OPTIMIZACIÓN DE LA OPERACIÓN DE BIOREACTORES EN EL PROCESO DE FERMENTACIÓN BIOLÓGICA

RONALD VALENCIA SÁNCHEZ

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE MECÁNICA BOGOTÁ

2003

MIM-2003-I-22

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OPTIMIZACIÓN DE LA OPERACIÓN DE BIOREACTORES EN EL PROCESO DE FERMENTACIÓN BIOLÓGICA

RONALD VALENCIA SÁNCHEZ

Tesis para optar al grado de Magíster en Ingeniería Mecánica

Asesor José Ignacio Huertas, ME, MSc, DSc

Coasesores José María Escovar Kousen, IQ, PhD

Andrés González, IQ, MSc

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE MECÁNICA BOGOTÁ

2003

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Bogotá, 1 de agosto de 2003 Doctor ALVARO E. PINILLA Director Departamento de Ingeniería Mecánica Universidad de los Andes Ciudad Apreciado Doctor: Someto a consideración suya la tesis de magíster titulada “Optimización de la operación de bioreactores en el proceso de fermentación biológica”, la cual representa una contribución en el estudio e investigación en el campo de la biotecnología. Considero que este trabajo cumple con los objetivos inicialmente planteados y lo presento como requisito para la obtención del titulo académico de la maestría en ingeniería mecánica. Cordialmente, _____________________ Ronald Valencia Sánchez Cod. 200117314

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Bogotá, 1 de agosto de 2003 Doctor ALVARO E. PINILLA Director Departamento de Ingeniería Mecánica Universidad de los Andes Ciudad Apreciado Doctor: Someto a consideración suya la tesis de magíster titulada “Optimización de la operación de bioreactores en el proceso de fermentación biológica”, desarrollada por el estudiante Ronald Valencia Sánchez. Certifico como asesor que este trabajo de investigación cumple con los objetivos propuestos y que por lo tanto califica como requisito para optar el titulo de magíster en ingeniería mecánica. Cordialmente, _____________________ José Ignacio Huertas

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Nota de aceptación:

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_________________________________ Firma del Asesor

_________________________________ Firma del jurado

_________________________________ Firma del jurado

Bogotá, 1 de agosto de 2003

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OPTIMIZACIÓN DE LA OPERACIÓN DE BIOREACTORES EN EL PROCESO DE FERMENTACIÓN BIOLÓGICA

Ronald Valencia Sánchez

(Resumen)

Los crecimientos de células animales BHK21 C13 a gran escala producidos en bioreactores, dependen de la transferencia de oxígeno kLa que se logre del equipo a las células. En la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios S.A. VECOL S.A., en el área de producción de la vacuna contra la fiebre Aftosa, se requiere maximizar los crecimientos celulares de este tipo de células logrando optimizar el kLa. La transferencia de oxígeno esta en función de los parámetros de operación del equipo, tales como, velocidad de agitación, presión, tipo de agitador y bafles. En la caracterización del kLa en el reactor se utilizó el método indirecto y se desarrolló un modelo analítico que predice los crecimientos celulares bajo los parámetros de operación establecidos. El modelo analítico se basa en la ecuación de Monod y en ecuaciones de balance de masa para el sustrato limitante glucosa y aireación continua. Los experimentos se realizaron en un reactor de volumen 2500 L con volúmenes de trabajo de 1000 L, distribuidos en 500 L de células y 500 L de medio de cultivo. En comparación al punto de operación tradicional del reactor el aumento de la velocidad de 120 r.p.m. a 160 r.p.m., la presión de 5 psi a 15 psi, la utilización de un agitador con flujo axial en cambio de flujo radial y la utilización de bafles, produjo mejoras en el cambio de los crecimientos celulares de hasta el 25%.

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DEDICATORIA A mis padres, Fabio y Amilbia porque se lo merecen todo

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Agradecimientos

El autor expresa su sincero agradecimiento al profesor José Ignacio Huertas, asesor de esta investigación por sus valiosas orientaciones. A los profesores José María Escovar Kousen de ingeniería química quien participó activamente en el desarrollo de la primera etapa de la investigación y Andrés González de ingeniería química quién participó en el desarrollo de la segunda etapa y finalización de este trabajo. Los aportes de este grupo de profesores fueron muy valioso para entender y proponer soluciones a un problema real de nuestra industria colombiana. También se extiende el agradecimiento a la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios S.A. VECOL S.A., en donde se realizó el trabajo de investigación, en especial a los doctores Guillermo Restrepo, Gerente de Manufactura, Judith Parraga, Directora del área de producción de la vacuna antiaftosa; Ricardo Avalo, Jefe de la sección de producción de virus Aftoso; Carlos Henao, Gerente Administrativo, y al ingeniero Germán Villarraga, Director del Departamento de Ingeniería; porque cada uno desde su área tuvo aportes muy significativos para desarrollar adecuadamente este trabajo de investigación.

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Tabla de contenido CAPITULO 1 INTRODUCCIÓN...................................................................................

1

CAPITULO 2 DESCRIPCIÓN DE FERMENTACIONES PARA CRECIMIENTOS CELULARES BHK21 C13 EN BIOREACTORES DE VECOL S.A.............................

3

CAPITULO 3 GENERALIDADES DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN AEROBIAS EN BIOREACTORES...............................................................................

4

3.1 CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN MICROORGANISMOS PARA FERMENTACIONES BATCH............................................................................ 4

3.2 AIREACIÓN Y TRANSFERENCIA DE MASA.................................................... 6 3.2.1 Ley de Henry...................................................................................................... 6 3.2.2 Transferencia de oxígeno................................................................................... 6 3.2.3 Determinación de la tasa de transferencia de oxígeno......................................

7

CAPITULO 4 MODELAMIENTO ANALÍTICO DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN AEROBIA.......................................................................................

9

4.1 CARACTERIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO kLa................ 10 4.2 CONCENTRACIÓN DE SATURACIÓN DE OXÍGENO..................................... 11 4.3 MODELO ANALÍTICO AJUSTADO.................................................................... 12 4.4 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN DE kLa............................................................... 13 4.5 SIMULACIONES ANALITICAS.......................................................................... 16 CAPITULO 5 MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................

19

5.1 METODOLOGÍA................................................................................................. 19 5.2 DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO............................................................................ 20 5.2.1 Sistema de Agitación.......................................................................................... 21 5.2.2 Instrumentación.................................................................................................. 22 5.2.3 Células y medio de cultivo.................................................................................. 22 5.3 MEDICIÓN DE VARIABLES............................................................................... 23 5.3.1 Concentración de glucosa.................................................................................. 23 5.3.2 Concentración celular......................................................................................... 23 5.3.3 Sistema de Monitoreo......................................................................................... 23 5.3.4 Calibración de instrumentación.......................................................................... 23 5.4 DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO............................................................... 24 5.4.1 Experimentos preliminares................................................................................. 24 5.4.2 Preparación del inóculo...................................................................................... 24 5.4.3 Fermentaciones batch con aireación continua................................................... 24 5.5 CÁLCULOS........................................................................................................

24

CAPITULO 6 RESULTADOS.......................................................................................

26

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6.1 METODOLOGÍA DE TAGUCHI.......................................................................... 26 6.2 MÉTODO ESTADÍSTICO................................................................................... 32 6.3 VERIFICACION EXPERIMENTAL DEL MEJOR PUNTO DE OPERACION

DEL REACTOR..................................................................................................

35

CAPITULO 7 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.........................................

38

BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................

40

ANEXO A CARACTERIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO kLa.......

41

ANEXO B CÓDIGOS DE PROGRAMACIÓN..............................................................

58

ANEXO C METODOLOGÍA DE TAGUCHI..................................................................

59

ANEXO D SISTEMA DE MONITOREO.......................................................................

62

ANEXO E CALIBRACIÓN DE INSTRUMENTACIÓN.................................................

64

ANEXO F REGISTROS DE LAS FERMENTACIONES...............................................

69

ANEXO G TABLA DISTRIBUCIÓN F..........................................................................

94

ANEXO H ALGORITMO DE MAXIMIZACIÓN.............................................................

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Lista de figuras

FIGURA 3.1 CURVA DE CRECIMIENTOS PARA CULTIVOS CELULARES........................................................................................ 4

FIGURA 3.2 RESISTENCIAS A LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO DE LA BURBUJA DE AIRE A LA CÉLULA..................................................... 7

FIGURA 4.1 kLa PARA LA COMBINACIÓN 1 DE LA TABLA 4.1............................ 14 FIGURA 4.2 kLa PARA LA COMBINACION 2 DE LA TABLA 4.1............................ 14 FIGURA 4.3 kLa PARA LA COMBINACION 3 DE LA TABLA 4.1............................ 15 FIGURA 4.4 kLa PARA LA COMBINACION 4 DE LA TABLA 4.1............................ 15 FIGURA 4.5 DATOS REALES Y TEÓRICOS PARA EL CRECIMIENTO

CELULAR DEL EXPERIMENTO 1...................................................... 16 FIGURA 4.6 DATOS REALES Y TEÓRICOS PARA EL CONSUMO DE

GLUCOSA DEL EXPERIMENTO 2..................................................... 17 FIGURA 4.7 CRECIMIENTO CELULARES MÁXIMOS, PARA AGITADOR AXIAL

Y BAFLES............................................................................................ 17 FIGURA 5.1 VISTA SUPERIOR BIOREACTOR DE 2500 L.................................... 20 FIGURA 5.2 VISTA INFERIOR BIOREACTOR DE 2500 L...................................... 21 FIGURA 5.3 AGITADOR FLUJO RADIAL................................................................ 22 FIGURA 5.4 AGITADOR FLUJO AXIAL................................................................... 22 FIGURA 5.5 ESQUEMA DEL CONTEO CELULAR................................................. 23 FIGURA 6.1 INFLUENCIA DE LA VELOCIDAD EN EL CRECIMIENTO

CELULAR............................................................................................. 28 FIGURA 6.2 INFLUENCIA DEL AGITADOR EN EL CRECIMIENTO CELULAR..... 29 FIGURA 6.3 INFLUENCIA DE LA PRESIÓN EN EL CRECIMIENTO CELULAR.... 29 FIGURA 6.4 INFLUENCIA DE BAFLES EN EL CRECIMIENTO CELULAR............ 30 FIGURA 6.5 INTERACCIÓN BAFLES - AGITADOR................................................ 30 FIGURA 6.6 INTERACCIÓN BAFLES - VELOCIDAD.............................................. 31 FIGURA 6.7 INTERACCIÓN VELOCIDAD - AGITADOR......................................... 31 FIGURA 6.8 ANOVA, ANÁLISIS DE VARIANZA..................................................... 33 FIGURA 6.9 REGRESIÓN LINEAL DEL MODELO EXPERIMENTAL..................... 34 FIGURA 6.10 COMPARACIÓN ENTRE EL PUNTO ÓPTIMO DE OPERACIÓN Y

EL HISTÓRICO.................................................................................... 36 FIGURA 6.11 COMPARACIÓN ENTRE LAS VELOCIDADES MÁXIMAS DE

CRECIMIENTO ENTRE EL HISTÓRICO Y EL MEJOR PUNTO DE OPERACIÓN........................................................................................

37

FIGURA A.1 kLa EXPERIMENTO 1.......................................................................... 43 FIGURA A.2 kLa EXPERIMENTO 2.......................................................................... 44 FIGURA A.3 kLa EXPERIMENTO 3.......................................................................... 46 FIGURA A.4 kLa EXPERIMENTO 4.......................................................................... 49 FIGURA A.5 kLa EXPERIMENTO 5.......................................................................... 51 FIGURA A.6 kLa EXPERIMENTO 6.......................................................................... 52 FIGURA A.7 kLa EXPERIMENTO 7.......................................................................... 55 FIGURA A.8 kLa EXPERIMENTO 8.......................................................................... 57 FIGURA D.1 PANTALLA PRINCIPAL SISTEMA DE MONITOREO......................... 62

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FIGURA D.2 PANTALLA MEDIDORES SISTEMA DE MONITOREO...................... 63 FIGURA D.3 PANTALLA TENDENCIAS SISTEMA DE MONITOREO..................... 63 FIGURA E.1 CURVA DE CALIBRACIÓN MANÓMETRO........................................ 64 FIGURA E.2 CURVA DE CALIBRACIÓN TERMÓMETRO...................................... 65 FIGURA E.3 CURVA DE CALIBRACIÓN VARIADOR DE VELOCIDAD.................. 67 FIGURA E.4 CURVA DE CALIBRACIÓN ROTÁMETRO (30 PSI)........................... 68

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Lista de tablas

TABLA 4.1 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN DE kLa.................................................... 13 TABLA 5.1 FACTORES Y NIVELES DEL PLAN EXPERIMENTAL.......................... 19 TABLA 5.2 PLAN DE EXPERIMENTACIÓN............................................................. 20 TABLA 5.3 CARACTERISTICAS TECNICAS DE LA INSTRUMENTACIÓN............ 22 TABLA 6.1 PLAN EXPERIMENTAL DESARROLLADO........................................... 27 TABLA 6.2 PROMEDIO DE LOS FACTORES EN CADA NIVEL............................. 27 TABLA 6.3 EFECTO DE LOS FACTORES CON RESPECTO A LA MEDIA............ 27 TABLA 6.4 PROMEDIO DE LAS INTERACCIONES................................................ 28 TABLA 6.5 PROMEDIO DE LAS INTERACCIONES CON RESPECTO A LA

MEDIA..................................................................................................... 28 TABLA 6.6 EVALUACIÓN DE COMBINACIONES PARA LA OPTIMIZACIÓN........ 32 TABLA 6.7 DISTRIBUCIÓN F................................................................................... 33 TABLA A.1 kLa PARA EL PLAN EXPERIMENTAL.................................................... 41 TABLA A.2 DATOS DO EXPERIMENTO 1............................................................... 42 TABLA A.3 DATOS DO EXPERIMENTO 2............................................................... 44 TABLA A.4 DATOS DO EXPERIMENTO 3............................................................... 45 TABLA A.5 DATOS DO EXPERIMENTO 4............................................................... 48 TABLA A.6 DATOS DO EXPERIMENTO 5............................................................... 50 TABLA A.7 DATOS DO EXPERIMENTO 6............................................................... 51 TABLA A.8 DATOS DO EXPERIMENTO 7............................................................... 54 TABLA A.9 DATOS DO EXPERIMENTO 8............................................................... 56 TABLA C.1 FACTORES Y NIVELES DEL PLAN EXPERIMENTAL.......................... 59 TABLA C.2 ACCIONES DISJUNTAS DEL PLAN EXPERIMENTAL......................... 60 TABLA C.3 TAGUCHI L8 27....................................................................................... 60 TABLA C.4 PLAN EXPERIMENTAL.......................................................................... 61 TABLA E.1 DATOS DE CALIBRACIÓN MANÓMETRO........................................... 64 TABLA E.2 DATOS DE CALIBRACIÓN TERMÓMETRO......................................... 65 TABLA E.3 DATOS DE CALIBRACIÓN VARIADOR DE VELOCIDAD..................... 66 TABLA E.4 DATOS DE CALIBRACIÓN ROTÁMETRO............................................ 68

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Lista de símbolos

a Superficie de intercambio específico (m2)

BA Interacción bafles-agitador

bafles, B Bafles toma un valor de 1 si se instalan o 2 si no se instalan

BV Interacción bafles- velocidad

Cg Concentración de glucosa (gg/L)

CL Concentración del aire disuelto (g/L)

Co Concentración de oxígeno (go/L)

C*, CO* Concentración de oxígeno saturada (g/L)

∆ Delta, utilizado como el cambio de alguna variable ∆t Cambio en tiempo (h)

∆X Cambio en el crecimiento celular en un delta de tiempo (células/ml)

GL Grados de libertad

g prom Promedio de glucosa entre un delta de tiempo (g/L)

h hora

H Constante de Henry

imp, A Agitador, toma un valor de 1 si es de flujo radial, ó 2 si es de flujo axial

Kg Constante de saturación de la tasa de consumo de glucosa (gg/L)

kL Coeficiente de transferencia en la fase de estancamiento o frontera (h-1m-2)

kLa Coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico(h-1)

Ko Constante de saturación de la tasa de consumo de oxígeno (go/L)

Ks Constante especifica de sustrato (gs/L)

L litro

MCM Mínimo común múltiplo

ml mililitro

M Promedio total de los experimentos en la razón S/N

n, N ,V Velocidad de agitación (r.p.m.)

NA Transferencia de masa dependiendo del volumen (g/L*h)

OTR Tasa de transferencia de oxígeno (g/L*h)

Pg Potencia de agitación (kW)

p , P Presión del tanque (psi)

po Presión parcial del aire en la fase gaseosa (unidades de presión)

QO Tasa Específica de consumo de Oxígeno (go/células *h)

R Resultado teórico de la función S/N

S Concentración del sustrato limitante (g / L)

T Temperatura (°C)

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t Tiempo (h)

µ Tasa específica de crecimiento(h-1) µmax Tasa máxima de crecimiento (h-1)

VA Interacción velocidad- agitador

Vol Volumen del fermentador (L)

Vs Velocidad de aireación por sección transversal del fermentador(cm/s)

X Concentración de células (células / ml)

X prom Promedio del crecimiento celular en un delta de tiempo (células/ml)

y Promedio de datos

Yx/g Coeficiente de rendimiento de crecimiento celular frente a la glucosa (células/gg)

Yx/o2 Coeficiente de rendimiento de crecimiento celular frente al oxígeno (células/go)

σ Desviación estándar α,β,γ,κ Constantes estimadas de los modelos

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Capítulo 1 Introducción

La optimización de la operación en bioreactores que son utilizados para el cultivo de células animales en suspensión, requieren consideraciones especiales debido a su natural fragilidad, sus tiempos prolongados de fermentación y sus bajas densidades celulares alcanzadas. Una cantidad adecuada y suficiente de oxígeno debe ser dada a los cultivos, para garantizar unas condiciones óptimas para el crecimiento celular, una mezcla homogénea y una buena tasa de transferencia de oxígeno desde el medio a las células. En Colombia, existen laboratorios que se dedican a la producción y comercialización de vacunas que utilizan procesos fermentativos para realizar los crecimientos celulares y virales. La Empresa Colombiana de Productos Veterinarios S.A. VECOL S.A., es una compañía que lleva cerca de 50 años en el mercado como líder en la fabricación y comercialización de vacunas, para uso veterinario y humano. Entre los programas de mejoramiento continuo en los procesos productivos que desarrolla VECOL S.A. en todas sus líneas de producción, surge la necesidad de optimizar la operación de los bioreactores que son utilizados para realizar los crecimientos de células animales BHK21 C13. Estas células de riñón de hámster bebe son cultivadas en suspensión y son utilizadas en la replicación del virus Aftoso. Se requiere estandarizar los resultados de crecimientos celulares y el tiempo empleado en las fermentación, para lograr minimizar las desviaciones en los resultados y obtener aumentos en los crecimientos celulares. En esta empresa, actualmente se utilizan reactores de capacidad 2500 L y 3000 L en los crecimientos celulares con un incremento promedio de 1X106 células/ml logrado en tiempos de 20 h aproximadamente. OBJETIVO GENERAL Aumentar el cambio del crecimiento celular al final de una fermentación, encontrando el valor que deben tomar las variables de operación estudiadas dentro de los rangos de operación máximos que tienen en el proceso. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Modelar analíticamente el funcionamiento de un tanque reactor (crecimiento célular). • Usar el modelo para encontrar el valor de las variables de control que optimizan el funcionamiento de los bioreactores en el proceso de fermentación. • Verificar experimentalmente las conclusiones obtenidas en el punto anterior.

