Obtención de aislamientos de

Pythium spp. de soja (Glycine max

L.) de suelos de Balcarce y prueba

de sensibilidad a fungicidas.

Tesis de Grado para optar al título de

Ingeniero Agrónomo

Alumno: Sergio Maximiliano Pase

Director: Ing. Agr. M.Sc. Pablo Enrique Grijalba

Codirector: Ing. Agr. Esp. Hemilse Elena

Palmucci

1971-19751981-19851991-19952001-20052005-2010

Fuente: www.laargentinaenmapas.com.ar (CONICET)

Objetivo del Proyecto: obtener aislamientos de Pythium spp. de la

localidad de Balcarce, provincia de Buenos Aires y probar su patogenicidad y sensibilidad frente a fungicidas.

Pythium spp. :

Clasificación taxonómica:Reino: Chromista- StramenopilaDivisión: OomycetesOrden: PeronosporalesFamilia: PythiaceaeGenero: Pythium Especie: spp.

Psudohongo: Paredes compuestas de celulosa y sin quitina.

Micelio: Hifas cenocíticas (plurinucleado)

Reproducción asexual: Zoospora, flagela por división citoplasmática.Reproducción sexual: Oospora formada por contacto gametangial entre anteridio y oogonio.

Habitante del suelo.Las mejores condiciones para su desarrollo son los altos niveles de humedad y las temperaturas de 20- 25°C.Signos y Sintomatología: Lesión castaño oscura o negro, crecimiento reducido de la planta, crecimiento miceliar blanco algodonoso en el cuello. Damping-off

Obtención de aislamientos de Pythium:

Trampa con semillas de soja” o “Baiting Technique”

Siembra 20 semillas.En estado cotiledonar VC anegamiento durante 8 HsSe retiró el agua, se esperó entre 3 a 4 días para observar plántulas anormales Se cortaron secciones del tejido infectado.

Siembra debajo de un medio selectivo para Oomycotas. (APD) + Antibióticos + Fungicidas Dentro de las 24 a 48 horas desde la siembra, se repicaron las puntas del micelio (APD), Los cultivos puros se procedió a cultivarlos en tubos pico de flauta y/o Eppendorf.

A través de la “Baiting Technique” se obtuvieron gran cantidad de plántulas que presentaban crecimiento anormal, puntas de raíces negras , y podredumbres a la altura del cuello de la plántula. De estas se aislaron :

18 Suelo I

10 Suelo III

18 Suelo IV

Total 46 Aislamientos Puros

Resultados Obtención de aislamientos de Pythium:

Selección de aislamientos para ensayos.

Se seleccionaron 15 aislamientos con características típicas de Pythium de cada una de las muestras de suelo.

Micelio filamentoso cenocítico (plurinucleado)

Presencia de esporangios lobulados y esféricos

Zoosporas biflageladas y reniformes

Formación de oogonios esféricos o subesféricos, terminales o intercalares.

Las oosporas son esféricas, de membrana lisa o reticulada.

•Trocito/s de APG con desarrollo miceliar. •Agua estéril y segmentos de 1-2 cm de césped Agrostis sp.

Ensayos:

Ensayo de patogenicidad in vitro y calculo de PG:

Se repicaron cultivos puros, de los 15 aislamientos seleccionados en cajas de Petri.

Se colocaron en cada caja 10 semillas previamente desinfectadas.

4 repeticiones por cada uno de los aislamientos.

Se cuantifico:

•Semillas y/o plántulas Muertas•Plántulas infectadas•Plántulas normales

PG = 97%

Suelo Variable n Media Des. Est.

I % Mortandad 5 76.2 10.76

III % Mortandad 5 82.8 4.44

IV % Mortandad 5 62.8 3.19

Aislamiento Variable n Media Des. Est.

I 12 % Mortandad 4 82.25 3.69

I 13 % Mortandad 4 80.00 2.31

I 2 % Mortandad 4 81.25 4.27

I 20 % Mortandad 4 56.75 2.50

I 22 % Mortandad 4 81.25 4.27

III 2 % Mortandad 4 84.50 2.89

III 3 % Mortandad 4 83.50 4.36

III 4 % Mortandad 4 85.75 2.50

III 7 % Mortandad 4 75.25 4.50

III 9 % Mortandad 4 83.50 4.36

IV 17 % Mortandad 4 63.00 10.80

IV 18 % Mortandad 4 66.75 4.79

IV 19 % Mortandad 4 58.00 4.08

IV 21 % Mortandad 4 62.75 13.67

IV 9 % Mortandad 4 63.00 4.08

•Los aislamientos obtenidos de la muestra de suelo I fueron los que presentaron mayor variabilidad en su patogenicidad, el aislamiento presento un 56.75 % de patogenicidad, mientras que el un 82.25 % •Los aislamientos pertenecientes a la muestra de suelo III fueron los más patógenos, con un 82,8% de patogenicidad promedio, de los cuales el aislamiento resultó ser el más patógeno con un valor de 85,75 % de mortandad. •Los aislamientos pertenecientes a la muestra de suelo IV fueron los que presentaron menor % de patogenicidad con un valor promedio de 62,80% y a su vez evidenciaron una mayor heterogeneidad en sus valores, Desvió estándar: 3,19

Sensibilidad in vitro frente a fungicidas

Los fungicidas a utilizados:Metalaxil con una dosis de 10 ppm (CASAFE 2007)

Carbendazim+Tiram con una dosis de 100 ppm (Dorrance et al., 2004)

Los tratamientos han sido 3, los dos principios activos y el testigo correspondiente. Se efectuaron 4 repeticiones para cada tratamiento. En aquellos aislamientos que evidenciaban un mínimo crecimiento sobre el medio con fungicida, se procedió a medir la tasa de crecimiento diaria en medio de cultivo con y sin fungicida.

