Agrobacterium Mediated-plant Transformation the Biology Behind the Gene-jockeying Tool

5/12/2018 Agrobacterium Mediated-plant Transformation the Biology Behind the Gene-jockeying Tool - slidepdf.com

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Mediada por Agrobacterium transformación de la planta: la biología detrásde la "Gene-Las maniobras" Herramienta

INTRODUCCIÓN

Veinticinco años atrás, el concepto de la utilización de Agrobacteriumtumefaciens como vector para crear plantas transgénicas fue visto comouna perspectiva y un "deseo". Hoy en día, muchos agronómica y hortícolaespecies importantes son sistemáticamente transformados con estabacteria, y la lista de especies que son susceptibles de transformaciónmediada por Agrobacterium parece crecer día a día. En algunos paísesdesarrollados, un alto porcentaje de la superficie de cultivoseconómicamente importantes tales como maíz, soja, algodón, canola,patatas y tomates es transgénica, un número creciente de estas variedades

transgénicas son o pronto serán generados por Agrobacterium, en lugar debombardeo de partículas mediada por la transformación. Todavía quedan,sin embargo, muchos desafíos para el genotipo independiente de latransformación de muchas especies de cultivos de importancia económica,así como las especies forestales utilizadas para madera, papel y celulosa.Además, la expresión predecible y estable de los transgenes sigue siendoproblemática. Varios excelentes críticas han aparecido recientemente quedescriben en detalle los aspectos diversos de la biología de Agrobacterium.

En esta revisión, se describe cómo los científicos utilizan el conocimiento de

la biología básica de Agrobacterium Agrobacterium para el desarrollo comouna "herramienta" para la ingeniería genética de plantas. También explorocómo nuestra creciente comprensión de la biología de Agrobacterium puedeayudar a prolongar la utilidad de la transformación mediada porAgrobacterium. Es mi creencia de que las mejoras en la tecnología detransformación implicará necesariamente la manipulación de estos procesosbiológicos fundamentales.

AGROBACTERIUM

"especie" y rango de hospederos

El género Agrobacterium se ha dividido en una serie de especies. Sinembargo, esta división se ha reflejado, en su mayor parte, la enfermedad yla sintomatología rango de hospederos. Así, A. radiobacter es un "virulento"de especies, A. tumefaciens causa la enfermedad de agalla de la corona, A.rhizogenes causa la enfermedad de raíz peluda, y A. rubi causa laenfermedad de la caña de la vesícula. Más recientemente, una nuevaespecie ha sido propuesta, A. vitis, lo que provoca agallas en las uvas yalgunas otras especies de plantas (244). Aunque Manual Bergey deBacteriología Sistemática aún refleja esta nomenclatura, la clasificación es

complejo y confuso, ahora sabemos que los síntomas se deben, en su mayor



parte, el tipo de tumorigénico plásmido contenido dentro de una cepa enparticular.

Curar un determinado plásmido y la sustitución de este plásmido con otrotipo de tumorigénico plásmido puede alterar los síntomas de la enfermedad.

Por ejemplo, la infección de las plantas con A. tumefaciens C58, quecontiene la nopalina tipo de plásmido Ti pTiC58, los resultados en laformación de teratomas agalla de la corona. Cuando este plásmido se cura,la cepa se convierte en patógena. Introducción de plásmidos Ri en la cepacurada "convierte" la bacteria en una cepa rizogénica (191, 358). Además,se puede introducir un Ti (inductor de tumores) plásmido de A. tumefaciensen A. rhizogenes, la cepa resultante incita a los tumores de la alteración dela morfología de las plantas Kalanchoe (53). Por lo tanto, ya que A.tumefaciens puede ser "convertida" en A. rhizogenes la simple sustituciónde un tipo oncogénico del plásmido por otro, el término "especie" carece de

sentido. Tal vez un sistema de clasificación más significativa divide el géneroAgrobacterium en "biotipos", basada en el crecimiento y las característicasmetabólicas (171). El uso de este sistema, la mayoría de A. tumefaciens y A.rubí (316) pertenecen a cepas biovar I, A. rhizogenes cepas encajar enbiovar II y biovar III está representado por las cepas de A. vitis. Másrecientemente, un nuevo sistema de clasificación taxonómica para elgénero Agrobacterium se ha propuesto (374). La reciente finalización de lasecuencia de ADN de todo el genoma de A. tumefaciens C58 (que secompone de una lineal y un cromosoma circular, un plásmido Ti, y otro granplásmido [114, 115, 363]) puede proporcionar un punto de partida para lareclasificación de Agrobacterium "tensiones" en un verdadero "especie".

A pesar de la confusión actual en la clasificación de las especies, a los finesde ingeniería genética de plantas, el aspecto más importante puede ser lagama de huéspedes de diferentes cepas de Agrobacterium. Como género,Agrobacterium puede transferir ADN a un grupo muy amplio de organismos,incluyendo numerosas especies de angiospermas dicotiledóneas ymonocotiledóneas (12, 68, 262, 341) y gimnospermas (198, 206, 215, 228,307, 357, 371). Además, Agrobacterium puede transformar los hongos, así

como las levaduras (32, 33, 260), ascomicetos (1, 71), y basidiomicetos(71). Recientemente, se informó Agrobacterium para transferir ADN a lascélulas humanas (187).

