Papel de Los Receptores de Kainato en La Regulacion de La Transmision Sinaptica Gabaergica 0

7/25/2019 Papel de Los Receptores de Kainato en La Regulacion de La Transmision Sinaptica Gabaergica 0

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Universidad Autnoma de Madrid

Papel de los receptores de kainato en la

regulacin de la transmisin sinptica

gabargica

Antonio Rodrguez Moreno

2000

Tesis de Doctorado

Facultad deCiencias

Director: Dr. Juan Lerma Gmez


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NDICE

INTRODUCCIN....................................................................................................................1

1. RECEPTORES IONOTRPICOS DE GLUTAMATO......................................1.1. RECEPTORES DE NMDA...............................................................................................41.2. RECEPTORES DE AMPA...............................................................................................51.3. RECEPTORES DE KAINATO.......................................................................................6

1.3.1. Biologa Molecular de los receptores de kainato........................................A. La familia de subunidades de los receptores de

kainato: GluR5-7, KA1 y KA2.................................................................................7B. Distribucin de las subunidades de los receptores de kainato...............................

C. Diversidad estructural................................................................................................

1.3.2. Propiedades funcionales de los receptores de kainato............................A. Propiedades biofsicas. Propiedades de los receptoresde kainato a nivel de canal nico........................................................................10

B. Propiedades de activacin y de desensibilizacin

de los receptores de kainato..................................................................................11C. Propiedades farmacolgicas de los receptores de kainato......................................

C.1. Agonistas......................................................................................................13C.2. Antagonistas.......... .......................................................................................

D. Papeles fisiolgicos de los receptores de kainato....................................15

OBJETIVOS...............................................................................................................................17

MATERIALES Y MTODOS.......................................................................................18

1. CULTIVOS NEURONALES...........................................................................................18Microcultivos de neuronas........................................................................................................

2. RODAJAS DE CEREBRO...............................................................................................18

3.REGISTROS ELECTROFISIOLGICOS...............................................................1

3.1. Cultivos...................................................................................................................................19

3.2. Rodajas....................................................................................................................................21

4. ANLISIS DE LOS REGISTROS................................................................................2

5. SOLUCIONES........................................................................................................................24

1

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5.1. Cultivos....................................................................................................................................24

5.2. Rodajas..........................................................................................................................................

6. EXPERIMENTOSIN VIVO.................................................................................................

RESULTADOS................................................................................................................................

1. La activacin de los receptores de kainato produce una depresinde la transmisin sinptica GABArgica en el hipocampo de rata................

1.1. Kainato produce una depresin de la transmisin

GABArgica.................................................................................................................................

1.2. La modulacin de la transmisin GABArgica por kainato es de

origen presinptico.....................................................................................................................

1.3. El efecto de kainato no se debe a la activacin de los receptores

metabotrpicos de glutamato..................................................................................................1.4. CNQX antagoniza el efecto de kainato de forma dosis-dependiente..........................

1.5. Kainato no acta sobre otro tipo de receptores descritos

que regulan la liberacin de neurotransmisor.....................................................................

1.6. El agonista endgeno de los receptores de kainato, glutamato,

ejerce el mismo efecto que kainato sobre las eIPSCs.......................................................

1.7. Kainato deprime la transmisin GABArgica en la regin CA1 del

hipocampoin vivo......................................................................................................................

2. La modulacin de la liberacin de GABA por los receptoresde kainato involucra una funcin metabotrpica..................................................

2.1. La activacin de una protena G sensible a toxina pertsica

y de protena kinasa C son necesarias para que se produzca

la disminucin de liberacin de GABA mediada por la activacin

de receptores de kainato.........................................................................................................

2.2. Kainato activa una poblacin particularde PKC.............................................................

2.3. La accin de kainato es independiente de la actividad

del receptor como canal inico.............................................................................................

2.4. AMPA no activa una cascada similar................................................................................

2.5. La activacin de los receptores metabotrpicos de tipo I

no ocluye la accin de kainato.............................................................................................2.6. La activacin de los receptores de kainato modula la seal de calcio.....................

3. Las interneuronas de hipocampo presentan dos poblacionesde receptores de kainato con mecanismos desealizacin diferentes.......................................................................................................

3.1. El aumento de actividad espontnea y el descenso de amplitud de las

respuestas evocadas son efectos producidos por la activacin

de receptores de kainato diferentes......................................................................

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25

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26

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46

46


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4. La modulacin de la liberacin de GABA mediada por laactivacin de los receptores de kainato presinpticosesun fenmenocomn adiferenteszonasdel cerebro

4.1. Hipocampo................................................................................................................................

4.2. Cerebelo.....................................................................................................................................

4.3. Neocorteza................................................................................................................................

DISCUSIN.................................................................................................................................

1. La accin de kainato es presinptica....................................................................................

2. La curva dosis-respuesta para el efecto de kainato y de glutamato

presenta forma de campana...................................................................................................

3. La depresin de las corrientes inhibidoras mediada por activacin de

receptores de kainato requiere una cascada metabotrpica...........................................

4. Son las protenas exocitticas los efectores de una poblacin

especfica de PKC?....................................................................................................................

5. En las interneuronas de hipocampo coexisten las dos

poblaciones de receptores de kainato con sistemas

de sealizacin diferentes........................................................................................................

6. La modulacin de la liberacin de GABA mediada por la activacin de

receptores de kainato presinpticos es un fenmeno comn a

diferentes reas del cerebro....................................................................................................7. Relevancia fisiolgica del bloqueo de la liberacin de GABA mediada porreceptores de kainato...............................................................................................................

CONCLUSIONES...................................................................................................................

BIBLIOGRAFA.....................................................................................................................

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i

ABREVIATURAS Y ACRNIMOS.

AMPA: cido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropinico

AMPc: adenosn monofosfato cclicoATP: adenosn trifosfato

ATPA: cido (RS)--amino-3-hidroxi-5-tert-butil-4-isoxazolepropinico

BIS: bisindolilmaleimida

Ca2+: ion calcio

CA: Cornus ammonis (nombre de las subcapas del hipocampo)

CNQX: 6-ciano-7-nitorquinoxaln-2,3-diona

CV: Coeficiente de Variacin

D-AP5: cido D-2-amino-5-fosfopentanoico

DNA: cido desoxirribonucleico

DRG: ganglios de la raz dorsal

EEM: error estndar de la media

EGTA: cido etilenglicol-bis-(-aminetilter)-N, N, N, N-tetractico.

eIPSCs: corrientes postsinpticas inhibidoras evocadas

EPSPs: potenciales postsinpticos excitadores de campo

GABA: cido -aminobutrico

GTP: guanosn trifosfato

HEK: Human embryonic kidney cells (clulas embrionarias de rin humano)

HEPES: N-(2-hidroxietil) piperacina-N-(2-cido etanosulfnico)

Hz: Hercio

iGluR: receptor de glutamato ionotrpico

IP3: inositoltrifosfato

K+: ion sodio

KBPs: kainate binding proteins (protenas que unen kainato)

KDa: Kilodalton

LTD: long Term Depression (Depresin de larga duracin)

LTP: long Term Potentiation (Potenciacin de larga duracin)

M: megaohmios

Mg2+: ion magnesio

mGluR: receptor de glutamato metabotrpico


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ii

mIPSCs: corrientes postsinpticas inhibidoras miniatura

mM: milimolar

mOsm: miliosmoles

mRNA: cido ribonucleico mensajero

ms: milisegundo

mV: milivoltio

Na+: ion sodio

NMDA: N-metil-D-aspartato

pA: picoamperio

PKA: protena kinasa A

PKC: protena kinasa C

PLC: fosfolipasa C

pS: picosiemens

PTx: toxina pertsica

sIPSCs: corrientes postsinpticas inhibidoras espontneas

SNC: Sistema Nervioso Central

TEA: tetraetilamonio

TTX: tetrodotoxina

M: micromolar


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Introduccin

1

INTRODUCCIN.

Han pasado 46 aos desde que se demostr por primera vez que la aplicacin deglutamato monosdico en la corteza cerebral induca depolarizaciones masivas (Hayashi,

1954). A esta observacin puntual indicando un posible papel del glutamato como agente

excitador delSistema Nervioso Central (SNC), le siguieron estudios electrofisiolgicos ms

detallados demostrando efectos depolarizantes tanto del glutamato como del aspartato en

neuronas aisladas del SNC de vertebrados y que stos eran el resultado de un aumento de

la conductancia de la membrana a sodio.

En la dcada de los 70 se realizaron los trabajos demostrativos de que el glutamato

cumpla la mayor parte de los criterios para ser considerado neurotransmisor en el SNC de

los mamferos. La presencia de receptores para glutamato en las membranas neuronales

(Evans et al., 1979), la liberacin de glutamato por las terminales nerviosas tras la

excitacin (Hamberger et al., 1979), as como la existencia de sistemas de transporte

especficos de alta afinidad tanto en clulas gliales como en terminales nerviosas (Logan y

Snyder, 1972), apoyaron fuertemente la hiptesis de que el glutamato era el

neurotransmisor excitador por excelencia en el SNC. Adems, el conocimiento de la

existencia de rutas metablicas biosintticas y degradativas de glutamato en neuronas as

como la presencia de un transportador dependiente de ATP implicado en el almacenaje de

glutamato en vesculas sinpticas, igualmente sirvieron para consolidar esta conclusin.

En la actualidad, est bien establecido que el glutamato es el agente neurotransmisor

usado en la mayora de las sinapsis excitadoras del Sistema Nervioso Central de los

mamferos. Adems de la funcin del glutamato como mediador de la transmisin sinptica,

este aminocido participa durante la formacin del sistema nervioso en procesos de

crecimiento y maduracin neuronal, en la formacin y eliminacin de sinapsis y, en

determinadas reas y de forma dependiente de actividad, en la formacin de patrones

precisos de conectividad sinptica. Igualmente desencadena cambios duraderos en la

eficacia sinptica, fenmenos conocidos como LTP (potenciacin de larga duracin, long-

term potentiation) y LTD (depresin de larga duracin, long-term depression), que se

consideran el correlato celular de los procesos de aprendizaje y formacin de la memoria.


