Panel Respiratorio 3 - Annar Diagnóstica Import · Sistema de PCR en tiempo real ... paso para la...

AllplexTM

Panel Respiratorio 3

(HBoV / HRV / CoV)

(Cat. No. RP9601X)

Sistema de PCR en tiempo real múltiplex con RT (Transcripción Inversa) en un solo

paso para la detección de Bocavirus humano 1/2/3/4, Rinovirus humano A/B/C,

Corinavirus humano NL63, Corinavirus humano 229E y Coronavirus humano OC43 en

aspirados nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares.

Para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet

Para su uso con el

1. Sistema de PCR en Tiempo Real CFX96TM (Bio-Rad)

(Uso para Diagnóstico In Vitro)

Éste producto puede ser usado con propósitos IVD en países autorizados.

(Únicamente para uso en investigación)

Este producto debe usarse para propósitos RUO en otros países.

No disponible en los Estados Unidos

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Panel Respiratorio AllplexTM 3

TABLA DE CONTENIDOS

NOTIFICACIONES ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 3

USO PREVISTO -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4

PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO -------------------------------------------- 5

ANTECEDENTES ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6

REACTIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8

MANEJO Y ALMACENAMIENTO ---------------------------------------------------------------------------------- 9

MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO -------------------------------------------------------------------------- 9

PROTOCOLO --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10

CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ----- 15

RESULTADOS -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS -------------------------------------------------------------------------------------- 27

RENDIMIENTO ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 29

REFERENCIAS -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 33

SIMBOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34

INFORMACIÓN DE PEDIDO -------------------------------------------------------------------------------------- 35

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NOTIFICACIONES

Este producto se puede utilizar con propósitos IVD (Diagnóstico In Vitro) en la UE dado que

la Marca IVD CE está aprobada por la Directiva de la UE (98/79/EC) y países autorizados,

pero debe utilizarse para propósitos RUO (Uso Exclusivo en Investigación) en otros países.

La confiabilidad de los resultados depende de la toma adecuada de la muestra, el

almacenamiento, el transporte y la ejecución de procesamiento.

Es posible usar el mismo ácido nucleico aislado para los Paneles Respiratorios

AllplexTM 1, 2, y 3.

Si la misma muestra será evaluada también con el kit del Panel Respiratorio AllplexTM

4 adicionar ambos RP-V IC y RP-B IC al ácido nucleico aislado (Véase página 12).

Este producto es para uso exclusivo con el MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB

STARlet, máximo 5 ensayos separados.

Ésta prueba ha sido validada para los siguientes tipos de muestras: aspirados

nasofaríngeos, hisopados nasofaríngeos y lavados broncoalveolares. Ésta prueba no

ha sido validada para otros tipos de muestras.

Almacene las muestras de ADN/ARN a ≤ -20℃ hasta su uso y manténgalas en hielo

durante su uso.

La sensibilidad del ensayo puede disminuir en las muestras que son congeladas y

descongeladas repetidamente o almacenadas por largos periodos de tiempo.

El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder de manera unidireccional.

Use siempre guantes desechables en cada área y cámbielos antes de ingresar a áreas

diferentes. Cambie los guantes inmediatamente si se contaminan o trátelos con un reactivo

descontaminante de ADN.

Asigne suministros y equipos a las áreas de trabajo separadas y no los mueva de un área

a la otra.

No pipetee con la boca.

No coma, beba o fume en las áreas de trabajo del laboratorio. Use guantes desechables

libres de talco, batas de laboratorio y gafas protectoras cuando manipule muestras y

reactivos. Lávese bien las manos después de manipular muestras y los reactivos de la

prueba.

Evite contaminar los reactivos al extraer las alícuotas de los tubos de reactivos. Se

recomienda el uso de puntas para pipetas estériles, desechables y con filtro resistente a

aerosoles

No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de tubos diferentes del mismo lote.

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No use este producto después de la fecha de vencimiento.

Todos los elementos desechables se pueden usar una sola vez. No los reutilice.

Use tubos de tapa rosca y evite las posibles salpicaduras o contaminación cruzada de

muestras durante la preparación.

Sea cuidadoso de no contaminar los reactivos con ácidos nucleicos aislados, productos de

la PCR, y control positivo. Para prevenir la contaminación de los reactivos, se recomienda

usar puntas con filtro.

Use áreas separadas para cada experimento.

Prepare y use un set diferente de pipetas para cada una de las siguientes áreas:

aislamiento de ácido nucleico, mezcla de reactivos, la adición del ácido nucleico molde y la

adición de productos de PCR.

Solo en un espacio designado, abra los tubos de reacción o tiras de PCR después de la

amplificación, para evitar la contaminación con amplicones.

Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit.

Los procedimientos de seguridad en el laboratorio (remitirse a Bioseguridad en laboratorios

microbiológicos y biomédicos y Documentos del CLSI) se deben tener en cuenta para

manipular las muestras. Limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con

hipoclorito de sodio al 0.5% (en agua desionizada o destilada). Los componentes del

producto (residuos del producto, empaque) se pueden considerar residuos de laboratorio.