Las bases moleculares y genéticas de la gama de huéspedes de una cepade Agrobacterium dado no está claro. Los primeros trabajos indican que losgenes del plásmido Ti, en lugar de los cromosomas, era el principaldeterminante genético de la gama de los huéspedes (207, 315). Varios devirulencia (vir) loci en el plásmido Ti, incluyendo Virc (367, 368) y VirF (220,267), se muestra para determinar el rango de especies de plantas que

pueden ser transformados para producir tumores agalla de la corona. El virH(antes llamado PINF) lugar parecía estar implicado en la capacidad deAgrobacterium para transformar el maíz, según lo establecido por un ensayo



en el que los síntomas de la infección por virus del rayado del maíz sedeterminaron los siguientes agroinoculation de las plantas de maíz (153).Otros genes vir, incluyendo virG, contribuir a la "hypervirulence" dedeterminadas cepas (41, 146).

Sin embargo, ahora está claro que van de acogida es un proceso muchomás complejo, que está bajo el control genético de múltiples factores, tantodentro de la bacteria y la planta huésped. La única forma para los ensayosde transformación puede afectar la forma en un rango de hospederospuntos de vista. Por ejemplo, muchas especies de plantasmonocotiledóneas, incluyendo algunas variedades de gramíneas como elmaíz (152), arroz (39, 40, 85, 139, 265, 321), cebada (317), y el trigo (42),ahora pueden ser genéticamente transformado por muchas cepas deAgrobacterium con el fenotipo de resistencia a los herbicidas o antibióticos.Sin embargo, estas especies de plantas no soportan el crecimiento de

tumores agalla de la corona.

Figura. 1. Representación esquemática de un típico plásmido octopina detipo Ti (A) y la región de T-ADN de una típica octopina de tipo plásmido Ti(B). (A) El ADN-T se divide en tres regiones. TL (T-ADN de la izquierda), TC(T-ADN centro) y TR (T-ADN de la derecha). El círculo negro indica T-DNA desecuencias repetidas frontera. oriV, el origen vegetal de la replicación delplásmido Ti, se indica mediante un círculo blanco. (B) Los distintos T-ADNcodificada transcripciones, y su sentido de la transcripción, se indican con

flechas. Los genes que codifican las funciones implicadas en la síntesis deauxina (auxina), la síntesis de citoquininas (CyT), y la síntesis de la octopinaopina (OCS), manopina (MAS), y agropina (AGS) se indican.

Gama de huéspedes más puede resultar de la interacción de determinadosplásmidos Ti con ciertos antecedentes cromosómicas bacterianas. Porejemplo, el pTiBo542 plásmido Ti, cuando en su huésped natural cepa A.tumefaciens Bo542, dirige potencial tumorigénico limitada cuando seensaya en muchas especies de plantas leguminosas. Sin embargo, cuandose coloca en el fondo C58 cromosómicas, pTiBo542 dirige virulencia fuerte

hacia la soja y otras leguminosas (143). Finalmente, la susceptibilidad a laenfermedad de la agalla de corona tiene una base genética encucurbitáceas (292), guisantes (272), soja (15, 214, 246), y la vid (312) eincluso entre diferentes ecotipos de Arabidopsis thaliana (231). Lasfunciones de los genes de virulencia bacteriana y los genes de acogida en elproceso de transformación, y las formas en las que posiblemente puedenser manipulados para propósitos de ingeniería genética, se analizan acontinuación.

BASES MOLECULARES DE LA transformación mediada por Agrobacterium

¿Qué es el ADN-T?



La base molecular de la transformación genética de las células vegetalespor Agrobacterium es la transferencia de la bacteria y la integración en elgenoma de la planta nuclear de una región de un gran inductor de tumores(Ti) o rizogénica (Ri) residente en el plásmido de Agrobacterium (Fig. 1A).Plásmidos Ti son del orden de 200 a 800 kpb de tamaño (81, 100, 111, 114,

145, 166, 175, 177, 245, 250, 251, 261, 311, 332, 342, 363). El ADNtransferido (T-ADN) (Fig. 1B) se conoce como la región T, cuando seencuentra en el plásmido Ti o Ri. T-regiones en Ti nativos y los plásmidos Rison aproximadamente 10 a 30 kpb de tamaño (17, 34, 197, 311, 378). Porlo tanto, T-regiones por lo general representan menos del 10% del plásmido

Ti. Algunos plásmidos Ti contienen una región T, mientras que otroscontienen múltiples T-regiones (17, 311). El procesamiento de los tDNA delplásmido Ti y su posterior exportación de la bacteria a la célula de la plantaresultado en gran parte de la actividad de la virulencia (vir) los genestransportados por el plásmido Ti (106, 147, 148, 174, 208, 303 ).

T-regiones están definidas por secuencias borde del ADN-T. Estos límitesson de 25 pb de longitud y altamente homóloga en secuencia (167, 366).Que flanquean la región T en una orientación directa repetida (257, 276,335, 345, 352). En general, los bordes del T-ADN delimitar el T-ADN (véasemás adelante para las excepciones), ya que estas secuencias son el blancode la frontera específica VirD1/VirD2 endonucleasa que procesa el ADN-Tdel plásmido Ti. Parece haber una polaridad establecida entre T-ADN de lasfronteras: las fronteras de la derecha que inicialmente parecía ser másimportante que las fronteras de la izquierda (136, 156, 286, 352, 353).

Ahora sabemos que esta polaridad puede ser causada por varios factores.En primer lugar, no las secuencias de las fronteras sólo sirven como blancopara la endonucleasa VirD1/VirD2 sino también servir como sitio de unióncovalente de la proteína VirD2.

