delproceso de la embriogénesis somática sin nin-gún tipo de cubierta protectora. Este sistemaha sido desechado en la práctica por la escasa

conversión de embriones en plantas.4) Semis sinéics cn embrines s-

máics hidrds ssendids en n geviscoso (¨fuid drilling¨) (Tipo 4 de la Fig. 2).

Inicialmente fue desarrollado en zanahoria ymás recientemente con batata.

Fig.2.- Tipos de semillas sintéticas

sistema más usado.Por esta razón, deaquí en adelantecuando se mencione

“semilla sintética” sereferirá a este tipo.Tiene la ventaja deque los embrionesno están sujetos ala desecación queconstituye la princi-

pal causa de los bajos valores de conversiónen plantas. Si bien se han ensayado numero-sas sustancias para encapsular a los embrio-nes somáticos (agar, gelrite, gomas), una de

la técnicas más usadas consiste en lograr laformación de una cubierta protectora de algi-nato de calcio que es un compuesto que ade-más de no ser tóxico para el embrión permiteuna rápida formación de la cubierta. El proce-so es muy simple (Fig. 3) y consiste básica-mente en sumergir los embriones somáticosen una solución de alginato de sodio (2%) yluego sumergirlo en un agente acomplejante[por ejemplo 100 mM de Ca (NO

3)

2]. Con esta

técnica se genera una semilla sintética consis-tente de un embrión somático con una cubiertaseminal y un endosperma articial (Fig.1a y

b). Eventualmente estas cápsulas pueden ser recubiertas por sustancias tales como el po-lioxietilenglicol que sirven para mantener unaadecuada hidratación de las cápsulas y em-briones. Este procedimiento ha posibilitado laobtención de semillas sintéticas de numerosasespecies de interés económico entre los quese pueden mencionar la alfalfa, la zanahoria, el

apio y especies forestales como Picea abies,Pinus radiata, Santalum album y Pseudotsuga

menziesii.

prdcción de semis sinéicsEn la Fig.4 se esquematizan 6 aspectos que

se deben tener en cuenta para la producción ymanipulación de las semillas sintéticas.

En primera instancia es necesario contar conun eciente sistema que asegure la inducción

in vitro de la embriogénesis somática que brin-




Fig. 4. Etapas en la producción de las semillassintéticas

de la producción de embriones sin la necesi-dad de la fusión de gametas. Estos embrionesdeben ser estructuras bipolares perfectas (conun polo que genere el vástago y el otro la raíz)capaces de convertirse (“germinar”) en plantasenteras. Si bien la existencia de embriogénesissomática ha sido informada en centenares deespecies de Angiospermas y Gimnospermas,en muchos casos no es de utilidad para iniciar la producción de semillas sintéticas debido a

la baja tasa de producción deembriones aptospara la encapsulación.En los últimos años se han hecho notables

avances en el conocimiento de los factores queregulan la embriogénesis somática. Sin embar-go aún se dista mucho de conocer las basesgenéticas de este fenómeno cuya ocurrencia,in vitro, si bien ha sido descripta en centenaresde especies de Angiospermas y casi otro tantode Gimnospermas, en muchos casos no es deutilidad para iniciar la producción de las semi-

Fig.3.- Inducción de la embriogénesis somática (a-d); selección de embriones somáticos (e); inmersiónde los embriones en alginato de sodio (f); acomplejamiento con nitrato de calcio (g); lavado (h); semillasintética (i)




llas sintéticas, por su baja tasa de producciónde embriones aptos para ser encapsulados.

El segundo paso consiste en lograr una pro-ducción sincronizada y en gran escala de losembriones. Es fundamental contar con embrio-nes simples que no se fusionen entre sí y queen un momento determinado se encuentren en

estado cotiledonar y que no generen embrio-nes secundarios. Diferentes procedimientos(basados en ltros y equipos clasicadores au-tomáticos) han sido desarrollados para selec-cionar estos embriones. Para la producción engran escala se han desarrollado varios diseñosde bioreactores y sistemas mecanizados deencapsulamiento adaptados a las particulari-dades de cada especie.