Deseche los reactivos no usados y los residuos de conformidad con los reglamentos

federales, estatales y locales aplicables.

USO PREVISTO

El Panel Respiratorio AllplexTM 3 es un ensayo cualitativo in vitro para la detección simple o

múltiple de virus de Bocavirus humano 1/2/3/4, (HBOV), Rinovirus humano A/B/C

(HRV), Corinavirus humano 229E (229E), Corinavirus humano NL63 (NL63) y

Coronavirus humano OC43 (OC43) en muestras de aspirados nasofaríngeos, hisopados

nasofaríngeos y lavados broncoalveolares.

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PRINCIPIOS Y DESCRIPCIÓN GENERAL DEL PROCEDIMIENTO

1. Principios

El Panel Respiratorio AllplexTM 3 es representativo de la tecnología patentada de Seegene

MuDT™, la cual proporciona valores multi-Ct (ciclo umbral) en un solo canal de fluorescencia

sin análisis de curvas de melting en los instrumentos para PCR en tiempo real.

El Panel Respiratorio AllplexTM 3 es un ensayo de RT-PCR en tiempo real multiplex en un solo

paso que permite la amplificación simultánea y la detección de ácidos nucleicos objetivo de

HboV, HRV, 229E, NL63; OC43 y el Control Interno (IC).

En la PCR, la eficiencia de amplificación puede reducirse usualmente por inhibidores que se

pueden presentar en las muestras clínicas. Por ende, el control interno (IC) es incorporado

dentro del producto como un control exógeno de todo el proceso para monitorear el aislamiento

de ácidos nucleicos y verificar una posible inhibición de la RT-PCR. El IC es co-amplificado con

los ácidos nucleicos objetivos en las muestras clínicas.

2. Descripción General del Procedimiento

< Descripción general del procedimiento del Panel Respiratorio AllplexTM 3 >

Muestras

(Aspirados nasofaríngeos, hisopados

nasofaríngeos y lavados broncoalveolares)

Aislamiento de ácidos

nucleicos

ADN/ARN Viral

RT-PCR en tiempo real

en un solo paso

utilizando el sistema

AllplexTM

Análisis de resultados

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ANTECEDENTES

1. Bocavirus (HboV)

Bocavirus (familia Parvoviridae) es un virus no envueltos con un genoma de ADN de cadena

sencilla. HBoV ha informado estar presente en 1,5 ~ 11,3% de todas las muestras respiratorias

de las personas con enfermedades respiratorias agudas. Además, se ha observado que se

asocia con un amplio espectro de ambas enfermedades del tracto respiratorio superior e

inferior, a través de más frecuentemente con inferior (tercera de ellas es la neumonía). Como

una de las causas de la bronquiolitis y la neumonía, que tiene 40% de probabilidad de

superposición con otras enfermedades respiratorias, y tiene una alta probabilidad de despertar

el asma.

2. Rinovirus (HRV)

Rinovirus (familia Picornaviridae) es un no envuelto con una sola, genoma de ARN de cadena

positiva. HRV tiene 101 tipos de serotipos y se conocen como la causa más común de frío.

Desde HRV tiene varios números de serotipos, es difícil el diagnóstico serológico. Sin embargo,

se puede diagnosticar a través de la realización de PCR en la secreción nasal.

No todos los síntomas de la HRV despiertan; los más comunes son la rinitis y faringitis que son

parte de las inflamaciones del tracto respiratorio superior. La congestión nasal, secreción nasal

y dolor de cabeza ocurren durante 2 ~ 4 días de periodo de latencia y 30 ~ 40% se acompaña

de tos. fiebre leve puede recuperarse en una semana, pero dura más de dos semanas el 35%

de los pacientes infantiles. En algunos casos, la enfermedad respiratoria baja severa se puede

despertar y provocar asma en los niños y la bronquitis crónica en adultos.

3. Coronavirus (CoV)

Coronavirus (familia Coronaviridae) es un virus con envoltura con una sola hebra, genoma de

ARN de cadena positiva. CoV dispone de varios tipos y cada tipo puede conducir infecciones a

mamíferos o aves. CoV se dividió serológicamente en tres grupos (I, II, y III) de acuerdo con la

antigenicidad. Sin embargo, después de descubrir que severa propagación del síndrome

respiratorio agudo en 2003 se originó a partir de animales, se ha creado un cuarto grupo. Entre

CoV que están aislados de los seres humanos, HCoV-229E es la cepa del agente patógeno

representante para el grupo I, que tiene antigenicidad, y HCoV-OC43 es la cepa del agente

patógeno representante para el grupo II. Debido a genomas de tamaño grande y método único

de composición, virus resultantes de la recombinación de genes se forman fácilmente.

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Por lo tanto, CoV tiene diversos tipos de variación antigénica. CoV tiene síntomas similares a

un resfriado común, tales como secreción nasal, irritación nasal, estornudos y congestión. En

los casos de los niños, los síntomas habituales incluyen dolor de garganta, adenitis cervical,

fiebre leve y en ocasiones convulsiones asma. CoV relacionada con 229E y OC43 produce

enfermedades del tracto respiratorio superior en niños y adultos, y la tasa de frecuencia y el

grado de severidad difieren en cada temporada.