En el plásmido Ti o Ri (o T-ADN de vectores binarios [ver abajo]), T-ADN delas fronteras se componen de ADN de doble cadena. La escisión de lassecuencias frontera doublestranded requiere VirD1 y VirD2 proteínas, tantoin vivo (82, 99, 155, 369) e in vitro (281). In vitro, sin embargo, VirD2proteína por sí sola puede romper una sola hebra de ADN-T secuencia de lafrontera (154, 249). La escisión de los resultados de la frontera de 25 pb de

ADN-T sobre todo de la formación de muescas de la T-DNA "menor cadena",como convencionalmente se presentan, entre los nucleótidos 3 y 4 de lasecuencia de la frontera (301, 353). Sin embargo, la doble cadena dedivisión de la frontera de T-ADN también se ha observado (155, 305, 344).Muescas de la frontera está asociado con el firme (probablementecovalentes) la vinculación de la proteína VirD2, a través de la tirosina 29(351), al final 5 de la resultante singlestranded T-molécula de ADNdenominado T-hilo (91, 99, 137, 150, 355, 373).

Este es el T-cadena, y no una doble cadena de ADN-T molécula, que se

transfiere a la célula vegetal (318, 375). Por lo tanto, es la proteína VirD2adjunto a la orilla derecha, y no la secuencia de la frontera en sí misma, que



establece la polaridad y la importancia de las fronteras de la derecha enrelación a las fronteras de la izquierda. Cabe señalar, sin embargo, quedebido a que la izquierda de la frontera mellar también se asocia con VirD2apego a la molécula restante (el "no-T-ADN" de la Ti "columna vertebral" delplásmido o de una región del vector binario T-DNA [ 91]), es posible que el

proceso T-hilos de estas regiones de Ti y los plásmidos Ri y de vectoresbinarios T-ADN (182, 264, 356). El problema de los vectores detransferencia de "espina dorsal" de secuencia para las plantas se discute acontinuación.

En segundo lugar, la presencia de T-ADN "overdrive" secuencias de cerca demuchos de T-ADN bordes derecho, pero no las fronteras a la izquierda,también puede ayudar a establecer la polaridad funcional de los bordesderecho e izquierdo. Secuencias Overdrive mejorar la transmisión de la T-hilos para las plantas, aunque el mecanismo molecular de cómo ocurre esto

sigue siendo desconocido (131, 156, 256, 291, 336, 337, 345). Los primerosreportes sugieren que la proteína VirC1 une a la secuencia overdrive ypuede mejorar el T-ADN división fronteriza por la endonucleasa VirD1/VirD2(322). virC1 y virC2 funciones son importantes para la virulencia, lamutación de estos genes da lugar a la pérdida de virulencia en muchasespecies de plantas (299). Sin embargo, varios laboratorios han señaladoque la T-cadena de producción en Virc cepas mutantes de Agrobacterium seproduce en los niveles de tipo salvaje (301, 344). Por lo tanto, cualquierefecto de Virc debe ser posterior a T-ADN de procesamiento.

¿Cómo se trata T-ADN transferido de las células vegetalesAgrobacteriumto?

Como se ha indicado anteriormente las proteínas, codificadas por muchosgenes vir juegan un papel esencial en el proceso de transformaciónmediada por Agrobacterium. Algunas de estas funciones se han discutido envarios artículos de revisión excelente (44, 109, 325, 327, 328, 384), y por lotanto, limitaré mi descripción de las funciones de las proteínas Vir quepueden servir como puntos de manipulación para la mejora de el proceso detransformación.

Proteínas vira y Virg función como miembros de una twocomponentsensorial de transducción de señales reguladoras del sistema genético. Viraes una antena periplásmico que detecta la presencia de determinadoscompuestos fenólicos de plantas que son inducidos por heridas (3, 87, 162,195, 303, 324, 359). En coordinación con el ChvE transportador demonosacáridos y en presencia de los fenólicos apropiado y moléculas deazúcar, autophosphorylates Vira y posteriormente transphosphorylates laproteína Virg (160, 161). Virg en forma nonphosphorylated está inactivo, sinembargo, en la fosforilación de la proteína ayuda a activar o aumentar elnivel de la transcripción de los genes vir, muy probablemente por la

interacción con secuencias de caja de vir-que forman un componente de lospromotores de genes vir (59, 60, 252). Proteínas vira y Virgconstitutivamente activa que no requieren inductores fenólicos de la



actividad, o de las proteínas que interactúan Virg de forma más productivacon las secuencias de caja de vir-para activar la expresión de genes vir,puede ser útil para aumentar la eficiencia de transformación conAgrobacterium o rango de hospederos. Los experimentos se describenalgunos intentos de manipulación de Vira y / o Virg para estos fines se

discuten a continuación.

Junto con la proteína VirD4, el 11 proteínas virB conforman un sistema desecreción tipo IV necesarios para la transferencia del T-ADN y otrasproteínas Vir, incluyendo VirE2 y VirF (44, 349). VirD4 puede servir como un"conector" para promover la interacción de los procesados ??T-DNA/VirD2complejo con el aparato de secreción virB codificados (126). La mayoría delas proteínas virB una u otra forma el canal de la membrana o servir comoATPasas para proporcionar energía para el montaje del canal o los procesosde exportación. Varias proteínas, incluyendo VirB2, VirB5 y VirB7

posiblemente, hacer que el T-pilus (94, 163, 189, 190, 278, 283). VirB2, quese procesa y se cicla, es la proteína pilin principales (94, 163, 189, 190). Lafunción del pilus de T-ADN de transferencia aún no está claro, ya que puedeservir como conducto para el T-ADN y la transferencia de proteínas Vir, osimplemente puede funcionar como un "gancho" para apoderarse de lacélula de la planta receptora y llevar a las bacterias y las plantas en lasproximidades de efectuar la transferencia molecular. Uno de los aspectos dela biología pilus que pueden ser importantes para la transformación es lalabilidad de la temperatura. A pesar de la inducción de genes vir es máximaen aproximadamente 25 a 27 ° C (8, 162, 323), el pilus de algunos, pero no

todas, las cepas de Agrobacterium es más estable a temperaturas másbajas (aproximadamente 18 a 20 ° C) (18, 105 , 188). Los primerosexperimentos de Riker indica un efecto de la temperatura de transformación(268). Por lo tanto, se puede considerar cocultivating Agrobacterium con lascélulas vegetales a temperaturas más bajas durante los primeros díasalgunos de los procesos de transformación.