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Introduccin

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Adems, alteraciones de la neurotransmisin glutamatrgica estn implicadas en el dao

neuronal observado despus de episodios de isquemia y de hipoglucemia, as como en la

etiologa de una serie de estados neurolgicos patolgicos que incluyen la epilepsia y las

enfermedades de Alzheimer, de Parkinson, la corea de Huntington y la esclerosis lateral

amiotrfica.

El glutamato realiza sus funciones mediante la activacin de varias molculas

receptoras. Los receptores que el glutamato activa se han dividido en dos familias:

receptores metabotrpicos y receptores ionotrpicos. Los receptores metabotrpicos

(mGluRs) estn acoplados a protenas G (protenas que unen GTP) y regulan la produccin

de mensajeros intracelulares (Pin y Duvoisin, 1995). Esta superfamilia est formada por 8

genes diferentes (mGluR1-8), cada uno de los cuales da lugar a distintos mRNAs por

mecanismos de ayuste (splicing) alternativo. Segn el nivel de conservacin de su

secuencia aminoacdica estos receptores se han subdividido en tres grupos (tipos I, II y III)

(Nakanishi, 1992), con dos posibles mecanismos de transduccin (adenilato-ciclasa y

fosfolipasa C). Estos tres grupos presentan tambin propiedades farmacolgicas propias.

Por el contrario, los receptores ionotrpicos de glutamato (iGluRs) forman un canal

catinico con diferente selectividad inica segn el tipo de receptor, siendo permeables a

sodio (Na+), potasio (K+) y, en ocasiones, a calcio (Ca2+) (Nakanishi, 1992; Hollmann y

Heinemann, 1994).

1. RECEPTORES IONOTRPICOS DE GLUTAMATO.

Se estima que en el SNC de los mamferos, el glutamato es el neurotransmisor

empleado en el 90 % de las sinapsis excitadoras rpidas, donde acta sobre receptores

ionotrpicos (iGluR). En funcin del agonista que produce la activacin de stos con

mayor afinidad o selectividad, los receptores ionotrpicos de glutamato se han clasificado

en tres tipos: receptores de NMDA (cido N-metil-D-asprtico), receptores de AMPA

(cido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropinico) y receptores de kainato.

Desde el punto de vista molecular, los receptores ionotrpicos de glutamato son

protenas integrales de membrana formadas, probablemente, por cuatro subunidades que


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Introduccin

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Figura 1. Los receptores de glutamato se dividen en ionotrpicos (canales inicos) ymetabotrpicos (acoplados a protenas G). Los receptores ionotrpicos se subdividen en funcin

de su activacin selectiva por los agonistas NMDA, AMPA y kainato. Por su parte, los

metabotrpicos se subdividen con respecto a la homologa de sus secuencias en los grupos I, II y

III. En la figura se incluyen tambin los nombres de las subunidades conocidas a la fecha para

cada uno de los diferentes tipos de receptor y, en el receptor de NMDA, se indican los diferentes

sitios de modulacin que se conocen. AdC, adenilato ciclasa; PLC, fosfolipasa C; PA,

poliaminas.

Figura 2.Topologa de los receptores de glutamato.A)Los tres tipos de receptores ionotrpicosposeen tres dominos transmembranales (1, 3 y 4) y un segmento hidrofbico que se introduce en la

membrana de manera incompleta (2) formando la pared del canal inico. El sitio de unin del

glutamato est formado por aminocidos de la regin N-terminal y del asa entre el tercero y el

cuarto dominios transmembranales. Tambin se muestra la posicin de los diferentes sitios

modificados por la edicin y el procesamiento o ayuste alternativo de los RNA mensajeros que

codifican estos receptores y que se discuten en el texto. B)Los receptores metabotrpicos poseensiete dominios transmembranales anlogos a los observados en otras familias de receptores

acoplados a protenas G. El sitio de unin de glutamato est formado por aminocidos del

segmento N-terminal exclusivamente. C) La disposicin en el plano de la membrana de lassubunidades que conforman un receptor ionotrpico revela que se trata de un tetrmero en el queel segmento hidrofbico M2 se ubica hacia el centro de la molcula formando el poro del canal.

NH2

1 2 5 63 4 7

COOH

NH2

COOH

1 3 4

Sitio Q/R/N

flip/flop

Sitio R/G

Sitio I/V

Sitio Y/C

A B

22

GluGlu

C

M2

Canal Inico

GLUTAMATO

Zn

METABOTRPICOS

Mg

IONOTRPICOS

EXTRACELULAR

INTRACELULAR

NR1+

NR2ANR2BNR2CNR2D

GluR1-4GluR5-7KA1, KA2 mGluR1-8SUBUNIDADES

GLYGLU

PA

NMDA AMPA KAINATO mGluR I, II, III

GG

AdCPLC


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Introduccin

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forman un tetrmero (Rosenmund et al., 1998). Estas subunidades son cadenas

polipeptdicas de aproximadamente 900 aminocidos (100 KDa), las cuales estn

formadas por tres dominios transmembranales (M1, M3 y M4) y un dominiointramembranal (M2); con el extremo carboxiterminal intracelular y el aminoterminal

situado en el lado extracelular. Se han identificado 28 subunidades distintas, codificadas

por, al menos, 17 genes diferentes. Tal variedad se genera porque los RNAs pueden ser

modificados mediante mecanismos de ayuste alternativo. Adems, se conocen variantes

generadas por edicin del RNA, lo que incrementa el nmero de isoformas.

1.1. RECEPTORES DE NMDA.De los tres tipos de receptores ionotrpicos de glutamato, el mejor conocido es el

receptor de NMDA, debido sobre todo, a la rpida disponibilidad de ligandos selectivos,

como el agonista NMDA (N-metil-D-aspartato) y los antagonistas D-AP5, MK801 o

ketamina. Los receptores de NMDA son canales catinicos que permiten el paso a su

travs de Na+, K+ y Ca2+. Funcionalmente, se caracterizan por poseer una alta

permeabilidad a Ca2+ (Ascher y Nowak, 1988), presentar dependencia de voltaje debida al

bloqueo del canal por concentraciones fisiolgicas de magnesio (Mg2+)(Nowak et al., 1984;

Mayer y Westbrook, 1987), un tiempo de apertura largo (Nowak et al., 1984) y una

cintica de activacin y de deactivacin relativamente lenta (Lester et al., 1990).

Adems de los sitios de unin para el agonista, el receptor de NMDA presenta

diversos lugares de regulacin alostrica, que son diana para compuestos tanto endgenos

como exgenos. Estos sitios de unin incluyen: un sitio de alta afinidad para glicina

(Johnson y Ascher, 1987; Klecner y Dingledine, 1998; Lerma et al., 1990); un sitio

localizado en la luz del canal donde se unen el Mg2+

y molculas como las fenciclidinas

(PCP), el MK801, TCP o ketamina (Macdonald et al., 1991; Lerma et al., 1991); adems

de un sitio adicional en el que acta Zn2+inhibiendo las respuestas inducidas por el agonista

de forma independiente de voltaje (Peters et al., 1987; Westbrook y Mayer, 1987).

Finalmente, es conocido que las poliaminas espermina y espermidina potencian de forma

alostrica el receptor de NMDA (Lerma, 1992). Igualmente, se ha descrito que los

receptores de NMDA son sensibles a altas concentraciones extracelulares de H+(i.e. son

sensibles al pH) (Traynelis y Cull-Candi, 1990) y son susceptibles a los estados de


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Introduccin

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oxidacin-reduccin (Aizenman et al., 1989).

A nivel estructural estos receptores estn formados por, al menos, dos tipos de

subunidades: NR1 (Moriyoshi et al., 1991) y NR2 (Monyer et al., 1992; Meguro et al.,

1992). Esta ltima consta de cuatro isoformas, NR2A, NR2B, NR2C y NR2D. La

subunidad NR1 presenta 8 variantes generadas por ayuste alternativo (Sugihara et al.,

1992; Nakanishi et al., 1992), que tienen diferentes propiedades farmacolgicas.

Expresando en sistemas heterlogos la subunidad NR1 con cualquiera de las cuatro

subunidades NR2, se obtienen receptores de NMDA con caractersticas funcionales

similares a los nativos. La subunidad NR1 parece ser el constituyente comn de los

receptores de NMDA, puesto que ninguna de las cuatro subunidades NR2 es capaz de

generar receptores funcionales por s misma. Dependiendo de la subunidad NR2 que se

ensamble, los receptores heteromricos NR1-NR2 tienen caractersticas propias.

La subunidad NR1 se encuentra expresada en prcticamente todas las neuronas

(Moriyoshi et al., 1991) mientras que las distintas subunidades NR2 muestran patrones de

expresin espacio-temporales caractersticos en el cerebro y en la mdula espinal,

sufriendo alteraciones durante el desarrollo (Watanabe et al., 1992; Monyer et al., 1994).

Los receptores de NMDA estn involucrados en procesos fisiolgicos complejos del SNC.

Adems de participar en la transmisin normal de la informacin, la activacin de los

receptores de NMDA se requiere para la generacin de algunas formas de LTP (Nicoll et

al., 1988). Igualmente, la alta permeabilidad a calcio de los receptores de NMDA hace que

estos jueguen un importante papel en procesos de muerte celular por excitotoxicidad.

