P11. Diversidad nutricional, fisiológica y requerimientos...

ME1515 - 2012/2 - Práctica 11 - página 1

Unidad 6. Nutrición microbiana y caracterización de bacterias.

Unidad 8. Condiciones ambientales para el desarrollo,

inhibición y destrucción de microorganismos.

P11. Diversidad nutricional, fisiológica y

requerimientos de oxígeno.

Objetivos A partir de una muestra natural:

Evidenciar la diversidad nutricional de los microorganismos.

Determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos desarrollados.

Observar los requerimientos de oxígeno de los microorganismos crecidos en las

diferentes zonas de la columna.

Introducción En general los requerimientos nutricionales y de oxígeno de cada grupo microbiano están

íntimamente relacionados con el ambiente natural en que se desarrollan.

El grupo bacteriano es, desde el punto de vista estructural, el más simple de los

microorganismos (procariotes); no obstante, fisiológicamente es el más complejo. Las

bacterias obtienen su energía a través de la luz solar (fotosintéticas), o por la oxidación de

compuestos químicos inorgánicos (quimiolitotrofas) u orgánicos (quimiorganótroficas); su

fuente de carbono a partir del CO2 (autótrofas) o de compuestos orgánicos (heterótrofas).

Así mismo, su fuente de nitrógeno la obtienen a partir de compuestos orgánicos

(aminoácidos) e inorgánicos en diferentes estados de oxidación incluyendo el nitrógeno

molecular. La capacidad de reducir el dinitrógeno atmosférico es exclusiva de algunos

microorganismos procariotes (fijadores de nitrógeno).

En lo que respecta a sus requerimientos de oxígeno, algunos microorganismos crecen de

manera obligada en presencia de oxígeno (aerobios estrictos); en el extremo opuesto

existen otros que no requieren de este elemento para su desarrollo (anaerobios estrictos). Y

entre ambos grupos existen microorganismos que se desarrollan en presencia o ausencia de

oxígeno (aerobios facultativos), los que crecen en bajas concentraciones de oxígeno

(microaerofílicos) y los anaerobios que toleran pequeñas cantidades de oxígenos

(anaerobios aerotolerantes).

1ª. Sesión.

Inoculación de las muestras

Materiales

Muestras

Agua de la columna de Winogradsky

Tierra húmeda de macetas


Microorganismos

Pseudomonas aeruginosa

Enterobacter sp

Micrococcus luteus

Clostridium sp

Streptococcus sp

Material por equipo

2 mecheros

1 gradilla

1 varilla de vidrio en “L”

2 bulbos de goma

1 tripié

1 charola de metal

1 vaso de precipitados de 250mL

Medios de cultivo

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio mineral sin carbono.

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio mineral con glucosa.

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio mineral con celulosa.

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey libre de nitrógeno.

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey con amonio.

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey con nitratos.

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey con peptona.

1 caja de Petri con agar Ramos-Callao con lecitina.

1 caja de Petri con agar Ramos-Callao con fósforo precipitado.

1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio para sulfato reductoras.

2 tubos de 16x150mm con tapón de rosca con 7mL de caldo Tioglicolato con resarzurina.

10 tubos de 22x175mm con 20mL de Agar Aneróbico de Brewer (por grupo).

Material que deben tener los alumnos

Pipetas Pasteur estériles

Tubos con SSI estéril

1 tubo de 13x100 estéril

Material por grupo

2 jarras de anaerobiosis

2 paquetes de Gas PacK

1 frasco grande de vidrio

1 vela

Metodología

Preparación de las muestras (tierra húmeda o columna de Winogradsky).

1. Tomar aproximadamente 1cm3 de tierra húmeda y resuspender en un tubo con 9mL de

SSI estéril, homogenizar y dejar sedimentar.

2. Transferir con ayuda de una pipeta Pasteur estéril aproximadamente 4mL de agua (sin

partículas) en un tubo estéril de 13x100mm.