Se trabaja mucho para lograr una adecuadamaduración de los embriones que es un pro-

ceso esencial para la obtención de altos valo-res de conversión en el suelo. Investigacioneshechas con alfalfa han mostrado la utilidad delempleo de tratamientos con ácido abscísico,maltosa y del pretratamiento con temperaturasbajas (4ºC).

El almacenamiento de las semillas sintéticases otro aspecto importante a tener en cuenta.Lo ideal sería que las semillas sintéticas tuvie-ran un comportamiento similar al de la mayo-ría de las semillas verdaderas y permanecie-ran viables por mucho tiempo. Los resultadosobtenidos con semillas sintéticas de muchasespecies muestran que aún hay que trabajar arduamente para que ello ocurra. Las técnicasde la cryopreservación con nitrógeno líquidopodrían resolver este punto.

Por último lo ideal es que la semilla sinté-tica sea sembrada directamente al suelo conun alto porcentaje de conversión en plantas.Muchos factores inciden negativamente para

que ello ocurra. Por ahora en la mayoría de loscasos, las semillas sintéticas son sembradasprimeramente en cámaras climatizadas o eninvernaderos para luego ser llevadas al campo.

Cidd de semi sinéicUn aspecto de gran importancia tecnológica

es el contar con semillas sintéticas que, ade-más de no generar variantes somaclonales,tengan un alto porcentaje de conversión enplantas cuando las mismas son sembradas en

el suelo. Este aspecto está afectado por va-rios factores entre los que guran, el tipo de

embrión, la calidad del endosperma sintético,la dureza de la cápsula y la protección contraagentes patógenos.

El tipo de embrión es quizás el factor más im-portante que inuye en la calidad de la semilla

sintética. Deben poder generarse rápidamente,en grandes cantidades, no fusionarse entre sí,ni formar callos. Deben desarrollarse de mane-ra sincronizada y convertirse rápidamente enplantas. Es altamente deseable que conservensu viabilidad por largo tiempo en condicionesde laboratorio o mantenidos en refrigeradorescomerciales. Generalmente la falta de embrio-nes de calidad es el factor limitante de la pro-ducción de semillas sintéticas.

El endosperma sintético tiene que proteger

y nutrir al embrión hasta que germine y pue-da crecer autotrócamente. En este punto es

preciso recordar que si bien los embriones so-máticos son muy similares a los embriones ci-góticos, carecen de las sustancias de reservanecesarias para su conversión en plántulas. Elendosperma sintético generalmente está com-puesto de los mismos medios de cultivo quese usan para inducir la germinación in vitro delos embriones. Estos medios contienen macroy micronutrientes, vitaminas, sacarosa y sus-tancias reguladoras de crecimiento. La compo-sición de este endosperma lo hace susceptibleal ataque de patógenos, por lo que también seincorporan compuestos de acción fungicida ybactericida. Es común el agregado de 1-5 mg/Lde benomyl y de algunos antibióticos como ce-fatoxina o ampicilina.

La dureza de la cápsula puede afectar, por acción mecánica o por dicultar la respiración,

la conversión de los embriones en plantas. Es

reconocido que la dureza debe ser del ordende 0,2 y 2 Kg/cm2 de presión, la que puede ob-tener mediante una adecuada manipulación dela concentración del alginato y de los tiemposde la reacción del acomplejamiento.