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REACTIVOS

Los reactivos contenidos en un kit son suficientes para 100 reacciones.

Información de pedido ( RP9601X)


Símbolo Contenido Volumen Descripción

5X RP3 MOM 500 μL

Mezcla de Oligos MuDT (MOM):

- Reactivo para la amplificación y detección

Enzima para tiempo real en un

solo paso 200 μL

Mezcla de enzimas para la RT-PCR en un solo paso.

Buffer 5X para tiempo real en un

solo paso 500 μL

Buffer para RT-PCR en un paso – Buffer que contiene dNTPs.

RP3 PC 80 μL Control Positivo (PC):

- Mezcla de patógenos y clones de IC

RP-V IC 1000 μL Control Interno Exógeno (IC) para el Panel Respiratorio Allplex 1, 2, y 3

Agua libre de RNasas

1.000 μL

Control Negativo (NC) grado PCR de

calidad ultrapura:

- Agua esterilizada como control negativo

Manual de usuario

AllplexTM es una marca registrada de Seegene Inc.

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MANEJO Y ALMACENAMIENTO

Todos los componentes del Panel Respiratorio 3 AllplexTM deben almacenarse a ≤

-20° C. Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad marcada en la

etiqueta. El congelamiento y descongelamiento repetido debe evitarse ya que podría disminuir

la sensibilidad. Si los reactivos serán usados de manera intermitente, deberán almacenarse en

alícuotas.

MATERIAL REQUERIDO NO INCLUIDO

Guantes desechables libres de polvo (látex o nitrilo).

Pipetas (ajustables) y puntas estériles.

Microcentrífuga para tubos de 1.5 ml.

Kit para aislamiento de ácidos nucleicos.

Máquina de hielo.

Centrífuga de mesa.

Agitador vórtex.

Equipo para PCR en tiempo real CFX-96TM (Bio-Rad).

Tiras de 8 tubos de bajo perfil de 0.2 ml sin tapas (color blanco, No. Cat. TLS0851, Bio-

Rad)

Tiras de 8 tapas planas de grado óptico (No. Cat. TCS0803, Bio-Rad)

Plato de 96 pozos, pozo blanco. (cat. No. HSP-9655, Bio-Rad)

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PROTOCOLO

1. Toma de muestra, almacenamiento y transporte

Nota: Todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos.

Sólo las muestras que sean recogidas, transportadas y almacenadas y atiendan estrictamente

las siguientes normas e instrucciones, serán permitidas:

Nota: Para garantizar una alta calidad de las muestras, se deben transportarse lo más

rápidamente posible. Las muestras tienen que ser transportadas en las condiciones de

temperatura indicadas.

A. Toma de muestra

Aspirado nasofaríngeo, hisopado nasofaríngeo, lavado broncoalveolar

Las muestras de aspirado nasofaríngeo, hisopado nasofaríngeo, y el lavado

broncoalveolar son examinadas rutinariamente para patógenos respiratorios comunes.

La obtención de las muestras puede ser difícil en algunos pacientes. En tales casos, el

hisopado nasofaríngeo puede recolectarse simple y eficientemente con el hisopo de nylon

(COPAN, Italia) y en el medio universal de transporte (UTM).

Manufacturer Specimen collection device Cat. No.

COPAN ESwab 482CE

COPAN ENAT PM 2ML PERNASAL APPLICATOR 606CS01P

COPAN UTM con hisopos flocados 360C / 305C

DIAGNOSTIC HYBRIDS UTM con hisopo flocado de minipunta flexible

403C / 406C

Nota: Recomendaciones del kit de ácidos nucleicos para el MICROLAB NIMBUS IVD o MICROLAB STARlet. SE RECOMIENDA ESPECIALMENTE SEGUIR LAS SIGUIENTES INSTRUCCIONES DEL FABRICANTE. 1. Utilice el kit STARMag 96 para tejidos o para virus para muestras clínicas tomadas en

UTM. 2. Utilice el kit STARMag 96 para tejidos para muestras clínicas tomadas en ESwab. 3. Utilice el kit STARMag 96 para virus para muestras clínicas tomadas con ENAT.

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B. Almacenamiento y transporte de muestras

Muestra

Almacenamiento y Transporte

Nota Temperatura Duración*

Aspirado Nasofaríngeo

2~8°C. 3 días.

- El desempeño podrá afectarse

por el almacenamiento

prolongado de las muestras.

- Las muestras deben ceñirse a

las instrucciones locales y

nacionales para el transporte de

material patogénico.

Hisopado Nasofaríngeo

Lavado broncoalveolar

* Duración: Muestras tomadas de la prueba antes del periodo.

2. Aislamiento de ácidos nucleicos

Diversos fabricantes ofrecen kits para aislamiento de ácidos nucleicos. Use el protocolo

correcto de acuerdo al protocolo del fabricante. Los siguientes kits han sido validados para

uso con este kit.

A. Control Interno

Nota: IC está incluido en el kit para permitir a los usuarios confirmar no solamente el

procedimiento de extracción de ácidos nucleicos sino también identificar cualquier inhibición de

la RT-PCR.