3. Si se cuenta con una columna de Winogradsky de varias semanas, seleccionar una

zona por equipo y con ayuda de una pipeta Pasteur, extraer aproximadamente 4mL de

agua de la zona asignada y colocar en un tubo limpio.

Siembra de cultivos de diversidad nutricional.

1. Etiquetar los tubos de medio Mineral y el medio de Ashbey de acuerdo a la muestra

empleada.

2. Con la pipeta Pasteur inocular cada uno de los tubos con tres gotas (150L) de la

muestra e incubar a temperatura ambiente en presencia de luz durante 5 días.

Siembra de cultivos de diversidad fisiológica (sulfato reductoras y transformaciones del

fósforo).

1. Etiquetar el tubo de medio para sulfato reductoras, de acuerdo a la muestra

empleada.

2. Con la pipeta Pasteur inocular con tres gotas (150L) de la muestra e incubar a

temperatura ambiente en condiciones reducidas de oxígeno (usar jarra de anaerobiosis

o jarra con vela) durante 5 días.

3. Etiquetar los medios de Ramos-Callao con lecitina (mineralizadores) y con fósforo

precipitado (solubilizadores), de acuerdo a la muestra empleada.

4. Con la pipeta Pasteur inocular con dos gotas (100L) de la muestra sobre la superficie

del agar y con la ayuda de una varilla de vidrio en “L” estéril (flamear con alcohol y

dejar enfriar al lado de la flama), extender la muestra sobre la superficie del agar.

Flamear la varilla antes de ser usada nuevamente y flamear después de ser usada.

5. Incubar a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas, por 5 días.

Zonas

Alta

Media alta

Media baja

Baja

4mL

Diversidad nutricional

Medio mineral

Medio Ashbey*

Diversidad fisiológica

Medio Ashbey*

Medios Ramos Callao

Medio para SO4= reductoras

Requerimientos de oxígeno

Caldo Tioglicolado

Agar anaeróbico de Brewer

Columna de

Winogradsky

4mL

SSI estéril

Tierra

Muestra de

tierra húmeda


Siembra para observar los requerimientos de oxígeno.

1. Someter a ebullición los dos tubos con caldo Tioglicolato hasta la reducción (observar

el indicador de resarzurina).

2. Sin agitar, colocar los tubos en una gradilla y dejar enfriar sin mover.

3. Etiquetar uno de los tubos con el nombre de la bacteria control que le corresponda al

equipo: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sp, Micrococcus luteus, Clostridium sp

o Streptococcus sp (un control por equipo), y el otro tubo indicando la muestra.

4. Inocular cada uno de los tubos con dos gotas (100L) del cultivo bacteriano control o

con dos gotas de la muestra.

5. Incubar 5 días a 37°C dependiendo de la muestra

Condiciones de incubación Control Muestra

Aerobiosis Pseudomonas aeruginosa

Micrococcus luteus

Enterobacter sp

Columna superficial

Columna intermedia

Muestra de tierra húmeda

Microaerofília Micrococcus luteus

Enterobacter sp

Columna intermedia

Columna profunda


Anaerobiosis Enterobacter sp

Streptococcus sp

Clostridium sp

Columna intermedia

Columna profunda


6. Por grupo, fundir los medios de Agar Anaeróbico de Brewer (10 tubos de 22x175) hasta

su disolución total y la reducción del indicador azul de metileno.

7. En cada mesa seleccionar una de las muestras ya sea proveniente de la columna o

de tierra húmeda e inocular por duplicado dos gotas en una caja de Petri vacía y

estéril.

8. Cuando el medio de cultivo esté fundido, fluido y a una temperatura de 45ºC, verter

en cada una de las cajas, y homogenizar.

9. Los dos tubos restantes vaciarlos en cajas sin inóculo y dejar solidificar. Dividir en dos e

inocular por cuadrante radial a P. aeruginosa y a Clostridium sp.

10. Incubar una caja de cada muestra en condiciones aeróbicas y la otra en condiciones

anaeróbicas.