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ALCANCE En este trabajo se estudia las variables físicas que influyen en la operación de un bioreactor de 2500L utilizado para realizar crecimientos de células BHK21 C13 en la planta VECOL S.A. Estos parámetros son: la agitación, la presión, el tipo de agitador y los bafles o mamparas. Permanece constante las variables biológicas del proceso, como son el tipo de células y la composición del medio de cultivo. ORGANIZACIÓN DEL DOCUMENTO Inicialmente se modela analíticamente el funcionamiento de los bioreactores en el proceso de fermentación, esto es, se plantean un conjunto de ecuaciones que describen el comportamiento de la fermentación, en función de las variables relevantes del proceso. Se usa este modelo para encontrar el valor de las variables de control que optimizan el funcionamientos del bioreactor, teniendo en cuenta todas las restricciones de operación y de diseño inherentes al sistema. Se realiza un plan de experimentación que incluya también las variables que no son sensibles en el modelo analítico. Se seleccionan los requerimientos de instrumentación necesarios, se realizan las calibraciones de los mismos, se realiza el montaje y se llevan a cabo los experimentos. El desarrollo de la experimentación sirve para ajustar el modelo matemático y hacerlo sensible a las variables de operación del reactor. Se analizan los resultados y se concluye estableciendo las relaciones de las variables de operación que optimizan el funcionamiento del equipo.

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Capítulo 2 Descripción de fermentaciones para crecimientos celulares BHK21 C13 en bioreactores de VECOL S.A. Las fermentaciones para cultivos celulares en bioreactores de gran capacidad se realizan después de realizar un escalamiento desde el banco de células hasta los bioreactores soleras de 300 L. Estos bioreactores soleras alimentan los bioreactores de mayor capacidad (2500 L), en donde se realiza el escalamiento final. El conteo de células inicial en los reactores de 2500 L es aproximadamente 1X106 células/ml para llegar a un conteo celular final promedio de 2X106 células/ml. Estas fermentaciones se realizan bajo condiciones controladas de temperatura, presión, agitación y flujo de aire. La temperatura de crecimiento celular es de 37°C, que se logra recirculando agua a esta temperatura por la camisa del reactor. El volumen de trabajo del reactor es de aproximadamente 1000 L, en los cuales 500 L son de medio de cultivo y los otros 500 L son de células. La presión del reactor se mantienen controlada en un valor de 5 psig. La agitación se realiza por medio de un agitador con transmisión tipo magnética con una velocidad de trabajo de 120 r.p.m. que se mantiene constante a lo largo de toda la fermentación. El PH se debe mantener controlado entre un valor de 7.0 y 7.2, esto se logra aireando sobre la cámara aire de superficie, o en el fondo del reactor aire de profundidad. Cuando el PH se mantiene en el rango establecido o es un poco superior se airea solamente en la superficie en un valor de 30 lpm. Cuando se baja el PH del valor mínimo requerido se airea en profundidad por intervalos de tiempo hasta alcanzar el valor de PH necesario. El reactor tiene un tipo de agitador que permite flujo radial, con un plato interior y seis paletas uniformemente distribuidas. Los reactores no tienen instalados los bafles o mamparas, estos son cuatro deflectores de ancho aproximado 1/10 o 1/12 del diámetro del reactor que se instalan a lo largo del cilindro y permiten aumentar la turbulencia en el medio y mejorar la transferencia de oxígeno. El tiempo total de fermentación oscila entre 20 h y 22 h. El reactor cuenta con instrumentos para medir la temperatura, la presión y la agitación. La medición de PH se realiza en laboratorio después de tomarle una muestra al tanque con intervalos de 2 h. La medición de oxígeno disuelto en el medio no se realiza por no contar con el instrumento adecuado

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Capítulo 3 Generalidades del proceso de fermentación aerobia en bioreactores

En este capítulo se presenta la teoría básica para entender la cinética de los crecimientos de los microorganismos en fermentaciones tipo batch. Se profundizará en las cuatro fases típicas de los crecimientos celulares, se verán los conceptos de transferencia de oxígeno y los métodos para su medición. 3.1 CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN MICROORGANISMOS PARA FERMENTACIONES TIPO BATCH Una fermentación tipo batch o discontinua puede ser considerada como un sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estéril dentro del fermentador es inoculado con microorganismos y la incubación se da bajo condiciones fisiológicas óptimas. En el trascurso de toda la fermentación, solo es adicionado oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante, y un ácido o base para el control del pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de biomasa, y la concentración del metabolito cambia constantemente como el resultado del metabolismo de las células. En el trascurso de la fermentación hay cuatro fases típicas de crecimiento: fase lag, fase log, fase estacionaria y fase de muerte. En la figura 3.1 se muestran las fases anteriormente descritas.

Figura 3.1 Curva de crecimiento para cultivos celulares[4]

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Fase Lag. Cuando las células son transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento en el número de células. Durante la fase lag, los microorganismos se adaptan a su nuevo ambiente. Fase Log. Al final de la fase lag, las células se han adaptado a las nuevas condiciones de crecimiento. El crecimiento de las células se pueden describir cuantitativamente como la duplicación del número de células por unidad de tiempo o la duplicación de la biomasa por unidad de tiempo. Dibujando el número de células o la biomasa a través del tiempo sobre una gráfica semilogarítmica, resulta una línea recta. De aquí el término “fase log”. A través de esta fase las células alteran el medio tomando los sustratos y excretando los productos metabolizados. El crecimiento permanece constante durante la fase log. La tasa de crecimiento es independiente de la concentración de sustrato mientras exista sustrato en el medio. La tasa de incremento en biomasa es correlacionada con la tasa de crecimiento específico µ y la concentración del número de células X (número de células/ml) según se relaciona en la ecuación 3-1.

XdtdX

µ= (3-1)

La tasa de crecimiento específico, µ, es generalmente una función de tres parámetros: la concentración del sustrato limitante, S, la máxima tasa de crecimiento, µm, y la constante específica de sustrato Ks. Esta relación puede ser expresada como:

SKS

sm +

= µµ (3-2)

La ecuación (3-2) es llamada ecuación de Monod. La constante Ks es la concentración de sustrato en la cual se obtiene la mitad de la máxima tasa de crecimiento (µ=0.5µm). La máxima tasa de crecimiento específico es de considerable importancia a nivel industrial, ya que en ella se incluye la dependencia de los microorganismos sobre las condiciones del fermentador. Fase estacionaria. Cuando el sustrato es metabolizado o las substancias tóxicas han sido formadas, el crecimiento celular desciende lentamente o se para completamente. La biomasa incrementa solo gradualmente o permanece constante durante la fase estacionaria, aunque la composición de las células puede cambiar. Fase de muerte. En esta fase la reserva de energía de las células se ha acabado. Una línea recta se puede obtener cuando una gráfica semilogarítmica se realiza de células que sobreviven vs. Tiempo, lo cual indica que las células se mueren a una tasa exponencial. El tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte depende del microorganismo y el proceso utilizado. En procesos comerciales, la fermentación se interrumpe usualmente al final de la fase log o al comienzo de la fase de muerte celular.

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3.2 AIREACIÓN Y TRANSFERENCIA DE MASA Uno de los factores más críticos en la operación de fermentadores a gran escala es la provisión de una adecuada aireación. El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el metabolismo microbiano, y el dióxido de carbono es el producto metabolizado más importante. El oxígeno, presenta una baja solubilidad en el agua, lo cual lo convierte en un factor limitante en la fermentación. La solubilidad de los gases sigue la ley de Henry en los rangos de presión sobre los cuales los fermentadores operan. 3.2.1 Ley de Henry. Describe la solubilidad del O2 en una solución de nutrientes con relación a la presión parcial del O2 en la fase gaseosa. Se puede expresar como:

Hp

C o=* (3-3)

En esta ecuación, C* es la concentración de oxígeno saturada en la solución de nutrientes, po es la presión parcial del gas en la fase gaseosa y H es la constante de Henry, la cual se especifica para las fases gaseosa y líquida. Cuando la concentración de oxígeno incrementa en la fase gaseosa, la proporción de O2 en la solución de nutrientes también incrementa. 3.2.2 Transferencia de oxígeno. Para que el oxígeno pueda ser transferido desde una burbuja de gas a una fase líquida que contiene células, debe pasar a través de una serie de resistencias de transporte como se ilustra en la figura 3.2, estas son:

1. Difusión desde la fase gaseosa hasta la interfase gas-líquido 2. Movimiento a través de la interfase gas-líquido 3. Difusión del soluto a través de la región líquida no mezclada alrededor de la

burbuja. 4. Transporte del soluto a través de la fase líquida hasta una segunda región de

líquido relativamente no mezclada alrededor de la célula. 5. Transporte a través de la segunda región de líquido no mezclada asociada con las

células. 6. Transporte por difusión en la pared celular 7. Transporte a través de la membrana celular para obtener una reacción intracelular.

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Figura 3.2 Resistencias a la transferencia de oxígeno de la burbuja de aire a la célula[10]

La transferencia de masa dentro del líquido puede ser caracterizada como sigue:

OTRCCakN LA =−= )( * (3-4) Donde: NA = Transferencia de masa dependiendo del volumen kL = Coeficiente de transferencia en la fase de estancamiento o frontera a = Superficie de intercambio específico kLa = Coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico C* = Valor de saturación del aire disuelto en la fase frontera CL = Concentración del aire disuelto OTR = Tasa de transferencia de oxígeno El coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno ha sido examinado como un parámetro crítico para el funcionamiento del bioreactor. El coeficiente depende del diámetro, capacidad, potencia, sistema y tasa de aireación del equipo, y sobre la densidad, viscosidad, y composición del medio de cultivo, estructura del microorganismo, el agente antiespumante usado y la temperatura. 3.2.3 Determinación de la tasa de transferencia de oxígeno. Existen los siguientes métodos para la determinación de la OTR: • El método dinámico. • El método del sulfito, • La medición directa de la tasa de transferencia volumétrico de oxígeno, • El método indirecto o de desgasificación.

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En este trabajo se utilizará el método indirecto, el cual es explicado en el capítulo 4.1. Si se requiere profundizar en cada uno de los métodos se recomienda consultar la referencia [4].

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Capítulo 4 Modelo analítico del proceso de fermentación aerobia

En este capítulo se desarrolla un modelo analítico para simular los crecimientos celulares, el consumo de glucosa y de oxígeno a lo largo de una fermentación. Para esto, se utiliza como base la ecuación de Monod y las ecuaciones de balance de masa para los sustratos limitantes glucosa y oxígeno. Para ajustar este modelo, se caracteriza el coeficiente de transferencia volumétrica de oxígeno (kLa) y la concentración de saturación de oxígeno, en función de los parámetros de operación velocidad, presión, tipo de agitador y bafles. Por último se simula teóricamente el efecto de la variación de kLa sobre los crecimientos celulares. La variable a modelar en el proceso de fermentación aerobia en la fase de crecimiento o fase ”Log”, es el incremento en el número de células, la cual se encuentra correlacionada con la tasa de crecimiento específica µ y la concentración celular X, así:

XdtdX

µ= (4-1)

donde µ = Tasa específica de crecimiento(h-1); X = Concentración de células (células/ml); t = tiempo (h) La tasa específica de crecimiento µ varía de la siguiente forma (ecuación de Monod):

SKS

s += maxµµ (4-2)

donde µmax = Tasa de crecimiento máxima (h-1); S = Concentración del sustrato limitante (g / L); Ks = Constante de saturación o constante de velocidad media (g/L) La tasa de cambio de la concentración de oxígeno (CO2) es:

XQCCkLdt

dCOOO

O −−= )( *2 α (4-3)

donde kLα = Coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico (h-1);

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CO* = Concentración de oxígeno saturada en el medio (g/L); CO = Concentración de oxígeno actual (g/L); QO = Tasa Específica de consumo de Oxígeno (go/células *h); X = Concentración de células (células / ml). El primer término del lado derecho de la ecuación (4-3) representa la transferencia de oxígeno por causa de las variables mecánicas y el segundo término de la ecuación (biológico) por causa del consumo propio de las células para el crecimiento. Para el caso particular de este trabajo se adecuó el modelo teórico explicado anteriormente, para simular fermentaciones de células animales con sustrato limitante de glucosa y aireación continua. El modelo consta de las siguientes tres ecuaciones: la ecuación (4-4) que representa la tasa de crecimiento celular con sustrato limitante glucosa y aireación continua, la ecuación (4-5) representa el consumo de sustrato de glucosa y la ecuación (4-6) representa el cambio de la concentración de oxígeno a lo largo de la fermentación. :

XCK

CCK

Cu

dtdX

oo

o

gg

g **max

+

+= (4-4)

−=gx

g

YdtdX

dt

Cd

/

1000*)( (4-5)

( )

−−=ox

oo

YdtdX

CCkLadt

Cd

/

*0

1000*)(2 (4-6)

Este sistema de ecuaciones se resuelve numéricamente, ya que presenta no linealidades en la ecuación (4-4). Este modelo se resolvió utilizando el software mathematica. Para desarrollar este modelo se debe caracterizar el coeficiente de transferencia de oxígeno kLa y la concentración de oxígeno saturado C*

o de la ecuación (4-6) en función de las variables de operación del reactor. 4.1 CARACTERIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA DE OXÍGENO kLa Se realiza la caracterización del kLa utilizando el método indirecto o de eliminación de gas. Consiste en desgasificar con nitrógeno el reactor lleno con agua hasta el volumen de trabajo (en este caso 1000 L); se retira todo el oxígeno presente en el líquido, cuando se

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llega a cero o a un nivel muy bajo de concentración de oxígeno se comienza a airear a las condiciones de operación del experimento hasta llegar al punto de saturación. El cambio en el porcentaje de oxígeno disuelto se monitorea a través de todo el experimento. Se obtiene experimentalmente con las ocho combinaciones del plan experimental ...véase la tabla 5.2..., la ecuación (4-7), que correlaciona las variables de operación con el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno. El desarrollo de la ecuación (4-7) se puede ver en el ANEXO A.

( ) ( ) ( )( )3501.05688.03273.22862.0)(*2041.0 pnimpbafleskLa −−= (4-7) donde Bafles toman un valor de 1 si no se instalan, ó 2 si se instalan las cuatro unidades; imp es el tipo de agitador, toma un valor de 1 si es de flujo radial, ó 2 si es de flujo

axial; n es la velocidad de agitación, varía entre el rango de 120 r.p.m. a 160 r.p.m.; p es la presión del tanque, varía entre un rango de 5 psi a 15 psi. 4.2 CONCENTRACIÓN DE SATURACIÓN DE OXÍGENO El valor de la concentración de saturación de oxígeno C*

o, se puede estimar a partir de la ley de Henry para presiones de trabajo bajas y a que la solubilidad del oxígeno en agua es también muy baja. Esta relación se encuentra en la siguiente ecuación:

7.14**

7.14* pCCo

α= (4-8)

donde la presión esta dada en valores absolutos, la concentración de oxígeno C*

a14.7 esta dada para la temperatura de crecimiento celular en los reactores (37°C) y 1 atm de presión. Existe una relación experimental de la concentración de oxígeno C* con la temperatura de trabajo[4] , se muestra en la ecuación (4-9):

TC

+=

6.31468* (4-9)

donde la concentración de oxígeno esta dada en mg/L y la temperatura en °C. Al combinar las ecuaciones (4-8) y (4-9) para ser utilizada en el modelo matemático queda la siguiente relación:

10007.14

83.10*82.6

*

+

=

p

Co (4-10)

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donde la concentración de oxígeno esta dada en go/L y la presión p en psi.. 4.3 MODELO ANALÍTICO AJUSTADO Las ecuaciones (4-4), (4-5) y (4-6) del modelo analítico base se deben ajustar con las ecuaciones (4-7) y (4-10) del coeficiente de transferencia de oxígeno y la concentración de oxígeno saturado respectivamente. Se obtiene finalmente el siguiente modelo analítico:

XCK

CCK

Cu

dtdX

oo

o

gg

g **max

+

+= (4-11)

−=gx

g

YdtdX

dt

Cd

/

1000*)( (4-12)

( ) ( ) ( )( )

−

−

+

= −−

2

3501.05688.03273.22862.0

/

1000*

10007.14

83.10*82.6

*)(*2041.0)(

2

2

oYxdtdX

C

p

pnimpbaflesdt

Cdo

o (4-13)

donde X = Concentración de células (células / ml); µmax = Tasa máxima de crecimiento (h-1); Cg = Concentración de glucosa (gg/L); Co = Concentración de oxígeno (go/L); Kg = Constante de saturación de la tasa de consumo de glucosa (gg/L); Ko = Constante de saturación de la tasa de consumo de oxígeno (go/L); Yx/g = Coeficiente de rendimiento de crecimiento celular frente a la glucosa

(células/gg); Yx/o2 = Coeficiente de rendimiento de crecimiento celular frente al oxígeno

(células/go); bafles = Deflectores instalados en el cilindro del reactor, toman un valor de 1 si no se

instalan, ó 2 si se instalan las cuatro unidades; imp = Tipo de agitador, toma un valor de 1 si es de flujo radial, ó 2 si es de flujo

axial; n = Velocidad de agitación, varía entre el rango de 120 r.p.m. a 160 r.p.m.; p = Presión del tanque, varía entre un rango de 5 psi a 15 psi. t = Tiempo (h) El modelo se resuelve entre los rangos de operación de las variables de acuerdo con la ecuación (4-7), y con los valores obtenidos experimentalmente para cada combinación según el plan experimental propuesto en el capítulo 5 .

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Se busca con este modelo matemático reproducir los crecimientos celulares obtenidos en las fermentaciones reales entre periodos de 18 h a 22 h. Actualmente en una fermentación se reproduce al doble la cantidad de células iniciales, típicamente los valores iniciales están en 1X106 células/ml y al final de la fermentación se obtienen recuentos que oscilan entre 2X106 células/ml y 2.2x106 células/ml. 4.4 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN DE kLa Como el objetivo fundamental es maximizar los crecimientos celulares en el reactor, se observa que entre más grande sea el kLa en la ecuación (4-13), mayor es la concentración de oxígeno y por lo tanto mayores serán los crecimientos en la ecuación (4-11). Por lo tanto, se realiza una simulación con el modelo matemático para determinar la influencia que tienen la variación de los bafles, el agitador, la velocidad y la presión sobre el coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico kLa. En el ANEXO B se encuentra el código del programa desarrollado en mathematica para realizar las simulaciones de kLa. Los puntos de operación de velocidad y presión, que maximizan el kLa para las diferentes combinaciones de agitador y bafles se presentan en la siguiente tabla: Tabla 4.1 Análisis de la variación de kLa

De la tabla 4.1 se observa que la mejor combinación para aumentar el kLa se obtiene utilizando agitador radial, con bafles, velocidad de 160 r.p.m. y presión de 15 psi. Para esta combinación el kLa toma un valor de 11.52 1/h. Las figuras 4.1, 4.2, 4.3 y 4.4 muestran las tendencias de crecimiento de kLa, para cada combinación de la tabla 4.1.