Se deben añadir 10 μL de RP-V IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos

nucleicos.

Cuando use este producto con el kit del Panel Respiratorio AllplexTM 4, debe agregar 10

μL de RP-V IC y 10 μL de RP-B IC a cada muestra antes del aislamiento de ácidos

nucleicos.

B. Sistema automatizado para el aislamiento de ácidos nucleicos

B-1. MICROLAB NIMBUS IVD

Nota: Por favor use las muestras y los volúmenes de elución como se indica abajo. Para todos

los demás, refiérase al protocolo del fabricante.

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Sistema automatizado para el aislamiento

Fabricante Cat. No. Vol. recomendado

MICROLAB NIMBUS IVD Hamilton 65415-02* -

STARMag96 Virus Seegene 744800.4.205875 Muestra: 600 µL

Elución: 100 µL

Cartucho para virus STARMag 48 X 8

Seegene 744800.4.VC384 Muestra: 600 µL

Elución: 100 µL

STARMag 96 Tejido Seegene 744300.4.205875 Muestra: 450 µL

Elución: 100 µL

Cartucho para tejidos STARMag 48 X 8

Seegene 744300.4.TC384 Muestra: 450 µL

Elución: 100 µL

* Si desea comprar este producto a Seegene Inc., por favor utilice este número de Cat.

B-1. MICROLAB STARlet

Nota: Por favor use las muestras y volúmenes de elución recomendados como se indica abajo.

Para todos los demás refiérase al protocolo del fabricante.

Sistema de aislamiento automatizado

Fabricante Cat No. Vol. recomendado

MICROLAB STARlet Hamilton 173000-075* -

STARMag 96 Virus Seegene 744800.4.205875 Muestra: 600 µL

Elución: 100 µL

STARMag 96 Tejido Seegene 744300.4.205875 Muestra: 450 µL

Elución: 100 µL

* Si desea comprar este producto a Seegene Inc., por favor utilice este número de Cat.

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Panel RespiratorIo AllplexTM 3

3. Preparación de la RT-PCR en tiempo real en un solo paso.

Nota: Se deben usar los tubos y tapas correctas (véase MATERIAL REQUERIDO NO

INCLUIDO).

Nota: Se deben usar puntas con filtro resistente a aerosoles y guantes ajustados durante la

preparación de las reacciones RT-PCR de un solo paso. Preste cuidado especial para prevenir la

contaminación cruzada.

Nota: Descongele completamente los reactivos sobre hielo.

Nota: Prepare todas las reacciones sobre hielo para minimizar el riesgo de degradación del ARN.

Nota: Centrifugue brevemente los tubos de reactivos para remover gotas del interior de la tapa.

Nota: Los pasos A – D se procesan se procesan automáticamente en el MICROLAB

NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet. Remítase a cada manual de operación.

A. Prepare la Mastermix de la RT-PCR en un solo paso

5 µL 5X RP1 MOM

5 µL Agua libre de RNasa

5 µL Buffer 5X para tiempo real en un solo paso

2 µL Enzima para tiempo real en un solo paso

17 µL Volumen total de Mastermix de RT-PCR en un solo paso

Nota: Calcule la cantidad necesaria de cada reactivo requerida según el número de reacciones

(muestras + controles).

B. Mezcle por inversión el tubo 5 veces o haga un vórtex rápido, y centrifugue brevemente.

C. Alicuote 17μL de Mastermix de RT-PCR en un solo paso en los tubos de PCR.

D. Adicione 8μL de cada ácido nucleico en el tubo que contiene la alícuota de Mastermix de RT-

PCR en un solo paso.

17 μL Mastermix de RT-PCR en un solo paso

8 μL Ácido nucleico de la muestra.

25 μL Volumen total de la reacción.

E. Cierre la tapa y centrifugue brevemente los tubos de PCR.

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F. Verifique que el líquido que contiene todos los componentes de la PCR este en el fondo de

cada tubo de PCR. Si no es así, centrifugue nuevamente a un rpm más alto por un mayor

tiempo.

Nota: Los tubos de PCR deben ser centrifugados antes de iniciar la reacción de PCR. Esto

fuerza a que el líquido vaya al fondo y a eliminar burbujas de aire.

Correcto Incorrecto

Nota: Use una punta nueva estéril para cada muestra.

Nota: Para el Control Negativo (NC), use 8µL de agua libre de RNasa en lugar de ácido

nucleico de muestra.

Nota: Para el Control Positivo (PC), use 8μL de RP1 PC.

Nota: Por favor ser cuidadoso de no contaminar la Mastermix de RT-PCR en un solo paso ni las

muestras con el Control Positivo.

Nota: Los tubos de PCR deben mezclarse y centrifugarse antes de iniciar la reacción de PCR.

Asegúrese que el líquido que contiene todos los componentes de la reacción de la PCR este en

el fondo de cada tubo de PCR.

Nota: No marque la tapa de los tubos de reacción dado que la fluorescencia es detectada a

través de la tapa del tubo.