Medio fluido

de tioglicolato

Ebullir (reducir) Dos gotas de

la cepa

control

Dos gotas a

partir del agua

de la muestra

Cepa control

Muestra de la

columna o

tierra húmeda


2ª. Sesión.

Diversidad nutricional, fisiológica (nitrógeno, fósforo y azufre) y

requerimientos de oxígeno

Materiales

Material por equipo

1 microscopio

1 juego de colorantes de Gram

2 mecheros

1 gradilla

2 bulbos de goma

2 tubos de 13x100

Agar anaeróbico de Brewer

a. Incubar a 37ºC

durante 48horas en

condiciones

aeróbicas.

b. Incubar a 37ºC

durante 48horas en

condiciones

anaeróbicas.

2 gotas Mesa 1 a

b

a

2 gotas Mesa 2 a

b

a

2 gotas Mesa 3 a

b

a

2 gotas Mesa 4

4

a

b

a

Control a

b

a

Muestra de

agua

Dividir en dos e inocular

por cuadrante radial a

P. aeruginosa y a

Clostridium sp.


Reactivos

4 frascos gotero con reactivo de Nessler.

4 frascos gotero con reactivo de Griess A.

4 frascos gotero con reactivo de Griess B.

Zinc en polvo.

4 frascos goteros con solución de BaCl2 al 5%

Metodología

Revisión de los resultados de diversidad nutricional

1. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos después de la incubación, describir el

desarrollo en cada uno y las características nutricionales de cada grupo que pudiera

estar presente.

Medio Desarrollo Características nutricionales

y grupos microbianos

MM sin carbono

MM con glucosa

MM con celulosa

Medio Ashbey libre de nitrógeno

Medio Ashbey con amonio

Medio Ashbey con nitritos

Medio Ashbey con peptona

Revisión de los resultados de diversidad fisiológica

Trasformaciones del nitrógeno.

1. Del tubo con medio de Ashbey libre de nitrógeno, transferir unas gotas en dos

portaobjetos con una pipeta Pasteur estéril.

2. En uno de los portaobjetos agregar una gota de reactivo de Nessler para determinar la

presencia de amonio. Una coloración naranja (puede presentarse un precipitado)

indica la presencia de amonio en el medio.

3. En el segundo portaobjetos agregar una gota de reactivo A de Griess y 1 gota del

reactivo B. Una coloración roja indica la presencia de nitritos en el medio.

4. Si el resultado de los nitritos es negativa, agregar una pizca de polvo de zinc al medio

con los reactivos de Griess. Si el medio se torna rojo hay presencia de nitratos en el

medio de cultivo.

5. Realizar un frotis y tinción de a cada uno de los tubos. Registrar los resultados.

6. Identificar los cambios en el ciclo del nitrógeno.

Medio Ashbey NH4 NO2 NO3 Transformaciones y grupos

microbianos

Observación

microscópica

(esquema)

S/nitrógeno

C/amonio

C/nitritos

C/peptona


Determinación de Amonio

El amonio reacciona en condiciones alcalinas con yoduro mercúrico dipotasico(1) (reactivo

de Nessler) para formar un precipitado color naranja(2).

(1) HgI2 + KI → K2HgI4

(2) K2HgI4 + KOH + NH3 → Hg2O(NH2I) + 7 KI + 2H2O

(anaranjado)

Determinación de nitritos y nitratos

Reducción de nitratos:

N03- → NO2

- → NO → N2O → N2

El nitrito reacciona con dos reactivos: ácido sulfanílico y dimetil--naftilamina (o -

naftilamina). La reacción de color se debe a la formación de un compuesto diazonio, p-

sulfobenceno-azo--naftilamina.


NH2

SO3H

Acido sulfanílico

(incoloro)

+ HNO2

Acido nitroso

Acido sulfanílico diazotizado

(sal de diazonio)

N

SO3H

N

+ H2O +

NH2

-naftilamina

(incolora)

p-sulfobenceno-azo--naftilamina

(colorante rojo azo hidrosoluble)

NH2

+ H2O

N

SO3H

NAcoplamiento

Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir

químicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griese el

compuesto colorido.