1.2. RECEPTORES DE AMPA.

La familia de los receptores de AMPA est formada por cuatro subunidades que

presentan una homologa entre ellas del 68 al 75 %. Se denominan GluR1-4 o GluRA-D,

segn el criterio seguido por el grupo que las clon. Cada una de las cuatro subunidades

presenta dos variantes generadas por procesamiento alternativo de los mRNAs,

denominadas flip o flop. Un determinante molecular importante para las propiedades

de canal de los receptores de AMPA es el aminocido situado en la posicin 586 (sitio

Q/R). En tres de las cuatro subunidades del receptor de AMPA (GluR1, 3 y 4) esta

posicin est ocupada por una glutamina (Q). Los canales formados por cualquiera de estas


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Introduccin

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subunidades presentan una marcada rectificacin entrante: dejan pasar ms corriente en

sentido entrante (potenciales de membrana negativos) que en sentido saliente (potenciales

de membrana positivos) y son significativamente permeables a calcio (Hollman et al.,

1991; Verdoorn et al., 1991; Burnashev et al.,1992). Por el contrario, la subunidad GluR2

presenta una arginina (R) en esta posicin. Este cambio hace que estos receptores

presenten rectificacin saliente (dejan pasar ms corriente a potenciales de membrana

positivos que negativos) y no permeen calcio. La subunidad GluR2 es fenotpicamente

dominante, determinando el comportamiento del canal.

De forma contraria a los receptores de NMDA, que poseen varios sitios de

modulacin, los receptores de AMPA carecen, aparentemente, de esta compleja

farmacologa. En 1990 se describi que la sustancia Aniracetam potenciaba las respuestas

de quisqualato a travs de los receptores de AMPA (Ito et al., 1990). Investigaciones

posteriores demostraron que una familia de compuestos, las benzotiodiacidas, eran capaces

de reducir la desensibilizacin de los receptores de AMPA. En este sentido, los diazxidos,

clnicamente usados como antidepresivos, son un orden de magnitud ms potentes que el

aniracetan. El compuesto ms efectivo de esta familia es la ciclotiacida que reduce

notablemente la desensibilizacin rpida de los receptores de AMPA, aumentando las

corrientes postsinpticas (Yamada et al., 1993; Patneau et al., 1993; Trussell et al, 1993).

Los receptores de AMPA se distribuyen por todo el cerebro, existiendo cambios de

expresin segn la etapa del desarrollo y el tipo de subunidad. De forma general, estos

receptores se encuentran altamente expresados en el hipocampo y en las capas

superficiales de la corteza. Por el contrario, las capas profundas de la corteza y el

caudado/putamen expresan niveles intermedios.

Adems de participar en la transmisin rpida de la informacin sinptica, estos

receptores tambin han sido involucrados en algunas formas de plasticidad sinptica.

Asimismo, una excesiva entrada de calcio a su travs en condiciones patolgicas tambin

contribuye a la muerte de las neuronas.

1.3. RECEPTORES DE KAINATO.

El receptor de kainato es el componente del sistema de sealizacin de glutamato que


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Introduccin

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se ha mostrado ms elusivo a los investigadores. La falta de herramientas farmacolgicas

especficas ha impedido la deteccin de este tipo de receptores en neuronas del Sistema

Nervioso Central (SNC), as como la determinacin de sus papeles fisiolgicos. Hasta la

clonacin de las subunidades que forman los receptores de kainato, la evidencia de su

existencia como receptores independientes era inexistente y slo recientemente se han

definido los procesos en los que estos receptores estn involucrados (Lerma, 1997a).

1.3.1. Biologa molecular de los receptores de kainato.

A. La familia de subunidades de receptores de kainato: GluR5-7, KA1 y KA2.

La familia de subunidades que puede contribuir a la formacin de receptores de

kainato nativos se puede dividir en dos subfamilias. Una primera incluye las subunidades

GluR5, GluR6 y GluR7 y muestran entre s un grado de homologa del 75-80 %. Todas

estas subunidades generan canales funcionales homomricos, conteniendo lugares de baja

afinidad para la unin de kainato. La otra subfamilia la constituyen las subunidades KA1 y

KA2, las cuales, aunque no forman canales homomricos por s mismas, generan lugares de

alta afinidad para la unin de kainato cuando se expresan en clulas de mamferos.

Mientras que las secuencias aminoacdicas de estas subunidades muestran un grado de

homologa entre s del 70 %, slo presentan un 45 % de homologa con las de la otra

subfamilia. De forma similar a las subunidades de otros receptores de glutamato, las

subunidades de los receptores de kainato se componen de aproximadamente 900

aminocidos (100 KDa) y tienen una topologa de membrana similar a la descrita para las

subunidades de los receptores de AMPA y de NMDA.

B. Distribucin de las subunidades del receptor de kainato.

Estudios de hibridacin in situ han revelado que los receptores de kainato se

encuentran ampliamente distribuidos en el sistema nervioso. Sin embargo, los patrones de

expresin de las distintas subunidades son bastante heterogneos (Wisden y Seeburg, 1993;

Bahn et al, 1994). As, el trnscrito de GluR5 se encuentra presente sobre todo en neuronas

de los ganglios de la raz dorsal (DRG), el subiculum, el ncleo septal, el crtex piriforme y

cingulado as como en las clulas de Purkinje del cerebelo (Bettler et al., 1990); GluR6 es

abundante en las clulas granulares del cerebelo, en el giro dentado y en la regin CA3 del

hipocampo, al igual que en el estriado. La subunidad GluR7 est presente con bajos niveles

en el cerebro pero, se expresa en particular en las capas profundas del crtex cerebral, el


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Introduccin

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estriado, y en las neuronas inhibidoras de la capa molecular del cerebelo. KA1 se restringe

de forma casi exclusiva a la regin CA3 del hipocampo, aunque tambin se expresa en

bajos niveles en el giro dentado, en la amgdala y en el crtex entorrinal (Werner et al.,

1991). Por el contrario, el mensajero de KA2 se encuentra prcticamente en todos los

ncleos del sistema nervioso.

Aunque las diferentes subunidades de los receptores de kainato estn ya presentes a

nivel embrionario, la expresin emerge durante el perodo postnatal. As, la cantidad de

mRNA de GluR5 alcanza un pico entre P0 y P5, y luego comienza a declinar hasta los

valores adultos. Esto ocurre tambin con otras subunidades.

C. Diversidad estructural.

Los receptores de kainato tienen la misma topologa transmembrana y la misma

estequiometra que los receptores de AMPA y de NMDA. Es decir, son tetrmeros en los

cuales cada monmero lleva su propio lugar de unin y contribuye con una secuencia de

aminocidos especfica a la formacin del lumen del canal, llamado segmento M2. Ese

segmento est compuesto por residuos hidrofbicos que entran en la membrana formando

una estructura en forma de horquilla. Adems de esta secuencia hidrofbica, cada

subunidad posee tres segmentos transmembrana (M1, M3 y M4) distribuidos de tal forma

que el dominio N-terminal de la protena se sita extracelularmente y la regin C-terminal

est localizada intracelularmente (Hollmann et al., 1994; Roche et al., 1994; Taverna et

al., 1994; Wo y Oswald, 1994; Bennet y Dingledine, 1995). Por analoga con los datos

disponibles para los receptores de AMPA, se supone que el sitio de unin a glutamato en

los receptores de kainato est formado por residuos distribuidos entre el dominio N-

terminal y el lazo extracelular existente entre los segmentos M3 y M4 (Stern-Bach et al.,

1994). Sin embargo, la estructura real del bolsillo de unin a kainato debe presentar

diferencias significativas entre los distintos receptores de glutamato, que podran ayudar a

explicar, entre otras cosas, porqu los receptores de AMPA pueden unir kainato con alta

afinidad mientras que algunos receptores de kainato no son capaces de unir AMPA.

Algunas subunidades de los receptores de kainato se presentan como isoformas

generadas por ayuste alternativo (e.g. Sommer y Seeburg, 1992). La subunidad GluR5 fue

inicialmente descrita en dos formas moleculares que difieren en la presencia (GluR5-1) o


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Introduccin

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ausencia (GluR5-2) de un fragmento de 15 aminocidos en el extremo N-terminal (Bettler

et al., 1990). Anlisis adicionales revelaron la existencia de dos formas moleculares

adicionales para GluR2 (Sommer et al., 1992), que difireren en regiones del extremo

carboxiterminal, por lo que la subunidad GluR5-2 puede presentar 3 regiones o dominios

C-terminal diferentes. Estas isoformas se denominaron GluR5-2a (la ms corta), GluR-2b y

GluR5-2c (la ms larga). Se desconoce si estas isoformas presentan el mismo

comportamiento farmacolgico, puesto que es la subunidad GluR5-2a la que se ha

estudiado ms, debido a que es la ms eficiente a la hora de expresarse cuando se

transfecta en clulas de mamferos (Sommer et al., 1992). La existencia de ayuste o

procesamiento aternativo no se ha descrito para las subunidades GluR6, KA1 y KA2. Por

el contrario, recientemente se ha descrito que la subunidad GluR7 existe en dos variantes

generadas por ayuste alternativo del extremo C-terminal, denominadas GluR7a y GluR7b.

(Schiffer et al., 1997).

Aunque se ha demostrado que las variantes por ayuste alternativo de otros receptores

de glutamato son fundamentales para la funcin del receptor, las implicaciones funcionales

de estas variaciones de los receptores de kainato todava estn por determinar. Se podra

hipotetizar que estas variantes con diferentes secuencias C-terminales podran

interaccionar con diferentes protenas del citoesqueleto dotando al receptor de un

mecanismo de interaccin diferencial con distintos sistemas de sealizacin (e.g.

Nishimune et al., 1998; Osten et al., 1998; Ehlers et al., 1996).

De forma similar a otros muchos receptores de neurotransmisores (ver Swope et al.,

1992 para revisin), las subunidades de los receptores de kainato contienen sitios consenso

de fosforilacin para diversas protenas kinasas. As, un residuo de serina en la posicin

684 parece ser el principal sitio de fosforilacin para la protena kinasa A (PKA).