Combinación Presión Velocidad kLaAxial Radial Si No (psi) (r.p.m.) (1/h)

1 X X 15 160 9,442 X X 15 160 1,883 X X 15 160 11,524 X X 15 160 2,29

Agitador Bafles

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Figura 4.1 kLa para la combinación 1 de la tabla 4.1 El máximo kLa para la figura 4.1 es 9.44 1/h para 160 r.p.m. y 15 psi

Figura 4.2 kLa para la combinación 2 de la tabla 4.1 El máximo kLa para la figura 4.2 es 1.88 1/h para 160 r.p.m. y 15 psi

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Figura 4.3 kLa para la combinación 3 de la tabla 4.1. El máximo kLa para la figura 4.3 es 11.52 1/h para 160 r.p.m. y 15 psi

Figura 4.4 kLa para la combinación 4 de la tabla 4.1 El máximo kLa para la figura 4.4 es 2.29 1/h para 160 r.p.m. y 15 psi De las figuras 4.1, 4.2, 4.3 y 4.4 se observa que la velocidad y la presión si tienen un efecto en el cambio de kLa, esto es, la transferencia de oxígeno se aumenta si se aumenta la velocidad y la presión. Para la figura 4.3, a una presión constante de 15 psi se obtiene un aumento en el kLa de 1.74/h para un cambio en velocidad de 120 r.p.m. a 160 r.p.m., así mismo, para una velocidad de 160 r.p.m. se obtiene un aumento en el kLa de 3.68 1/h variando la presión de 5 psi a 15 psi. Para corroborar este resultado se debe realizar un plan de experimentación que confirme la tendencia y el valor de las variables de operación del reactor para maximizar los

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crecimientos celulares. Posteriormente se realiza una comparación del modelo analítico con los resultados experimentales y se utilizan estos para calibrar el modelo matemático. 4.5 SIMULACIONES ANALITICAS Para realizar las simulaciones con el modelo analítico desarrollado en las ecuaciones (4-11), (4-12) y (4-13), se debe hallar el valor de las variables del modelo según se explica en la sección 5.5. El algoritmo del modelo se desarrolló en el software mathematica y se encuentra en el ANEXO B. Se muestra en la figura 4.5 una comparación entre una gráfica obtenida del modelo matemático y unos resultados reales de fermentaciones para los crecimientos celulares. Se toma como ejemplo la repetición 1 del experimento 1, con los siguientes puntos de operación: velocidad 120 r.p.m., presión 15psi, sin bafles y agitador radial.

Figura 4.5 Datos reales y teóricos para el crecimiento celular del experimento 1 En la figura 4.6 se muestra una comparación para obtener el perfil del consumo de glucosa en el tiempo, para los datos reales y teóricos. Se toma como ejemplo la repetición 1 del experimento 2. El punto de operación es: velocidad 160 r.p.m., presión 15 psi, bafles no y agitador radial.

1,10E+06

1,30E+06

1,50E+06

1,70E+06

1,90E+06

2,10E+06

2,30E+06

2,50E+06

0 5 10 15 20 25

tiempo (h)

nú

mer

o d

e cé

lula

s/m

l

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Figura 4.6 Datos reales y teóricos para el consumo de glucosa del experimento 2 De estas gráficas se observa que el modelo teórico simula bien los crecimientos celulares y el consumo de glucosa, pero depende directamente de la calibración del modelo y de la exactitud de la medición de las variables en sitio. Se simula la influencia de la velocidad y la presión para un agitador tipo axial y bafles frente a los crecimientos celulares (combinación que maximiza el crecimiento celular ...véase secciones 6.1 y 6.2...). Se obtiene la siguiente figura:

Figura 4.7 Crecimiento celulares máximos, para agitador axial y bafles

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 5 10 15 20 25

Tiempo(h)

glu

cosa

(g

/L)

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En la figura 4.7 se grafican los puntos máximos de crecimiento celular para cada una de las combinaciones entre velocidad y presión, para agitadores axiales y bafles en el reactor. Se observa que el punto donde se obtienen los más altos crecimientos celulares es cuando la velocidad toma un valor de 160 r.p.m. y la presión 15 psi. Se deben verificar estos resultados analíticos con los resultados experimentales descritos en el capítulo 6.

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Capítulo 5 Materiales y métodos En este capítulo se desarrolla y selecciona la metodología a seguir en el procedimiento experimental. Se escogen los factores y los niveles de las variables. Se selecciona el plan experimental de acuerdo con la metodología de Taguchi. Se realiza una descripción del equipo y de la medición de las variables. Por último, se explica el desarrollo de un experimento y los respectivos cálculos que se deben realizar. 5.1 METODOLOGÍA La experimentación tiene como objetivo corroborar o descartar las predicciones del análisis de variación de kLa, de acuerdo a las conclusiones de la sección 4.4. También, la de obtener experimentalmente las variables del modelo analítico para cada uno de los experimentos, y así encontrar la solución a las ecuaciones (4-11), (4-12) y (4-13). Los factores y los niveles de la experimentación se seleccionaron de acuerdo a las variables de operación del reactor. En la siguiente tabla se presentan estos: Tabla 5.1 Factores y niveles del plan experimental

Los valores utilizados se seleccionaron de acuerdo a las condiciones de operación actual del reactor y a los valores máximos que se pueden obtener, teniendo en cuenta las restricciones del proceso. La experimentación se realiza siguiendo el modelamiento de Taguchi en la realización de planes de experimentación, esto es, realizando matrices ortogonales para la selección de las combinaciones críticas de una experimentación tipo factorial. Esta metodología reduce el número de experimentos del modelo factorial, permite estudiar muchos factores a partir de pocas combinaciones, analiza las interacciones entre los factores y da la posibilidad de predecir combinaciones no probadas. Se presenta una descripción de la metodología de Taguchi en el ANEXO C. En el tabla 5.2 se presenta el plan de experimentación a seguir:

FACTORESNIVEL 1 NIVEL 2

BAFLES 0 4AGITADOR RADIAL AXIALVELOCIDAD (r.p.m.) 120 160PRESIÓN (psi) 5 15

NIVELES

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Tabla 5.2 Plan de experimentación

El plan experimental consta de ocho combinaciones en donde se presenta el valor que debe tomar los bafles, el agitador, la velocidad y la presión en cada uno de los experimentos. Se podrán analizar tres interacciones entre las variables que se crean importantes para el resultado final, estas son: interacción bafles y agitador (BXA), interacción bafles y velocidad (BXVEL) e interacción velocidad y agitador (VELXA). 5.2 DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO El equipo asignado para la experimentación se presenta en las figuras 5.1 y 5.2. Es un bioreactor de volumen 2500 L existente en la planta VECOL S.A. Construido en acero inoxidable 316L en todas las zonas que están en contacto directo con el producto. Cuenta con un variador de velocidad, sensor de temperatura y de presión. Adicionalmente se acondicionaron para este trabajo los puertos para la instalación de los medidores de oxígeno disuelto (DO) y pH.

Figura 5.1 Vista superior del Bioreactor de 2500 L.

EXPERIMENTO BAFLES AGITADOR B X A VELOCIDAD B X VEL PRESIÓN VEL X A1 0 RADIAL 0-R 120 0-120 5 120-R2 0 RADIAL 0-R 160 4-160 15 160-A3 0 AXIAL 4-A 120 0-120 15 160-A4 0 AXIAL 4-A 160 4-160 5 120-R5 4 RADIAL 4-A 120 4-160 5 160-A6 4 RADIAL 4-A 160 0-120 15 120-R7 4 AXIAL 0-R 120 4-160 15 120-R8 4 AXIAL 0-R 160 0-120 5 160-A

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Figura 5.2 Vista inferior del Bioreactor de 2500 L El equipo es esterilizado con vapor a una temperatura de 121°C por un periodo promedio de una hora; todas las tuberías de transferencia de medio de cultivo, de cultivo celular y el modulo de filtración de aire se esterilizan in situ. La temperatura de crecimiento celular es de 37°C, que se logra recirculando agua en un circuito de lazo cerrado a esta temperatura por la camisa del tanque durante el tiempo de la fermentación entre 18 h y 22 h aproximadamente. La temperatura dentro del tanque es medida por una termoresistencia RTD Pt100 localizada en un termopozo en el cilindro del tanque. El sistema de aireación consta de aire en la superficie, de profundidad y un venteo. El aire de superficie permanece constante a lo largo de toda la fermentación en un valor de 30 lpm, mientras que el aire de profundidad es inyectado solamente para control de PH. Este control en profundidad se realiza aireando por medio de un tubo en SS316 de diámetro 1/2" localizado en la parte inferior del agitador. El valor del pH es medido por medio de un electrodo esterilizable Hamilton y su control se realiza manualmente adicionando aire estéril de superficie o profundidad según se requiera para mantener este valor entre un rango de 7.0 a 7.2. El oxígeno disuelto es medido por medio de un electrodo esterilizable con principio de operación polarográfico. El sistema de agitación cuenta con un conjunto de motor-reductor y variador de 5 HP, con acople magnético al eje y con un agitador de flujo radial de seis aletas planas. El sistema no cuenta con los bafles instalados lo cual influye en la minimización de la turbulencia para maximizar la transferencia de oxígeno. 5.2.1 Sistema de Agitación. Debido a la fragilidad de las células animales los agitadores deben ser los adecuados para alcanzar una mezcla homogénea mientras se minimiza la generación de esfuerzos cortantes.

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Se propone investigar el comportamiento del crecimiento celular con dos tipos de agitadores: a. Flujo radial (tipo aleta plana) b. Flujo axial (propela) El impulsor tipo marino o propela es un tipo especial de impulsor que minimiza los esfuerzos cortantes (Chistel et al, 1993).

Figura 5.3 Agitador flujo radial Figura 5.4 Agitador flujo axial 5.2.2 Instrumentación Las características técnicas de la instrumentación utilizada en el reactor se presentan en la tabla 5.3. Tabla 5.3. Características técnicas de la instrumentación INSTRUMENTO DESCRIPCIÓN Manómetro Marca Ashcroft de rango 0-60 psi, División de escala 1 psi, carátula de

2 ½”, diafragma en SS 316 de 21/2” conexión triclamp, clase 1.6 Termógrafo digital

Marca Honeywell de rango 0-150 °C, resolución 0.1 °C, sensor RDT PT100.

Variador de velocidad

Marca Siemens de rango 0-180 r.p.m., resolución 1 r.p.m

Rotámetro para aire

Rango 10-100 lpm, división de escala 5 lpm, resolución 1 lpm

Glucómetro Marca Roche de rango 0.1 g/L a 6 g/L , división de escala 0.01 g/L Medidor de oxígeno disuelto

Marca Hamilton con analizador Nick, con doble rango de medición en % o en ppm, resolución 1%

Medidor de PH Marca Hamilton con analizador Nick. De rango 0-14 5.2.3 Células y medio de cultivo. La línea celular utilizada en este trabajo son células animales BHK 21 C13 de riñón de Hámster bebe cultivadas en medios en suspensión o monocapas. Son utilizadas para reproducir el virus Aftoso en el área de producción de la vacuna Antiaftosa. El medio de cultivo es llamado medio de crecimiento y tiene como

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base aminoácidos, vitaminas, factores de crecimiento (suero bovino), sales, carbohidratos y glucosa entre otros. 5.3 MEDICIÓN DE VARIABLES 5.3.1 Concentración de glucosa. Este parámetro se determina utilizando el glucómetro de rango 0.1 g/L a 6 g/L, en una muestra de 1 ml . Se toman mediciones cada dos horas a lo largo de la fermentación. 5.3.2 Concentración celular. La muestra del cultivo celular se toma cada dos horas durante toda la fermentación. Utilizando una micropipeta se toma 1 ml de muestra y se le agrega 1 ml de colorante azul tripan, esta solución se debe agitar manualmente. Se realiza el recuento celular en los cuatro cuadros de la lámina según se muestra en la siguiente figura,

Figura 5.5 Esquema del conteo celular Se aplica la siguiente ecuación para realizar el conteo:

dosadroscontanúmerodeculusiónfactordedilulasnúmerodecé

mlcélulas410**

/ = (5-1)

se utiliza un factor de dilución igual a dos. 5.3.3 Sistema de Monitoreo. Para monitorear las variables de operación del tanque reactor se desarrolló un sistema de monitoreo en tiempo real. Permite guardar en una hoja electrónica (Excel) el valor de las variables de temperatura, velocidad de agitación, oxígeno disuelto y PH, cada un determinado tiempo preestablecido. Se muestra en el ANEXO D una explicación del sistema desarrollado. 5.3.4 Calibración de instrumentación. La explicación, los métodos y las curvas de calibración de los instrumentos se encuentran en el ANEXO E.

1 2

3 4

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5.4 DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO 5.4.1 Experimentos preliminares. Se tienen los datos históricos de las fermentaciones de este reactor con las variables de operación utilizadas, esto es: velocidad 120 r.p.m., presión 5 psi, agitador tipo radial y sin bafles. La medición de pH se realiza cada dos horas en el laboratorio cada vez que se toma una muestra para realizar los conteos celulares. Esta combinación es la número 1 del plan experimental propuesta en la sección 5.1. Estas fermentaciones no cuentan con mediciones de oxígeno disuelto, ni un método exacto para la medición de glucosa. 5.4.2 Preparación del inóculo. Se cuentan con dos reactores solera de capacidad 300 L que alimentan el fermentador de 2500 L con 500 L de células. Se obtiene un conteo celular inicial promedio de 1X106 células/ml. Por otro lado, se completa el volumen de trabajo del reactor de 1000 L , filtrando 500 L de medio de cultivo estéril. 5.4.3 Fermentaciones batch con aireación continua. Cuando se tiene el volumen de trabajo de 1000 L en el reactor, se inicia la fermentación tipo batch o discontinua. Se mantiene una temperatura controlada de 37°C, se ajusta el valor de la velocidad de agitación por medio del variador según lo requiera el experimento entre 120 r.p.m. y 160 r.p.m., se ajusta el valor de la presión parcial del tanque entre 5 psi y 15 psi, con anterioridad se deben instalar los bafles y el tipo de agitador a utilizar. Se airea continuamente en superficie a 30 lpm y de profundidad solamente si el pH se baja de 7.0, si el pH se sube de 7.2 se suspende el aire de profundidad y se deja que la actividad celular baje el pH al rango establecido de control entre 7.0 y 7.2. Se utiliza el sistema de monitoreo explicado en la sección 5.3.3 para medir en tiempo real la temperatura, la velocidad, el pH y el oxígeno disuelto (DO). Se toman muestras cada dos horas de la fermentación y se llenan los registros correspondientes hasta el final de la fermentación que dura aproximadamente de 20 h a 22 h. La fermentación finaliza cuando se termina la glucosa que trabaja como sustrato limitante. 5.5. CÁLCULOS Para todas las fermentaciones del plan experimental se toma un muestreo celular cada dos horas y se realizan los conteos celulares como se describe en la sección 5.3.2.. Para desarrollar el modelo matemático según las ecuaciones (4-11), (4-12) y (4-13), se deben encontrar experimentalmente las siguientes variables: • La tasa máxima de crecimiento (µmax), es el valor de la pendiente de la recta obtenida al realizar una regresión lineal en la grafica (Ln X- LnXo) vs. tiempo. Esta variable debe hallarse para cada experimento. • La constante de saturación para la glucosa Kg,, se obtiene al realizar la linealización de la ecuación de Monod, ecuación (4-2). Obteniéndose la siguiente relación:

maxmax

11µµ

+=∆∆

−

−

g

K

Xt

X g (5-2)

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se debe graficar X∆t/∆X vs. 1/g , para hallar el punto de corte 1/µmax . Luego se reemplaza en la ecuación (5-2) y se obtiene Kg. • El factor de rendimiento Yx/g , se obtiene de la relación entre el cambio del crecimiento celular (células/ml) y la glucosa consumida. • El factor de rendimiento Yx/o , se define como la cantidad de células producida por gramo de oxígeno consumido. Se obtiene de la curva de consumo de oxígeno a lo largo de la fermentación. • El coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico kLa, se obtiene del valor de las variables de operación de acuerdo a la ecuación (4-7).

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Capítulo 6 Resultados El análisis de resultados para buscar el mejor punto de operación del bioreactor, se hará por dos métodos diferentes: el primero es el análisis del método de Taguchi para el plan experimental y el segundo método es aplicando el análisis de varianza ANOVA, regresiones y maximizaciones. Al final del capítulo se presenta una simulación gráfica obtenida del modelo experimental y el teórico. La experimentación se realizó en la planta de VECOL S.A. localizada en Bogotá, en un reactor de 2500 L del área de producción de la vacuna contra la fiebre Aftosa. Este reactor pertenece al área de producción de células BHK21 C13. Se realizó el plan experimental propuesto en la tabla 5.2., que consta de ocho combinaciones y cada una de ellas se repitió tres veces, para un total de 24 experimentos. Esta experimentación se desarrolló entre agosto de 2002 y mayo de 2003. Durante el proceso de la experimentación se contó con el apoyo del personal técnico y operativo del área. 6.1 METODOLOGÍA DE TAGUCHI Esta metodología permite encontrar la mejor combinación de los parámetros de operación del reactor, lo cual maximiza los crecimientos celulares dentro de los rangos establecidos. Para esto, esta metodología utiliza un indicador de rendimiento para comparar los resultados de cada experimento: la razón señal / ruido (S/N). Este indicativo permite optimizar simultáneamente la media y la desviación estándar. La regla de utilización de este indicador S/N es: en cuanto mayor es la razón S/N mejor es el desempeño. Existe una función S/N para cada criterio que se quiera desarrollar, esto es, una para maximizar, para minimizar, para un valor nominal, para un valor objetivo y para una fracción de defectos. La ecuación de S/N para maximizar un criterio, se presenta en la ecuación (6-1):

+

−= 2

2

2 311

log10)(/yy

dBNSσ

(6-1)

donde y es el promedio y σ es la desviación estándar. Del plan experimental mostrado en el tabla 5.2, se realizaron tres repeticiones de cada experimento y se calculó la razón S/N para cada una de ellos, así:

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Tabla 6.1 Plan experimental desarrollado

Los formatos de cada fermentación para todo el plan experimental se encuentran en el ANEXO F. El conteo celular teórico que aparece en los formatos de las fermentaciones se obtiene desarrollando el modelo analítico presentado en las ecuaciones (4-11), (4-12) y (4-13). El código del programa se encuentra en el ANEXO B. El promedio de la señal S/N es: 1.2050E+02 Se calcula el efecto de cada factor en cada nivel, calculando el promedio de cada factor en cada nivel: Tabla 6.2 Promedio de los factores en cada nivel

Se calcula el efecto de los factores con respecto a la media: Tabla 6.3 Efecto de los factores con respecto a la media

Se obtiene el promedio de las interacciones, entre bafles y agitador (BXA), entre bafles y velocidad (BXVEL) , y entre velocidad y agitación (VELXA). Los dos niveles de cada variable se establece con los números 1 y 2. La descripción de esta metodología se encuentra en el ANEXO C. Se describe para la interacción la letra I.