Burbuja

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CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANÁLISIS DE

RESULTADOS

1. Sistema para PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-Rad)

1.1. Configuración del Equipo para PCR en tiempo real

Nota: La configuración del experimento en el Sistema para PCR en tiempo real CFX96TM (Bio-

Rad) puede dividirse en tres pasos: Configuración del Protocolo, Configuración de la Placa, Inicio

del Ensayo.

A. Configuración del Protocolo

1) En menú principal, seleccione File New Protocol para abrir la ventana de Protocol

Editor.

Fig. 1. Configuración del Protocolo. Cree un Nuevo protocolo o cargue un protocolo existente

para el experimento

2) En Protocol Editor, defina el perfil térmico como se menciona a continuación:

Nota*: Lectura de placa en el segmento 4 y 5. Fluorescencia detectada a 60°C y 72°C.

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Fig. 2. Editor del Protocolo

3) Haga clic sobre Sample Volume para modificar directamente el valor a 25 μL.

4) Haga clic en OK y guarde el protocolo para abrir la ventana de Experiment Setup.

Fig. 3. Configuración del Experimento: Protocolo

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B. Configuración de la Placa

1) En la pestaña Plate en Experiment Setup, haga clic en Create New para abrir la ventana de

Plate Editor para crear una nueva placa.

Fig. 4. Editor de Placa. Cree una nueva placa

2) Haga clic en Select Fluorophores para indicar los fluoróforos (FAM, HEX, Cal Red 610, y

Quasar 670) que serán utilizados en el experimento y haga clic en OK.

Fig. 5. Seleccionar Fluróforos (FAM, HEX, Cal Red 610 y Quasar 670)

3) Seleccione los pozos deseados y luego su tipo de muestra del menú desplegable Sample

Type.

- Unknown: Muestras clínicas

- Control Negativo

- Control Positivo

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4) Haga clic en las casillas de verificación apropiadas (FAM, HEX, Cal Red 610 y Quasar 670)

para especificar los fluoróforos que se detectarán en los pozos seleccionados.

5) Digite el nombre de la muestra en Sample Name y presione la tecla enter.

6) En Settings del menú principal del Plate Editor, elija el tamaño de la placa en Plate Size (96

wells) y el tipo de placa en Plate Type (BR White).

Fig. 6. Plate Setup

7) Haga clic en OK para guardar la nueva placa.

8) Se devolverá a la ventana de Experiment Setup.

Fig. 7. Configuración del Experimento: Placa

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C. Inicio del ensayo

1) De la pestaña Start Run en Experiment Setup, haga clic en Close Lid para cerrar la tapa del

equipo.

Fig. 8. Cierre de Tapa

2) Haga clic en Start Run.

3) Guarde el archivo del ensayo en Mis Documentos o en la carpeta que usted designe. Ingrese

el nombre del archivo, haga clic en SAVE, y el ensayo iniciará.

1.2. Análisis de datos

A. Cree carpetas para la exportación de datos

1) Cree una carpeta para guardar los resultados de la curva de amplificación.

2) El nombre de la carpeta podrá ser designado por el usuario (Para la función ‘Seegene

Export’, las Carpetas “QuantStep4” y “QuantStep5” se crean automáticamente para guardar

los datos de cada curva de amplificación en la carpeta creada por el usuario).

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B. Pre-ajustes para el Análisis de Datos en el CFX96TM

1) Después de la prueba, haga clic en la pestaña de Cuantificación para confirmar los resultados

de curva de amplificación.

Fig. 9. Resultados de la curva de amplificación

2) Seleccione No Baseline Subtraction del Modo de Análisis del menú Settings.

Fig. 10. Sin sustracción de línea de referencia

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3) Seleccione Seegene Export del menú Tools.

Fig. 11. Exportación Seegene

4) Elija una ubicación para guardar los datos y haga clic en OK.

Fig. 12. Exportación Seegene a la carpeta designada

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C. Ajustes para el análisis de datos en el Seegene Viewer

1) Abra el programa Seegene Viewer, y haga clic en Open para encontrar el archivo guardado en

la carpeta “QuantStep4”.

Fig. 13. Seegene Viewer

2) Después de abrir la carpeta de resultados, seleccione el kit de prueba del menú PRODUCT.

Fig. 14. Ajustes para el análisis de datos en Seegene Viewer

Nota: Por favor verifique el tipo de tubo al seleccionar el kit de prueba (banda de 8 o

placa de 96).

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3) Verifique el resultado de cada pozo.

Fig. 15. Resultados de la prueba en el CFX96TM mediante el Seegene Viewer

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RESULTADOS

1. Interpretación de Resultados

Fluoróforo

Analito

Gráfica 1 Gráfica 2

FAM OC43 HboV

HEX 229E NL63

Cal Red 610 HRV -

Quasar 670 IC -

Valor Ct Resultado

≤ 42 Detectado (+)

> 42 or N/A No detectado (-)

Resultado Objetivo* Resultado

IC Interpretación

Gráfica 1 Gráfica 2

+ -

+

Ácido nucleico objetivo, Detectado

- +

+ +

+ -

-

Ácido nucleico objetivo, Detectado **

- Virus respiratorios adicionales que no fueron detectados pueden estar presentes.