Se dispone de algunas subunidades clonadas de pollo, sapo o peces que no forman

canales funcionales ni receptores heteromricos con otras subunidades cuando se expresan

en sistemas recombinantes. Estas subunidades han sido designadas protenas que unen

kainato (KBP, kainate-binding proteins), (ver Henley, 1994 para revisin).

La edicin de los mRNA es una fuente de heterogeneidad molecular para


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Introduccin

10

determinadas protenas (Cattaneo, 1991; ver Sommer y Seeburg, 1992 para revisin). Las

subunidades GluR5 y GluR6, pueden sufrir edicin postranscripcional del mRNA en un

sitio localizado en la posicin 590 (GluR6) o 591 (GluR5), conocido como sitio

glutamina/arginina (Q/R). Es conocido que las propiedades de rectificacin de los

receptores de kainato estn controladas exclusivamente por el sitio Q/R, de forma anloga

a lo observado para los receptores de AMPA (Herb et al., 1992, Egebjerg y Heinemann,

1993; Kler et al., 1993). La versin no editada codifica para una glutamina (Q) y muestra

una clara rectificacin entrante, mientras que la versin editada codifica para una arginina

(R) en esta posicin y no rectifica (Egebjerg y Heinemann, 1993). GluR6 puede sufrir

tambin edicin en dos sitios adicionales localizados en el primer dominio transmembrana,

donde una isoleucina puede ser sustituida por una valina (sitio I/V) y una tirosina puede ser

sustituida por una cistena (sitio Y/C). La edicin del RNA en estas posiciones tiene

consecuencias funcionales en los canales GluR6 homomricos. Se ha visto que la

permeabilidad a calcio de los canales GluR6 es modulada por el sitio Q/R, cuando los sitios

I/V y Y/C del primer dominio transmembrana estn editados (Khler et al., 1993). El

alcance de la edicin es regulado durante el desarrollo. A diferencia de la subunidad GluR2

de los receptores de AMPA, una proporcin significativa de subunidades de receptores de

kainato no editadas est presentes tanto en el cerebro embrionario como en el adulto

(Paschen et al., 1997; Bernard y Khrestchatisky, 1994). Igualmente, se ha observado la

edicin parcial de las subunidades GluR5 en el sitio Q/R tambin en neuronas individuales

de hipocampo de rata adulta (Mackler y Eberwine, 1993). Aproximadamente el 60 % de

los mRNAs de GluR5 se encuentran editados en tejido adulto, mientras que para GluR6 la

proporcin encontrada es del 80 %.

1.3.2. Propiedades funcionales de los receptores de kainato.

A. Propiedades biofsicas. Propiedades de los receptores de kainato a nivel de canal

nico.

Los receptores homomricos editados GluR6(R) y GluR5(R) presentan una

conductancia unitaria del orden de femtosiemens. La edicin del sitio Q/R altera de forma

drstica la conductancia de canal nico, en el sentido que la forma no editada (Q) presenta

una conductancia unitaria mucho mayor. La combinacin de las subunidades GluR5 (R) o

GluR6 (R) con KA2 produce receptores heteromricos que tienen 2-3 veces mayor


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Introduccin

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conductancia que sus respectivos homomricos en la forma R, pero muestran menor

afinidad por su agonista (Howe, 1996; Swanson et al., 1996). Sin embargo, GluR6(Q)/KA2

presenta caractersticas de canal nico que son indiferenciables de las que presentan los

receptores homomricos GluR6 (Q), aunque la coexpresin de KA2 y GluR5 (Q) acorta la

duracin de las respuestas cuando se compara con los canales homomricos (Swanson et

al., 1996). Este efecto est de acuerdo con el hecho de que los mRNAs de las subunidades

KA1 y KA2 no son susceptibles de ser editados y ambos llevan una Q en el lugar Q/R.

En clulas embrionarias de rin (HEK) que expresan la forma Q de GluR5 o de

GluR6 en receptores homomricos (o heteromricos con KA2), se realizaron registros de

corrientes en la configuracin de parches de membrana escindidos, que permitieron

resolver tres niveles de subconductancias (Swanson et al., 1996).

Recientemente, se ha descubierto que la corriente de canal nico media de los

receptores de glutamato tambin depende de cuntos de los sitios de unin para agonista

estn ocupados (Rosemund et al., 1998) mientras el receptor no entre en estado

desensibilizado.

B. Propiedades de activacin y de desensibilizacin de los receptores de kainato.

Un sello de identidad de los receptores de kainato es que en presencia continuada del

agonista, la corriente que fluye a travs de los canales activados decae rpidamente. Ello se

debe a la desensibilizacin del receptor. En neuronas de hipocampo en cultivoel desarrollo

de la desensibilizacin sigue una curva exponencial nica (Lerma et al., 1993; Paternain et

al., 1998), aunque tambin se ha observado procesos que se ajustan mejor a una

exponencial doble (Lerma et al., 1993; Wilding y Huettner, 1997). La conclusin que

permiten alcanzar los datos observados por algunos autores en diferentes preparaciones es

que la desensibilizacin de los receptores de kainato es un proceso rpido y muy marcado.

La desensibilizacin del receptor sigue una exponencial con una constante de tiempo de

11-13 ms tanto en neuronas de hipocampo como en canales GluR6 recombinantes (Lerma

et al, 1993; Paternain et al, 1998). La velocidad de desensiblizacin estimada para

receptores GluR6 en parches de membrana escindidos es ms rpida (5-8 ms; Heckmann et

al., 1996; Traynelis y Wahl, 1997), pero no muy diferente a los valores medidos en

condiciones de clula completa.


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Introduccin

12

Por el contrario, la recuperacin de la desensibilizacin de los receptores de kainato es

muy lenta. La recuperacin total de la respuesta inducida por glutamato en neuronas de

hipocampo se obtiene despus de 15 segundos de una aplicacin inicial, aunque la

velocidad de recuperacin depende del agonista usado para desensibilizar el receptor

(Paternain et al, 1998). Es necesario esperar 1 minuto para recuperar la amplitud inicial en

clulas de hipocampo, cuando se usa kainato para desensibilizar el receptor. En general la

recuperacin de la desensibilizacin sigue una exponencial simple, con una constante de

tiempo que depende del tipo de subunidades que componen el receptor. Por ejemplo, los

receptores homomricos GluR5 cuando son desensibilizados con (S)-5-IW se recuperan en

2.5 minutos, mientras que los receptores heteromricos GluR5/KA2 se recuperan de la

desensibilizacin con una constante de tiempo de 12 segundos (Swanson et al. 1998).

Independientemente del tipo de subunidad estudiada, estos datos implican que los

receptores de kainato tienden a estar largos perodos de tiempo en el estado desensibilizado

y que este estado puede ser considerado como un estado absorbente ya que el equilibrio

est casi completamente desplazado en este sentido. El anlisis de las curvas dosis-

respuesta para el agonista endgeno, ya sea para receptores nativos o recombinantes,

permiten concluir que los receptores de kainato no tienen una alta afinidad por glutamato.

Sin embargo, en trminos de desensibilizacin en el estado estacionario, los receptores de

kainato son muy sensibles a la concentracin ambiente de agonista. Estos receptores son

aproximadamente dos rdenes de magnitud ms sensibles al agonista para su

desensibilizacin que para su activacin.

El clculo de la desensibilizacin en el estado estacionario para los receptores de

kainato expresados por las neuronas de hipocampo en cultivo da un valor de IC50, (i.e. la

concentracin de agonista a la cual el 50 % de los receptores se desensibilizan), de

aproximadamente 3 M para glutamato (Paternain et al., 1998). Esto significa que a

concentraciones de glutamato incapaces de producir activacin, los receptores estn

desensibilizados. Lo mismo ocurre cuando se usa kainato como agonista. Esta diferencia de

sensibilidad entre activacin y desensibilizacin tambin se encontr en receptores GluR6

recombinantes (Heckmann et al., 1996; Paternain et al., 1998). Curiosamente, los

receptores GluR6 recombinantes son ms sensibles a la desensibilizacin por glutamato

(IC1/2de 0.3 M) que los nativos. Por el contrario, son menos sensibles a la activacin por


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Introduccin

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glutamato (EC50de 500-700 M).

C. Propiedades farmacolgicas de los receptores de kainato.

El principal obstculo para el estudio de los receptores de kainato ha sido la falta deagonistas y antagonistas especficos. El desarrollo de agonistas y antagonistas especficos

de los receptores de NMDA ha permitido determinar numerosos procesos en los cules

estos receptores estn involucrados. Sin embargo, la separacin funcional de los receptores

nativos de kainato y de AMPA en neuronas ha sido dificultosa ya que ambos receptores se

activan por la misma coleccin de agonistas, y durante mucho tiempo se denominaron

genricamente receptores de tipo No-NMDA. Por ejemplo, el AMPA carece de efecto

sobre los receptores de kainato recombinantes (Egebjerg et al., 1991; Herb et al., 1992)

dado que es completamente inactivo sobre GluR6 y GluR7 y presenta una EC50de 3 mM

para GluR5 (Sommer et al., 1992). De forma similar, AMPA no activa los receptores de

kainato nativos en cultivos de neuronas de hipocampo, y slo a altas concentraciones a los

presentes en clulas de los ganglios de la raz dorsal (DRG) de la mdula espinal (Huettner,

1990; Lerma et al., 1993; Wong et al., 1994). Sin embargo, kainato, aunque con menor

afinidad que para los receptores de kainato, activa todos los tipos de receptores de AMPA

a dosis relativamente bajas.

C.1. Agonistas.

La afinidad de kainato por sus receptores vara segn la composicin de subunidades

de los mismos. Los valores de EC50calculados para las distintas subunidades en sistemas

recombinantes corresponden a 33.6 M para GluR5 (Sommer et al., 1992), 299 M para

GluR6 (Paternain et al., 1998) y >1 mM para GluR7. Una situacin similar se encontr

cuando se us glutamato como agonista (631 M para GluR5, 270-762 M para GluR6 y5.9 mM para GluR7). Estos datos nos indican que los receptores de kainato no muestran

alta afinidad ni por kainato ni por glutamato.

