DISTRIBUCIÓN DIFERENCIAL Y REGIONAL DEL TRANSPORTADOR SNAT5 DURANTE LA ONTOGENIA DEL SISTEMA NERVIOSO DE RATA

Cortés-Torres M. C, Bonilla-Zea M., Moreno-Layseca P., Escobar-Cabrera J., Rodríguez-Torres A., Berumen-Segura L., García-Alcocer G.

Unidad de Investigación Genética / Facultad de Química, UniversidadAutónoma de Querétaro.

RESUMEN La glutamina es un aminoácido neutro, que se sintetiza en las células gliales, a partir del glutamato, el cual es recapturado de la sinapsis, a través del ciclo glutamato-glutamina, reponiéndose así el reservorio del neurotransmisor (glutamato) en la neurona. En este sentido, una molécula esencial para el mantenimiento e integridad neuronal es el transportador de glutamina SNAT5, el cual en la rata adulta transfiere la glutamina glial a las neuronas glutamatérgicas para que pueda llevarse acabo la sinapsis. Por ello, a partir de 2005 se le ha establecido una importante conexión entre éste transportador y el tratamiento de enfermedades como la esquizofrenia o el Alzheimer. En este trabajo se pretendió conocer la presencia del transportador SNAT5 durante la ontogenia, que pueda dar pauta, a explorar la posible participación de la glutamina en la diferenciación celular, para ello, se estudió la distribución regional y diferencial del transportador de glutamina SNAT5, en cortes coronales de encéfalos de ratas embrionarias E14, E16, y E18 y post-natales P0, P7, P12, P21 y P60 por inmunohistoquímica. Los resultados indican la presencia del transportador en la corteza, aunque solo se observó la marca en embriones E14, E18 y en post-natal 7. Sin embargo en otra región como el hipotálamo, la marca fue observada en los encéfalos embrionarios estudiados y en encéfalos postnatales P0 y P7. Los resultados obtenidos son los primeros que se conocen del transportador SNAT5, durante la ontogenia de rata, por lo que es de suma importancia, explorar tanto la participación de la glutamina, en la diferenciación celular, como las células que están presentes, en la distribución diferencial observada en los resultados de esta investigación.

INTRODUCCIÓNLa glutamina es un aminoácido neutro que está codificado en el ARN mensajero como “CAA” o “CAG”, cuya estructura presenta dos cadenas nitrogenadas (un grupo amida y otro amino). Este aminoácido esta involucrado en numerosas vías metabólicas en distintos órganos y sistemas (Bonet et al., 2007), entre ellos se encuentra el denominado sistema N, cuyo papel es importante en el aporte de glutamina a las neuronas como precursor de la síntesis de glutamato, éste es el principal neurotransmisor excitador dentro del sistema nervioso central, en donde se ha establecido su implicación en aspectos relevantes al funcionamiento normal del cerebro tales como la cognición, la memoria y el aprendizaje.

El aporte de glutamina al sistema nervioso es regulado mediante el ciclo glutamato-glutamina entre células gliales y neuronas. En este ciclo los transportadores de alta afinidad recapturan gran parte del glutamato liberado durante la sinapsis introduciéndolo en las células gliales, las cuales lo

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convertirán en glutamina gracias a la enzima glutamina sintetasa. Finalmente, la glutamina es devuelta a las neuronas glutamatérgicas y también a las GABAérgicas donde puede ser transformada a glutamato, reponiendo así el reservorio de neurotransmisor en las neuronas y completando el ciclo glutamato-glutamina. Por tanto en este ciclo son necesarios al menos dos transportadores adicionales, uno en las células gliales con capacidad para exportar glutamina al espacio extracelular, y otro neuronal con capacidad para recapturar esta glutamina para la neurona. La familia de los transportadores SNAT (Synaptic neutral aminoacid transporter), tienen la capacidad de catalizar estos pasos. Entre estos se encuentra el transportador de baja afinidad SNAT5 (González, 2007), el cual regula la recaptura de glutamina mediante el cotransporte Na+/aminoácidos e intercambiando H+ (Mackenzie, et al., 2003). En estudios recientes se ha demostrado que SNAT5 no se encuentra en las terminales glutamatérgicas, sino en la membrana de los astrocitos que envuelven a las sinapsis excitadoras, ésta situación parece adecuada para intervenir en la salida de glutamina desde las células de la glía en dirección a las neuronas. Recientemente se ha establecido una importante conexión entre este transportador y el tratamiento de enfermedades como la esquizofrenia (Javitt, et al., 2005). El esclarecimiento de los mecanismos moleculares por los que actúan estos transportadores de baja afinidad podría ayudar a identificar nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevos fármacos, así como conocimiento básico importante para el desarrollo del sistema nervioso.

METODOLOGÍARatas Sprague Dawley embrionarias de 14, 16 y 18 días de gestación, así como ratas post-natales de 0, 7, 12, 21 y 60 días se sacrificaron para obtener los encéfalos que fueron fijados con paraformaldehido al 4%. Una vez fijados se sumergieron en sacarosa para crioprotegerlos y posteriormente se realizaron cortes de 12 micras en un crióstato Leica.