El VirD2 y VirE2 proteínas juegan un papel esencial y complementaria talvez en transformación mediada por Agrobacterium. Estas dos proteínas sehan propuesto para constituir, con el T-cadena, una "T-complejo" que es laforma de transferir el ADN-T (149). Si este complejo reúne dentro de la

bacteria sigue siendo controvertido. Citovsky et al. (50) demostró que VirE2podría funcionar en una célula vegetal: VirE2 transgénicos que expresan lasplantas de tabaco podrían "complementar" la infección por una cepamutante virE2 Agrobacterium. Varios laboratorios han demostrado queVirE2 puede transferir a la célula vegetal en ausencia de un T-hilo (27, 193,244, 309, 349), y es posible que VirE2 complejos con el T-cadena, ya sea enel canal de exportación de bacterias o dentro de la célula vegetal. Uninforme reciente sugiere que tal vez otro papel para VirE2 temprano en elproceso de exportación: Dumas et al. (90) demostró que VirE2 podríaasociar con membranas artificiales in vitro y crear un canal para el

transporte de moléculas de ADN. Por lo tanto, es posible que una función de



VirE2 es para formar un poro en la membrana citoplasmática de plantaspara facilitar el paso de la T-cuerda.

Debido a su apego a la final 5 de la T-hebra, VirD2 puede servir como unaproteína piloto para guiar a los T-hilo a través del aparato y el tipo de

exportación IV. Una vez en la célula vegetal, VirD2 puede funcionar en lospasos adicionales del proceso de transformación. VirD2 contiene la señal delocalización nuclear (NLS) secuencias que pueden ayudar a dirigirlo y eladjunto de T-ADN al núcleo de la planta. El NLS de VirD2 puede dirigirfusionado proteínas periodista e in vitro-ensamblados T-complejos a losnúcleos de las células vegetales, animales y hongos (48, 119, 138, 151,185, 186, 229, 319, 326, 381, 382 ). Además, VirD2 puede asociar con unnúmero de Arabidopsis importina proteínas de una manera dependiente deNLS, tanto en la levadura e in vitro (16, S. Bhattacharjee y Gelvin SB, datosno publicados). Importina-es un componente de una de las vías de

transporte de proteínas nucleares se encuentran en los eucariotas. Losdatos más recientes, sin embargo, sugieren que VirD2 puede no sersuficiente para dirigir T-hilos del núcleo. Ziemienowicz et al. (382) mostróque en las células permeabilizadas, VirD2 podría afectar a los ataquesnucleares de pequeña oligonucleótidos ligados generados in vitro, pero nopudo dirigir el transporte nuclear de moléculas más grandes ligados. Paraalcanzar objetivos nucleares de estas moléculas más grandes, VirE2 ademástuvo que ser asociado con el T-capítulos. Por último, VirD2 pueden jugar unpapel en la integración del T-ADN en el genoma de la planta. Variasmutaciones en VirD2 puede afectar tanto a la eficiencia (229) o la

"precisión" (320) de T-ADN de integración.El papel de VirE2 de T-ADN de transporte nuclear sigue siendo polémica.VirE2 es una proteína no-secuencia específica de ADN de cadena sencilla deunión (45, 46, 49, 112, 286). En las células de Agrobacterium, VirE2probablemente interactúa con la chaperona molecular VirE1 y por tanto noestarán disponibles para obligar a T-hilos (77, 84, 310, 380). Sin embargo,cuando se unen a ADN de cadena sencilla (tal vez en la célula vegetal?),VirE2 puede alterar el ADN de una conformación al azar de la bobina a unaforma que se asemeja a un cable de teléfono en espiral (47). Esta formaalargada puede ayudar a dirigir la T-cadena a través del poro nuclear. VirE2

también contiene secuencias NLS que puede dirigir proteínas fusionadasreportero a los núcleos de las plantas (48, 50, 326, 383). Al igual que conVirD2, VirE2 interactúa en la levadura con Arabidopsis importina lasproteínas de una manera dependiente de NLS (Bhattacharjee y Gelvin,inédito). Un informe indica que VirE2 obligado a ADN de cadena sencilla yde microinyección en células vegetales puede dirigir el ADN en el núcleo(381). Sin embargo, otros informes demuestran que no puede dirigir VirE2obligado ADN de cadena sencilla a los núcleos de cualquiera de las célulasvegetales o animales que se permeabilized con el fin de llevar a cabo laabsorción de ADN (380). La causa de estos resultados contradictorios no

está claro, pero puede reflejar diferencias en los tipos de células y sistemasde entrega de ADN utilizados por los dos grupos. Cuando T-ADN se entrega



a las células vegetales de las cepas de Agrobacterium que codifica unaforma mutante de VirD2 contiene una supresión precisa de la NLS, hay a losumo, una disminución del 40% en la eficiencia de transformación (229,233, 290). Plantas transgénicas que expresan VirE2 puede complementaruna cepa doble mutante que carece de Agrobacterium virE2 y contiene una

supresión en la región de codificación de NLS virD2 (110). Estos resultadossugieren que en ausencia de las secuencias NLS VirD2, otro mecanismonuclear objetivo (tal vez VirE2) puede tener lugar.