Adems de kainato y glutamato, se han encontrado algunas molculas capaces de

activar los receptores de kainato con cierto grado de especifidad. El domoato, una toxina

que se aisl de mejillones contaminados con algas, tiene 20-25 veces mayor preferencia por

los receptores de kainato que por los de AMPA en clulas de DRG y en receptores GluR5recombinantes (Huettner et al., 1990; Sommer et al., 1992), aunque es inactivo sobre


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Introduccin

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GluR7 (Schiffer et al., 1997).

El cido (RS)--amino-3-hidroxi-5-tert-butil-4-isoxazolepropinico (ATPA), un

derivado de AMPA, ha sido descrito como agonista selectivo de receptores recombinantesGluR5. La EC50para ATPA es 0.6 M para receptores nativos en neuronas de DRG y de

2.1 M para receptores GluR5 recombinantes, un orden de magnitud mayor que kainato

(Clarke et al., 1997). Al mismo tiempo su afinidad por los receptores de AMPA es unas

500 veces ms baja.

El derivado de willardina, (S)-5-iodo-wilardina, muestra una selectividad de unas 130

veces mayor para los receptores de kainato que para los de AMPA. Su EC50es 140 nM.

C.2. Antagonistas.

La bsqueda de antagonistas de los receptores de kainato no ha sido tan exitosa como

la bsqueda de agonistas. La primera generacin de antagonistas de los receptores de

glutamato de tipo No-NMDA, las quinoxalinodionas (CNQX; DNQX y NBQX), son

incapaces de discriminar entre los receptores de AMPA y los de kainato. El compuesto

denominado NS102, otro antagonista de receptores de tipo No-NMDA, fue descrito comoun producto que, en membranas de corteza, inhibe completamente la unin de kainato

(Johansen et al., 1993). Adems, NS102 antagoniza parcialmente las respuestas generadas

por activacin de receptores GluR6 en clulas embrionarias de rin (HEK) con un IC50de

2.2 M (Verdoorn et al., 1994). Sin embargo, NS102 tambin es activo sobre los receptores

de AMPA, aunque de forma menos potente. Por ello, esta droga se consider ineficaz para

separar las actividades mediadas por ambos receptores (Paternain et al., 1996; Wilding y

Huettner, 1996).

El desarrollo de las 2,3-benzodiazepinas como antagonistas de los receptores de

AMPA (ver Vizi et al., 1996 para revisin), y la posterior demostracin de que estos

compuestos son selectivos para estos receptores (Paternain et al., 1995; Wilding y

Huettner, 1995), ha sido crucial para el entendimiento de la funcin de los receptores de

kainato. En particular GYKI 53655 (LY300168 segn el cdigo de Elli Lilly) es un

antagonista no competitivo de los receptores de AMPA, capaz de bloquear completamenteestos receptores a una concentracin de 100 M. A esta concentracin, no ejerce


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Introduccin

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antagonismo sobre los receptores de kainato, y por ello ha sido usado para desenmascarar

las corrientes de kainato en neuronas maduras (Paternain et al., 1995; Wilding y Huettner,

1997). Aunque GYKI 53655 es la mezcla racmica, presenta una IC50 de 1M para

antagonizar los receptores de AMPA (Paternainet al

., 1995; Wilding y Huettner, 1997),siendo el ismero activo, LY303070, ms potente.

Recientemente, se ha desarrollado una nueva serie de compuestos que muestran una

diferente sensibilidad para los receptores de AMPA y de kainato. LY293558 inhibe GluR5

pero no GluR6. Sin embargo, este compuesto tambin antagoniza las respuestas mediadas

por los receptores de AMPA (Bleakman et al., 1996). Otro derivado, LY294486, muestra

mayor selectividad para GluR5, y ms recientemente se ha demostrado que el compuesto

LY382884 es especfico para antagonizar la unin a los receptores GluR5, no presentando

afinidad significativa por las subunidades de los receptores de AMPA GluR1,2,3 ni por las

de kainato GluR6, GluR7 y KA2 (Simmons et al., 1998).

1.3.3. Papeles fisiolgicos de los receptores de kainato.

La primera evidencia acerca de la existencia de receptores de kainato se obtuvo en el

sistema nervioso perifrico. Los primeros estudios mostraron que los nervios perifricos dela raz dorsal de ratas inmaduras, especficamente las fibras de tipo C, se depolarizaban con

kainato, un efecto que luego se observ que se deba a la inactivacin de canales de sodio

dependientes de voltaje (Davies et al., 1979; Agrawal y Evans, 1986). Estudios posteriores

demostraron que la aplicacin de kainato en clulas disociadas de los DRG induca

respuestas que se desensibilizaban rpidamente (Huettner et al., 1990), un efecto

sorprendente puesto que, el conocido hasta ese momento, se corresponda con una

respuesta a kainato sostenida debido a la activacin de los receptores de AMPA por

kainato. La posterior demostracin de que los receptores de kainato producan respuestas

desensibilizantes cuando se expresaban en sistemas heterlogos as como la localizacin de

subunidades de receptores de kainato en clulas de DRG, condujeron a la aceptacin de

que las respuestas observadas se deban, efectivamente, a la activacin de receptores de

glutamato de tipo kainato. Este constituy la primera evidencia de la presencia de

receptores de kainato especficos.

La disponibilidad del GYKI53655 como antagonista selectivo de los receptores de


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Introduccin

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AMPA, hizo posible el estudio de la participacin de los receptores de kainato en la

transmisin sinptica excitadora. Los primeros experimentos en cultivos de neuronas de

hipocampo indicaban que, al contrario que los de AMPA, estos receptores no participaban

en la transmisin sinptica excitadora. Aunque se demostr que las neuronas estudiadas

tenan receptores de kainato, no fue posible provocar corriente postsinptica alguna en

presencia de antagonistas de los receptores de AMPA y de NMDA (Lerma et al., 1997b).

Sin embargo, estudios posteriores en rodajas de hipocampo han permitido identificar una

serie de sinapsis donde los receptores de kainato parecen mediar una fraccin pequea de

la corriente sinptica. En este sentido, se ha demostrado que se pueden inducir corrientes

excitadoras postsinpticas (EPSCs) con caractersticas farmacolgicas propias de los

receptores de kainato en las sinapsis formadas por la fibras musgosas y las neuronas

piramidales de CA3 (Castillo et al., 1997; Vignes y Collingridge, 1997). Sin embargo, estas

respuestas slo se observan en circunstancias de actividad presinptica repetitiva y podran

reflejar disposicin extrasinptica de los receptores.

La corriente inducida por estos trenes de estmulos est ausente en ratones a los que se

les ha anulado el gen GluR6 (Mulle et al., 1998), lo que indica que los receptores de

kainato que contienen la subunidad GluR6 participan en la transmisin sinptica a nivel

fibra musgosa-neurona de CA3. Adems del hipocampo, se ha identificado la presencia de

receptores postsinpticos de kainato en neuronas de la amgdala lateral (Li y Rogawski,

1998), en neuronas del asta dorsal de la mdula espinal (Li et al., 1999) (posiblemente

implicados en nocicepcin), en algunas clulas bipolares de la retina (DeVries y Schwartz,

1999) y en el crtex cerebral (Kidd e Isaac, 1999).


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Objetivos

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OBJETIVOS.

Teniendo en cuenta la disponibilidad del antagonista especfico de los receptores de AMPA,

GYKI53655, se plante determinar el papel de los receptores de kainato en la fisiologacerebral. Para ello, en la presente tesis se han abordado los siguientes objetivos generales:

1. Determinar el papel de los receptores de kainato en la modulacin de la transmisin

sinptica inhibidora en el hipocampo.

2. Determinar el/los mecanismos mediante los cules estos receptores interfieren con la

transmisin inhibidora.


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Materiales y Mtodos

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MATERIALES Y MTODOS.

1. CULTIVOS NEURONALES.

Microcultivos de neuronas.

Las neuronas de hipocampo se cultivaron en condiciones de microcultivo (Fotografa

1), segn el protocolo descrito por Bekkers y Stevens (1991) con algunas modificaciones

(Lerma et al., 1997b). Las clulas se disociaron de hipocampos aislados de embriones de 17-

18 das de gestacin y se sembraron a una densidad de 100 clulas/mm2en placas de Petri de

35 mm (Nunc). Cuarenta y ocho horas antes de comenzar el cultivo, el fondo de las placas de

Petri fue recubierto con una fina capa de agarosa estril (0.2 %) que se dej secar en elinterior de un incubador a 37 C. Antes de comenzar la disociacin, se pulveriz sobre la

agarosa una solucin que contuvo poli-D-lisina (100 g/ml) y laminina (16 g/ml), con el

objeto de producir mltiples microgotas de sustrato permisivo. La pulverizacin se ajust para

obtener islas con un dimetro de aproximadamente 100 m, con una densidad de 30-50

gotas/mm2.

El medio de cultivo usado fue Neurobasalcon suplemento B27al 4 %, (ambos de

Gibco) (Brewer et al., 1993) al que se aadi glutamina (0.5 mM), mercaptoetanol (25 M)

(Grill y Pixley, 1993), penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). En los das

de cultivo 4, 7, 14 y 21 un 40 % del medio de cultivo de cada placa se reemplaz con medio

fresco. Tras una semana de cultivo, la distribucin aleatoria de las neuronas en las placas

permiti encontrar numerosas islas ocupadas por una sla neurona as como microgotas

conteniendo dos o ms clulas. En aquellas gotas que slo albergaban una neurona, esta al

crecer y desarrollarse termina estableciendo contactos sinpticos con ella misma (autapsis) y

en aquellas gotas en las cules se encuentran dos neuronas estas establecen contacto entre s y

as se obtuvieron conexiones heterosinpticas.