- +

+ +

- - + Ácido nucleico objetivo, No detectado

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- - -

Inválido***

- Señal débil o negativa del control interno es

indicativa de una toma de muestra inadecuada, o

errores en el procedimiento o presencia de

inhibidores.

- Repita la prueba de aislamiento de ácido nucleico

utilizando otra alícuota de la muestra original.

- Si el mismo resultado se muestra en el ácido

nucleico re-aislado, por favor diluya la muestra

(1/3~1/10) en solución salina y repita el aislamiento

(después de añadir RP-V IC) y RTPCR.

*La detección del Control Interno en el canal de detección del Quasar 670 no es requerida para

resultados positivos de patógenos objetivo. Una carga elevada de otro analito puede conducir a

una reducción o ausencia de la señal del Control Interno.

** Si no se observa ninguna de las señales incluyendo el Control Interno, véase Solución de

Problemas TROUBLESHOOTING.

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2. Aplicación a Muestras Clínicas

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra

FAM (Ct) HEX (Ct) Cal Red 610 (Ct) Quasar 670 (Ct) Auto

interpretación OC43 HBoV 229E NL63 HRV IC

1 N/A 34.26 N/A N/A N/A 34.40 HBoV

2 N/A 25.39 N/A N/A 40.72 34.29 HboV, HRV

3 N/A N/A N/A N/A 35.35 35.43 NL63, HRV

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SOLUCIÓN DE PROBLEMAS


OBSERVACIONES CAUSAS PROBABLES SOLUCIÓN

No se observa señal Los fluoróforos para análisis

de datos no cumplen con el

protocolo.

Seleccione los fluoróforos correctos para el

análisis de datos y exporte los datos de nuevo. No

hay necesidad de repetir la prueba en este caso.

Ajustes incorrectos del

termociclador en tiempo real

Verifique las condiciones del ciclo térmico y repita

la prueba bajo los ajustes correctos.

Almacenamiento incorrecto o

posterior a la fecha de

vencimiento del kit de la

prueba.

Verifique las condiciones de almacenamiento

(Véase página 9) y la fecha de vencimiento

(remítase a la etiqueta) del kit de la prueba y

utilice un nuevo kit, si es necesario.

Fallo en el aislamiento de

ácidos nucleicos

Una ausencia de señal de IC puede indicar la

pérdida de ácidos nucleicos durante su

aislamiento. Asegúrese de utilizar el método de

aislamiento recomendado.

Si es debido a los inhibidores, re-aísle la muestra

original o diluya la muestra (1/3~1/10) en solución

salina y repita la prueba desde el paso de

aislamiento.

No se observa señal

de Control Interno

Alta carga del ácido nucleico

del patógeno

Si se observa la señal del patógeno objetivo pero

no la del IC, entonces la amplificación del IC

podrá haberse inhibido por la alta carga del

patógeno objetivo. Con el fin de confirmar la señal

de IC, diluya la muestra (1/3~1/10) en solución

salina y repita la prueba desde el paso de

aislamiento.

Presencia de inhibidores de

RT-PCR

Diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y

repita la prueba desde el paso de aislamiento.

Se observan señales

objetivo o falsos

positivos putativos

en el Control

Negativo

Contaminación Descontamine todas las superficies y los equipos

con hipoclorito de sodio y etanol. Utilice

solamente puntas con filtro durante el

procedimiento y cambie las puntas entre cada

tubo. Repita todo el procedimiento del aislamiento

de ácidos nucleicos con un nuevo set de

reactivos.

28 10/2015 V1.01



OBSERVACIONES CAUSAS PROBABLES SOLUCIÓN

No se observan

señales o falsos

negativos putativos

en el Control

Positivo

Error en la toma de muestras Verifique el método de toma de muestras y tome

de nuevo la muestra.

Almacenamiento incorrecto

de la muestra

Tome de nuevo la muestra y repita todo el

procedimiento. Asegúrese de que la muestra sea

almacenada, según las recomendaciones.

Error en el aislamiento de

ácido nucleico

Verifique el procedimiento de aislamiento de

ácidos nucleicos así como la concentración de

ácidos nucleicos, y re-aísle el ácido nucleico.

Error en la adición de ácido

nucleico a los tubos de PCR

correspondientes

Verifique los números de muestra de los tubos

que contienen ácido nucleico y asegúrese de

adicionar ácido nucleico en el tubo correcto de

PCR y repita cuidadosamente la prueba, si es

necesario.

Presencia de inhibidores Diluya la muestra (1/3~1/10) en solución salina y

repita la prueba desde el paso de aislamiento.

Mezclado de la PCR

incorrecto

Confirme que todos los componentes sean

adicionados al mezclado de la RTPCR (La

sensibilidad está comprometida con el pre-mix

compuesto). Todos los reactivos deben ser

homogeneizados y girados hacia abajo antes de

ser utilizados.

Picos en los ciclos

de la curva de

amplificación

Burbuja en el tubo de PCR Centrifugue el tubo de PCR antes de iniciar.