EXP BAFLES AGITADOR B X A VELOCIDAD B X VEL PRESIÓN VEL X A ∆cont/ml ∆cont/ml ∆cont/ml S/N1 0 RADIAL 0-R 120 0-120 5 120-R 7,00E+05 9,00E+05 9,00E+05 1,1817E+022 0 RADIAL 0-R 160 4-160 15 160-A 1,30E+06 9,00E+05 1,30E+06 1,2086E+023 0 AXIAL 4-A 120 0-120 15 160-A 1,05E+06 1,20E+06 1,55E+06 1,2155E+024 0 AXIAL 4-A 160 4-160 5 120-R 9,00E+05 1,20E+06 1,55E+06 1,2086E+025 4 RADIAL 4-A 120 4-160 5 160-A 8,00E+05 8,00E+05 8,50E+05 1,1822E+026 4 RADIAL 4-A 160 0-120 15 120-R 1,15E+06 1,60E+06 1,30E+06 1,2212E+027 4 AXIAL 0-R 120 4-160 15 120-R 1,10E+06 1,00E+06 9,00E+05 1,1987E+028 4 AXIAL 0-R 160 0-120 5 160-A 1,30E+06 1,55E+06 1,20E+06 1,2238E+02

BAFLES AGITADOR B X A VELOCIDAD B X VEL PRESIÓN VEL X ANIVEL 1 1,20E+02 1,20E+02 1,20E+02 1,19E+02 1,21E+02 1,20E+02 1,20E+02NIVEL 2 1,21E+02 1,21E+02 1,21E+02 1,22E+02 1,20E+02 1,21E+02 1,21E+02DIFERENCIA 0,289 1,322 0,368 2,099 1,102 1,190 0,497RANGO 4 2 1 3

BAFLES AGITADOR B X A VELOCIDAD B X VEL PRESIÓN VEL X ANIVEL 1 -1,45E-01 -6,61E-01 -1,84E-01 -1,05E+00 5,51E-01 -5,95E-01 -2,48E-01NIVEL 2 1,45E-01 6,61E-01 1,84E-01 1,05E+00 -5,51E-01 5,95E-01 2,48E-01

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Tabla 6.4 Promedio de las interacciones

Se calcula el efecto de las interacciones con respecto a la media Tabla 6.5 Promedio de las interacciones con respecto a la media

Se representa gráficamente los efectos de cada factor. En la figura 6.1 se obtiene la tendencia de cambiar la velocidad del estado 1 al 2, esto es, de 120 r.p.m. a 160 r.p.m. con respecto al cambio en el crecimiento celular. Se observa que en estado 2 se aumentan los crecimientos celulares. Figura 6.1 Influencia de la velocidad en el crecimiento celular En la figura 6.2 se obtiene la tendencia de cambiar el agitador del estado 1 al 2, esto es, de tipo radial a tipo axial, con respecto al cambio en el crecimiento celular. Se observa que en estado 2 se aumentan los crecimientos celulares.

IA1 IA2 IV1 IV2IB1 1,20E+02 1,21E+02 IB1 1,20E+02 1,21E+02IB2 1,20E+02 1,21E+02 IB2 1,19E+02 1,22E+02

IA1 IA2IV1 1,18E+02 1,21E+02IV2 1,21E+02 1,22E+02

IA1 IA2 IV1 IV2IB1 -1,84E-01 1,84E-01 IB1 5,51E-01 -5,51E-01IB2 1,84E-01 -1,84E-01 IB2 -5,51E-01 5,51E-01

IA1 IA2IV1 -5,95E-01 5,95E-01IV2 5,95E-01 -5,95E-01

-1,50E+00

-1,00E+00

-5,00E-01

0,00E+00

5,00E-01

1,00E+00

1,50E+00

0 1 2 3

Velocidad

cél

ula

s/m

l

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Figura 6.2 Influencia del agitador en el crecimiento celular En la figura 6.3 se obtiene la tendencia de cambiar la presión del estado 1 al 2, esto es, de 5 psi a 15 psi, con respecto al cambio en el crecimiento celular. Se observa que en estado 2 se aumentan los crecimientos celulares. Figura 6.3 Influencia de la presión en el crecimiento celular En la figura 6.4 se obtiene la tendencia de cambiar los bafles del estado 1 al 2, esto es, de no instalarlos a instalar las cuatro unidades, con respecto al cambio en el crecimiento celular. Se observa que en estado 2 se aumentan los crecimientos celulares.

-1,50E+00

-1,00E+00

-5,00E-01

0,00E+00

5,00E-01

1,00E+00

1,50E+00

0 1 2 3

Agitador

cél

ula

s/m

l

-1,50E+00

-1,00E+00

-5,00E-01

0,00E+00

5,00E-01

1,00E+00

1,50E+00

0 1 2 3

Presión

célu

las

/ml

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Figura 6.4 Influencia de Bafles en el crecimiento celular A continuación se grafican los efectos de las interacciones supuestas entre Bafles y agitador, Bafles y velocidad, y velocidad y agitador. Los interacciones que maximicen los crecimientos celulares también deben ser estudiadas en la búsqueda del punto de operación que maximice los crecimientos celulares. La figura 6.5 muestra la interacción entre bafles y agitador. Se puede determinar que se maximizan los crecimientos celulares en el reactor sin bafles y el agitador tipo axial, y con bafles y el agitador tipo radial. Figura 6.5 Interacción bafles - agitador La figura 6.6 muestra la interacción entre bafles y velocidad. Se puede determinar que se maximizan los crecimientos celulares en el reactor sin bafles y la velocidad en 120 r.p.m., y con bafles y la velocidad en 160 r.p.m.

-1,50E+00

-1,00E+00

-5,00E-01

0,00E+00

5,00E-01

1,00E+00

1,50E+00

0 1 2 3

Bafles

cél

ula

s/m

l

-8,00E-01

-6,00E-01

-4,00E-01

-2,00E-01

0,00E+00

2,00E-01

4,00E-01

6,00E-01

8,00E-01

0 1 2 3

Bafles

cél

ula

s/m

l

A1

A2

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Figura 6.6 Interacción bafles - velocidad La figura 6.7 muestra la interacción entre la velocidad y el agitador. Se puede determinar que se maximizan los crecimientos celulares en el reactor con la velocidad en 120 r.p.m. y el agitador axial, y con la velocidad en 160 r.p.m. y el agitador radial. Figura 6.7 Interacción velocidad - agitador De las figuras 6.1, 6.2, 6.3 y 6.4 se obtiene que los efectos más significativos corresponden a los que tienen mayor pendiente, en su orden son: velocidad, agitador, presión y bafles. Para este modelo los bafles no son significativos, ya que la pendiente es casi horizontal. Presión tiene un grado de significancia media. Velocidad y agitador tienen un grado de significancia alta.

-8,00E-01

-6,00E-01

-4,00E-01

-2,00E-01

0,00E+00

2,00E-01

4,00E-01

6,00E-01

8,00E-01

0 1 2 3

Bafles

cél

ula

s/m

l

V1

V2

-8,00E-01

-6,00E-01

-4,00E-01

-2,00E-01

0,00E+00

2,00E-01

4,00E-01

6,00E-01

8,00E-01

0 1 2 3

Velocidad

cél

ula

s/m

l

A1

A2

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Las interacciones más significativas son: velocidad-agitador y bafles-velocidad, mientras que la interacción bafles-agitador es menos significativa. Para maximizar los cambios en los crecimientos celulares (celulas/ml) se debe escoger la velocidad en el nivel 2 (V2), agitador en el nivel 2 (A2), presión en el nivel 2 (P2) y bafles en el nivel 2 (B2). Los bafles por tener una pendiente tan pequeña es un factor que no es significativo. También se deben analizar las interacciones que maximizan los resultados, estas son: de la interacción bafles-velocidad V1B1 y V2B2, de la interacción velocidad-agitador V1A2 y V2A1 y de la interacción bafles-agitador B1A2 y B2A1. Se analizan todas las combinaciones que puedan maximizar los crecimientos celulares. A cada una de ellas se le halla el factor S/N, y se selecciona como la mejor quien tenga el valor mayor de este factor de rendimiento. La respuesta se obtiene sumándole al promedio total la media de los efectos de cada factor en el nivel escogido. Los resultados se presentan en la tabla 6.6 Tabla 6.6 Evaluación de combinaciones para la optimización

De la tabla 6.6 se obtiene que la combinación que maximiza los crecimientos celulares es la primera B2,A2,V2,P2. Para esta combinación se tiene el siguiente punto de operación que optimiza el sistema entre los rangos de trabajo seleccionados: Velocidad : 160 r.p.m. Agitador : Axial Presión : 15 psi Bafles : SI, aunque no es significativo. En esta combinación la señal S/N es 122.95 dB, mientras que para la combinación que siempre se ha utilizado hasta el momento B1,A1,V1,P1, la señal S/N es 118 dB. Un aumento en el valor de la señal S/N significa mejores condiciones de operación para maximizar los crecimientos celulares en el reactor. Los resultados experimentales de esta sección concuerdan con los resultados que se obtuvieron en la sección 4.5 de las simulaciones analíticas. 6.2 MÉTODO ESTADÍSTICO Se realiza un análisis de varianza ANOVA, para el conteo celular en función de los bafles, la agitación, la velocidad, la presión, las interacciones bafles- velocidad y bafles - agitador. En la figura 6.8 se muestran los resultados del análisis de varianza.

Combinación Promedio (dB) Bafles (dB) Agitador (dB) Velocidad (dB) Presión (dB) Resultado (dB)B2,A2,V2,P2 120,5042025 0,14470082 0,660935017 1,049573567 0,594789741 122,954B1,A2,V2,P2 120,5042025 -0,14470082 0,660935017 1,049573567 0,594789741 122,665B1,A2,V1,P2 120,5042025 -0,14470082 0,660935017 -1,049573567 0,594789741 120,566B1,A2,V1,P2 120,5042025 -0,14470082 0,660935017 -1,049573567 0,594789741 120,566B1,A1,V2,P2 120,5042025 -0,14470082 -0,660935017 1,049573567 0,594789741 121,343B2,A1,V2,P2 120,5042025 0,14470082 -0,660935017 1,049573567 0,594789741 121,632

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Figura 6.8 ANOVA, Análisis de varianza. Aplicando la distribución F para analizar las variables que influyen en el sistema, se tiene que para un intervalo de confianza del 90%, un total de 23 grados de libertad para el denominador y 1 grado de libertad para el numerador, F.10 1,23= 2.94, las variables significativas en el sistema se muestran a continuación: Tabla 6.7 Distribución F

Variables Valor F Descripción Bafles 0.01 No es significativo Agitador 4.15 Es significativo Velocidad 12.7 Es la variable más significativa Presión 3 Es medianamente significativo Interacción Bafles-velocidad

3.36 Es medianamente significativa

Interacción Bafles-agitador

0.84 No es significativo

En la figura 6.9. se encuentra una regresión lineal del modelo, que tiene en cuenta todo el plan experimental:

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Figura 6.9 Regresión lineal del modelo experimental Con lo que se tiene la siguiente ecuación de regresión lineal para el modelo:

BABVpresiónvelocidadagitadorbafleslarconteocelu

*150000*7500*14167*3958*391667*816667937500

−++−+−=

(6-2)

con un coeficiente de determinación del 58,6%. Se utiliza el programa mathcad para encontrar el mejor punto de operación de la ecuación (6-2). El algoritmo se presenta en el ANEXO H.

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El punto que maximiza los crecimientos celulares en los rangos de operación establecidos según esta metodología es: Agitador : nivel 2, con agitador axial; Presión : nivel 2, a 15 psi; Velocidad : nivel 2, a 160 rpm. Bafles : nivel 2, con bafles instalados; aunque no es un factor significativo según

ANOVA. Al comparar los resultados del punto de operación que maximiza los crecimientos celulares por esta metodología con respecto a la metodología de Taguchi, se concluye que los dos análisis concuerdan en seleccionar el mismo punto de operación en el reactor. Este análisis se realiza entre los rangos de operación establecidos en la fabrica, ya que por restricciones mecánicas del sistema, el valor de la velocidad y presión no se puede aumentar. 6.3 VERIFICACION EXPERIMENTAL DEL MEJOR PUNTO DE OPERACION DEL REACTOR El análisis de resultado entre la metología de Taguchi del capitulo 6.1 y el análisis estadístico del capitulo 6.2 coinciden en que el mejor punto de operación para trabajar el reactor es: Velocidad : 160 r.p.m. Presión : 15 psi Agitador : Axial Bafles : si, aunque no es un factor significativo. El modelo teórico predice que el aumento en la velocidad y la presión producen crecimientos celulares más altos. Las restricciones para aumentar el valor de estas variables en proceso se deben especialmente a los equipos utilizados en este trabajo, por ejemplo, al tipo de transmisión de potencia magnético que no permite elevar el valor de la agitación y a la sensibilidad que tienen las células a la generación de esfuerzos cortantes. Se realiza una verificación experimental del mejor punto de operación del reactor dentro de los rangos establecidos, y se compara frente al que se venía utilizando hasta el momento. Se obtiene la figura 6.10.

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Figura 6.10 Comparación entre el mejor punto de operación y el histórico Las condiciones de operación de los bioreactores históricamente son: velocidad 120 r.p.m., presión 5 psi, agitador tipo radial y sin bafles. Esto corresponde a la combinación 1 del plan experimental. De la figura 6.10 se concluye que se pueden llegar a obtener aumentos en los crecimientos celulares hasta de 480.000 células/ml, con una combinación de velocidad en 160 r.p.m., presión 15 psi, agitador tipo axial y bafles. Este aumento corresponde a mejoras del 25% en recuentos celulares. En la figura 6.11 se muestra una comparación entre las velocidades máximas de crecimiento de la combinación histórica y el punto de operación propuesto.

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 1 2 3

Experimento

∆ c

élu

las/

ml

Histórico

Experimento 1: Bafles NO, Agitador radial, velocidad 120 r.p.m., presión 5 psiExperimento 2: Bafles SI, Agitador axial, velocidad 160 r.p.m., presión 15 psi

1

2

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Figura 6.11 Comparación entre las velocidades máximas de crecimiento entre el histórico y el mejor punto de operación. De la figura 6.11 se concluye que se pueden llegar a obtener aumentos en la tasa máxima de crecimiento hasta de 0.02 1/h para la combinación propuesta. Este aumento en la tasa de crecimiento refleja condiciones más favorables de transferencia de oxígeno en el reactor. Se logra aumentos en la tasa máxima de crecimiento del 25%. Con estos resultados se lograron ahorros en producción de aproximadamente $700.000 por fermentación y se logró mejorar la capacidad instalada de la compañía, esto es, con los mismos equipos se producen más células.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0 1 2 3

Experimento

µ m

ax(1

/h)

Histórico

Experimento 1: Bafles NO, Agitador radial, velocidad 120 r.p.m., presión 5 psiExperimento 2: Bafles SI, Agitador axial, velocidad 160 r.p.m., presión 15 psi

1

2

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Capítulo 7 Conclusiones y recomendaciones Para estudiar la optimización de la operación de los reactores utilizados en los crecimientos de células animales BHK21 C13 en VECOL S.A. se caracterizó el coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico kLa para un reactor de 2500L, en función de los parámetros de operación: velocidad de agitación, presión, tipo de agitador y bafles. En la caracterización del kLa se utilizó el método indirecto y se desarrolló un modelo analítico que predice los crecimientos celulares bajo los parámetros establecidos. Para corroborar los resultados del modelo, se seleccionó un plan experimental con un total de 24 experimentos. El análisis del plan experimental coincide con las predicciones del modelo analítico y como producto de esas actividades se puede concluir: • Se encontró que las concentraciones celulares se maximizan al aumentar la velocidad, la presión, utilizar agitador axial y bafles(opcional). • La combinación recomendada de trabajo para los reactores en los cuales se realizan los crecimientos celulares de células BHK 21 C13 en la línea de producción de la vacuna antiAftosa en la planta de VECOL S.A. es: con bafles, agitación axial, presión 15 psi y velocidad 160 r.p.m. • Se lograron aumentos en los crecimientos celulares de hasta el 25%, que producen ahorros en producción de aproximadamente $700.000 por fermentación. • Se lograron aumentos en la tasa máxima de crecimiento del 25%, mejorando notablemente las condiciones de transferencia de oxígeno en estos reactores. • Se logró mejorar la capacidad instalada de la compañía, esto es, con los mismos equipos se producen más células. • El modelo teórico reproduce bien las variables de crecimiento celular, consumo de glucosa y oxígeno, el cual debe ser calibrado cada vez que se cambia alguna variable de proceso. Este modelo es una buena herramienta para realizar simulaciones y poder predecir los crecimientos celulares bajo diferentes condiciones de operación. • Aunque con el agitador radial teóricamente se obtienen mayores valores de kLa según la sección 4.4, en la realidad los crecimientos celulares se maximizan con el agitador axial según el capitulo 6. Esto se debe a que la medición del coeficiente de oxígeno volumétrico kLa se realiza en un solo punto en el reactor y no se tiene en cuenta el resto del sistema. Se tiene que estos bioreactores son sistemas heterogéneos y no pueden ser modelados como sistemas ideales de mezcla homogénea, en donde todo el medio tiene la misma distribución de oxígeno y por lo tanto el crecimiento celular es uniforme. • Se desarrolló un sistema de monitoreo en tiempo real para las variables de temperatura, agitación, pH y oxígeno disuelto. Esta herramienta permite monitorear y guardar los datos del proceso en todo momento durante la fermentación. Esto contribuye a mejorar la supervisión y control de los parámetros de operación del reactor.

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• Para la presión y la velocidad, los valores de operación seleccionados son los que maximizan los crecimientos dentro de los rangos de trabajo del reactor. Según el modelo teórico, si se sigue aumentando la velocidad y la presión, los crecimientos aumentan. En este sentido, teóricamente si no tuviera las restricciones mecánicas del equipo se lograrían otros puntos de operación que mejorarían los recuentos celulares. Estos puntos deben ser validados experimentalmente debido a que a velocidades mayores, se generan esfuerzos cortantes que pueden dañar la morfología de las células. • El sistema de transmisión de potencia actual en el reactor es magnético. Este sistema limita el aumento de la velocidad de agitación. De acuerdo con el modelo teórico, deja un campo sin explorar propicio para seguir aumentando los recuentos celulares, en donde el aumento de la velocidad favorece los crecimientos de las células. RECOMENDACIONES • Para aumentar la exactitud en la caracterización del coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico kLa, se debe instalar otro medidor de oxígeno en el reactor. • Seguir desarrollando el sistema de monitoreo de los reactores. Se deben incluir los parámetros que no se están monitoreando aún, como son: la presión y el flujo de aire. • Mejorar y estandarizar la metodología de medición de glucosa en las fermentaciones. • Estudiar, desarrollar y validar la metodología para controlar automáticamente los parámetros de operación del reactor. • Estudiar la distribución de oxígeno durante la fermentación. Para estandarizar los crecimientos celulares y minimizar las desviaciones, se debe controlar este parámetro para mantener el nivel de pH entre los rangos establecidos de 7.0 a 7.2 • Evaluar el montaje de un sistema de transmisión de potencia de sello mecánico sanitario. Este sistema reemplazaría al actual (magnético), ofreciendo mayor versatilidad en los aumentos de la velocidad de agitación, la cual es propicio para incrementar los crecimientos celulares.