2. RODAJAS DE CEREBRO.

Las rodajas de hipocampo fueron preparadas de acuerdo con los procedimientos

descritos (Stuart et al., 1993), a partir de ratas Wistar de 14-16 das de edad. Brevemente, tras

sacrificar el animal por decapitacin, el cerebro fue sumergido en una solucin fra


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Materiales y Mtodos

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conteniendo (en mM) 124 NaCl, 2.69 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 MgSO4, 1.8 CaCl2, 26 NaHCO3y

10 glucosa (300 mOsm). El cerebro completo conteniendo los dos hipocampos se posicion

sobre la platina de un vibratomo (Word Precision Instruments, VSLM1) y se seccion para

obtener rodajas transversales de 350 m. Las rodajas fueron transferidas a una cmara de

incubacin conteniendo la solucin descrita que se mantuvo oxigenada continuamente (95 %

O2, 5 % CO2, pH=7.4). As se mantuvieron a temperatura ambiente durante, al menos, una

hora antes de ser usadas para los registros electrofisiolgicos.

Las rodajas de cerebelofueron obtenidas usando igual metodologa que en el caso de

las rodajas de hipocampo, salvo que en este caso se posiciona sobre la platina del vibratomo

slo el cerebelo que ha sido previamente separado del resto del cerebro, el cual se orient de

forma que al seccionar se obtuvieron rodajas sagitales del mismo.

Las rodajas de corteza se obtuvieron usando igual metodologa y soluciones que las

descritas para la obtencin de rodajas de hipocampo.

3. REGISTROS ELECTROFISIOLGICOS.

3.1. Cultivos.

Se hicieron registros de actividad sinptica entre pares de neuronas interconectadas

entre s y tambin en neuronas que establecen conexiones sinpticas consigo mismas. En los

pares de neuronas, una de ellas se utiliz como clula presinptica y la otra como neurona

postsinptica, de forma que se hizo disparar la neurona presinptica (aplicndole pulsos

depolarizantes) y las corrientes as evocadas se registraron en la clula postsinptica. En el

caso de las conexiones autpticas la misma neurona se us como pre y postsinptica.

Los registros se obtuvieron usando las tcnica depatch clampen su configuracin de

clula completa (whole cell) en condiciones de fijacin de voltaje (Hamill et al., 1981) para la

clula postsinptica, para lo cual se us un amplificador Axopatch-200A y en condiciones de

fijacin de corriente para la clula presinptica, para lo cual se us un amplificador

Axoclamp-2A. Para el caso de los registros obtenidos de conexiones autpticas se us un

amplificador Axopatch-200A y se obtuvieron los registros en condiciones de fijacin de

corriente.


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Materiales y Mtodos

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Fotografa 1. Dos neuronas creciendo en microcultivo. Estas neuronas establecen

contactos sinpticos entre s y consigo mismas. La imagen corresponde a neuronas de un

cultivo de aproximadamente 21 das.


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Materiales y Mtodos

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Las micropipetas se fabricaron a partir de capilares de borosilicato en un estirador de

pipetas horizontal (Sutter P-81), y tuvieron una resistencia de 2.5-5 Mcuando se llenaron

con la solucin interna. Con el fin de minimizar los cambios en el potencial de punta del

electrodo cuando se intercambiaron las soluciones, el bao se conect al amplificador

mediante un puente salino de agar (2 %; NaCl 135 mM) y mediante un hilo de plata

previamente clorurado en una solucin de cido clorhdrico 1 N.

Las respuestas fueron supervisadas continuamente con un osciloscopio (Tektronix

TDS 310). Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25 C).

Las seales electrofisiolgicas se filtraron a 1-2 KHz, se digitalizaron mediante un

convertidor analgico-digital (Lab-Master TM-40, Axon Instruments, USA) y se almacenaron

en un ordenador personal usando el programa de adquisin de datos Clampex (versin 5.5.1,

pClamp 5.6, Axon Instruments, USA). El programa Clampex igualmente permiti generar

protocolos de estimulacin que fueron usados para imponer cambios de voltaje a las clulas a

travs del amplificador.

3.2. Rodajas.

Las rodajas se transfirieron a una cmara de registro, montada sobre un microscopio

(Axioscop, Zeiss) y se mantuvieron en posicin mediante una rejilla de hilos de nylon con un

armazn de platino. Esta cmara se perfundi a razn de 3-4 ml/min con una solucin externa

igual a la descrita para la obtencin de las rodajas. Las clulas de las rodajas se visualizaron

por videomicroscopa infrarroja de contraste interdiferencial (IR-DIC) (Stuart et al., 1993) a

travs de un objetivo de inmersin en agua 40x. Las soluciones se aplicaron por gravedad

cambiando entre cuatro lneas de perfusin mediante una electrovlvula de multiples vas.

Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25 C).

En el hipocampo, las corrientes inhibidoras postsinpticas (IPSCs) se indujeron

mediante pulsos elctricos aplicados con un electrodo bipolar colocado en el stratum oriens, a

50-150 m del lugar de registro. Los electrodos se fabricaron con capilares de borosilicato

presentando una resistencia de 5-10 M cuando se llenaron con la solucin interna. Las

corrientes se registraron en el soma de neuronas de la capa CA1 o CA3 en la configuracin de

clula completa tras el establecimiento de sellos >1 G.


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Materiales y Mtodos

22

Para obtener respuestas inhibidoras al registrar el soma de clulas de Purkinje se

estimul (con un electrodo igual al descrito para hipocampo) en la zona de la capa molecular

cerca de la capa de clulas de Purkinje. Para obtener respuestas inhibidoras en las clulas de

los ncleos profundos del cerebelo se estimul en la zona de los terminales axnicos de las

clulas de Purkinje y se registr en el soma de las clulas de los ncleos profundos del

cerebelo.

En las rodajas de corteza, se obtuvieron registros de los somas de la neuronas

piramidales situadas en la capa V, estimulando las interneuronas situadas en las proximidades

de estas neuronas piramidales.

En todas los casos us un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments). La

resistencia de acceso fue monitorizada continuamente durante los registros, los cuales fueron

rechazados si durante un experimento sufri un cambi >15 %. Las seales electrofisiolgicas

se filtraron a 1-2 KHz, se digitalizaron y se almacenaron en el disco duro de un ordenador

personal.

Las corrientes elementales (miniatura, mIPSCs) fueron registradas durante periodos de180-360 segundos bajo cada situacin experimental en presencia de tetrodotoxina (TTX; 0.5-

Figura 3. Diseo experimental para la obtencin de

registros de las clulas de la regin CA1 del hipocampo.Como se observa en la figura, el electrodo de estimulacin

se coloca en elstratum oriensy la pipeta de registro en las

neuronas de la capa CA1 del hipocampo.

Estimulacin

St. Oriens

CA3

CA1

St. Radiatum

Registro


29/85

Materiales y Mtodos

23

1M). Estas respuestas miniatura fueron adquiridas usando el programa Axotape 2.0 (Axon

Instruments) y almacenados en el disco duro del ordenador.

4. ANLISIS DE LOS REGISTROS.

Los registros se analizaron con el programa Clampfit, versin 6.02 (Axon Instruments,

USA). Las respuestas miniatura se analizaron, adems de con Clampfit, con Fetchan 6.02 y

con el programa de anlisis de corrientes elementales Snap, diseado en el Instituto Cajal por

el Dr. Imanol Martnez-Padrn. El anlisis estadstico se realiz usando los programas

SigmaPlot y Origin, versiones 2.0 y 3.5, respectivamente.

El grado de inhibicin (o de incremento) de la amplitud de las respuestas se calcul

como [1-(IPSCtest /IPSCcontrol)]100. Donde, IPSCtestrepresenta la amplitud de las corrientes

(en pA) tras aplicar kainato, glutamato o cualquier otra sustancia, segn el caso, a las clulas

en cultivo o a las rodajas y IPSCcontrol representa la amplitud (en pA) de las corrientes antes de

aplicar alguna sustancia a las clulas cultivadas o a las rodajas.

El Coeficiente de Variacin libre de ruido (CV) de las corrientes inhibidoras se calcul

como:

IPSC

ruidoIPSC

amplitudCV

)()(22

=

donde 2(IPSC)y 2

(ruido)son la varianza de las respuestas de corriente y la varianza del ruido

basal, respectivamente. La razn de CV en ambas situaciones (CVR) se obtuvo para cada

neurona como CVka/CVcontrol. La grfica comparando la variacin en la amplitud media de las

IPSCs (M) con respecto al estadstico 1/CV2 que refleja el cambio en la varianza de la

amplitud de las respuestas, se construy como se describe en Bekkers y Stevens (1990) y

Malinow y Tsien (1990; ver tambin Siegelbaum y Kandel, 1991 para una mayor

explicacin).

Las corrientes miniaturas fueron analizadas tras ser detectadas usando un programa de

deteccin. Este calcul la primera derivada de la corriente registrada, teniendo en cuenta slo


30/85

Materiales y Mtodos

24

aquellas respuestas que sobrepasan un umbral aleatorio, (tpicamente 1.5 veces la amplitud

del ruido; i.e. 8-12 pA). En algunos casos, la deteccin se hizo bajo control visual. Con el fin

de comprobar si las condiciones de registro influenciaron las variaciones en la amplitud

espontnea de las mIPSCs, se representaron tanto el tiempo de subida frente al tiempo de

cada de los eventos registrados en cada clula. Estos dos parmetros no mostraron ningn

tipo de correlacin significativa por lo que se conluy que el filtro electrotnico no fue una

fuente importante de variacin. La frecuencia de mIPSCs fue calculada mediante la

exponencial de las distribuciones cumulativas tanto de los intervalos como de las amplitudes.

Las distribuciones obtenidas tras la aplicacin de kainato o de glutamato se compararon

estadsticamente con las obtenidas en condiciones control usando el test de Kolmogorov-

Smirnov.