29 10/2015 V1.01


RENDIMIENTO

1. Especificidad

La alta especificidad del Panel Respiratorio AllplexTM 3 está asegurada por los oligos

diseñados específicamente para los blancos de interés bajo las condiciones definidas de

reacción. Se evaluó reactividad cruzada del Panel respiratorio AllplexTM 3 con 85 patógenos

diferentes, y en la amplificación RT-PCR y detección se identificaron únicamente los blancos

específicos.

No. Organismo Número de Cepa

Resultado

1 Rinovirus humano AB ATCC VR-488 HRV Detectado

2 Rinovirus humano A16 ATCC VR-283 HRV Detectado

3 Rinovirus humano B14 ATCC VR-284 HRV Detectado

4 Rinovirus humano C aislado de Corea HRV Detectado

5 Bocavirus Humano aislado de Corea HboV Detectado

6 Coronavirus humano 229E ATCC VR-95 229E Detectado

7 Coronavirus humano NL63 aislado de Corea NL63 Detectado

8 Coronavirus humano OC43 ATCC VR-1558 OC43 Detectado

9 Adenovirus humano C tipo 1 ATCC VR-1 No Detectado

10 Adenovirus humano C tipo 2 KBPV VR-58 No Detectado

11 Adenovirus humano B tipo 3 ATCC VR-3 No Detectado

12 Adenovirus humano E tipo 4 ATCC VR-1572 No Detectado

13 Adenovirus humano C tipo 5 KBPV VR-61 No Detectado

14 Adenovirus humano D tipo 8 ATCC VR-1368 No Detectado

15 Adenovirus humano A tipo 18 ATCC VR-1095 No Detectado

16 Adenovirus humano D tipo 23 ATCC VR-1101 No Detectado

17 Adenovirus humano F tipo 40 ATCC VR-931 No Detectado

18 Metapneumovirus humano aislado de Corea No Detectado

19 Coxsackievirus Humano A9 KBPV VR-786 No Detectado

20 Coxsackievirus Humano B1 KBPV VR-26 No Detectado

30 10/2015 V1.01



Resultado






26 Echovirus humano 6 KBPV VR-19 No Detectado

27 Echovirus humano 7 KBPV VR-20 No Detectado

28 Echovirus humano 9 ATCC VR-39 No Detectado

29 Echovirus humano11 KBRV VR-22 No Detectado

30 Echovirus humano 22 (Parechovirus) KBRV VR-23 No Detectado

31 Echovirus humano 25 KBRV VR-24 No Detectado

32 Echovirus humano 30 KBRV VR-25 No Detectado

33 Echovirus humano 34 ( Cox A24C) ATCC VR-583 No Detectado

34 Echovirus humano 70 (D) ATCC VR-836 No Detectado

35 Echovirus humano 71 (A) ATCC VR-784 No Detectado

36 Virus del polio KBRV VR-74 No Detectado

37 Virus de la parainfluenza humana 1 ATCC VR-1378 No Detectado



40 Virus de la parainfluenza humana 4A ATCC VR-1378 No Detectado

41 Virus de la parainfluenza humana AB ATCC VR-1377 No Detectado

42 Virus de la inlufenza humana A (H3N2) ATCC VR-544 No Detectado






31 10/2015 V1.01



Resultado







54 Virus de la inlufenza humana A (H1pdm09)

ATCC VR-1736 No Detectado

55 Virus de la inlufenza humana B ATCC VR-101 No Detectado








63 Virus respiratorios sincitial A ATCC VR-26 No Detectado

64 Virus respiratorios sincitial B ATCC VR.955 No Detectado

65 Legionella pneumophila ATCC 41782 No Detectado

66 Streptococcus pneumoniae ATCC BAA-255D No Detectado

67 Bordetella pertussis ATCC BAA-589D No Detectado

68 Haemophilus influenzae ATCC 51907D No Detectado

69 Mycoplasma pneumoniae ATCC 29342 No Detectado

70 Chlamydophila pneumoniae Korean isolate No Detectado

71 Klebsiella pneumoniae aislado de Corea No Detectado

72 Klebsiella oxytoca ATCC 700324D No Detectado

73 Serratia macrescens ATCC 27137D-5 No Detectado

74 Enterobacter cloacae KCTC 13047 No Detectado

75 Enterobacter aerogenes ATCC 15038D No Detectado

32 10/2015 V1.01



Resultado

76 Proteus mirabilis ATCC 12453D No Detectado

77 Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085D No Detectado

78 Pseudomonas fluorescens KCTC 49642 No Detectado

79 Candida albicans ATCC 14053 No Detectado

80 Staphylococcus aureus ATCC 700699D-5 No Detectado

81 Streptococcus mitis ATCC 3556 No Detectado

82 Streptococcus agalactiae ATCC BAA-611D No Detectado

83 Fusobacterium nucleatum ATCC 25586D-5 No Detectado

84 Herpesvirus humano 1 ATCC VR-260 No Detectado

85 Herpesvirus humano 2 ATCC VR-734 No Detectado

86† Para evaluar la reproducibilidad de los resultados, el experimento se repitió tres veces.