Venjs de eme de semissinéicsLa mayoría de las plantas de interés econó-

mico son propagadas mediante semillas verda-deras. Éstas constituyen excelentes propágu-




los que pueden ser producidos a bajo costo, enforma rápida, y pueden ser sembrados mecáni-camente. Además la mayoría de ellas puedenser conservadas fácilmente por mucho tiempo.Sin embargo hay muchas plantas que no sepropagan mediante las semillas verdaderas ylo hacen a través de partes vegetativas (Es el

caso entre otras de la caña de azúcar, mandio-ca, ajo, frutilla, papa, batata, varios árboles yplantas ornamentales). Otras especies tienensemillas de poca calidad (Muchas coníferas).En algunos casos si bien las plantas puedenpropagarse por semillas, presentan diculta-des para su germinación (por ej. yerba mate)o bien debido al alto grado de heterocigosislas poblaciones derivadas de semillas son muy

heterogéneas (té, yerba mate, paraíso) y es re-comendable su propagación asexual. Tambiénes el caso de muchos híbridos y de plantasque no producen semillas verdaderas o bien elcaso de ciertas plantas transgénicas. En todasestas situaciones el uso de semillas sintéticases ventajosa. Las plantas serán clonadas, es

decir cada planta derivada de una semilla sin-tética será una copia el de la planta madre,

utilizando sembradoras similares a las quehoy se emplean con las semillas verdaderas.Adicionalmente las semillas sintéticas podránactuar como transportadoras de reguladoresde crecimiento, microorganismos y pesticidasque se quieran incorporar durante la siembra,los costos de los transplantes se verán redu-

Cdr 2. Necesidad de contar con semillas sintéticas en algunas plantas leñosas subtropicales de inte-rés para Argentina y Estado actual de su desarrollo.v




cidos, las poblaciones serán genéticamenteuniformes y podrán ser comercializadas cier-tos híbridos de plantas resultantes de costosasmanipulaciones manuales.

En el Cuadro 2 se señalan algunas especiespara las cuales sería necesario contar con un-sistema de semilla sintética.

La falta de una difusión más masiva de estatecnología en la actualidad obedece por unlado a razones técnicas (En muchas especiesaún no se ha logrado inducir ecientes siste-mas que permitan la generación de grandescantidades de embriones somáticos de cali-dad) y económicos (Cálculos hechos en alfalfaindican que su costo de producción supera encasi cien veces el costo de producción de lasemilla verdadera. Sin embargo, este costo escasi similar o incluso inferior al de la producción

de semillas verdaderas de algunos híbridos dealcaucil, geranio y gerbera.

CoNCluSIoNESSi bien aún el uso de la semilla sintética en la

Agricultura es insignicante y sólo es utilizada

en cierto grupos de árboles forestales, hay co-incidencia en el mundo en que esta tecnologíase va a convertir en un futuro cercano en elprincipal método de propagación de las plan-tas. Los progresos logrados en los últimos 20años han sido notables. Sin embargo hay queincrementar las investigaciones básicas sobreembriogénesis somática para luego abordar los aspectos ¨industriales¨ de la producción engran escala de las semillas sintéticas. En la Ar-gentina, si bien esta tecnología podría ser usa-da teóricamente en todas las Angiospermas yGimnospermas, en la actualidad la mayor de-manda de su utilización proviene de producto-res de plantas leñosas, con los cuales un rá-

pido diagnóstico de lo que sucede en el áreasubtropical (Cuadro 2) nos ubica a Argentinaen un estado de desarrollo inicial, con capaci-dad técnica y humana para encarar la produc-ción de las semillas sintéticas.

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IV. Capítulo 3

Cnservción de Germsmin vitro.

adrin Sccchi y Hebe Rey

abrevirs sds en ese c:DMSO (Dimetilsulfóxido); PVP (Polivinilpirro-

lidona); PVS2 (30% glicerol, 15% etilenglicol,

15% DMSO, 0.04M sacarosa), TTC (Cloruro2,3,5–Trifenil-Tetrazolio), PEG (Polietilengli-col).