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BIBLIOGRAFÍA [1] Aguilar, C & Santamaría, O. Estudio de transferencia de oxígeno en el cultivo de

Bacillus Thuringiensis. Universidad de América. Bogotá.2000 [2] Bailey, J & Ollis, D. Biochemical engineering fundamentals. Second edition.

McGraw-Hill.1984 [3] Chistel, F & Cornelia, K. Agitation, aeration and perfusion modules for cell culture

bioreactors. B. Braun Biotech International.1993 [4] Crueger, W & Crueger, A. Biotecnología: Manual de Microbiología industrial.

España. 1993 [5] Hensirisak, P. Scale-up the use of a microbubble dispersion to increase oxygen

transfer in aerobic fermentation of Baker´s yeast. M.S. thesis. Virginia Polytechinc Institute and State University. 1997

[6] Instituto colombiano de Normas técnicas y certificación. Tesis y otros trabajos de grado. Bogotá: Icontec,2002.

[7] Jimenez C.& Rojas C. Escalamiento para la producción de un biopesticida a partir de Bacillus Thuringiensis subesp Kurstaki en fermentaciones de 14 y 250 L con base en la transferencia de oxígeno. Uiversidad de los Andes. Bogotá. 2003

[8] Linz, M; Zeng, An-ping; Wagner, Roland; Deckwer, Wolf- Dieter. Stoichiometry, kinetics, and regulation of glucosa and amino acid metabolism of a recombinant BHK cell line in batch and continuous cultures. Biotechnology 1997,13,453-463.

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[11] Shuler, M & Kargi, F. Bioprocess Engineering. Prentice Hall. New Jersey.1992

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Anexo A Caracterización de la transferencia de oxígeno kLa

La caracterización de la transferencia de oxígeno en el bioreactor se realiza tomando datos para las ocho combinaciones del plan experimental explicado en el capítulo 5, para cada una de ellas se monitorea el cambio en el oxígeno disuelto hasta llegar a la saturación. En este caso el proceso de transferencia de oxígeno al líquido esta determinada por:

( )oo CCkLa

dt

Cd−= *

0

)(2 (A-1)

La pendiente de la gráfica de Ln (C*

o-Co) vs Tiempo, es el valor estimado de kLa. El siguiente tabla muestra el valor obtenido de kLa para cada uno de los experimentos: Tabla A.1 kLa para el plan experimental

Varios autores han establecido correlaciones experimentales para el valor de kLa como función de las variables de operación del equipo del tipo (Aiba, et al, 1973 p.182-183):

κγβα )/( VolPVNak gsL = (A-2)

donde, N es la velocidad de agitación, Vs es la velocidad de aireación por sección transversal del fermentador, Pg es la potencia de agitación, Vol es el volumen del fermentador y α,β,γ,κ son constantes estimadas de los modelos. Se toma la siguiente convención en el sistema para desarrollar la correlación: 1 al sistema con bafles 2 al sistema sin bafles 1 al agitador radial 2 al agitador axial.

EXPERIMENTO BAFLES IMPELLER VELOCIDAD PRESIÓN kLa1 NO RADIAL 120 5 6,122 NO RADIAL 160 15 11,883 NO AXIAL 120 15 1,84 NO AXIAL 160 5 1,445 SI RADIAL 120 5 6,126 SI RADIAL 160 15 97 SI AXIAL 120 15 1,88 SI AXIAL 160 5 1,44

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De acuerdo con los datos obtenidos en la tabla A.1, se obtiene la siguiente ecuación que correlaciona la velocidad de agitación, la presión, el agitador y los bafles, con el coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico kLa, utilizando el software xlstat.

( ) ( ) ( )( )3501.05688.03273.22862.0)(*2041.0 pnimpbafleskLa −−= (A-3) donde Bafles, toman un valor de 1 si no se instalan, ó 2 si se instalan las cuatro unidades; imp, es el tipo de agitador, toma un valor de 1 si es de flujo radial, ó 2 si es de flujo axial; n, es la velocidad de agitación, varía entre el rango de 120 r.p.m. a 160 r.p.m.; p, es la presión del tanque, varía entre un rango de 5 psi a 15 psi. Con un coeficiente de determinación R2=0.989. Los siguientes son los datos obtenidos del porcentaje de oxígeno disuelto en el tiempo para cada uno de los experimentos de la tabla A.1: Experimento 1 Tabla A.2 Datos DO Experimento 1

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)20 3,3 4,40 460 44,2 3,7140 5,7 4,37 480 45,6 3,6760 8 4,34 500 47 3,6380 10,6 4,31 520 48 3,61100 13,2 4,27 540 49,4 3,57120 15,3 4,24 560 50,4 3,54140 17,6 4,21 580 51,7 3,50160 19,6 4,18 600 52,9 3,47180 21,8 4,14 620 54 3,43200 23,6 4,12 640 55,2 3,39220 25,5 4,08 660 56,1 3,36240 27 4,06 680 56,9 3,33260 28,9 4,03 700 57,8 3,30280 30,6 3,99 720 58,9 3,26300 32,2 3,96 740 60,1 3,21320 33,8 3,93 760 61 3,17340 35,5 3,90 780 61,8 3,14360 36,8 3,87 800 62,7 3,10380 38,4 3,84 820 63,5 3,06400 39,7 3,81 840 64,6 3,01420 41,3 3,78 860 65,5 2,97440 42,7 3,74 880 66,3 2,92

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Figura A.1 kLa experimento 1

y = -0,0017x + 4,4604R2 = 0,9979

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Tiempo (s)

Ln

(C

*-C

)

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)900 66,8 2,90 1220 77,4 2,01920 67,6 2,85 1240 77,9 1,95940 68,4 2,80 1260 78,3 1,89960 69,2 2,75 1280 78,8 1,81980 69,8 2,71 1300 79,3 1,72

1000 70,6 2,66 1320 79,9 1,611020 71,4 2,60 1340 80,5 1,481040 71,9 2,56 1360 80,8 1,411060 72,8 2,49 1380 81,2 1,311080 73,3 2,45 1400 81,8 1,131100 73,8 2,41 1420 82,1 1,031120 74,6 2,33 1440 82,6 0,831140 75,2 2,27 1460 82,9 0,691160 75,7 2,22 1480 83,3 0,471180 76,2 2,16 1500 83,7 0,181200 76,8 2,09

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Experimento 2 Tabla A.3 Datos DO Experimento 2

Figura A.2 kLa Experimento 2

y = -0,0033x + 4,7555R2 = 0,9813

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Tiempo (s)

Ln

(C

*-C

)Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)

20 2,7 4,58 340 61,6 3,6540 4,9 4,55 360 64,7 3,5660 9,1 4,51 380 67,9 3,4780 13,2 4,46 400 70,9 3,37100 17,2 4,42 420 73,9 3,26120 21,4 4,36 440 76,5 3,16140 25,6 4,31 460 79,7 3,01160 29,5 4,26 480 82,5 2,86180 33,3 4,20 500 85 2,71200 37,1 4,14 520 87,6 2,52220 40,8 4,08 540 89,7 2,33240 44,5 4,02 560 92 2,08260 48 3,95 580 94,4 1,72280 51,5 3,88 600 96,7 1,19300 54,9 3,81 620 98,7 0,26320 58,3 3,73

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Experimento 3 Tabla A.4 Datos DO Experimento 3

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)10 7,2 4,53 1030 45 4,01 2030 65,9 3,53 3030 84,3 2,7530 7,1 4,53 1050 45,3 4,00 2050 66,2 3,52 3050 84,6 2,7350 8,4 4,52 1070 45,7 3,99 2070 66,5 3,51 3070 85 2,7170 9,9 4,50 1090 45,9 3,99 2090 67 3,50 3090 85,3 2,6990 11 4,49 1110 46,2 3,99 2110 67,3 3,49 3110 85,6 2,67110 12,6 4,47 1130 46,8 3,97 2130 67,9 3,47 3130 86 2,64130 13,8 4,46 1150 47,1 3,97 2150 68,3 3,46 3150 86,3 2,62150 15,4 4,44 1170 47,6 3,96 2170 68,8 3,44 3170 86,6 2,60170 16,8 4,42 1190 48,2 3,95 2190 69,1 3,43 3190 86,9 2,57190 18,4 4,40 1210 48,5 3,94 2210 69,7 3,41 3210 87,2 2,55210 19,9 4,38 1230 48,9 3,93 2230 70 3,40 3230 87,5 2,53230 21,3 4,37 1250 49,1 3,93 2250 70,5 3,38 3250 87,8 2,50250 22,6 4,35 1270 49,5 3,92 2270 70,8 3,37 3270 88,1 2,48270 23,7 4,33 1290 49,9 3,91 2290 71,2 3,36 3290 88,4 2,45290 25 4,32 1310 50,3 3,91 2310 71,5 3,35 3310 88,7 2,42310 26,1 4,30 1330 51,1 3,89 2330 72 3,33 3330 89,1 2,39330 26,7 4,29 1350 51,3 3,89 2350 72,3 3,32 3350 89,4 2,36350 27,3 4,29 1370 51,8 3,88 2370 72,6 3,31 3370 89,6 2,34370 27,8 4,28 1390 52,1 3,87 2390 72,9 3,30 3390 89,9 2,31390 28,8 4,27 1410 52,5 3,86 2410 73,4 3,28 3410 90,2 2,28410 29,2 4,26 1430 53,1 3,85 2430 73,8 3,27 3430 90,5 2,25430 30,3 4,24 1450 53,6 3,84 2450 74,2 3,25 3450 90,8 2,22450 30,7 4,24 1470 53,9 3,83 2470 74,6 3,23 3470 91,2 2,17470 31,5 4,23 1490 54,3 3,82 2490 74,9 3,22 3490 91,5 2,14490 32 4,22 1510 54,9 3,81 2510 75,2 3,21 3510 91,8 2,10510 32,5 4,21 1530 55,2 3,80 2530 75,7 3,19 3530 92,1 2,07530 33 4,20 1550 55,9 3,79 2550 76,3 3,17 3550 92,4 2,03550 33,6 4,20 1570 56,1 3,78 2570 76,5 3,16 3570 92,7 1,99570 34,2 4,19 1590 56,6 3,77 2590 76,8 3,14 3590 93 1,95590 34,4 4,18 1610 57,1 3,76 2610 77 3,14 3610 93,3 1,90610 34,9 4,18 1630 57,4 3,75 2630 77,4 3,12 3630 93,7 1,84630 35 4,17 1650 58 3,74 2650 77,7 3,10 3650 93,9 1,81650 35,6 4,17 1670 58,2 3,73 2670 77,9 3,10 3670 94,2 1,76670 36,1 4,16 1690 58,8 3,72 2690 78,3 3,08 3690 94,5 1,70690 36,1 4,16 1710 59,1 3,71 2710 78,6 3,06 3710 94,7 1,67710 36,7 4,15 1730 59,6 3,70 2730 78,9 3,05 3730 95,1 1,59730 36,9 4,14 1750 59,9 3,69 2750 79,2 3,03 3750 95,3 1,55750 37,9 4,13 1770 60,4 3,68 2770 79,6 3,02 3770 95,6 1,48770 38,1 4,13 1790 60,8 3,67 2790 79,9 3,00 3790 95,9 1,41790 38,7 4,12 1810 61,3 3,66 2810 80,2 2,99 3810 96,2 1,34810 39 4,11 1830 61,8 3,64 2830 80,6 2,97 3830 96,4 1,28830 39,6 4,10 1850 62 3,64 2850 81,1 2,94 3850 96,7 1,19850 40 4,09 1870 62,4 3,63 2870 81,4 2,92 3870 97 1,10870 41,1 4,08 1890 62,9 3,61 2890 81,9 2,90 3890 97,3 0,99890 41,6 4,07 1910 63,3 3,60 2910 82,2 2,88 3910 97,6 0,88910 41,9 4,06 1930 63,7 3,59 2930 82,4 2,87 3930 97,9 0,74930 42,5 4,05 1950 64 3,58 2950 82,7 2,85 3950 98,1 0,64950 43 4,04 1970 64,7 3,56 2970 83,3 2,82 3970 98,4 0,47970 43,7 4,03 1990 64,9 3,56 2990 83,7 2,79 3990 98,7 0,26990 43,9 4,03 2010 65,4 3,54 3010 84 2,77 4010 98,9 0,101010 44,4 4,02

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Figura A.3 kLa Experimento 3

y = -0,0005x + 4,5035R2 = 0,9908

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Tiempo (s)

Ln

(C*-

C)

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EXPERIMENTO 4

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Experimento 4 Tabla A.5 Datos DO Experimento 4

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)10 6,3 4,43 930 34,5 4,02 1850 52,4 3,63 4850 84,8 1,7230 6,8 4,42 950 34,8 4,01 1870 52,7 3,62 4910 85 1,6750 7,1 4,42 970 35,4 4,00 1890 53,2 3,61 4970 85,3 1,6370 7,7 4,41 990 35,7 4,00 1910 53,4 3,60 5030 85,5 1,5790 8,3 4,40 1010 36,3 3,99 1930 53,7 3,59 5090 85,8 1,53110 9,1 4,39 1030 36,6 3,98 1950 54,2 3,58 5150 86,1 1,46130 9,6 4,39 1050 37,2 3,97 1970 54,5 3,57 5210 86,3 1,39150 10,2 4,38 1070 37,5 3,96 1990 54,8 3,56 5270 86,6 1,34170 11 4,37 1090 37,8 3,96 2010 55,2 3,55 5330 86,9 1,25190 11,9 4,36 1110 38,3 3,95 2030 55,5 3,54 5390 87,1 1,16210 12,4 4,35 1130 38,7 3,94 2050 55,8 3,54 5450 87,4 1,10230 13,2 4,34 1150 39,2 3,93 2090 56,4 3,52 5510 87,7 0,99250 14 4,33 1170 39,5 3,92 2150 57,3 3,49 5570 87,9 0,88270 14,6 4,32 1190 39,9 3,92 2210 58,2 3,49 5630 88,3 0,79290 15,3 4,31 1210 40,2 3,91 2270 59,1 3,46 5690 88,6 0,59310 16,2 4,30 1230 40,6 3,90 2330 59,9 3,43 5750 88,9 0,41330 16,7 4,30 1250 40,9 3,90 2390 60,8 3,41 5810 89,2 0,18350 17,5 4,28 1270 41,5 3,88 2450 61,6 3,38370 18,1 4,28 1290 42 3,87 2510 62,6 3,35390 18,9 4,27 1310 42,2 3,87 2570 63,4 3,31410 19,4 4,26 1330 42,6 3,86 2630 64,1 3,28430 20 4,25 1350 42,9 3,85 2690 64,9 3,26450 20,8 4,24 1370 43,5 3,84 2750 65,6 3,23470 21,3 4,23 1390 43,8 3,84 2810 66,2 3,20490 21,8 4,22 1410 44,2 3,83 2870 67 3,17510 22,7 4,21 1430 44,5 3,82 2930 67,7 3,14530 23,2 4,20 1450 44,8 3,81 2990 68,4 3,11550 23,7 4,20 1470 45,2 3,80 3050 70,4 3,08570 24,5 4,18 1490 45,7 3,79 3110 71,1 2,98590 25 4,18 1510 46 3,79 3170 71,7 2,94610 25,5 4,17 1530 46,6 3,77 3230 72,3 2,91630 26 4,16 1550 46,8 3,77 3290 72,8 2,88650 26,6 4,15 1570 47,1 3,76 3710 76,7 2,85670 27,1 4,14 1590 47,7 3,75 4070 79,5 2,60690 27,7 4,13 1610 47,9 3,74 4130 80,2 2,36710 28,2 4,13 1630 48,2 3,74 4190 80,6 2,29730 28,8 4,12 1650 48,6 3,73 4250 81,1 2,25750 29,6 4,10 1670 49 3,72 4310 81,4 2,20770 30,1 4,09 1690 49,5 3,70 4370 81,8 2,16790 30,6 4,09 1710 49,8 3,70 4430 82,1 2,12810 31,1 4,08 1730 50,3 3,68 4490 82,5 2,08830 31,9 4,06 1750 50,6 3,68 4550 82,8 2,03850 32,5 4,05 1770 51 3,67 4610 83,5 1,99870 32,9 4,05 1790 51,3 3,66 4670 83,8 1,89890 33,4 4,04 1810 51,6 3,65 4730 84,1 1,84910 33,9 4,03 1830 52,2 3,63 4790 84,5 1,79

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Figura A.4 kLa Experimento 4

y = -0,0004x + 4,447R2 = 0,9975

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Tiempo (s)

Ln

(C

*-C

)

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50

Experimento 5 Tabla A.6 Datos DO Experimento 5

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)10 2,8 4,50 840 69,2 3,1620 4 4,49 860 70 3,1340 6,1 4,46 880 70,9 3,0960 8,6 4,43 900 71,7 3,0580 10,8 4,41 920 72,6 3,01100 12,8 4,38 940 73,1 2,98120 15,3 4,35 960 73,6 2,95140 17,4 4,32 980 74,5 2,91160 19,7 4,29 1000 75 2,88180 21,7 4,26 1020 75,6 2,84200 23,7 4,24 1040 76,4 2,80220 25,9 4,20 1060 76,9 2,77240 27,8 4,17 1080 77,5 2,73260 29,8 4,14 1100 78 2,69280 31,5 4,12 1120 78,5 2,66300 33,3 4,09 1140 79,1 2,62320 35 4,06 1160 79,4 2,60340 36,9 4,02 1180 79,9 2,56360 38,6 3,99 1200 80,6 2,50380 40,4 3,96 1220 80,8 2,48400 42,2 3,92 1240 81,4 2,43420 43,6 3,90 1260 81,7 2,41440 45,5 3,86 1280 82,5 2,33460 46,8 3,83 1300 82,9 2,29480 48,7 3,79 1320 83,3 2,25500 50,1 3,75 1340 83,6 2,22520 51,7 3,72 1360 83,9 2,19540 53,1 3,68 1420 84,9 2,07560 54,4 3,65 1480 85,8 1,95580 55,6 3,62 1540 86,6 1,82600 56,7 3,59 1600 87,3 1,70620 58,2 3,54 1660 88 1,57640 59,1 3,52 1720 88,6 1,44660 60,5 3,48 1780 89,1 1,31680 61,7 3,44 1840 89,6 1,16700 62,6 3,41 1900 90,1 0,99720 63,7 3,37 1960 90,5 0,83740 64,7 3,34 2020 90,9 0,64760 65,6 3,30 2080 91,2 0,47780 66,7 3,26 2140 91,5 0,26800 67,3 3,24 2200 91,7 0,10820 68,4 3,19

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51

Figura A.5 kLa Experimento 5 Experimento 6 Tabla A.7 Datos DO Experimento 6

y = -0,0017x + 4,5681R2 = 0,9984

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 200 400 600 800 1000 1200

Tiempo (s)

Ln

(C

*-C

)