Transformaciones del azufre

1. A partir del tubo con medio TT transferir con una pipeta Pasteur aproximadamente 1mL

en cada uno de 2 tubos de 13x100.

2. En el primer tubo determinar la presencia de tiosulfato agregando unas gotas de la

mezcla de almidón-yodo. La presencia de tiosulfato se interpreta como la desaparición

del color.

3. En el segundo tubo determinar la presencia de sulfatos agregando una gota de HCl

0.1N y posteriormente gota a gota de la solución de BaCl2 al 5%, la aparición de un

precipitado blanco indica la presencia de sulfatos.

4. Observar en el medio para bacterias sulfato reductoras la aparición de un precipitado

negro debido al gas incoloro H2S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el

citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso

metálico.

5. Realizar un frotis y tinción de a cada uno de los tubos. Registrar los resultados.

Medios H2S S2O32- SO4

2- Transformaciones y

grupos microbianos

Observación

microscópica

(esquema)

Bacterias oxidantes

del azufre (Medio TT) XX

Bacterias sulfato

reductoras XX XX


Reacciones

Bacterias Quimiolitótrofas del azufre

H2S + 2O2 → SO42- + 2H+

HS- + H+ + ½O2 → Sº + H2O

Sº + 1½O2 + H2O → SO42- + 2H+

S2O32- + 2O2 + H2O → SO4

2- + 2H+

Bacterias sulfato reductoras SO42- → SO3

2- → H2S

Determinación de tiosulfato

El yodo en presencia de yoduro y la -amilosa de una solución de almidón forma un

complejo colorido azul intenso. En presencia de tiosulfato el yodo es reducido a yoduro en

una disolución débilmente ácida lo que provoca la desaparición del complejo colorido.

I2 + 2S2O32+ → 2I- + S4O6

2+

Determinación de sulfato

El ión sulfato en solución se determina por precipitación con cloruro de bario en una solución

caliente, débilmente acidificada con ácido clorhídrico. Se originan cristales blancos

relativamente grandes.

SO42++ BaCl2 → BaSO4 + 2Cl-


Trasformaciones de fósforo

1. Revisar el medio de Ramos-Callao con lecitina (mineralizadores), observar la formación

de halos de desaparición de lecitina.

2. Realizar una tinción de Gram a cada tipo de colonia formadora de halos.

3. Revisar el medio de Ramos-Callao con fósforo precipitado (solubilizadores), observar la

formación de halos de desaparición del precipitado de fosfato.

4. Realizar una tinción de Gram a cada tipo de colonia formadora de halos.

5. Registrar los resultados en la tabla.

Medios Descripción de colonias con

halo

Observación microscópica

(esquema)

Ramos-Callao con lecitina

(mineralizadores)

Ramos-Callao con fósforo

precipitado

(solubilizadores)

Resultados de requerimientos de oxígeno.

1. De manera grupal Comparar el crecimiento en medios sólidos en condiciones aerobias

y anaerobias de las columnas. Revisar las cajas control para descartar la

contaminación externa.

2. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos a las 48 horas de incubación y registrar

el desarrollo en cada uno de ellos en la tabla.

Columna Desarrollo en aerobiosis Desarrollo en anaerobiosis

Muestra

Control

3. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos a las 48 horas de incubación y registrar

el desarrollo en cada uno de ellos en la tabla.

Microorganismo o muestra Clasificación Condiciones de

incubación

Esquema y descripción

del desarrollo

Pseudomonas aeruginosa Aerobio estricto

Enterobacter sp

Aerobio facultativo

Micrococcus luteus Microaerofílico1

Streptococcus sp Anaerobio

aerotolerante

Clostridium sp2

Anaerobio estricto

Muestra 1 esta reportado como de aerobio estricto 2 la cepa empleada resiste ciertas concentraciones de oxígeno


Composición de medios de cultivo.