Cuando se une al ADN, los motivos de NLS VirE2 puede ser ocluido einactivos. Esto se debe a los dominios de NLS y la unión al ADN de VirE2superposición (50). Grupo de Hohn ha hipótesis de que la función principalde VirE2 en el transporte nuclear es independiente y que NLS VirE2 sólo daforma a la T-cadena para que pueda serpentean a través de los porosnucleares (274). Mayor controversia implica la capacidad de VirE2 proteínas

para localizar a los núcleos de las células animales. Ziemienowicz et al.(381) mostró que en permeabilized células HeLa, octopina tipo VirE2 podríaapuntar al núcleo, mientras que en la microinyección de Drosophila ycélulas de Xenopus, la secuencia NLS de nopalina tipo VirE2 tuvo que sercambiado a fin de efectuar la localización nuclear de la proteína alterada(50). Aunque la razón de esta discrepancia no se conoce, no es probableque los resultados de la utilización de octopina contra nopalina tipo VirE2por los dos grupos (326).

Por último, VirE2 puede proteger T-hebras de la degradación nucleolytic quepuede ocurrir tanto en el citoplasma de las plantas y tal vez en el núcleo(274, 374). La existencia de un T-complejo formado por una sola moléculade VirD2 covalentemente al extremo 5 de la T-hebra, que a su vez estárecubierto por VirE2 moléculas, por lo general ha sido aceptado por lacomunidad de investigación Agrobacterium (149). Sin embargo, el lectordebe ser consciente de que este complejo no ha sido identificado, ya sea enAgrobacterium o células de las plantas. Es posible que otras proteínas,como importins (16), VIP1 (329), e incluso VirF (285), además, puedeninteractuar, ya sea directa o indirectamente, con el T-cadena para formargrandes complejos de T en la célula vegetal .

Aunque el papel de los genes vir Ti plásmidos codifican a menudo ha sidoconsiderado de importancia primordial para la transformación, muchos delos genes cromosómicos Agrobacterium también son esenciales para esteproceso. El papel de los genes de los cromosomas se estableció por primeravez por mutagénesis aleatoria inserción de todo el genoma deAgrobacterium (106). La investigación adicional se definen las funciones demuchos de estos genes. Entre estas funciones están la producción deexopolisacáridos, modificación, y la secreción (PSCA / exoC, chvA y chvB[36, 37, 88, 89, 313]) y otros papeles en la adhesión bacteriana a las célulasde las plantas (genes att [212, 213] ), los transportistas de azúcar que

participan en coinduction de los genes vir (chvE [86, 172, 289]), laregulación de la inducción de genes vir (chvD [204]), y T-ADN de transporte



(ACVB [168, 248, 360, 361, 362 ]). Otros genes, como MIAA (116), tambiénpueden desempeñar un papel más secundario en el proceso detransformación. El esclarecimiento reciente de la A. tumefaciens C58 todala secuencia (114, 363) seguramente será un terreno fértil para eldescubrimiento de nuevos genes implicados en la transformación mediada

por Agrobacterium.

MANIPULACIÓN DE AGROBACTERIUM DE INGENIERÍA GENÉTICA CONFINES

Introducción de genes en las plantas mediante Agrobacterium

Años antes que los científicos dilucidar el mecanismo molecular de latransformación mediada por Agrobacterium de las plantas, Armin Braunpropuso el concepto de un "principio de la inducción de tumores", que fuetrasladado de manera estable y se propaga a en el genoma de la planta

(30). La investigación en la década de 1970 resultó en la identificación delos grandes plásmidos en cepas virulentas de Agrobacterium (376), aunqueahora sabemos que muchas cepas contienen plásmidos relacionados con lavirulencia. Los experimentos genéticos indican que una clase particular deplásmidos, el Ti (y más tarde Ri) plásmidos, fueron los responsables de latumorigénesis (339) y que una parte de estos plásmidos, el T-ADN, fuetransferido a las células vegetales y se incorporan en el genoma de laplanta (43). Era, pues, evidente para proponer que los plásmidos Ti serutilizado como vector para introducir genes extraños en células vegetales.

Sin embargo, los plásmidos Ti son muy grandes y de T-ADN regiones por logeneral no contienen sitios únicos de restricción de endonucleasa que no seencuentran en otras partes del plásmido Ti. Por lo tanto, uno no puedesimplemente clonar un gen de interés en la T-región. Por lo tanto, loscientíficos desarrollaron una serie de estrategias para la introducción degenes extraños en el ADN-T. Estas estrategias implicadas dos enfoquesdiferentes: la clonación del gen, por medios indirectos, en el plásmido Ti detal manera que el nuevo gen fue en cis con los genes de virulencia en elmismo plásmido, o clonar el gen en un T-región que estaba en una porseparado replicón de los genes vir (T-ADN de vectores binarios).