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)10 2,5 4,58 380 55,7 3,7920 4 4,56 390 56,4 3,7830 5,5 4,55 400 57,9 3,7440 7,1 4,53 410 58,9 3,7250 8,7 4,51 420 59,9 3,6960 10,3 4,50 430 61 3,6670 11,9 4,48 440 62,5 3,6280 13,5 4,46 450 63,4 3,6090 15,1 4,44 460 64,6 3,57100 16,7 4,42 470 65,4 3,54110 18,3 4,40 480 68 3,47120 19,7 4,39 490 68,8 3,44

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52

Figura A.6 kLa Experimento 6

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)130 21,3 4,37 500 70,1 3,40140 22,8 4,35 510 70,8 3,37150 24,3 4,33 520 72,1 3,33160 25,7 4,31 530 72,9 3,30170 27,2 4,29 540 74,2 3,25180 29 4,26 550 75,1 3,21190 30 4,25 560 76 3,18200 31,4 4,23 570 77,2 3,13210 32,8 4,21 580 78,1 3,09220 34,2 4,19 590 79 3,04230 35,6 4,17 600 79,9 3,00240 36,9 4,14 610 81,4 2,92250 38 4,13 620 81,9 2,90260 39,4 4,10 630 83,4 2,81270 40 4,09 640 84,8 2,72280 42 4,06 650 86,8 2,58290 43,2 4,04 660 87,3 2,54300 44,6 4,01 670 88,8 2,42310 46 3,99 680 89,9 2,31320 47 3,97 690 91,3 2,16330 48,3 3,95 700 92,5 2,01340 49,8 3,92 710 93,7 1,84350 50,7 3,90 720 94,8 1,65360 52,3 3,86 730 95,8 1,44370 54,3 3,82 740 97,1 1,06

y = -0,0025x + 4,6947R2 = 0,9817

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 100 200 300 400 500 600

Tiempo (s)

Ln

(C*-

C)

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53

EXPERIMENTOS 7 Y 8

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54

Experimento 7 Tabla A.8 Datos DO Experimento 7

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%)10 6,1 4,54 480 16,7 4,42 950 31,5 4,23 1420 45,3 4,00 2510 70,520 6,1 4,54 490 17,2 4,42 960 31,9 4,22 1430 45,3 4,00 2540 7130 6,2 4,54 500 17,3 4,42 970 32,3 4,22 1440 45,4 4,00 2570 71,640 6,5 4,54 510 17,7 4,41 980 32,4 4,21 1450 45,6 4,00 2600 72,350 6,6 4,54 520 18,1 4,41 990 32,8 4,21 1460 46 3,99 2630 72,960 6,8 4,53 530 18,6 4,40 1000 32,9 4,21 1470 47 3,97 2660 73,670 6,9 4,53 540 18,7 4,40 1010 33,4 4,20 1480 48 3,95 2690 74,180 7 4,53 550 19 4,39 1020 33,5 4,20 1490 48,2 3,95 2720 74,690 7,3 4,53 560 19,5 4,39 1030 33,9 4,19 1500 48,2 3,95 2750 75,2100 7,4 4,53 570 19,7 4,39 1040 34 4,19 1510 48,1 3,95 2780 75,7110 7,5 4,53 580 20,1 4,38 1050 34,5 4,18 1520 48 3,95 2810 76,3120 7,7 4,53 590 20,5 4,38 1060 34,6 4,18 1530 47,9 3,95 2840 76,9130 7,9 4,52 600 20,7 4,37 1070 35 4,17 1540 47,9 3,95 2870 77,3140 8 4,52 610 21,1 4,37 1080 35,4 4,17 1550 48 3,95 2900 77,9150 8,5 4,52 620 21,5 4,36 1090 35,9 4,16 1560 48,2 3,95 2930 78,5160 8,5 4,52 630 21,6 4,36 1100 36,4 4,15 1570 48,6 3,94 2960 79,2170 8,6 4,52 640 22 4,36 1110 36,5 4,15 1580 48,8 3,94 2990 79,6180 8,8 4,51 650 22,4 4,35 1120 37 4,14 1610 49,3 3,93 3020 80,3190 9 4,51 660 22,5 4,35 1130 37,2 4,14 1640 50,3 3,91 3050 80,9200 9,4 4,51 670 22,9 4,35 1140 37,7 4,13 1670 51,3 3,89 3080 81,4210 9,5 4,51 680 23,4 4,34 1150 37,8 4,13 1700 52 3,87 3110 81,8220 9,7 4,50 690 23,5 4,34 1160 38,2 4,12 1730 52,7 3,86 3140 82,4230 10,1 4,50 700 24 4,33 1170 38,4 4,12 1760 53,5 3,84 3170 82,8240 10,2 4,50 710 24,1 4,33 1180 38,5 4,12 1790 54,3 3,82 3200 83,2250 10,4 4,50 720 24,5 4,32 1190 39 4,11 1820 55 3,81 3230 83,7260 10,6 4,49 730 24,9 4,32 1200 39,2 4,11 1850 55,6 3,79 3260 84,2270 10,9 4,49 740 25,1 4,32 1210 39,5 4,10 1880 56,4 3,78 3290 84,7280 11 4,49 750 25,5 4,31 1220 39,7 4,10 1910 57 3,76 3320 85,4290 11,2 4,49 760 25,6 4,31 1230 39,8 4,10 1940 57,7 3,74300 11,4 4,48 770 26,1 4,30 1240 40 4,09 1970 58,4 3,73310 11,8 4,48 780 26,2 4,30 1250 40,2 4,09 2000 59,4 3,70320 11,9 4,48 790 26,6 4,30 1260 40,4 4,09 2030 60,1 3,69330 12,3 4,47 800 27,1 4,29 1270 40,8 4,08 2060 60,7 3,67340 12,7 4,47 810 27,2 4,29 1280 40,9 4,08 2090 61,5 3,65350 12,9 4,47 820 27,6 4,28 1290 41,4 4,07 2120 62,2 3,63360 13,3 4,46 830 27,7 4,28 1300 41,9 4,06 2150 62,9 3,61370 13,5 4,46 840 28,2 4,27 1310 42 4,06 2180 63,4 3,60380 13,8 4,46 850 28,6 4,27 1320 42,2 4,06 2210 64,1 3,58390 14,3 4,45 860 29 4,26 1330 42,6 4,05 2240 64,7 3,56400 14,3 4,45 870 29,1 4,26 1340 42,7 4,05 2270 65,6 3,54410 14,8 4,45 880 29,2 4,26 1350 43,1 4,04 2300 66,3 3,52420 14,9 4,44 890 29,7 4,25 1360 43,3 4,04 2330 66,8 3,50430 15,3 4,44 900 30,1 4,25 1370 43,5 4,03 2360 67,5 3,48440 15,7 4,43 910 30,2 4,25 1380 43,8 4,03 2390 68,2 3,46450 15,8 4,43 920 30,6 4,24 1390 44 4,03 2420 68,7 3,44460 16,2 4,43 930 30,9 4,24 1400 44,4 4,02 2450 69,4 3,42470 16,3 4,43 940 31,4 4,23 1410 44,6 4,01 2480 69,8 3,41

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Figura A.7 kLa Experimento 7

y = -0,0005x + 4,6491R2 = 0,9847

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Tiempo (s)

Ln

(C

*-C

)

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Experimento 8 Tabla A.9 Datos DO Experimento 8

Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co) Tiempo(s) Co (%) Ln (Co*-Co)1850 49,9 3,74 2310 57,7 3,54 2770 65,1 3,29 3770 75,7 2,791860 50 3,74 2320 57,9 3,53 2780 65,2 3,29 3800 75,9 2,781870 50,2 3,73 2330 58 3,53 2790 65,4 3,28 3830 76,2 2,761880 50,7 3,72 2340 58,2 3,52 2800 65,5 3,28 3860 76,4 2,751890 50,8 3,72 2350 58,4 3,51 2810 65,7 3,27 3890 76,6 2,731900 50,9 3,72 2360 58,5 3,51 2820 65,8 3,27 3920 76,8 2,721910 51 3,71 2370 58,4 3,51 2830 65,9 3,26 3980 77,2 2,691920 51,2 3,71 2380 58,8 3,50 2840 66,1 3,25 4040 77,5 2,671930 51,3 3,71 2390 59 3,50 2850 66,3 3,25 4100 77,9 2,651940 51,5 3,70 2400 59,2 3,49 2860 66,4 3,24 4160 78,3 2,621950 51,7 3,70 2410 59,4 3,48 2870 66,5 3,24 4220 78,7 2,591960 52,1 3,69 2420 59,5 3,48 2880 66,6 3,23 4280 79 2,561970 52,2 3,68 2430 59,7 3,48 2890 66,8 3,23 4340 79,4 2,531980 52,3 3,68 2440 59,9 3,47 2900 66,9 3,22 4400 79,7 2,511990 52,4 3,68 2450 60,1 3,46 2920 67,2 3,21 4460 80,1 2,482000 52,6 3,67 2460 60,2 3,46 2940 67,5 3,20 4520 80,5 2,442010 52,7 3,67 2470 60,4 3,45 2960 67,8 3,19 4580 80,7 2,422020 52,9 3,67 2480 60,5 3,45 2980 68,1 3,17 4640 81 2,402030 53 3,66 2490 60,7 3,44 3000 68,3 3,17 4700 81,3 2,372040 53,2 3,66 2500 60,8 3,44 3020 68,6 3,15 4760 81,7 2,332050 53,3 3,66 2510 61 3,43 3040 68,9 3,14 4820 81,9 2,312060 53,5 3,65 2520 61,2 3,43 3060 69,1 3,13 4880 82,2 2,282070 53,6 3,65 2530 61,3 3,42 3080 69,4 3,12 4940 82,5 2,252080 53,8 3,64 2540 61,5 3,42 3100 69,6 3,11 5000 82,8 2,222090 53,9 3,64 2550 61,7 3,41 3120 69,9 3,10 5060 83,1 2,192100 54 3,64 2560 61,8 3,41 3140 70,1 3,09 5120 83,4 2,152110 54,3 3,63 2570 62 3,40 3170 70,4 3,07 5180 83,7 2,122120 54,4 3,63 2580 62,2 3,39 3200 70,8 3,05 5240 84 2,082130 54,6 3,62 2590 62,3 3,39 3230 71,1 3,04 5300 84,2 2,052140 54,7 3,62 2600 62,5 3,38 3260 71,4 3,03 5360 84,4 2,032150 54,9 3,61 2610 62,6 3,38 3290 71,7 3,01 5420 84,7 1,992160 55 3,61 2620 62,8 3,37 3320 72 3,00 5480 85 1,952170 55,2 3,61 2630 62,9 3,37 3350 72,3 2,98 5540 85,5 1,872180 55,4 3,60 2640 63,1 3,36 3380 72,6 2,97 5600 85,8 1,822190 55,6 3,59 2650 63,3 3,36 3410 72,7 2,96 5660 85,9 1,812200 55,7 3,59 2660 63,4 3,35 3440 73,1 2,94 5720 86,2 1,762210 55,9 3,59 2670 63,6 3,35 3470 73,4 2,92 5780 86,5 1,702220 56,1 3,58 2680 63,7 3,34 3500 73,6 2,91 5840 86,7 1,672230 56,3 3,58 2690 63,9 3,34 3530 73,9 2,90 5900 86,9 1,632240 56,5 3,57 2700 64 3,33 3560 74,1 2,88 5960 87,1 1,592250 56,7 3,56 2710 64,2 3,33 3590 74,3 2,87 6020 87,4 1,532260 56,8 3,56 2720 64,4 3,32 3620 74,6 2,86 6080 87,7 1,462270 57 3,56 2730 64,5 3,31 3650 74,8 2,84 6140 87,8 1,442280 57,2 3,55 2740 64,6 3,31 3680 75 2,83 6200 88 1,392290 57,4 3,54 2750 64,8 3,30 3710 75,3 2,82 6260 88,2 1,342300 57,5 3,54 2760 65 3,30 3740 75,5 2,80 6320 88,3 1,31

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Figura A.8 kLa Experimento 8

y = -0,0004x + 4,4977R2 = 0,9916

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Tiempo (s)

Ln

(C

*-C

)

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Anexo B Códigos de programación

Los códigos de programación se encuentran en el CD anexo. Los nombres para cada uno de los archivos utilizados en cada capítulo son: Capitulo 4.4. Análisis teórico de la variación de kLa. Nombre del archivo: Análisis de kLa.nb Capitulo 4.5 Simulaciones analíticas. Nombre del archivo: Modelosimplificado.nb Capitulo 6.1 Modelamiento de Taguchi. Nombre del archivo: Modelo.nb

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Anexo C Metodología de taguchi

La metodología de Taguchi se basa en utilizar tablas estándar de planes de experimentación para reducir el número de experimentos de un plan factorial asegurando ortogonalidad en las matrices. Los siguientes son los pasos que se deben seguir en esta metodología: 1. Se establecen los factores y niveles a estudiar Tabla C.1 Factores y niveles del plan experimental

2. Se determinan las interacciones supuestas: • Entre los bafles y el agitador (BA) • Entre los bafles y la velocidad (BV) • Entre la velocidad y el agitador (VA) 3. Se establece el modelo a seguir:

VABVBAPVABMR +++++++= (C-1) Donde R es el resultado M es el promedio total B Incidencia de los Bafles A Incidencia del tipo de agitador V Incidencia dela velocidad P Incidencia de la presión BA Incidencia de la interacción bafles-agitador BV Incidencia de la interacción bafles- velocidad VA Incidencia de la interacción velocidad- agitador 4. Escogencia de la tabla estándar Grados de libertad (GL): El número mínimo de ensayos es igual al número de grados de libertad del modelo estudiado. GL= 8

FACTORESNIVEL 1 NIVEL 2

B BAFLES 0 4A AGITADOR RADIAL AXIALV VELOCIDAD (r.p.m.) 120 160P PRESIÓN (psi) 5 15

NIVELES

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Número mínimo de ensayos: El número mínimo de ensayos es igual al mínimo común múltiplo (MCM) del producto de los niveles de todas las acciones disjuntas. Tabla C.2 Acciones disjuntas del plan experimental

El MCM es 8. El número mínimo de ensayos para este plan experimental es ocho. Se selecciona la tabla estándar L8 27 que tiene ocho ensayos y máximo siete factores con dos niveles cada uno. La tabla se muestra a continuación: Tabla C.3 Taguchi L8 27

5. Se establece el plan experimental final Con base en la tabla L8 27, se organiza el plan de experimentación para las variables de operación bafles (B), agitador (A), velocidad (n), presión (P) y las interacciones bafles-

Acciones disjuntas ConsecuenciaB ortogonal A Plan múltiplo de 2x2= 4B ortogonal V Plan múltiplo de 2x2= 4B ortogonal P Plan múltiplo de 2x2= 4

B ortogonal VA Plan múltiplo de 2x(2x2)= 8A ortogonal V Plan múltiplo de 2x2= 4A ortogonal P Plan múltiplo de 2x2= 4

A ortogonal BV Plan múltiplo de 2x(2x2)= 8V ortogonal P Plan múltiplo de 2x2= 4

V ortogonal BA Plan múltiplo de 2x(2x2)= 8P ortogonal BA Plan múltiplo de 2x(2x2)= 8P ortogonal BV Plan múltiplo de 2x(2x2)= 8P ortogonal VA Plan múltiplo de 2x(2x2)= 8

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agitador (BXA), bafles- velocidad (BXV) y velocidad- agitador (VXA) de la siguiente manera: Tabla C.4 Plan experimental

EXPERIMENTO BAFLES AGITADOR B X A VELOCIDAD B X VEL PRESIÓN VEL X A1 0 RADIAL 0-R 120 0-120 5 120-R2 0 RADIAL 0-R 160 4-160 15 160-A3 0 AXIAL 4-A 120 0-120 15 160-A4 0 AXIAL 4-A 160 4-160 5 120-R5 4 RADIAL 4-A 120 4-160 5 160-A6 4 RADIAL 4-A 160 0-120 15 120-R7 4 AXIAL 0-R 120 4-160 15 120-R8 4 AXIAL 0-R 160 0-120 5 160-A

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Anexo D Sistema de monitoreo El sistema de monitoreo se desarrolló en el software Lookout de National Instruments. El desarrollo de las pantallas se diseñaron exclusivamente para esta aplicación en las cuales se puede monitorear y guardar en tiempo real el valor de las variables de operación del reactor. Para esto se adquirió un modulo de Field Points de ocho entrada análogas, un módulo de comunicación que lleva estas señales hasta el computador y un run time para el software. Se están monitoreando los sensores con salida 4-20 mA, estos son: temperatura, pH, oxígeno disuelto y agitación. El sistema queda abierto para incluir cuatro entradas más cuando sea requerido. La configuración de las pantallas desarrolladas se muestra a continuación. Figura D.1 Pantalla principal sistema de monitoreo Esta pantalla presenta un esquema general del equipo, los sensores utilizados, el sistema de recepción de señales análogas y el sistema de comunicación. Presenta tres botones que administran la selección de los datos guardados y las pantallas medidores y tendencias.

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Figura D.2 Pantalla medidores sistema de monitoreo En esta pantalla se presenta el valor de las variables que se están midiendo en tiempo real. Figura D.3 Pantalla tendencias sistema de monitoreo En esta pantalla se obtienen las curvas de los históricos de cada una las variables que se esta midiendo en tiempo real. Almacena datos de días anteriores para consultas.

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Anexo E Calibración de instrumentación

1. Calibración del manómetro El manómetro en prueba es marca Ashcroft de rango 0-60 psi, con división de escala 1 psi. Para la calibración se utiliza un manómetro patrón marca Wika clase 0.25, rango 0-100 psi, con división de escala 0.5 psi. La siguiente tabla muestra los datos tomados en el laboratorio para la calibración: Tabla E.1 Datos de calibración manómetro

Error máximo: 0.888 psi, error mínimo: -0.69 psi , histéresis máxima : 0.4 psi %Error: 1.48, clase: 1.6, tolerancia: 0.96 psi. La siguiente es la curva de calibración del manómetro:

Figura E.1 Curva de calibración manómetro

Patron subida(psi)

Patrón bajada (psi)

Manom prueba subida (psi)

Manom prueba bajada (psi) prom (psi) error subida (psi) error bajada (psi) histéresis (psi)

0 -0,03 0 0 0 0 0,03 05,934 5,912 6,6 6,8 6,7 0,666 0,888 0,211,878 11,861 12,6 12,6 12,6 0,722 0,739 017,842 17,819 18 18,2 18,1 0,158 0,381 0,223,826 23,809 23,8 24,2 24 -0,026 0,391 0,429,82 29,815 29,8 30 29,9 -0,02 0,185 0,235,823 35,813 35,6 35,8 35,7 -0,223 -0,013 0,241,831 41,818 41,4 41,8 41,6 -0,431 -0,018 0,447,849 47,833 47,4 47,8 47,6 -0,449 -0,033 0,453,869 53,848 53,2 53,6 53,4 -0,669 -0,248 0,459,89 59,865 59,2 59,2 59,2 -0,69 -0,665 0

y = 1,0193x - 0,5989R2 = 0,9998

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60 70

Presión Manómetro prueba (psi)

Pre

sió

n M

ano

met

ro P

atró

n (

psi

)

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2. Calibración del termómetro El sensor utilizado es un termógrafo digital Honeywell de rango 0-150 °C con resolución 0.1 °C y sensor RDT PT100. El termómetro patrón utilizado es una RDT PT100 con display digital Hart y resolución 0.001°C. La siguiente tabla muestra los datos tomados en el laboratorio para la calibración: Tabla E.2 Datos de calibración termómetro

La siguiente es la curva de calibración del termómetro:

Figura E.2 Curva de calibración termómetro

Patrón (°C) T. Prueba (°C) error (°C)3,987 4 0,0133,986 4 0,0143,982 4 0,0183,985 4 0,015

36,997 36,9 -0,09736,993 36,9 -0,09336,992 36,9 -0,09236,991 36,9 -0,091

121 120,4 -0,6120,99 120,4 -0,59120,989 120,4 -0,589120,991 120,4 -0,591

y = 1,0054x - 0,065R2 = 1

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 40 60 80 100 120 140

Temperatura Termómetro prueba(°C)

Tem

per

atu

ra T

erm

óm

etro

Pat

rón

(°C

)

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3. Calibración del medidor de velocidad El equipo utilizado es un variador de velocidad con display Siemens de rango 0-180 r.p.m., resolución 1 r.p.m. El equipo patrón utilizado es un tacómetro digital con resolución 0.1 r.p.m. y exactitud de ± 0.05%. La siguiente tabla muestra los datos tomados en el laboratorio para la calibración: Tabla E.3 Datos de calibración variador de velocidad

VARIADOR (r.p.m.)