5. SOLUCIONES.

5.1. Cultivos.

Solucin extracelular.

La solucin externa usada consisti (en mM) en: 165 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 2

MgCl2, 20 Glucosa y 10 HEPES. La solucin se ajust a un pH de 7.4 con NaOH. La

osmolaridad, medida con un osmmetro de presin de vapor (Wescor 5500), se ajust a 320-

330 mOsm mediante la adicin de sacarosa, cuando fue necesario.

Solucin intracelular.

Las pipetas de registro se llenaron con la siguiente solucin (en mM):

130 K-metanosulfonato, 20 CsCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 4 mM ATP-Mg, 10 EGTA y 10

HEPES. Esta solucin se ajust a un pH de 7.3 con KOH. La osmolaridad se ajust a 315-

320 mOsm, siempre entre 5 y 10 mOsm inferior a la solucin externa.

5.2 Rodajas.

Soluciones extracelulares.

Las solucin externa usada en la mayora de los experimentos estuvo compuesta por

(en mM): 124 NaCl, 2.69 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 MgSO4, 1.8 CaCl2, 26 NaHCO3y 10 glucosa

(300 mOsm) (1).


31/85

Materiales y Mtodos

25

En los experimentos en los que el calcio extracelular se vari, los componentes fueron

los mismos, salvo que las concentraciones de CaCl2 se ajustaron a 0.5 o 10 mM.

En algunos experimentos la concentracin de Na+se modific, ajustndose a 60 mM,

37.5 y, en algn caso, 0 mM, de forma que la solucin (1) se modific para obtener estas

condiciones, la osmolaridad se ajust a 300 mOsm usando N-metil-Glucamina y HCl.

Los agonistas o antagonistas que se emplearon se prepararon con estas soluciones a

partir de soluciones madre altamente concentradas.

Soluciones intracelulares.

En los experimentos realizados en condiciones de fijacin de voltaje (voltaje clamp)

la solucin interna usada estuvo compuesta por (en mM): 120 CsCl, 20 QX-314, 8 NaCl, 1

MgCl2, 0.2 CaCl2, 10 HEPES y 2 EGTA (pH=7.3, 287 mOsm). En los experimentos

realizados en condiciones de fijacin de corriente, la solucin interna usada estuvo compuesta

por (en mM): K-gluconato 120, 8 NaCl, 1 MgCl2, 0.2 CaCl2, 10 HEPES y 2 EGTA (pH=7.3).

6. EXPERIMENTOSIN VIVO.

En colaboracin con el Dr. Oscar Herreras del Departamento de Investigacin del

Hospital Ramn y Cajal, se realizaron algunos experimentos in vivocon el fin de comprobar

el efecto de kainato sobre la excitabilidad hipocmpica en el circuito intacto. Los

experimentos se realizaron en ratas Sprague-Dawley de 200-250 g de peso, anestesiadas con

uretano (1-2 g/kg), cuya temperatura se mantuvo a 37 C usando una manta elctrica. Los

mtodos quirrgicos y estereotxicos usados han sido descritos previamente por el grupo (ver

Largo et al., 1996). Brevemente, se implant un electrodo bipolar concntrico en el lado

homolateral de CA3 para estimular ortodrmicamente las colaterales de Schaffer y un

electrodo de registro en la capa piramidal de CA1 con el fin de registrar el potencial de

campo. El estmulo consisti en pulsos de 0.1 ms a una frecuencia de 0.1 Hz y a una

intensidad que fue supramxima para evocar una espiga poblacional. Igualmente, se implant

una sonda de microdilisis, (dimetro externo, 220 m; longitud 0.8-1 mm) manufacturada de

la forma descrita (Herreras et al., 1994; Largo et al., 1996), la cual se us para introducir

kainato (3 M) en el fluido extracelular. La sonda se baj hasta una posicin en la que toda la

extensin dorso-ventral de CA1 qued expuesta a la dilisis.


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Resultados

26

RESULTADOS.

1. La activacin de los receptores de kainato produce una depresin de la

transmisin sinptica GABArgica en el hipocampo de rata.

1.1. Kainato produce una depresin de la transmisin GABArgica.

En microcultivos de neuronas hipocmpicas y en condiciones de bloqueo de los

receptores de AMPA (con GYKI 53655, 100 M) y de NMDA (con D-AP5, 50 M), la

aplicacin de bajas concentraciones de kainato provoc una disminucin de las respuestas

inhibidoras postsinpticas (IPSCs) (Figura 4). Una concentracin de kainato de 0.6 M produjo

una disminucin del 43.0 11.5 % (n=5). En nuestras condiciones de microcultivo, slo el 25

% de los pares de clulas estaban conectados sinpticamente y menos del 20 % de estas

conexiones eran inhibidoras. Por lo tanto, este modelo no permiti hacer un anlisis exhaustivo

del efecto de kainato sobre la inhibicin sinptica. Sin embargo, se registraron un total de 6

pares, uno de los cuales fue descartado debido a que las respuestas inhibidoras mostraban una

marcada disminucin de la amplitud con el tiempo (rundown) que hizo imposible cualquier tipo

de cuantificacin. En el resto de los casos, se observ de forma clara un aumento en el nmero

de fallos en la liberacin de neurotransmisor (se genera un potencial de accin en la clulapresinptica pero no se produce liberacin de neurotransmisor) y en dos de estos pares se

observ un aumento en la latencia de las IPSCs en presencia de kainato. En dos casos

adicionales se evalu el efecto de 0.6 M de kainato en IPSCs autpticas (obtenidas en

neuronas que establecen conexiones sinpticas consigo mismas). Kainato no tuvo ningn efecto

en uno de estos casos, en el cual se comprob la falta de receptores de kainato en la membrana,

pero disminuy la amplitud de las IPSCs en el otro. Para descartar una posible interaccin del

GABA con su receptor se examin la respuesta a 100 M GABA en presencia y en ausencia dekainato en neuronas de hipocampo en cultivo. La magnitud de las respuestas mediadas por

GABA fue similar en ambas condiciones indicando que la accin de kainato sobre las IPSCs no

se debe a una interaccin del kainato con los receptores de GABA postsinpticos.

Con el inters de extender estos resultados a modelos experimentales ms fisiolgicos,

se pas a realizar el estudio en rodajas de hipocampo de rata, las cuales retienen en gran medida

las conexiones sinpticas originales. Para ello, las interneuronas GABArgicas se estimularoncon un electrodo emplazado en elstratum oriensdel rea CA1 y se registraron las corrientes


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Resultados

27

inhibidoras en clulas piramidales de CA1 usando la tcnica de patch-clamp en su

configuracin de clula completa. Estas clulas fueron identificadas visualmente mediante

microscopa de infrarrojos. Para evitar la activacin de los otros receptores ionotrpicos de

glutamato, se incluyeron en el lquido de perfusin, de manera sistemtica, el antagonista

especfico no competitivo de receptores de AMPA, GYKI 53655 (100 M) y el antagonista de

los receptores de NMDA, D-AP5 (50 M).

Debido a que la concentracin de Cl- en la pipeta coincidi con la del lquido de

perfusin (e.g. igual concentracin de Cl-en el interior y en el exterior celular) la apertura de

los canales de Cl- determin la salida de este ion al exterior celular, observndose como

corrientes entrantes. Las IPSCs as registradas se abolieron completamente en presencia de

bicuculina, el antagonista especfico de los receptores de GABA del tipo A, lo que demostr

que slo son responsables de las mismas receptores de este tipo.

100pA

40 ms

Kainato 0.6 MControl Lavado

Vm=-30 mV

A BDos clulas en una isla

PrePost

C

Bicuculina

Control

100pA

40 ms

Figura 4. Kainato inhibe las eIPSCs mediadas por GABA enmicrocultivos de neuronas de hipocampo. En una microisla se registrarondos neuronas conectadas entre s (A) y se gener un potencial de accin enuna de ellas para evocar una respuesta sinptica en la otra.B)Las corrientes postsinpticas fueron sensibles a bicuculina (100 M). Losregistros son el promedio de 10 respuestas.C) La aplicacin de kainato redujo de forma reversible la transmisininhibidora, aumentando el nmero de fallos. Ntese, que durante la perfusinde kainato, la latencia de las eIPSCs aumenta ligeramente. Resultados

similares se obtuvieron en 4 pares adicionales de clulas.


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Resultados

28

Los estmulos se aplicaron a una frecuencia de 0.1-0.2 Hz (un estmulo cada 10 cada 5

segundos) y tras la estabilizacin de la amplitud de las eIPSCs se adicion kainato a la cmara

de registro a diferentes concentraciones (0.3-300 M). Como muestra la figura 5A, durante la

perfusin de kainato la amplitud de las eIPSCs decreci, recuperndose la amplitud original

tras la retirada del kainato en la mayora de los casos. Las concentraciones ms efectivas de

kainato fueron 0.3-10 M (fig.5B), concentraciones mayores o menores a stas fueron menos

eficaces para disminuir las eIPSCs. De esta forma, la curva dosis-respuesta present forma de

campana.

Incluso a bajas concentraciones, kainato indujo una corriente de membrana en direccin

entrante, indicando que tuvo un efecto depolarizante. Sin embargo, este efecto fue variable de

clula a clula y no se observ una correlacin evidente con la concentracin de kainato usada.