Se utilizaron dos métodos para la clonación de ADN extraño en el plásmido Ti. El primer método se basa en una estrategia desarrollada por Ruvkin yAusubel (277) (Fig. 2). Una región del ADN (ya sea la T-región o región deADN específicas para la ruptura), que contiene sitios únicos de restricción deendonucleasa se clona en una amplia gama de hospedadores plásmido, talcomo un vector basado en IncP. Estos plásmidos pueden replicarse tanto enEscherichia coli, en el que la clonación inicial se lleva a cabo, y en elAgrobacterium. El gen exógeno de interés, junto con un marcador deresistencia a los antibióticos, es el siguiente clonado en un sitio deendonucleasa de restricción únicos en la región de destino de ADN. Por otra

parte, un gen de resistencia a los antibióticos pueden ser introducidos en elfragmento de ADN de interés por la transposición (107, 297). El plásmido



resultante se introduce en Agrobacterium por conjugación o transformación.La presencia de este plásmido en Agrobacterium se confirma con laselección de resistencia a los antibióticos codificada por tanto el esqueletodel vector plásmido y el marcador de resistencia cerca del gen de interés. Acontinuación, otro plásmido del grupo de incompatibilidad mismo que el

primer plásmido, pero alberga otro marcador de resistencia a losantibióticos, se introduce en la cepa de Agrobacterium que contiene elprimer plásmido. Las bacterias resultantes se colocan en medio deantibióticos que contienen a seleccionar para el segundo (el desalojo)plásmido y el marcador de resistencia al lado del gen de interés. Debido aque los plásmidos del grupo de incompatibilidad mismo por lo general nopuede coreside dentro de la célula bacteriana misma, las bacterias puedenvolverse resistentes a ambos antibióticos sólo si (i) la cointegrates primerplásmido en el plásmido Ti y utiliza el oriV del plásmido Ti de replicar o (ii)un intercambio de ADN en el plásmido primero y el plásmido Ti se produce

por doble recombinación homóloga (homogenotization) utilizandosecuencias homólogas en el plásmido Ti que flanquean ambos lados del gende interés, más el marcador de resistencia. En el primer caso (cointegracióndel plásmido entero con el plásmido Ti), el marcador de resistencia delesqueleto del plásmido se expresaría, estas bacterias son examinados paradetectar y desechar. En el segundo caso (homogenotization), el marcadorde resistencia codificada por el esqueleto del plásmido se pierde. Doblerecombinación homóloga puede ser confirmado por análisis de ADN blot deADN total de la cepa resultante (107). Una variante de este procedimientoutiliza un gen sacB en el esqueleto del plásmido del primer plásmido. Sólo la

eliminación de la columna vertebral del plásmido después dehomogenotization hace que la bacteria resistente al crecimiento de lasacarosa (194).

Otro método para introducir ADN extraños en la región T del plásmido Tiimplica en primer lugar la introducción de un replicón ColE1, tales comopBR322, en la región T de un plásmido Ti. De ADN para ser integrados en el

T-región se clona en un aparte pBR322 derivado de molécula que contieneun segundo marcador de resistencia a antibióticos. Este plásmido seintroduce en la alteración de la tensión de Agrobacterium, y la tensión

resultante es seleccionado para la resistencia a los antibióticos segundos.Porque ColE1 replicones no puede funcionar en Agrobacterium, el plásmidopBR322 basada tendría que cointegran en el segmento de pBR322 de laalteración de T-región de la expresión estable del gen de resistenciacodificada por plásmidos (379). Una modificación de este procedimiento seutilizó para desarrollar el "split-vector final" del sistema. El uso de estesistema, un gen de interés se clona en un vector basado en pBR322 quecontiene un borde derecho del T-ADN, un gen quimérico que nos-nptII parala selección de las plantas transgénicas, un marcador de resistencia a laespectinomicina, estreptomicina para seleccionar a la presencia de laplásmido de Agrobacterium, y una región de homología con una parte nooncogénico de octopina de tipo T-región. Cointegración del plásmido con unplásmido Ti falta un borde derecho, pero que contienen el ADN-T región



homóloga restaura la actividad fronteriza y se localiza el gen de interés y elmarcador de la planta puede seleccionar dentro de la reconstituida región T(101).

Cada uno de estos métodos de integración cis-tiene ventajas y desventajas.

La primera estrategia puede dirigirse al gen ajeno a cualquier parte de laregión T (u otra región en el plásmido Ti). Sin embargo, es complicado derealizar y consiste en un tanto sofisticados procedimientos genéticosmicrobianos que muchos laboratorios rechazados. El segundo método estécnicamente más fácil, pero permite cointegración del gen foráneo sólo en

Ti-plásmido pBR322 lugares donde habían sido colocadas anteriormente. Sinembargo, una modificación de este procedimiento permite cointegración deun plásmido pBR322 basada en cualquier región del plásmido Ti (338, 377).Una de las ventajas de ambos sistemas es que mantienen el gen extraño enel número de copias del mismo bajo que el del plásmido Ti de

Agrobacterium.Figura. 2. Representación esquemática de los pasos involucrados en lasustitución de genes por doble recombinación homóloga (homogenotization[107, 277]). Las líneas verdes representan las regiones seleccionadas parala ruptura. (A) Un gen de resistencia a los antibióticos (en este caso, quecodifica una lactamasa que confiere resistencia a carbenicilina) se hainsertado en el gen diana que ha sido clonado en un plásmido IncP (quecontiene un gen de resistencia a kanamicina [kan] en su columna vertebral)e introducido en Agrobacterium. Doble recombinación homóloga se lepermite tomar su lugar. (B) Después de doble recombinación homóloga, elgen alterado se intercambia en el plásmido Ti (PTI). (C) Un plásmido delgrupo de incompatibilidad mismo que el primer plásmido se introduce enAgrobacterium. Un ejemplo es el pPH1JI plásmido de la RIPC, que contieneun gen de resistencia a la gentamicina (Gent). (D) Debido a que losplásmidos del grupo de incompatibilidad mismo (en este IncP caso) nopuede replicar de forma independiente en la célula, al mismo tiempo, laselección de los resultados de resistencia a la gentamicina en el desalojo dela RIPC otro plásmido, en que se ha intercambiado el gen de tipo salvaje.