Los cortes fueron sometidos a inmunohistoquímica para lo cual se lavaron tres veces con PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente; enseguida se sometieron a 2 bloqueos, el primero de ellos empleando una solución de peróxido de hidrógeno al 1% por una hora con el fin de inactivar la actividad endógena de las peroxidasas, el segundo utilizando una solución de leche descremada sin grasa (BIO-RAD) al 3% en buffer PBT por 2 horas con la intención de bloquear sitios de unión inespecíficos. Después de cada bloqueo los cortes se lavaron tres veces con PBT durante 10 minutos y se aplicó el anticuerpo policlonal primario SNAT5 producido en guinea pig con el que se incubó toda la noche a 4°C.

Al segundo día, se retiró el anticuerpo policlonal primario y se lavaron los cortes tres veces con PBT durante 10 min. Luego se incubaron con el anticuerpo policlonal secundario antiguinea pig acoplado a peroxidasa y se revelaron con una solución de 3,3´-diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno en buffer PBS. Terminado este procedimiento se montaron las laminillas con glicerol y observaron los cortes para su análisis.

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RESULTADOSEn este trabajo se pretendió conocer la presencia del transportador SNAT5 durante la ontogenia, que pueda dar pauta, a explorar la posible participación de la glutamina en la diferenciación celular, para ello, se estudió la distribución regional y diferencial del transportador de glutamina SNAT5, en cortes coronales de encéfalos de ratas embrionarias E14, E16, y E18 (figura 2) y postnatales P0, P7, P12, P21 y P60 (figura 1) por inmunohistoquímica. Los resultados indican la presencia del transportador en la corteza en embriones E14, E18 y en post-natal 7. Sin embargo en otra región como el hipotálamo, la marca fue observada en los encéfalos embrionarios estudiados y en encéfalos postnatales P0 y P7.

FIGURA 1: FOTOMICROGRAFÍAS DE LA INMUNOTINCIÓN EN CORTES CORONALES DE ENCÉFALOS DE RATAS POSTNATALES SPRAGUE DAWLEY. A) En los cortes control y blanco de las inmunohistoquímicas de encéfalos de rata no se presentó señal inmunorreactiva. B) Se observa la corteza cerebral de una rata postnatal P0, en la cual no hubo señal inmunorreactiva para SNAT5. C) Se observa el hipotálamo de una rata post-natal P0, en el cual se observa señal inmunorreactiva para SNAT5. D) Resultados de la corteza cerebral de una rata postnatal P7, en la cual hubo inmunotinción. E) Se observa el hipotálamo de un encéfalo postnatal P7, en el que hubo inmunotinción para SNAT5.

FIGURA 2: FOTOMICROGRAFÍAS DE LA INMUNOTINCIÓN EN CORTES CORONALES DE ENCÉFALOS DE RATAS EMBRIONARIAS SPRAGUE DAWLEY. A) En la corteza cerebral de encéfalos embrionarios E14 se observó señal inmunorreactiva para SNAT5. B) Se observa el hipotálamo de una rata embrionaria E14, en el que hubo inmunotinción para SNAT5. C) En la corteza cerebral de encéfalos embrionarios E16, no se presentó señal inmunorreactiva.

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A B D EC

A B C D E

D) En el hipotálamo de encéfalos embrionarios E16, se encontró inmunotinción para SNAT5. E) En la corteza cerebral de encéfalos embrionarios E18 se observó marca inmunorreactiva.

CONCLUSIONESEl transportador de glutamina SNAT5 se presenta en las regiones de la corteza cerebral e hipotálamo durante la ontogenia del sistema nervioso de rata. Sin embargo, la señal inmunorreactiva para la corteza solo se observó en embriones de 14 y 18 días y en encéfalos de ratas postnatales de 7 días. En la zona del hipocampo la marca inmunorreactiva para SNAT5, se presentó en los encéfalos embrionarios que fueron estudiados y en encéfalos postnatales de P0 y P7 días. Los resultados de este trabajo son importantes por el aporte de nuevo conocimiento al desarrollo del sistema nervioso.

BIBLIOGRAFÍA

Bonet, A, Grau T. 2007. Glutamine, an almost essential amino acid in the critically ill patient. Med. Intensive: Vol. 37:

Javitt, D. C., Duncan L., Balla, A., Sershen, H. 2005. Inhibition of system A-mediated glycine transport in cortical synaptosomes by therapeutic concentrations of clozapine: implications for mechanisms of action. Mol Psychiatry: Vol.10:275-87.

Mackenzie, B., Erickson J. D. 2004. Sodium-coupled neutral amino acid (System N/A) transporters of the SLC38 gene family. Eur J Physiol: Vol 447:784–795.

González, G. I. 2007. Estudios sobre la localización y tráfico de los transportadores de las sinapsis glutamatérgicas SNAT2, SNAT5 Y GLT1. Madrid, España. Universidad Autónoma de Madrid. Memoria para obtener el grado de doctora en ciencias: 49-54.

Cubelos, B. González, G. I. Giménez, C., Zafra, F. 2005. Amino acid transporter SNAT5 localizes to glial cells in the rat brain. Glia: Vol. 49: 230-244.

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