InrdcciónDesde sus inicios, el hombre ha dependido

básicamente de los vegetales como fuente de

energía. Al aumentar rápidamente la población,se ha hecho necesario implantar técnicas deexplotación, en particular agropecuarias, quehan contribuido a la destrucción de las pobla-ciones pioneras vegetales que fueron productode siglos de evolución. Por otro lado, las téc-nicas modernas de producción de variedadesmejoradas altamente homogéneas han provo-cado la reducción de la variabilidad genéticade las especies cultivadas, ocasionando una“erosión genética”.

En este contexto es cuando se recurre a lasfuentes genéticas originales de la variabilidad,las que se deben preservar adecuadamente.Cuando se habla de preservación de germo-plasma hay que subrayar que el objetivo esconservar, con la mayor integridad posible, lavariabilidad genética de las poblaciones selec-cionadas.

Méds emeds r cnservción

de germsm:La estrategia a seguir para la conservaciónde germoplasma, depende de la naturaleza delmaterial vegetal, y está denida por la duración

de su ciclo de vida, el modo de reproducción yel tamaño de sus individuos. De acuerdo conestas características se han intentado diversasalternativas de conservación, que van desde eltradicional banco de semillas hasta el manteni-miento de áreas de reservas. Sin embargo, enmuchos casos el mantenimiento no es posible

y en otros casos resulta sumamente costosoy los riesgos de pérdidas por manipulación odesastres naturales son muy altos. Por lo tan-to, se buscó implantar nuevas estrategias paraconservar los recursos genéticos en forma máseciente.

Los métodos de conservación de germoplas-

ma se pueden dividir en:Métodos de Conservación in situ ;Métodos de Conservación ex situ.

Los primeros se basan en la conservaciónde las plantas en sus habitats naturales e in-cluyen la conservación en Parques Nacionalesy en Reservas Ecológicas, los cuales requie-ren un considerable espacio físico, altos cos-tos asociados a la necesidad de mano de obraespecializada, control permanente de enferme-dades y malezas, a la par que las plantas están

expuestas a las inclemencias del clima y de losincendios.

Por otra parte, los métodos de conservaciónex situ se basan en el mantenimiento del ma-terial biológico en bancos de semillas, bancosde cultivo in vitro, colecciones de plantas (encampo, viveros, jardines botánicos).

En general, los bancos de semillas consti-tuyen uno de los métodos más convenientespara la conservación de germoplasma ex situ ,porque permiten almacenar una gran variabili-dad genética en forma económica y práctica.Para la conservación de semillas la Internatio-nal Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI)recomienda su desecación hasta un 3-7% dehumedad y su almacenamiento a bajas tem-peraturas (-18ºC). Este protocolo de conserva-ción es en general el más recomendado para lamayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la deseca-ción sin que ello implique pérdida de viabilidad.

A las semillas que presentan estas caracterís-ticas se las denominan “semillas ortodoxas”como por ejemplo las semillas de arroz, trigo,avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo,en ciertos casos este método de conservaciónno es aplicado, porque la especie se propaga,en la práctica, vegetativamente (como la man-dioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bana-nos) o bien porque sus semillas pierden rápi-damente la viabilidad cuando son sometidas aprocesos de desecación. A estas semillas se




las denominan “semillas recalcitrantes”. Lassemillas de numerosas especies que viven enzonas tropicales o subtropicales se incluyen enesta categoría, como por ejemplo las de coco,cacao, frutales tropicales perennes y diversaspalmeras.

Otro método de conservación de germoplas-

ma ex situ , es mediante el cultivo in vitro de tejidos. El descubrimiento de la totipotencialidadde las células vegetales y la posibilidad de de-sarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes, ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplas-ma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Al-gunos de los primeros estudios sobre el man-tenimiento in vitro del germoplasma fueron rea-lizados en mandioca en el Centro Internacionalde Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el

Centro Internacional de la Papa (CIP). Reciénen 1980 se reconoció el potencial de los méto-dos del cultivo in vitro para la conservación deespecies de plantas "difíciles". Este término sereere a las especies propagadas vegetativa-mente en forma obligada o que tienen semillasrecalcitrantes. En estos casos, la conservaciónde los genotipos se realiza mediante el mante-nimiento de plantas vivas o mediante el cultivoin vitro de ápices caulinares o de nudos.