Debido a la complejidad de la introducción de genes foráneos directamente

en la región T de un plásmido Ti laboratorios, varias desarrollado unaestrategia alternativa a la utilización de Agrobacterium para entregar genesextraños a las plantas. Esta estrategia se basa en conclusionesfundamentales de Hoekema et al. (140) y de Frammond et al. (70). Estosautores determinaron que la región T y los genes vir se pueden separar endos replicones diferentes. Cuando estos replicones estaban dentro de lacélula de Agrobacterium mismo, los productos de los genes vir podría actuaren trans en la región T para llevar a cabo de T-ADN tratamiento y latransferencia de una célula vegetal. Hoekema et al. llamó a este sistemabinario-vector, el replicón que alberga la región T constituye el vector

binario, mientras que el replicón que contiene los genes vir que se conocecomo el ayudante de vir. El ayudante general vir plásmido contenía una



deleción total o parcial de la T-región, haciendo que las cepas que contieneneste plásmido no puede incitar a los tumores. Un número de cepas deAgrobacterium que contiene no oncogénico plásmidos auxiliares vir se handesarrollado, incluyendo LBA4404 (242), GV3101 MP90 (181), AGL0 (192),EHA101 y su cepa derivada EHA105 (144, 146), y NT1 (pKPSF2) (247 ).

T-ADN de vectores binarios revolucionado la utilización de Agrobacteriumpara introducir genes en las plantas. Los científicos, sin formaciónespecializada en genética microbiana ahora podría manipular fácilmenteAgrobacterium para crear plantas transgénicas. Estos plásmidos sonpequeños y fáciles de manipular, tanto en E. coli y Agrobacterium ygeneralmente contienen múltiples sitios únicos de restricción deendonucleasa en el T-región en la que los genes de interés podría serclonado. Muchos vectores se han diseñado para propósitos especiales, quecontienen marcadores de diferentes plantas seleccionables, promotores, y

poli (A) Además de las señales entre las que los genes de interés se podríaninsertar, potenciadores de traducción para aumentar la expresión de lostransgenes, y la proteína de metas de las señales para dirigir el transgén -proteína codificada a determinados lugares dentro de la célula de la planta(algún representante del T-ADN sistemas vector binario se describen en lasreferencias 10, 20, 25, 26, 62, 113, 120, 216, 364 y ??386 y en http://www .cambia.org). Hellens et al. (134) proporcionan un resumen de muchas cepasde A. tumefaciens y vectores de uso común para la ingeniería genética deplantas.

Aunque el término "sistema de vector binario" se utiliza generalmente paradescribir dos componentes (un componente del ADN-T y un componente deayuda de la boca), cada uno situado en un plásmido separado, la definiciónoriginal colocado los dos módulos sólo en replicones diferentes. Estosreplicones no necesariamente tienen que ser los plásmidos. Varios gruposhan demostrado que el ADN-T, cuando se encuentra en el cromosoma deAgrobacterium, se puede movilizar a las células vegetales por un ayudantevir plásmido (141, 224).

¿Cuánto ADN puede ser transferido de Agrobacterium para lasplantas?

El T-regiones de los plásmidos Ti y Ri naturales pueden ser losuficientemente grande como para codificar decenas de genes. Por ejemplo,el T-región de pTiC58 es de aproximadamente 23 kpb de tamaño. Además,algunos plásmidos Ti y Ri contienen múltiples T-regiones, cada una de lascuales se pueden transferir a las plantas de forma individual o encombinación (34, 314). Para los fines de ingeniería genética de plantas, loscientíficos deseen introducir en las grandes instalaciones de T-ADN con lacapacidad de codificar productos de múltiples genes en una vía biosintética.Por otra parte, la reintroducción de grandes regiones del genoma de una

planta en una planta mutante puede ser útil para identificar, por lacomplementación genética, los genes responsables de un fenotipoparticular. ¿Qué tamaño de T-región se pueden transferir a las plantas?



Miranda et al. (224) demostraron que mediante la inversión de laorientación de un borde derecho del T-ADN, que podría movilizar a todo unplásmido Ti, aproximadamente 200 kpb, en las plantas. Aunque el eventofue poco frecuente, este estudio demostró que las moléculas de ADN degran tamaño podrían ser introducidos en las plantas mediante

transformación Agrobacteriummediated. Hamilton et al. (124) demostró porprimera vez la transferencia dirigida de grandes moléculas de ADN deAgrobacterium a las plantas mediante el desarrollo de un sistema binarioBAC (BIBAC) del sistema. Estos autores mostraron que un inserto de 150kpb clonado del ADN humano podría ser introducido en las células vegetalesmediante el uso de este sistema. Sin embargo, la transferencia eficaz deeste segmento de ADN de gran tamaño requiere la sobreexpresión de uno oambos virG virG y Vire. VirE2 codifica una proteína de ADN de cadenasencilla vinculante que protege el ADN-T de la degradación en la célulavegetal (275). Porque virG es un activador de la transcripción de los

operones vir (303), expresión de copias de este gen vir regulación fuepensado para mejorar la expresión de proteínas Vir VirE2 y otrosinvolucrados en la transferencia de T-ADN. La sobreexpresión de Vireformado parte del sistema de BIBAC que se utilizó para transformar grandes(30 - 150 kpb) fragmentos de ADN en el tabaco y el tomate másrecalcitrantes y Brassica (56, 103, 123, 125). Sin embargo, la transferenciade diferentes tamaños T-ADN de varias cepas de Agrobacterium teníadiferentes requisitos para la sobreexpresión de virG y vire (103). Liu et al.(203, 204) desarrolló un sistema artificial transformationcompetent vectorcromosoma basado en un origen de replicación y P1 utiliza este sistema

para generar bibliotecas de gran tamaño (40 - 120 kpb) de Arabidopsis y lasmoléculas de ADN de trigo. Este sistema no requiere la sobreexpresión devirG o vire a efectuar la transferencia precisa de grandes fragmentos deArabidopsis.