Aislamiento Methalaxyl

Dosis 10 ppm

Carbendazim + Thiram

Dosis 100 ppm

I2 Con inhibición Sin inhibición

I12 Con inhibición Sin inhibición

I13 Con inhibición Sin inhibición

I20 Sin inhibición Sin inhibición

I22 Con inhibición Sin inhibición

III4 Con inhibición Sin inhibición

III2 Con inhibición Con inhibición

III3 Con inhibición Sin inhibición

III7 Con inhibición Sin inhibición

III9 Con inhibición Sin inhibición

IV17 Con inhibición Sin inhibición

IV9 Con inhibición Sin inhibición

IV18 Con inhibición Sin inhibición

IV19 Con inhibición Con inhibición

IV21 Con inhibición Con inhibición

% de Inhibición 93 % 20%

Metalaxil presento un 93% de inhibición ya que 1 solo aislamiento presentó crecimiento de un total de 15. Mientras que el Carbendazim + Thirampresentó un 20 % de inhibición debido a que únicamente 3 aislamientos no presentaron desarrollo.

AislamientoMethalaxyl

Dosis 10 ppmCarbendazim + Thiram

Dosis 100 ppm

I2 Con inhibición Sin inhibición

I12 Con inhibición Sin inhibición

I13 Con inhibición Sin inhibición

I20 Con inhibición Sin inhibición

I22 Con inhibición Sin inhibición

III4 Con inhibición Sin inhibición

III2 Con inhibición Con inhibición

III3 Con inhibición Sin inhibición

III7 Con inhibición Sin inhibición

III9 Con inhibición Sin inhibición

IV17 Con inhibición Sin inhibición

IV9 Con inhibición Sin inhibición

IV18 Con inhibición Sin inhibición

IV19 Con inhibición Con inhibición

IV21 Con inhibición Con inhibición

% de Inhibición 100 % 20%

Con la dosis de 10 ppm. de Metalaxil in vitro la inhibición fue del 100% de los aislamientos lo que demuestra una alta eficiencia de control por parte de dicho principio activo sobre los aislamientos del género Pythium. Cuando el medio de cultivo contenía una dosis de 100 ppm. de Carbendazim+Tiram inhibió al 20% de los aislamientos, por ende la eficiencia de control resultó ser muy baja

Sensibilidad in vivo frente a fungicidas Metalaxil con una dosis de 50 cm3 / 100 Kg. de semilla. (MET)

Carbendazim+Tiram con una dosis de 200 cm3 / 100 Kg. de semilla (RIT)

Semilla sin tratar y sin inóculo.Semilla sin tratar y con inóculo.Semilla tratada con fungicida y sin inóculo.Semilla tratada con fungicida y con inóculo.

Tratamientos:

Arena esterilizada APD con micelio

Semilla SojaTierra Tindalizada Mezcla de tierra y

arena

Variable medida: N° de Plántulas emergidas sanas.

Testigo Testigo Metalaxil Inoculado Metalaxil Testigo Inoculado

Testigo Testigo Carbendazim Inoculado Carbendazim Testigo Inoculado

Metalaxil controló de manera eficiente los 15 aislamientos en forma conjunta.Alta eficiencia de este principio activo sobre el género Pythium.

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 256,50 3 85,50 26,31 <0,0001Tratamiento 256,50 3 85,50 26,31 <0,0001Error 45,50 14 3,25Total 302,00 17

Test:LSD Fisher Alfa=0,05 DMS=2,65474Error: 3,2500 gl: 14Tratamiento Medias n E.E.Testigo 1,50 6 0,74 A Inoculado MET 1,67 3 1,04 A Testigo MET 2,00 3 1,04 A Inoculado 9,67 6 0,74 B

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 290,50 3 96,83 29,79 <0,0001Tratamiento 290,50 3 96,83 29,79 <0,0001Error 45,50 14 3,25Total 336,00 17

Test:LSD Fisher Alfa=0,05 DMS=2,65474Error: 3,2500 gl: 14Tratamiento Medias n E.E.Testigo RIT 1,00 3 1,04 A Testigo 1,50 6 0,74 A Inoculado RIT 8,67 3 1,04 B Inoculado 9,67 6 0,74 B

Para la mezcla de fungicidasCarbendazim+Tiram los datos evidenciaron que el tratamiento no generó ningún tipo de protección.Baja eficiencia de control sobre el género Pythium.

Conclusiones:

• De los suelos muestreados se aislaron 46 cepas de Pythium, de las cuales, las 15 seleccionadas presentaron distinto grado de patogenicidad.

• No se encontraron aislamientos resistentes a Metalaxil, siendo muy eficiente su control tanto in vitro como in vivo, con un 100% de eficiencia.

• El Carbendazim+Tiram presentó valores bajos de eficiencia, siendo del 20% in vitro y 5% in vivo.