El mantenimiento de los recursos togenéti-cos mediante los métodos del cultivo in vitro selogra haciendo cambios en el ambiente de cul-tivo para desacelerar el crecimiento de las cé-lulas y de los tejidos. El objetivo es aumentar almáximo el período de transferencia del cultivo.Es esta necesidad la que estimuló algunos delos primeros estudios sobre el mantenimientoin vitro del germoplasma de diversas especies.Este método cubre un amplio espectro de técni-cas que implican el cultivo, bajo condiciones de

asepsia, de órganos o fragmentos de órganos(meristemas, semillas, embriones somáticos,embriones cigóticos, hojas, tallos, raíces, ye-mas, polen, anteras, callos o protoplastos), enun medio de cultivo articial denido, bajo con-diciones ambientales controladas. Esta técnicaha sido usada para mantener colecciones encrecimiento mínimo, para lo cual se requiere:reducir la temperatura, reducir las condicionesde luminosidad, modicar el medio de cultivo,

adicionar al mismo inhibidores osmóticos o re-

tardantes del crecimiento, deshidratadores detejido o modicar la fase gaseosa del recipiente

de cultivo. La modicación de uno o más de es-tos factores es usada para la conservación denumerosas especies, como por ejemplo para laconservación de microestacas de Manihot es-

culenta; de vástagos de especies de Fragaria,

Ipomoea, Rubus, Musa, Saccharum, Zingiber , Ananas, Coffea, Dioscorea y de microtubércu-los de Solanum. Estas técnicas de almacena-miento se realizan a mediano plazo, es decir,se basan en reducir el metabolismo celular ycon ello reducir el crecimiento y el número desubcultivos durante meses hasta un año, sinque ello afecte la viabilidad de los cultivos. Enel Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto deBotánica del Nordeste (IBONE), en la Facultadde Ciencias Agrarias de la UNNE, desde hace

varios años se llevan a cabo experimentos re-feridos a la conservación de germoplasma deparaíso (Melia azedarach). Utilizando comoexplantes meristemas de clones selectos deparaíso mantenidos durante 12 meses a tasasde crecimiento reducidas (medios de cultivosubóptimos o empobrecidos y en condicionesde oscuridad se logró mantener con éxito y re-generar plantas de paraíso que actualmente seencuentran en evaluación a campo (Fig. 1). Asi-mismo en el IBONE, se realizan experimentostendientes a optimizar las técnicas de conser-vación in vitro a largo plazo que consisten enel almacenamiento a temperatura del nitrógenolíquido (-196ºC) –crioconservación- con lo cualse consigue la supresión del crecimiento hastallegar a un estado de "suspensión animada".En el Laboratorio del IBONE se ha logrado conéxito la crioconservación de meristemas deparaíso aplicando la técnica de encapsulación-desidratación (Fig. 1).

Las técnicas de conservación de germo-plasma mediante el uso de la crioconservaciónofrecen varias ventajas en relación con lastécnicas tradicionales de conservación, puespermiten la conservación a largo plazo (años),presenta bajos costos de mantenimiento, unafácil manipulación de las muestras y no depen-den del suministro eléctrico.

Desde que en 1968 se informara acerca dela crioconservación de células de lino y luegode los resultados satisfactorios que se obtuvie-




ron con la crioconservación de meristemas defrutilla en el Instituto de Biotecnología de Plan-tas en Sakatoon - Canadá, se iniciaron en 1985algunas investigaciones colaborativas entre elCIAT y el IPGRI para desarrollar esta técnicacon el cultivo de meristemas de mandioca. Apartir de estos estudios, numerosos trabajosdan muestra de la importancia de esta técnica,de sus usos y aplicaciones.