2. Sensibilidad

Con el fin de determinar la sensibilidad del Panel Respiratorio AllplexTM 3, se realizó una

dilución seriada estándar de ADN blanco clonado desde 105 a 100 copias/reacción y se

analizó con el Panel Respiratorio AllplexTM 3. El límite de detección del Panel Respiratorio

AllplexTM 3 fue 100 copias/reacción.

3. Reproducibilidad

Se realizaron pruebas de reproducibilidad en 5 momentos diferentes en el transcurso de 5

días, por 3 experimentadores diferentes, y con 3 lotes de producto distintos. Se obtuvieron los

mismos resultados en todas las pruebas, confirmando la reproducibilidad del Panel

Respiratorio AllplexTM 3.

33 10/2015 V1.01


REFERENCIAS

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molecular genetics and pathogenesis.] Clinical Microbiology Reviews. (2004) 17: 390-

412

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Fox. [Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNA PCR.]

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3. D. H. Lee. [TOCE: Innovative Technology for High Multiplex Real-time PCR.] Seegene

Bulletin. (2012) 1: 5-10 J. Y. Chun. [High Multiplex Molecular Diagnostics.] Seegene

Bulletin. (2012) 1: 1-4

4. J. Y. Chun, K. J. Kim, I. T. Hwang, Y. J. Kim, D. H. Lee, I. K. Lee, and J. K. Kim. [Dual

priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and

SNP genotyping of CYP2C19 gene.] Nucleic Acids Research. (2007) 35: e40

5. M. T. Coiras, J. C. Aguilar, M. L. Garcia, I. Casas, and P. Perez-Brena. [Simultaneous

detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse

transcription nested-PCR assays.] Journal of Medical Virology. (2004) 72: 484-495

6. M. W. Syrmis, D. M. Whiley, M. Thomas, I. M. Mackay, J. Williamson, D. J. Siebert, M.

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transcriptase-PCR assay for the detection of seven common respiratory viruses in

respiratory samples.] Journal of Diagnostics. (2004) 6: 125-131

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assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses.] Journal of Virological Methods.

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8. Y. J. Lee, D. Y. Kim, K. H. Lee, and J. Y. Chun. [Single-channel multiplexing without

melting curve analysis in real-time PCR.] Scientific Reports. (2014) 4: 1-6

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contaminated DNA in PCR.] Nucleic Acids Research. (1990) 18: 6739.

10. Y. Jinno, K. Yoshiura, and N. Niikawa. [Use of psoralen as extinguisher of

contaminated DNA in PCR.] Nucleic Acids Research. (1990) 18: 6739

34 10/2015 V1.01


SIMBOLOGÍA

Explicación de los símbolos utilizados en el manual y en las etiquetas.

Símbolo Explicación

Dispositivo médico de diagnóstico In vitro

Uso exclusivo en investigación

Número de lote

Número de catálogo

Fecha de vencimiento

Límite de temperatura de almacenamiento

Mezcla de oligonucleotidos para amplificación y detección

Mezcla de enzimas

Buffer

Agua libre de RNasa

Control Positivo (PC)

Control Interno (IC)

Consulte instrucciones de uso

Fabricante

Fecha de fabricación

Representante autorizado en la Comunidad Europea

Precaución

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INFORMACIÓN DE PEDIDO

Cat. No. Producto Tamaño

Serie AllplexTM

RP9801Y Panel Respiratorio AllplexTM 1 50 rxns

RP9801X Panel Respiratorio AllplexTM 1 100 rxns*







* Para su uso exclusivo con MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet

Serie AnyplexTM

RV7G01Y Detección AnyplexTM II RV16 (V1.1) 50 rxns

RV7G01X Detección AnyplexTM II RV16 (V1.1) 100 rxns*

RB7500Y Detección AnyplexTM II RB5 50 rxns

RB7500X Detección AnyplexTM II RB5 100 rxns*

RV7310X Detección en tiempo real de digitación AnyplexTM FluA/B (V1.1)

100 rxns

* Para su uso exclusivo con MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet

Serie Seeplex®

RV3210 Detección Seeplex® RV7 50 rxns

RV6C00Y Detección Seeplex® RV12 ACE 50 rxns

RV6F00Y Detección Seeplex® RV15 ACE 50 rxns

RV6F01Y Detección Seeplex® RV15 OneStep ACE (V1.1) 50 rxns

RV6520X Seeplex® Influenza A/B OneStep Typing (V2.1) 100 rxns

PB1610Y Detección Seeplex® PneumoBacter ACE (V3.0) 50 rxns

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Productos accesorios

SG1701 Ribo_spin vRD (Kit de aislamiento de ARN/AND Viral) 50 preps

Sistemas automáticos de aislamiento

65415-02 MICROLAB NIMBUS IVD EA

173000-075 MICROLAB STARlet EA

744800.4.205875 STARMag 96 Virus 384T / 1 caja

744800.4.VC384 STARMag 48 X 8 Virus Cartridge kit 384T / 1 caja

744300.4.205875 STARMag 96 Tissue 384T / 1 caja

744300.4.TC384 STARMag 48 X 8 Tissue Cartridge kit 384T / 1 caja

Panel Respiratorio 3 - Annar Diagnóstica Import · Sistema de PCR en tiempo real ... paso para la...

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