0.1 1 10 100 1000

In

hibiciondeeIPSCs(%)

20

40

60

8050pA

AControl

Kainato

0.3 M Lavado

Kainato (M)

BIC1/2=0.37 M

EC50=20 M

50

pA

Control LavadoKainato

10 M

100 ms

100

pA

Control LavadoKainato

200 M

Figura 5. Efecto de kainato sobre la transmisin sinptica inhibidora en la capa CA1del hipocampo en rodajas de cerebro de rata.A)Las corrientes sinpticas inhibidoras(IPSCs) fueron registradas en neuronas piramidales de CA1 y provocadas por estimulacindel stratum oriens. A -60 mV de potencial de membrana, las IPSCs fueron entrantesdebido a la concentracin simtrica de cloro. B)Curva dosis-respuesta para la inhibicin de

las IPSCs inducida por kainato. El grado de inhibicin se calcul como [1-(IPSCKA/IPSCControl]100 y se represent grficamente frente a la concentracin de kainato.Cada punto corresponde a un experimento. La lnea continua representa la curva dosis-respuesta en estado estacionario para los receptores de kainato con parmetrosdeterminados en clulas cultivadas de hipocampo. sta se calcul de acuerdo con laexpresin:

[ ]( )

( )[ ]

C

KA

EC

IC

KAI

a

a

i

i

n

n

n

n +

+

+

=50

2/1

11

1

con los siguientes parmetros: EC50= 20 M; IC1/2= 0.37 M; ni= 0.8 and na= 1.2. Lacurva resultante fue escalada para ajustar con los valores mximos, aadiendo un 25 % deoffset.


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Resultados

29

Incluso a bajas concentraciones, kainato indujo una corriente de membrana en direccin

entrante, indicando que tuvo un efecto depolarizante. Sin embargo, este efecto fue variable de

clula a clula y no se observ una correlacin evidente con la concentracin de kainato usada.

Por ejemplo, a 0.5, 10 y a 200 M, la amplitud fue de 23 3.4, 27 5.4 y de 30 3.5 pA,

respectivamente, presentando un valor medio para las clulas estudiadas de 31.9 3.1 pA

(n=54).

1.2. La modulacin de la transmisin GABArgica por kainato es de origen presinptico.

Para determinar si la modulacin de las respuestas inhibidoras GABArgicas se

produca a travs de un mecanismo de accin pre o postsinptico se usaron varias

aproximaciones experimentales basadas en el anlisis cuntico de la liberacin de

neurotransmisor. Dado que tanto en clulas microcultivadas como en rodajas de hipocampo,

kainato produjo un aumento en el nmero de fallos en la transmisin sinptica, se cuantific la

proporcin de stos representndose frente al grado de inhibicin de las eIPSCs observado,

independientemente de la concentracin usada de kainato. Para este anlisis se seleccionaron

12 de las 54 clulas estudiadas en las rodajas, clulas en las que los fallos en la transmisin

sinptica se pudieron identificar inequvocamente. Como muestra la figura 6B, el nmero de

fallos se correlacion bien con el grado de inhibicin de las eIPSCs inducido por kainato. Ello

sugiere que un cambio en la fiabilidad sinptica podra ser la causa de la reduccin de las

eIPSCs.

Para comprobar si realmente un origen presinptico poda explicar estos cambios, se

calcul el coeficiente de variacin (CV) de las respuestas sinpticas tanto en condiciones

control como en presencia de kainato, calculndose la razn entre ambos valores. Este valor,

fue >1 en 48 de las 54 clulas analizadas (1.82 0.1), lo cual segn est establecido, seala un

cambio en los parmetros de liberacin como la explicacin ms probable para la reduccin de

las eIPSCs. Esta conclusin fue tambin evidente cuando se represent la variacin de la

amplitud media de las eIPSCs (M) frente al cambio en el estadstico 1/CV2 (el inverso del

cuadrado del coeficiente de variacin), que denota la varianza de las eIPSCs (Fig. 6C). Se ha

establecido que un cambio en M no acompaado de un cambio correspondiente en la varianza

denota que slo el contenido cuntico (q) sufre modificacin durante un tratamiento dado,

indicando por tanto, un mecanismo postsinptico (Figura 6C, lnea punteada) como causa de la

modificacin de la transmisin. Por el contrario, un cambio en la amplitud de las respuestas


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Resultados

30

acompaado por un cambio en el coeficiente de variacin (i.e. en el estadsitico 1/CV2), sugiere

una variacin en los parmetros de liberacin (n p), lo que indica fuertemente un origen

presinptico como fuente de la variacin (lnea discontnua en la figura 6C; ver revisin de

Thompson y Deuchars, 1995). Como se puede observar en la figura 6C, la reduccin en la

amplitud de las eIPSCs producida por kainato se vi acompaada de un cambio paralelo en

1/CV2, lo que indica un mecanismo de accin presinptico para kainato.

Est bien establecido que la frecuencia de las corrientes postsinpticas miniatura

(mIPSCs) puede ser, en determinadas condiciones, un buen indicador de los cambiosproducidos en la probabilidad de liberacin por efecto de alguna sustancia. Para determinar con

Control Kainato 0.3 MA

Aumento de Fallos (%)

0 25 50 75 100InhibicindeeIPSCs(%)

25

45

65

85

M

0.0 0.5 1.0 1.5

1/CV2

0.5

1.0

1.5

Presinptico

Postsinpticor=0.93 r=0.7B C

Figura 6. Kainato activ un mecanismo presinptico para inhibir latransmisin GABArgica. A)Kainato produce una reduccin de la amplitud de laseIPSCs y un aumento en el nmero de fallos.B)El aumento en el nmero de fallos se correlacion con el grado de disminucinde las eIPSCs, independientemente de la concentracin de kainato usada. Slo secomputaron las neuronas en las que los fallos pudieron determinarse de formasegura (n=12). Las lneas discontinuas corresponden al intervalo de confianza de laregresin del 95 %.C)Las amplitudes medias y su coeficiente de variacin (CV) se midieron durante la

aplicacin de kainato y se normalizaron con sus respectivos valores control en cadaclula. La variacin proporcional de la amplitud (M) vs. la variacion proporcional en1/CV2 en 49 neuronas se represent independientemente de la concentracin usadade kainato. Ntese, que los datos experimentales siguen la relacin predicha parauna accin presinptica (lnea discontinua) ms que para una accin postsinptica(lnea punteada). Por claridad, la recta de regresin (r=0.7, p


37/85

Resultados

31

una tercera aproximacin si las reducciones de las eIPSCs inducidas por kainato poseen origen

presinptico, se estudiaron las corrientes miniatura (mIPSCs) antes, durante y despus de la

adicin de kainato 3-10 M a la rodaja. Para ello, se incluy tetrodotoxina a una concentracin

de 0.5-1 M para evitar la generacin de potenciales de accin. De las 38 clulas estudiadas, en

29 de ellas se observ un descenso en la frecuencia de las mIPSCs (39.0 3.8 %); en 3 clulas

el kainato no tuvo efecto notable y en las 6 restantes se produjo un aumento en la frecuencia

(17.3 4.0 %). En conjunto la disminucin media fue del 28.4 4.8 % (n=38 clulas de 24

rodajas). Por el contrario, la amplitud de los mIPSCs no sufri variacin significativa. La figura

7 muestra un ejemplo representativo en una neurona piramidal de CA1. Estos datos tambin

son congruentes con un modo de accin presinptico para kainato.

1.3. El efecto de kainato no se debe a la activacin de los receptores metabotrpicos de

glutamato.

Con el fin de descartar que un aumento en la concentracin extracelular de glutamato

inducido por la adicin de kainato a la rodaja, y la subsecuente activacin de los receptores de

glutamato metabotrpicos, fuera el origen de las acciones observadas, se ensay el efecto de

kainato en presencia de inhibidores de los receptores de glutamato metabotrpicos. Esta

Intervalo (s)

0 2 4 6 8 10

ProbabilidadAcumulativa

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Kainato

3 M

Control

Amplitud (pA)

0 40 80 120

ProbabilidadAcumulativa

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Kainato

3 M

Control

A B CControl

Kainato 3 M

Recuperacin

4 s

50pA

Figura 7. Efecto de kainato sobre las corrientes inhibidoras GABArgicas postsinpticas

miniatura (mIPSCs).Las respuestas miniatura se registraron en presencia de TTX 0.5-1 M. A)Registros de las mIPSCs antes, durante y despus de la aplicacin de kainato. B) Distribucincumulativa de amplitud de las mIPSCs antes y durante la aplicacin de kainato. Como se puedeobservar, no hay ningn cambio en la amplitud de las respuestas durante la aplicacin de kainato. C)Distribucin cumulativa de intervalos entre miniaturas antes y durante la aplicacin de kainato 3 M.Se puede observar que el intervalo de tiempo que pasa entre la ocurrencia de dos miniaturas aumenta

cuando se aplica kainato a las rodajas.


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Resultados

32

posibilidad se descart dado que en presencia de MPPG y MCPG (1.5 mM cada uno de ellos),

los efectos de kainato permanecieron inalterados.

1.4. CNQX antagoniza el efecto de kainato de forma dosis-dependiente.

Aunque CNQX est considerado como el antagonista prototpico de los receptores de

AMPA, tambin bloquea a los receptores de kainato. Dado que en nuestras condiciones

experimentales los receptores de AMPA se encuentran bloqueados con GYKI 53655, a todos

los efectos se puede usar CNQX como antagonista de los receptores de kainato. Como se puede

observar en la figura 8A, cuando se aplic kainato 10 M en presencia de CNQX, ste fue

menos efectivo en reducir la amplitud de las eIPSCs, efecto que fue dosis-dependiente. Estos

resultados sugirieron que la reduccin de la amplitud de las eIPSCs por kainato se debi,

efectivamente, a la activacin de receptores de glutamato de tipo kainato.

1.5. Kainato no acta sobre otro tipo de receptores descritos que regulan la liberacin de

neurotransmisor.

Para descartar la posibilidad de que un mensajero indeterminado, liberado tras ladepolarizacin neuronal y/o glial fuera la causa del efecto descrito, al activar algn receptor

Reduccindefrec.mIPSCs(%)

porkainato

3M

0

15

30

45

60

Control Cctel

Inhibicinde

laseIPSCs(%)

0

20

40

60

80

100

KA

10 M +CNQX

50 M25 M 100 M

*

***

Figura 8.Propiedades farmacolgicas de la accin de kainato sobre las IPSCs.A)La accin inh

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