La crioconservación consta de siete pasos:

1.- Seección de meri cricnservr:Cuando se realiza la selección del material

a crioconservar, se debe tener la absoluta se-guridad de que a partir del mismo se obtienenplantas completas. El explante seleccionadodepende del objetivo de conservación y estáestrechamente relacionado con el tipo de pro-

Figr 1: Estrategias para la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarach L.), desarrolla-das en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE. Facultad de Ciencias Agrarias. UNNE




pagación de la especie. Por ejemplo en el casode la mandioca, la cual se propaga principal-mente por vía asexual (mediante estacas), seconserva su germoplasma in vitro en el CIATmediante el cultivo de microestacas y tambiénde meristemas con lo cual paralelamente a laconservación se consigue el saneamiento de

los cultivares. Además, se están realizando es-tudios para la crioconservación de meristemas.

2.- Deshidrción:La deshidratación del explante es un paso

crucial para el éxito de la crioconservación, yaque es necesario eliminar toda el agua librepresente en el tejido vegetal, minimizando asílas posibles pérdidas por congelación. La des-hidratación del tejido puede realizarse en una

cámara a 0ºC o en cámaras herméticamentecerradas utilizando sustancias higroscópicascomo por ejemplo: silica gel, glicerol (5 - 20%),o sometiendo al explante a una corriente deaire en un ujo laminar de aire estéril.

3.- acimción:La aclimatación se puede realizar en forma

rápida o lenta. La aclimatación rápida consisteen colocar el explante directamente en el ni-trógeno líquido, con o sin la adición exógena

de crioprotectores; mientras que la aclimata-ción lenta se realiza bajando gradualmente latemperatura (0.1-3ºC/min.). Este punto debeser manejado cuidadosamente pues una des-hidratación excesiva de las células puede ex-ponerlas a una alta concentración interna delos solutos. Por esta razón generalmente elmaterial se congela lentamente, a una veloci-dad adecuada hasta alcanzar una temperaturapróxima a los -40ºC y luego se lleva a nitrógeno

líquido (-196ºC).Para preparar (aclimatar) al explante a lasbajas temperaturas se utilizan sustancias crio-protectoras como azúcares (sacarosa, gluco-sa); alcoholes (glicerol, etilenglicol, manitol ysorbitol), DMSO, PVP, o también pueden uti-lizarse soluciones de vitricación, que son una

combinación de crioprotectores tal como elPVS2. Tanto los crioprotectores como las solu-ciones de vitricación actúan fundamentalmen-te como agentes anti-congelantes, aumentan-

do la viscosidad del tejido vegetal y reduciendola permeabilidad de las células.

4.- almcenmieno:

De acuerdo al material vegetal que se utilice,

se presentan dos grandes sistemas:

-Sistemas Secos: comprende todos aque-

llos tejidos vegetales endógenamente resisten-

tes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la

deshidratación.

-Sistemas Hidratados: son todos aquellos

tejidos vegetales no tolerantes a las bajas tem-

peraturas y a la deshidratación por lo que se re-

quiere una protección exógena. Esta protección

puede estar dada por el uso de crioprotectores

o bien por la utilización de soluciones de vitri-

cación.

Los sistemas secos, por ser más resistentes

necesitan menor preparación para su almace-

namiento y comprende aquellas especies que

habitan zonas frías y/o templadas. En cambio,

los sistemas hidratados son más susceptibles

al frío y están representados por todas aquellas

especies que habitan zonas tropicales y sub-

tropicales, las cuales no están adaptadas para

soportar temperaturas inferiores a 0ºC, por este

motivo estos tejidos deben ser protegidos exó-

genamente mediante el uso de crioprotectores.