PATRON (r.p.m.)

VARIADOR (r.p.m.)

PATRON (r.p.m.)

100 99 135 133100 99 140 138100 99 140 138105 104 140 138105 104 145 143105 104 145 143110 108 145 143110 108 150 148110 108 150 148115 113 150 148115 113 155 153115 112 155 153120 119 155 153120 119 160 159120 119 160 157125 123 160 158125 123 165 163125 123 165 162130 128 165 162130 128 170 167130 128 170 166135 133 170 168135 133

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La siguiente es la curva de calibración del variador de velocidad:

Figura E.3 Curva de calibración variador de velocidad 4. Calibración de rotámetro El equipo utilizado es un rotámetro para aire de rango 10-100 lpm, división de escala 5 lpm, resolución 1 lpm. El método utilizado es el de la campana invertida con una capacidad total de 40 L. Se tienen en cuenta las siguientes consideraciones: Temperatura: 18°C Presión en Bogotá: 75 KPa Presión de trabajo: 30 psi Volumen del patrón: 4 L El siguiente tabla muestra los datos tomados en el laboratorio para la calibración:

y = 0,9817x + 0,5417R2 = 0,9994

80

90

100

110

120

130

140

80 90 100 110 120 130 140

velocidad variador (r.p.m.)

tacó

met

ro p

atro

n (

r.p

.m.)

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Tabla E.4 Datos de calibración rotámetro

La siguiente es la curva de calibración del rotámetro:

Figura E.4 Curva de calibración rotámetro (30 psi)

Q rotametro (L/min) Q corregido (L/min) Tiempo (s) Caudal Patrón10 13,15 21,32 11,2610 13,15 22,1 10,8610 13,15 22,15 10,8410 13,15 25,84 9,2915 19,73 17,25 13,9115 19,73 15,7 15,2915 19,73 14,6 16,4415 19,73 12,68 18,9320 26,30 10,67 22,4920 26,30 10 24,0020 26,30 11,1 21,6220 26,30 11 21,8225 32,88 7,33 32,7425 32,88 6,5 36,9225 32,88 7,5 32,0025 32,88 7,7 31,1730 39,45 5,53 43,4030 39,45 5,91 40,6130 39,45 5,97 40,2030 39,45 5,95 40,34

y = 1,1896x - 6,5822R2 = 0,9679

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00

Caudal rotámetro prueba (L/min)

Cu

adal

Pat

rón

(L

/min

)

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Anexo F Registros de las fermentaciones

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EXPERIMENTO 1-1

VOLUMEN MEDIO: 500 LVOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.Presión : 5 psiTipo de impulsor: Flujo radialBafles: No

Tasa máxima de crecimiento: 0,026 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C) Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-08-31 11:00 7,12 4 -- -- 50 1,00E+06 -- 13,822002-09-03 13:00 7 37 -- -- 120 1,30E+06 1,30E+06 14,08 0,00 02002-09-03 15:00 6,87 37 30 30 120 1,40E+06 1,36E+06 14,15 0,07 22002-09-03 17:00 7,19 37 30 30 120 1,40E+06 1,43E+06 14,15 0,07 42002-09-03 19:00 7,25 37 30 -- 120 1,50E+06 1,50E+06 14,22 0,14 62002-09-03 21:00 6,93 37 30 20 120 1,60E+06 1,57E+06 14,29 0,21 82002-09-03 23:00 7 37 30 20 120 1,70E+06 1,64E+06 14,35 0,27 102002-09-04 1:00 7,02 37 30 20 120 1,80E+06 1,72E+06 14,40 0,33 122002-09-04 3:00 7,03 37 30 20 120 1,90E+06 1,79E+06 14,46 0,38 142002-09-04 5:00 7 37 30 20 120 2,00E+06 1,87E+06 14,51 0,43 162002-09-04 7:00 6,96 37 30 20 120 2,00E+06 1,93E+06 14,51 0,43 18

Aire Conteo celular/ml

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EXPERIMENTO 1-2

VOLUMEN MEDIO: 500 LVOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.Presión : 5 psiTipo de impulsor: Flujo radialBafles: No

Tasa máxima de crecimiento: 0,037 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C) Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-09-04 13:00 7,06 37 -- -- 50 9,00E+05 -- 13,712002-09-06 11:00 7,3 37 30 -- 110 1,00E+06 1,00E+06 13,82 0,00 02002-09-06 13:00 7,3 37 30 -- 110 1,00E+06 1,07E+06 13,82 0,00 22002-09-06 15:00 7,27 37 30 -- 120 1,00E+06 1,14E+06 13,82 0,00 42002-09-06 17:00 7,07 37 30 15 120 1,10E+06 1,22E+06 13,91 0,10 62002-09-06 19:00 7,15 37 30 15 120 1,20E+06 1,31E+06 14,00 0,18 82002-09-06 21:00 7,2 37 30 15 120 1,30E+06 1,40E+06 14,08 0,26 102002-09-06 23:00 7,18 37 30 15 120 1,40E+06 1,49E+06 14,15 0,34 122002-09-07 1:00 7,18 37 30 15 120 1,60E+06 1,59E+06 14,29 0,47 142002-09-07 3:00 7,15 37 30 15 120 1,70E+06 1,68E+06 14,35 0,53 162002-09-07 5:00 7,14 37 30 15 120 1,80E+06 1,78E+06 14,40 0,59 182002-09-07 7:00 7,12 37 30 15 120 1,90E+06 1,85E+06 14,46 0,64 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

72

EXPERIMENTO 1-3

VOLUMEN MEDIO: 500 LVOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.Presión : 5 psiTipo de impulsor: Flujo radialBafles: No

Tasa máxima de crecimiento: 0,035 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C) Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-09-07 11:00 7,14 4 -- -- 50 9,00E+05 13,712002-09-10 11:00 7,06 37 30 -- 120 1,00E+06 1,00E+06 13,82 0,00 02002-09-10 13:00 6,97 37 30 10 120 1,10E+06 1,06E+06 13,91 0,10 22002-09-10 15:00 7,17 37 30 10 120 1,10E+06 1,13E+06 13,91 0,10 42002-09-10 17:00 7,19 37 30 10 120 1,10E+06 1,21E+06 13,91 0,10 62002-09-10 19:00 7,24 37 30 6 120 1,10E+06 1,29E+06 13,91 0,10 82002-09-10 21:00 7,18 37 30 5 120 1,20E+06 1,37E+06 14,00 0,18 102002-09-10 23:00 7,14 37 30 5 120 1,40E+06 1,46E+06 14,15 0,34 122002-09-11 1:00 7,07 37 30 10 120 1,60E+06 1,55E+06 14,29 0,47 142002-09-11 3:00 7,09 37 30 15 120 1,80E+06 1,64E+06 14,40 0,59 162002-09-11 5:00 7,25 37 30 10 120 1,80E+06 1,73E+06 14,40 0,59 182002-09-11 7:00 7,22 37 30 10 120 1,90E+06 1,81E+06 14,46 0,64 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

73

EXPERIMENTO 2-1

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,038 (1/h)

Yxg 0,93X10^9 celulas/g

Kg 0,09 g/L

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Glucosa (g/L)

Prom G (g/L)

Prom X (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-09-14 13:00 7 4 -- -- 54 1,00E+06 -- -- -- -- 13,82 -- --

2002-09-17 11:00 6,95 37 30 6 160 1,10E+06 1,10E+06 1,39 1,29 1,15,E+06 13,91 0,00 0

2002-09-17 13:00 7,02 37 30 10 160 1,20E+06 1,18E+06 1,19 1,165 1,30,E+06 14,00 0,09 2

2002-09-17 15:00 7,15 37 30 10 160 1,40E+06 1,26E+06 1,14 1,035 1,45,E+06 14,15 0,24 4

2002-09-17 17:00 7,18 37 30 10 160 1,50E+06 1,35E+06 0,93 0,795 1,55,E+06 14,22 0,31 6

2002-09-17 19:00 7,11 37 30 10 160 1,60E+06 1,45E+06 0,66 0,54 1,65,E+06 14,29 0,37 8

2002-09-17 21:00 7,1 37 30 10 160 1,70E+06 1,56E+06 0,42 0,37 1,80,E+06 14,35 0,44 10

2002-09-17 23:00 7,1 37 30 10 160 1,90E+06 1,67E+06 0,32 0,27 1,95,E+06 14,46 0,55 12

2002-09-18 1:00 7,09 37 30 10 160 2,00E+06 1,78E+06 0,22 0,17 2,05,E+06 14,51 0,60 14

2002-09-18 3:00 7,09 37 30 10 160 2,10E+06 1,90E+06 0,12 -- 2,15,E+06 14,56 0,65 16

2002-09-18 5:00 7,04 37 30 15 160 2,20E+06 2,00E+06 L.O. -- 2,30,E+06 14,60 0,69 18

2002-09-18 7:00 7,2 37 30 15 160 2,40E+06 2,15E+06 L.O. -- -- 14,69 0,78 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

74

EXPERIMENTO 2-2

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,022 (1/h)

Yxg 0,64X10^9 celulas/g

kg 1,17 g/L

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Glucosa (g/L)

Prom G (g/L)

Prom X (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-09-18 13:00 7,3 4 -- -- 120 1,10E+06 -- 13,91

2002-09-19 9:00 7,13 37 30 -- 160 1,10E+06 1,10E+06 1,20E+06 13,91 0,00 0

2002-09-19 11:00 7,03 37 30 4 160 1,30E+06 1,14E+06 1,1 1,01 1,45E+06 14,08 0,17 2

2002-09-19 13:00 6,96 37 30 15 160 1,60E+06 1,00E+00 0,91 0,88 1,60E+06 14,29 0,37 4

2002-09-19 15:00 7,16 37 30 15 160 1,60E+06 1,19E+06 0,85 0,81 1,65E+06 14,29 0,37 6

2002-09-19 17:00 7,26 37 30 10 160 1,70E+06 1,24E+06 0,76 0,71 1,75E+06 14,35 0,44 8

2002-09-19 19:00 7,24 37 30 10 160 1,80E+06 1,29E+06 0,65 0,58 1,80E+06 14,40 0,49 10

2002-09-19 21:00 7,26 37 30 10 160 1,80E+06 1,34E+06 0,5 0,49 1,80E+06 14,40 0,49 12

2002-09-19 23:00 7,26 37 30 10 160 1,80E+06 1,40E+06 0,47 0,45 1,85E+06 14,40 0,49 14

2002-09-20 1:00 7,25 37 30 10 160 1,90E+06 1,46E+06 0,43 0,32 1,90E+06 14,46 0,55 16

2002-09-20 3:00 7,15 37 30 10 160 1,90E+06 1,51E+06 0,2 1,95E+06 14,46 0,55 18

2002-09-20 5:00 7,17 37 30 10 160 2,00E+06 1,57E+06 -- 2,00E+06 14,51 0,60 202002-09-20 7:00 7,05 37 30 10 160 2,00E+06 1,64E+06 -- 14,51 0,60 22

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

75

EXPERIMENTO 2-3

VOLUMEN MEDIO: 650 L

VOLUMEN CÉLULAS: 700 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,038 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-09-21 11:00 7,14 4 -- -- 50 1,00E+06 -- 13,82

2002-09-24 11:00 6,96 37 30 10 160 1,10E+06 1,10E+06 13,91 0,00 0

2002-09-24 13:00 7,15 37 30 10 160 1,30E+06 1,18E+06 14,08 0,17 2

2002-09-24 15:00 7,21 37 30 10 160 1,50E+06 1,26E+06 14,22 0,31 4

2002-09-24 17:00 7,09 37 30 10 160 1,60E+06 1,36E+06 14,29 0,37 6

2002-09-24 19:00 7,02 37 30 15 160 1,70E+06 1,45E+06 14,35 0,44 8

2002-09-24 21:00 7,02 37 30 15 160 1,80E+06 1,56E+06 14,40 0,49 10

2002-09-24 23:00 6,89 37 30 20 160 1,80E+06 1,67E+06 14,40 0,49 12

2002-09-25 1:00 6,85 37 30 30 160 2,00E+06 1,78E+06 14,51 0,60 14

2002-09-25 3:00 6,82 37 30 40 160 2,20E+06 1,90E+06 14,60 0,69 16

2002-09-25 5:00 6,78 37 30 50 160 2,40E+06 2,00E+06 14,69 0,78 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

76

EXPERIMENTO 3-1

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,030 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-11-01 9:00 7 37 30 10 120 1,10E+06 1,10E+06 13,91 0,00 0

2002-11-01 11:00 7,29 37 30 10 120 1,20E+06 1,16E+06 14,00 0,09 2

2002-11-01 13:00 7,29 37 30 -- 120 1,40E+06 1,22E+06 14,15 0,24 4

2002-11-01 15:00 7 37 30 5 120 1,50E+06 1,29E+06 14,22 0,31 6

2002-11-05 17:00 6,9 37 30 10 120 1,50E+06 1,37E+06 14,22 0,31 8

2002-11-05 19:00 6,94 37 30 18 120 1,60E+06 1,44E+06 14,29 0,37 10

2002-11-05 21:00 6,96 37 30 20 120 1,70E+06 1,52E+06 14,35 0,44 12

2002-01-06 23:00 6,93 37 30 25 120 1,80E+06 1,60E+06 14,40 0,49 14

2002-11-06 1:00 6,95 37 30 25 120 1,90E+06 1,68E+06 14,46 0,55 16

2002-11-06 3:00 6,97 37 30 25 120 1,90E+06 1,76E+06 14,46 0,55 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

77

EXPERIMENTO 3-2

VOLUMEN MEDIO: 650 L

VOLUMEN CÉLULAS: 700 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,032 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-11-08 11:00 7,2 37 30 10 120 9,00E+05 9,00E+05 13,71 0,00 0

2002-11-08 13:00 7,22 37 30 10 120 1,00E+06 9,50E+05 13,82 0,11 2

2002-11-08 15:00 7,22 37 30 10 120 1,00E+06 1,00E+06 13,82 0,11 4

2002-11-08 17:00 7,2 37 30 12 120 1,10E+06 1,07E+06 13,91 0,20 6

2002-11-08 19:00 7,13 37 30 20 120 1,10E+06 1,14E+06 13,91 0,20 8

2002-11-08 21:00 7,18 37 30 20 120 1,20E+06 1,20E+06 14,00 0,29 10

2002-11-08 23:00 7,15 37 30 20 120 1,30E+06 1,27E+06 14,08 0,37 12

2002-11-09 1:00 7,15 37 30 20 120 1,40E+06 1,35E+06 14,15 0,44 14

2002-11-09 3:00 7,11 37 30 20 120 1,50E+06 1,42E+06 14,22 0,51 16

2002-11-09 5:00 7,08 37 30 20 120 1,60E+06 1,50E+06 14,29 0,58 18

2002-11-09 7:00 6,8 37 30 30 120 1,70E+06 1,57E+06 14,35 0,64 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

78

EXPERIMENTO 3-3

VOLUMEN MEDIO: 600 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,025 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-11-09 11:00 7,03 4 30 -- 120 8,00E+05 -- 13,59

2002-11-11 11:00 7,15 37 30 10 120 8,50E+05 8,50E+05 13,65 0,00 0

2002-11-11 13:00 7,18 37 30 -- 120 1,00E+06 8,90E+05 13,82 0,16 2

2002-11-11 15:00 6,98 37 30 10 120 1,10E+06 9,32E+05 13,91 0,26 4

2002-11-11 17:00 6,98 37 30 20 120 1,30E+06 9,76E+05 14,08 0,42 6

2002-11-11 19:00 7,17 37 30 15 120 1,30E+06 1,02E+06 14,08 0,42 8

2002-11-11 21:00 7,22 37 30 15 120 1,20E+06 1,07E+06 14,00 0,34 10

2002-11-11 23:00 7,15 37 30 15 120 1,20E+06 1,12E+06 14,00 0,34 12

2002-11-12 1:00 7,01 37 30 25 120 1,30E+06 1,17E+06 14,08 0,42 14

2002-11-12 3:00 6,96 37 30 30 120 1,30E+06 1,22E+06 14,08 0,42 16

2002-11-12 5:00 7 37 30 40 120 1,50E+06 1,28E+06 14,22 0,57 182002-11-12 7:00 6,97 37 30 40 120 1,70E+06 1,33E+06 14,35 0,69 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

79

EXPERIMENTO 4-1

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,044 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-11-27 13:00 7,24 4 -- -- 7,00E+05 -- 13,46

2002-11-28 11:00 7,35 37 -- -- 160 7,50E+05 7,50E+05 13,53 0,00 0

2002-11-28 13:00 7,32 37 -- -- 160 8,50E+05 8,11E+05 13,65 0,13 2

2002-11-28 15:00 7,24 37 30 -- 160 9,00E+05 8,77E+05 13,71 0,18 4

2002-11-28 17:00 7,24 37 30 -- 160 1,00E+06 9,47E+05 13,82 0,29 6

2002-11-28 19:00 7,21 37 30 -- 160 1,20E+06 1,02E+06 14,00 0,47 8

2002-11-28 21:00 7,18 37 30 10 160 1,20E+06 1,10E+06 14,00 0,47 10

2002-11-28 23:00 7,16 37 30 10 160 1,30E+06 1,19E+06 14,08 0,55 12

2002-11-29 1:00 7,18 37 30 10 160 1,40E+06 1,28E+06 14,15 0,62 14

2002-11-29 3:00 7,14 37 30 10 160 1,50E+06 1,38E+06 14,22 0,69 16

2002-11-29 5:00 7,1 37 30 10 160 1,70E+06 1,48E+06 14,35 0,82 182002-11-29 7:00 7,07 37 30 10 160 1,90E+06 1,59E+06 14,46 0,93 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

80

EXPERIMENTO 4-2

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,037 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2002-12-06 9:00 7,04 37 30 5 160 1,00E+06 1,00E+06 13,82