Medio Ahsbey’s libre de nitrógeno

Manitol 15.0 g Disolver cada uno de los componentes en un

litro de agua destilada, ajustar el pH a 7 y

distribuir. Esterilizar a 121ºC, 15 lb de presión

durante 15 minutos. Adicionar las fuentes de

nitrógeno en una proporción de 0.5-1.0% previo

a la esterilización.

CaCl2.2H2O 0.2 g

K2HPO4 0.2 g

MgSO4.7H2O 0.2 g

MoO3 (sol’n 10%) 0.1 mL

FeCl3 (sol’n 10%) 0.05 mL

pH 7.0+0.2

Thiobacillus / Thermophilus medium pH 6.5 (TT)

Na2S2O3.5H2O 5.0 g Disolver cada uno de los componentes en 900

mL de agua, ajustar el pH a 6.5 con HCl

concentrado y aforar a 1 L. Esterilizar por

filtración. Distribuir en los tubos estériles.

NaHCO3 1.0 g

Na2HPO4 0.2 g

MgCl2 0.1 g

NH4Cl 0.1 g

Agua destilada 1000 mL

pH 6.5

Medio para movilizadores de fósforo

Medio basal de Ramos-Callao.

Extracto de levadura 2.0 g

Glucosa 20.0 g

Agar 18.0 g

Agua destilada 1000 mL

pH 7.0

Para mineralizadores:

En condiciones de asepsia colocar una yema de huevo en un matraz Erlenmeyer de

250 mL estéril. Agregar agua estéril hasta un volumen aproximado de 100 mL y

homogeneizar perfectamente. De ésta mezcla agregar 10mL a 100 mL del medio basal

de Ramos-Callao (sin glucosa) previamente esterilizado y enfriado a aproximadamente

45ºC, mezclas perfectamente y verter en las cajas de Petri ya inoculadas con las

diferentes diluciones del suelo.

Para solubilizadores:

Solución A K2HPO4 al 10% Mezclar una parte de la solución A con dos


Solución B CaCl2 al 10%

partes de la Sol. B y homogeneizar el

precipitado obtenido. De esta suspensión

agregar 5.0mL a 100 mL de medio basal de

Ramos-Callao (Con glucosa) previamente

esterilizado y enfriado a 45ºC. Verter en cajas

de Petri previamente inoculadas con las

diferentes diluciones de suelo.

Medio para sulfato reductoras

Sulfato reductoras medio Postgate C modificado

KH2PO4 0.5 g

Na2SO4 4.5 g

NH4Cl 1 g

MgSO4•7H2O 0.06 g

CaCl2•6H2O 0.06 g

Citrato de sodio 0.3 g

FeSO4•7H2O 0.004 g

H2O destilada c.s.p. 1000 mL

Disposición de desechos 1. El material plástico como las cajas Petri desechables, papel filtro y palillos de madera

deberán colocarse en los contenedores de incineración previamente atadas con

masking las cajas petri.

2. Las pruebas de Nessler y Griess realizadas en portaobjetos deberán recolectarse por

separado y entregar para el tratamiento de residuos químicos.

3. Esterilizar el material de vidrio en los que realizó sus lecturas y posteriormente lavar.

Bibliografía complementaria Atlas, R. M. (1997). Handbook of Microbiological Media. 2nd edition. Edited by Lawrence

C. Parks. CRC Press. USA.

Atlas, R. M. Y Bartha R. (2002). Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental. 2ª

edición en español. Pearson Education. Madrid, España.

Ayres, G. H. (1968). Análisis Químico Cuantitativo. 2ª edición. Traductor: Santiago V.

Pérez. Oxford University Press. México DF.

Mac Faddin, Jean F. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de

importancia clínica. 3ª edición. Médica Panamericana, Argentina. QR67 M3318 2003

Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition.

Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006

Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía

Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M

del C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª

edición. Facultad de Química, UNAM. México.

Widdel F., Bak F., The prokariotes, 2a ed. New York, Springer-Verlag, 1992.

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