5.- Descongelmieno y Rehidrción:

Cuando se desea recuperar al explante del

nitrógeno líquido, se puede realizar un descon-

gelamiento rápido a Baño María (generalmente

1-2 min. a 30 ó 40ºC) o en forma lenta some-

tiendo al explante a temperatura de laboratorio

o a una corriente de aire en el ujo laminar de

aire estéril.

6.- tes de Vibilidd:

Los tests de viabilidad nos permiten com-

probar las zona/s del tejido que ha/n muerto y

cual/es ha/n sobrevivido al frío. La evaluación

de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma

visual, realizando el recultivo y determinando

la capacidad de regeneración, utilizando TTC

que colorea el tejido que ha sobrevivido a la

crioconservación; o midiendo la conductividad




eléctrica, que permite estimar el daño produci-

do en las membranas celulares.

En la última década, han surgido numerosas

técnicas que combinan el uso de crioprotecto-

res y de soluciones de vitricación con técnicas

de deshidratación y encapsulación, las cuales

básicamente pueden resumirse en técnicas de:

- Encapsulación-Deshidratación- Vitricación

- Encapsulación-Vitricación

- Desecación- Precultivo

Cdr Nº 1: Utilización de técnicas de crioconservación en diferentes explantes de algunas especies deinterés agronómico.




- Precultivo-Desecación- Gotita Congelada.

En el Cuadro Nº 1 se detallan las especiesy explantes en los cuales cada una de estastécnicas ha sido empleada con resultados sa-tisfactorios.

Encapsulación-Deshidratación: La técnica de encapsulación-deshidratación

esta basada en el desarrollo de la metodologíaaplicada a las semillas sintéticas, en la cual unexplante es recubierto por una matriz de algina-to de sodio y polimerizado en una solución decloruro de calcio formando un gel alrededor delexplante de alginato de calcio. Una vez llevadaa cabo la encapsulación, se realizan pre-tra-

tamientos generalmente con sacarosa (desde0.3 hasta 1.5M), que actúa como crioprotector del explante. En especies tolerantes al frío, laexposición de las plantas madres a bajas tem-peraturas durante varias semanas previas a lacriopreservación, incrementa la supervivencia.

La deshidratación puede llevarse a cabo so-metiendo las cápsulas de alginato (contenien-do a los explantes) a una corriente de aire en elujo laminar o exponiéndolas en cámaras her -

méticamente cerradas con silica gel. Las cáp-sulas así deshidratadas pueden ser llevadasdirectamente a inmersión en nitrógeno líquidoo bien a un descenso lento de temperatura.

Vitrifcación: Esta técnica, involucra el pre-tratamiento de

las muestras con soluciones de vitricación.

Ejemplos de estas soluciones muy utilizadasen el mundo son el PVS2 o bien otra compues-

ta por 40% etilenglicol, 15% sorbitol y 6% albú-mina sérica bovina.

Luego de la exposición a las soluciones devitricación (generalmente a una temperatura

de 0ºC para disminuir los riesgos de totoxici-dad), las muestras pueden ser sumergidas di-rectamente en nitrógeno líquido o llevadas a undescenso lento de temperatura. Las solucionescrioprotectoras usadas en los protocolos de vi-tricación, son generalmente tóxicas para las

células y el tiempo de exposición a la solución

debe estar relacionado con el tamaño del ex-plante y la misma debe ser removida rápida-mente luego del descongelado.

Encapsulación- Vitrifcación:

La técnica de encapsulación-vitricación, es

una combinación de las técnicas de encapsu-lación-deshidratación y vitricación. Las mues-tras son encapsuladas en alginato de calcioy sometidas a vitricación durante el enfria-miento. Comparada con la técnica de encap-sulación-deshidratación tiene un 30% más desupervivencia. Esto puede explicarse debido a

que las cápsulas de alginato de calcio reducen

la toxicidad de las soluciones de vitricación.