2002-12-06 11:00 7,15 37 30 5 160 1,20E+06 1,08E+06 14,00 0,00 0

2002-12-06 13:00 7,17 37 30 -- 160 1,40E+06 1,17E+06 14,15 0,15 2

2002-12-06 15:00 7,15 37 30 -- 160 1,50E+06 1,27E+06 14,22 0,22 4

2002-12-06 17:00 7,1 37 30 5 160 1,70E+06 1,38E+06 14,35 0,35 6

2002-12-06 19:00 7,03 37 30 5 160 1,90E+06 1,50E+06 14,46 0,46 8

2002-12-06 21:00 6,96 37 30 10 160 2,00E+06 1,62E+06 14,51 0,51 10

2002-12-06 23:00 7,33 37 30 -- 160 2,10E+06 1,76E+06 14,56 0,56 12

2002-12-07 1:00 7,25 37 30 -- 160 2,30E+06 1,90E+06 14,65 0,65 14

2002-12-07 3:00 7,2 37 30 -- 160 2,40E+06 2,00E+06 14,69 0,69 16

2002-12-07 5:00 7,18 37 30 -- 160 2,40E+06 2,20E+06 14,69 0,69 182002-12-07 7:00 7,17 37 30 -- 160 2,60E+06 2,34E+06 14,77 0,77 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

81

EXPERIMENTO 4-3

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 400 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: radial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,042 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-01-22 13:00 7,16 4 -- -- 100 9,00E+05 -- 13,71 0

2003-01-23 11:00 7,14 37 30 4 160 1,00E+06 1,00E+06 13,82 0,00 2

2003-01-23 13:00 7,17 37 30 4 160 1,10E+06 1,07E+06 13,91 0,10 4

2003-01-23 15:00 7,16 37 30 4 160 1,10E+06 1,14E+06 13,91 0,10 6

2003-01-23 17:00 7,11 37 30 4 160 1,30E+06 1,23E+06 14,08 0,26 8

2003-01-23 19:00 7,04 37 30 10 160 1,30E+06 1,31E+06 14,08 0,26 10

2003-01-23 21:00 7,18 37 30 10 160 1,50E+06 1,40E+06 14,22 0,41 12

2003-01-23 23:00 7,15 37 30 10 160 1,60E+06 1,50E+06 14,29 0,47 14

2003-01-24 1:00 7,08 37 30 15 160 1,70E+06 1,60E+06 14,35 0,53 16

2003-01-24 3:00 7,11 37 30 15 160 1,90E+06 1,71E+06 14,46 0,64 18

2003-01-24 5:00 7,15 37 30 15 160 2,00E+06 1,82E+06 14,51 0,69 20

2003-01-24 7:00 7,23 37 30 15 160 2,30E+06 1,94E+06 14,65 0,83 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

82

EXPERIMENTO 5,1

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,041 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-02-19 13:00 7,01 37 30 10 120 1,10E+06 1,10E+06 13,91 0,00 0

2003-02-19 15:00 7,2 37 30 15 120 1,10E+06 1,18E+06 13,91 0,00 2

2003-02-19 17:00 7,15 37 30 15 120 1,20E+06 1,27E+06 14,00 0,09 4

2003-02-19 19:00 7,16 37 30 15 120 1,30E+06 1,37E+06 14,08 0,17 6

2003-02-19 21:00 7,14 37 30 15 120 1,50E+06 1,48E+06 14,22 0,31 8

2003-02-19 23:00 6,96 37 30 25 120 1,50E+06 1,59E+06 14,22 0,31 10

2003-02-20 1:00 7,15 37 30 25 120 1,70E+06 1,71E+06 14,35 0,44 12

2003-02-20 3:00 7,19 37 30 25 120 1,90E+06 1,83E+06 14,46 0,55 14

2003-02-20 5:00 7,18 37 30 25 120 2,00E+06 1,95E+06 14,51 0,60 16

2003-02-20 7:00 7,18 37 30 20 120 2,20E+06 2,00E+06 14,60 0,69 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

83

EXPERIMENTO 5-2

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,034 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-02-21 11:00 7,04 37 30 15 120 1,10E+06 1,10E+06 13,91 0,00 0

2003-02-21 13:00 7,11 37 30 15 120 1,20E+06 1,17E+06 14,00 0,09 2

2003-02-21 15:00 7,06 37 30 15 120 1,20E+06 1,24E+06 14,00 0,09 4

2003-02-21 17:00 7,08 37 30 20 120 1,20E+06 1,32E+06 14,00 0,09 6

2003-02-21 19:00 7,11 37 30 20 120 1,30E+06 1,41E+06 14,08 0,17 8

2003-02-21 21:00 7,1 37 30 20 120 1,30E+06 1,50E+06 14,08 0,17 10

2003-02-21 23:00 7,07 37 30 20 120 1,50E+06 1,59E+06 14,22 0,31 12

2003-02-22 1:00 7,11 37 30 20 120 1,70E+06 1,69E+06 14,35 0,44 14

2003-02-22 3:00 7,12 37 30 20 120 1,90E+06 1,78E+06 14,46 0,55 16

2003-02-22 5:00 7,09 37 30 30 120 2,00E+06 1,88E+06 14,51 0,60 18

2003-02-22 7:00 7,14 37 30 30 120 2,10E+06 1,97E+06 14,56 0,65 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

84

EXPERIMENTO 5-3

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,023 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-03-06 13:00 7,01 4 -- -- 120 1,20E+06 -- 14,00 0,00 0

2003-03-07 11:00 7,11 37 30 10 120 1,40E+06 1,40E+06 14,15 0,15 2

2003-03-07 13:00 7 37 30 20 120 1,50E+06 1,46E+06 14,22 0,22 4

2003-03-07 15:00 6,98 37 30 25 120 1,50E+06 1,52E+06 14,22 0,22 6

2003-03-07 17:00 7,12 37 30 25 120 1,60E+06 1,59E+06 14,29 0,29 8

2003-03-07 19:00 7,09 37 30 35 120 1,60E+06 1,65E+06 14,29 0,29 10

2003-03-07 21:00 7,26 37 30 20 120 1,60E+06 1,72E+06 14,29 0,29 12

2003-03-07 23:00 7,21 37 30 20 120 1,70E+06 1,80E+06 14,35 0,35 14

2003-03-08 1:00 7,16 37 30 20 120 1,80E+06 1,87E+06 14,40 0,41 16

2003-03-08 3:00 7,1 37 30 20 120 1,90E+06 1,95E+06 14,46 0,46 18

2003-03-08 5:00 7,06 37 30 30 120 2,00E+06 2,00E+06 14,51 0,51 20

2003-03-08 7:00 6,98 37 30 40 120 2,30E+06 2,10E+06 14,65 0,65 22

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

85

EXPERIMENTO 6-1

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,045 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-02-07 13:00 7,32 37 -- -- 160 1,10E+06 1,10E+06 13,91 0,00 0

2003-02-07 15:00 7,3 37 -- -- 160 1,20E+06 1,17E+06 14,00 0,09 2

2003-02-07 17:00 7,14 37 30 -- 160 1,20E+06 1,24E+06 14,00 0,09 4

2003-02-07 19:00 7,08 37 30 10 160 1,30E+06 1,31E+06 14,08 0,17 6

2003-02-07 21:00 7,12 37 30 10 160 1,40E+06 1,38E+06 14,15 0,24 8

2003-02-07 23:00 7,16 37 30 10 160 1,60E+06 1,44E+06 14,29 0,37 10

2003-02-08 1:00 7,16 37 30 15 160 1,80E+06 1,51E+06 14,40 0,49 12

2003-02-08 3:00 7,21 37 30 15 160 2,00E+06 1,58E+06 14,51 0,60 14

2003-02-08 5:00 7,24 37 30 15 160 2,20E+06 1,65E+06 14,60 0,69 16

2003-02-08 7:00 7,27 37 30 15 160 2,40E+06 1,72E+06 14,69 0,78 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

86

EXPERIMENTO 6-2

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,065 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-02-27 13:00 7,02 37 30 10 160 7,50E+05 7,50E+05 13,53 0,00 0

2003-02-27 15:00 7,26 37 30 -- 160 8,50E+05 8,46E+05 13,65 0,13 2

2003-02-27 17:00 7,18 37 30 -- 160 1,00E+06 9,50E+05 13,82 0,29 4

2003-02-27 19:00 7,16 37 30 -- 160 1,20E+06 1,07E+06 14,00 0,47 6

2003-02-27 21:00 7,13 37 30 -- 160 1,30E+06 1,20E+06 14,08 0,55 8

2003-02-27 23:00 7,09 37 30 15 160 1,40E+06 1,35E+06 14,15 0,62 10

2003-02-28 1:00 7,11 37 30 15 160 1,70E+06 1,52E+06 14,35 0,82 12

2003-02-28 3:00 7,13 37 30 15 160 2,00E+06 1,69E+06 14,51 0,98 14

2003-02-28 5:00 7,17 37 30 15 160 2,30E+06 1,88E+06 14,65 1,12 16

2003-02-28 7:00 7,22 37 30 10 160 2,30E+06 2,00E+06 14,65 1,12 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

87

EXPERIMENTO 6-3

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: SI

Tasa máxima de crecimiento: 0,046 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-02-28 13:00 7,08 37 30 20 160 1,00E+06 1,00E+06 13,82 0,00 0

2003-02-28 15:00 7,28 37 30 -- 160 1,10E+06 1,08E+06 13,91 0,10 2

2003-02-28 17:00 -- 37 30 -- 160 1,10E+06 1,18E+06 13,91 0,10 4

2003-02-28 19:00 6,96 37 30 10 160 1,20E+06 1,28E+06 14,00 0,18 6

2003-02-28 21:00 7,17 37 30 10 160 1,30E+06 1,40E+06 14,08 0,26 8

2003-02-28 23:00 7,16 37 30 10 160 1,40E+06 1,52E+06 14,15 0,34 10

2003-03-01 1:00 7,18 37 30 10 160 1,60E+06 1,64E+06 14,29 0,47 12

2003-03-01 3:00 7,2 37 30 10 160 1,90E+06 1,78E+06 14,46 0,64 14

2003-03-01 5:00 7,24 37 30 10 160 2,10E+06 1,91E+06 14,56 0,74 16

2003-03-01 7:00 7,25 37 30 10 160 2,20E+06 2,04E+06 14,60 0,79 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

88

EXPERIMENTO 7-1

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,046 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-05-08 13:00 6,99 37 30 10 120 8,50E+05 8,50E+05 13,65 0,00 0

2003-05-08 15:00 7,16 37 30 10 120 9,00E+05 9,26E+06 13,71 0,06 2

2003-05-08 17:00 7,26 37 30 5 120 1,10E+06 1,00E+06 13,91 0,26 4

2003-05-08 19:00 7,16 37 30 5 120 1,30E+06 1,09E+06 14,08 0,42 6

2003-05-08 21:00 7,05 37 30 10 120 1,50E+06 1,19E+06 14,22 0,57 8

2003-05-08 23:00 7,02 37 30 15 120 1,50E+06 1,29E+06 14,22 0,57 10

2003-05-09 1:00 7,1 37 30 15 120 1,60E+06 1,40E+06 14,29 0,63 12

2003-05-09 3:00 7,2 37 30 -- 120 1,70E+06 1,52E+06 14,35 0,69 14

2003-05-09 5:00 7,03 37 30 5 120 1,90E+06 1,64E+06 14,46 0,80 16

2003-05-09 7:00 7,04 37 30 10 120 1,90E+06 1,75E+06 14,46 0,80 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

89

EXPERIMENTO 7-2

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,042 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-05-10 11:00 6,95 4 -- -- -- 1,10E+06 -- 13,91 0,00 0

2003-05-12 11:00 6,99 37 30 -- 120 1,20E+06 1,20E+06 14,00 0,09 2

2003-05-12 13:00 7,02 37 30 5X5´ 120 1,40E+06 1,29E+06 14,15 0,24 4

2003-05-12 15:00 7,04 37 30 5 120 1,50E+06 1,40E+06 14,22 0,31 6

2003-05-12 17:00 7,07 37 30 5 120 1,70E+06 1,51E+06 14,35 0,44 8

2003-05-12 19:00 7,05 37 30 10 120 1,80E+06 1,63E+06 14,40 0,49 10

2003-05-12 21:00 7,03 37 30 15 120 1,90E+06 1,76E+06 14,46 0,55 12

2003-05-12 23:00 7,05 37 30 20 120 2,10E+06 1,89E+06 14,56 0,65 14

2003-05-13 1:00 7,05 37 30 20 120 2,20E+06 2,03E+06 14,60 0,69 16

2003-05-13 3:00 7,08 37 30 20 120 2,40E+06 2,17E+06 14,69 0,78 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

90

EXPERIMENTO 7-3

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 120 r.p.m.

Presión: 15 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,054 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-05-14 13:00 7,15 4 -- -- 60 8,00E+05 -- 13,59 0,00 0

2003-05-15 9:00 7,05 37 30 10X10¨ 120 8,50E+05 8,50E+05 13,65 0,06 2

2003-05-15 11:00 6,94 37 30 10 120 9,50E+05 9,40E+05 13,76 0,17 4

2003-05-15 13:00 7,12 37 30 -- 120 1,10E+06 1,04E+06 13,91 0,32 6

2003-05-15 15:00 7,1 37 30 10 120 1,20E+06 1,14E+06 14,00 0,41 8

2003-05-15 17:00 7 37 30 15 120 1,40E+06 1,26E+06 14,15 0,56 10

2003-05-15 19:00 7,02 37 30 15 120 1,70E+06 1,39E+06 14,35 0,75 12

2003-05-15 21:00 7,02 37 30 25 120 1,90E+06 1,54E+06 14,46 0,86 14

2003-05-15 23:00 7,01 37 20 35 120 1,90E+06 1,69E+06 14,46 0,86 16

2003-05-16 1:00 7,1 37 20 35 120 2,20E+06 1,85E+06 14,60 1,01 182003-05-16 3:00 7,06 37 20 40 120 2,30E+06 2,00E+06 14,65 1,06 202003-05-16 5:00 7 37 20 40 120 2,40E+06 2,20E+06 14,69 1,10 22

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

91

EXPERIMENTO 8-1

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,034 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-05-17 13:00 7,25 4 -- -- 60 1,00E+06 -- 13,82 0,00 0

2003-05-19 11:00 7,18 37 30 -- 160 1,10E+06 1,10E+06 13,91 0,10 2

2003-05-19 13:00 7,08 37 30 -- 160 1,20E+06 1,17E+06 14,00 0,18 4

2003-05-19 15:00 6,92 37 30 10 160 1,30E+06 1,24E+06 14,08 0,26 6

2003-05-19 17:00 7,05 37 30 10 160 1,30E+06 1,32E+06 14,08 0,26 8

2003-05-19 19:00 7,02 37 30 10 160 1,40E+06 1,41E+06 14,15 0,34 10

2003-05-19 21:00 7,02 37 30 10 160 1,50E+06 1,49E+06 14,22 0,41 12

2003-05-19 23:00 7,05 37 30 10 160 1,60E+06 1,59E+06 14,29 0,47 14

2003-05-20 1:00 7,05 37 30 10 160 1,80E+06 1,68E+06 14,40 0,59 16

2003-05-20 3:00 7,02 37 30 10 160 1,90E+06 1,78E+06 14,46 0,64 182003-05-20 5:00 7 37 30 10 160 2,00E+06 1,87E+06 14,51 0,69 20

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

92

EXPERIMENTO 8-2

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,043 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-05-10 11:00 6,95 4 -- -- -- 1,10E+06 -- 13,91 0,00 0

2003-05-12 11:00 6,99 37 30 -- 120 1,20E+06 1,20E+06 14,00 0,09 2

2003-05-12 13:00 7,02 37 30 5X5´ 120 1,40E+06 1,30E+06 14,15 0,24 4

2003-05-12 15:00 7,04 37 30 5 120 1,50E+06 1,40E+06 14,22 0,31 6

2003-05-12 17:00 7,07 37 30 5 120 1,70E+06 1,52E+06 14,35 0,44 8

2003-05-12 19:00 7,05 37 30 10 120 1,80E+06 1,64E+06 14,40 0,49 10

2003-05-12 21:00 7,03 37 30 15 120 1,90E+06 1,77E+06 14,46 0,55 12

2003-05-12 23:00 7,05 37 30 20 120 2,10E+06 1,90E+06 14,56 0,65 14

2003-05-13 1:00 7,05 37 30 20 120 2,20E+06 2,04E+06 14,60 0,69 16

2003-05-13 3:00 7,08 37 30 20 120 2,40E+06 2,18E+06 14,69 0,78 18

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

93

EXPERIMENTO 8-3

VOLUMEN MEDIO: 500 L

VOLUMEN CÉLULAS: 500 L

Velocidad de agitación: 160 r.p.m.

Presión: 5 psi

Tipo de impeller: axial

Bafles: NO

Tasa máxima de crecimiento: 0,054 (1/h)

Fecha Hora pH Temperatura (°C)

Superficie (l/min)

Profundidad (L/min)

Agitación (r.p.m.)

Viable (células/ml)

Teórico (células/ml)

Ln viable Ln X-Ln Xo Tiempo (h)

2003-05-14 13:00 7,15 4 -- -- 60 8,00E+05 -- 13,59 0,00 0

2003-05-15 9:00 7,05 37 30 10X10¨ 120 8,50E+05 8,50E+05 13,65 0,06 2

2003-05-15 11:00 6,94 37 30 10 120 9,50E+05 9,40E+05 13,76 0,17 4

2003-05-15 13:00 7,12 37 30 -- 120 1,10E+06 1,03E+06 13,91 0,32 6

2003-05-15 15:00 7,1 37 30 10 120 1,20E+06 1,14E+06 14,00 0,41 8

2003-05-15 17:00 7 37 30 15 120 1,40E+06 1,26E+06 14,15 0,56 10

2003-05-15 19:00 7,02 37 30 15 120 1,70E+06 1,40E+06 14,35 0,75 12

2003-05-15 21:00 7,02 37 30 25 120 1,90E+06 1,53E+06 14,46 0,86 14

2003-05-15 23:00 7,01 37 20 35 120 1,90E+06 1,68E+06 14,46 0,86 16

2003-05-16 1:00 7,1 37 20 35 120 2,20E+06 1,83E+06 14,60 1,01 182003-05-16 3:00 7,06 37 20 40 120 2,30E+06 2,00E+06 14,65 1,06 202003-05-16 5:00 7 37 20 40 120 2,40E+06 2,16E+06 14,69 1,10 22

Aire Conteo celular/ml

MIM-2003-I-22

94

Anexo G Tabla distribución F

MIM-2003-I-22

95

Anexo H Algoritmo de maximización

C

2

160

2

15

=

Punto óptimo de operación

C Maximizef b, v, a, p,( ):=

Función de maximización

p 15≤

p 5≥

a 2≤

a 1≥

v 160≤

v 120≥

b 2≤

b 1≥

Given

Definición de restriccones e intervalos

p 5:=

a 1:=

v 120:=

b 1:=

Definición del punto de inicio

f b v, a, p,( ) 937500 816667 b⋅− 391667 a⋅+ 3958 v⋅− 14167 p⋅+ 7500 b⋅ v⋅+ 150000 b⋅ a⋅−:=

Definición de la función a maximizar

bafles en el nivel 2, velocidad en el nivel 2, presión en el nivel 2 y presión en el nivel 2.