Desecación:

La técnica de desecación es un proceso muysimple que sólo requiere la deshidratación del

material vegetal, la cual es crucial para el éxito

de la crioconservación. Esta técnica consiste en

someter al explante a una corriente de aire en

un ujo laminar o en cámaras herméticamente

cerradas conteniendo silica gel; luego de lo cual

se realiza un enfriado rápido, sumergiendo el

material directamente en nitrógeno líquido.

Precultivo:La técnica del pre-cultivo, involucra la incor-

poración de crioprotectores (durante distintos

tiempos que dependen del explante) antes del

enfriamiento; como por ejemplo la adición de

altas dosis de sacarosa para la crioconserva-

ción de meristemas de Musa spp.; la utiliza-

ción de PEG y DMSO en embriones cigóticos

de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la

utilización de sacarosa y DMSO o glicerol en

semillas, embriones cigóticos, polen y anterasde Oryza spp. y la utilización de ácido abscísico

para la conservación de líneas celulares y de

callos de Oryza sativa.

Precultivo-Desecación:

Esta técnica es una combinación de dos téc-

nicas descriptas anteriormente. Las muestras

son tratadas con crioprotectores, parcialmente

desecadas y luego sometidas a enfriamiento

rápido o lento. Generalmente en el precultivo se




emplean azúcares (sacarosa, glucosa) y con un

tiempo de duración variable desde horas como

en el caso de la conservación de embriones

maduros de Cocos nucifera, en el cual el pre-

cultivo tuvo una duración de 11-20 hs., hasta 7

días como fue aplicado con éxito en embriones

somáticos de Elaeis guineensis.

Gotita Congelada:

La técnica de la microgota congelada ha sido

aplicada con éxito en ápices de Solanum tube-

rosum, la misma consiste en pretratar (2-3 hs)

con DMSO en medio líquido y formar una mi-

crogota (2.5 µl) la cual se suspende sobre papel

de aluminio y se la lleva a inmersión directa en

nitrógeno líquido. Este procedimiento es una

adaptación de la técnica clásica desarrollada

para meristemas de mandioca.

Esta técnica ha sido satisfactoriamente apli-cada en 150 variedades de Solanum tuberosum

con un porcentaje de supervivencia del 40%.

Cncsines:Los recursos togenéticos constituyen un

reservorio de información genética imprescin-dible para la solución de muchos de los proble-mas a los que se enfrenta la agricultura. Losmétodos para asegurar su conservación sondiversos y cada uno de ellos posee sus ven-tajas e inconvenientes. Por ello, se consideraque el conjunto de técnicas de conservación in

situ y ex situ , son métodos complementarios,no excluyentes, para lograr el objetivo comúnde preservar los recursos togenéticos, como

parte esencial de una estrategia global para laconservación de la biodiversidad.

En la última década se han producido avan-ces signicativos en el desarrollo de técnicas in

vitro de conservación. La disponibilidad de ban-

cos de germoplasma in vitro, tanto en condicio-nes de crecimiento lento como la conservacióna temperaturas ultrabajas (crioconservación),han contribuido a dicho avance. Algunos ejem-plos de conservación de germoplasma en cre-cimiento lento son usados como rutina en Cen-tros Internacionales, como por ejemplo, para laconservación de germoplasma de mandioca enel CIAT Cali, Colombia y para la conservaciónde germoplasma de papa en el CIP (Centro In-ternacional de la Papa) en Perú. Además, es

importante resaltar que las técnicas de criocon-servación ofrecen una alternativa muy valiosacuando se piensa en conservar los recursos -togenéticos por tiempo ilimitado (años), si bienhasta el momento solo se aplica como rutinapara la conservación de líneas celulares en la-boratorios de investigación y para la conserva-

ción de algunos genotipos pertenecientes a losgéneros Rubus spp., Pyrus spp., Solamun spp. y Elaeis guineensis.

lecrs Recmendds:

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Parte_IV

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