Lo que el ADN es transferido desde Agrobacterium a las plantas?

T-ADN fue inicialmente definido como la parte (la región T) del plásmido Tique fue trasladado de Agrobacterium a células de plantas para formartumores agalla de la corona. T-ADN repetir secuencias definidas lasfronteras de la región T (366), y las regiones del plásmido Ti fuera de estas

fronteras no se encontraron inicialmente en las células tumorales (43). Sinembargo, la transferencia de plásmido Ti secuencias fuera de la región Tconvencionales pueden en un primer momento se han perdido debido a lafalta de seleccionable conocido (por ejemplo, la tumorigénesis) o screenable(por ejemplo, la producción de opinar) marcadores. Ooms et al. (241)observaron la incorporación al ADN de las plantas de las regiones delplásmido Ti más tarde demostrado que fuera de los clásicos del T-ADN delas fronteras. Ramanathan y Veluthambi (264) también mostró que uncasete de nosnptII, situado fuera de la frontera de T-ADN a la izquierda,podría ser transferida y confieren resistencia a la kanamicina en las células

infectadas por el tabaco.



El uso de vectores binarios relativamente pequeña del ADN-T hizo más fácilpara los científicos para evaluar la transferencia de la "no-T-ADN" a lasplantas de las regiones. Martineau et al. (211) por primera vez latransferencia de secuencias de vectores binarios de columna vertebral en elADN de plantas transgénicas y cuestionó la definición de T-ADN. Wenck et

al. (356) encontró que el vector binario completo, incluyendo secuencias decolumna vertebral, así como secuencias de ADN-T, con frecuencia podríanser transferidos a Nicotiana plumbaginifolia y las células de Arabidopsisthaliana. Kononov et al. (182) examinó cuidadosamente la estructura de lassecuencias del vector binario columna vertebral que se puede encontrarhasta en un 75% de las plantas transgénicas de tabaco y la conclusión deque dicha transferencia podría resultar de saltar a la izquierda de T-ADN enla frontera de T-ADN fue procesada a partir del binario vector o el inicio de

T-ADN de transferencia desde el borde izquierdo para traer secuencias delvector columna vertebral en las células vegetales. Teniendo en cuenta la

observación anterior por Durrenberger et al. (91) que VirD2 proteínacovalentemente pudo unirse al extremo 5 de la cadena no-T-ADN, Kononovet al. sugiere que la transferencia de secuencias de vector columnavertebral de las plantas fue una consecuencia natural del mecanismo deVirD2 función. Por lo tanto, la definición de T-ADN y la columna vertebral devectores constituye un argumento semántico. Parece, pues, que latransferencia de no tDNA secuencias a las plantas puede ser un resultadoinevitable, pero con frecuencia no observadas y no probada, de latransformación. De hecho, Frary y Hamilton (103) observaron laincorporación de BIBAC secuencias de plásmido en 9 a 38% de los

transformantes de tomate a prueba. Debido a la presencia de ADNcaracterizado en las plantas transgénicas es importante que laspreocupaciones regulatorias, este enfoque puede ser útil en el futuro para laproducción de plantas (especialmente difícil para transformar especies), conuna composición más alta se define transgénicos.

La transferencia de múltiples T-ADN en la célula vegetal mismo, y lageneración de "Marcador-Free" Plantas transgénicas

Debido a la preocupación por la propagación de los genes de resistencia alos antibióticos en la naturaleza o el escape de genes de resistencia a

herbicidas a especies silvestres de malezas, los científicos han desarrolladovarios métodos para generar marcadores libre de plantas transgénicas.Estas plantas serían inicialmente seleccionadas por su resistencia a unantibiótico o un herbicida, pero el marcador de selección sería eliminado enla manipulación posterior y el crecimiento de las plantas. Varios métodoshan sido propuestos para eliminar el marcador de selección de lostransformantes primarios. Estos incluyen el uso de un sistema derecombinación específica de sitio, como Cre-salmón o Flp Frt-(2, 19, 57, 209,235, 347, 348) para eliminar el marcador, transposón basado en elmovimiento del marcador de selección de la inicial del sitio de inserción del

genoma de la planta entera o no vinculados a otro sitio desde el cual puedeser segregados en las generaciones subsiguientes (93), o el uso de



múltiples T-ADN que se puede insertar en sitios no vinculados a lasegregación futuro (revisado en las referencias 142 y 372). Cada uno deestos sistemas tiene ventajas y desventajas. Por ejemplo, la supresión degenes marcadores con un sitio específico de sistema de recombinaciónrequiere la introducción de la recombinasa específica de sitio en las plantas,

ya sea por transformación genética o por cruce. La segregación de losmarcadores puede ocurrir sólo en la descendencia cuando se la generaciónde la planta transgénica inicial y se limita a las especies naturales propagana través de la semilla y no los propagan vegetativamente.

Las primeras investigaciones que caracteriza el patrón de integración de T-ADN en los tumores de la agalla de corona indicó que cada uno de los dos T-ADN codificado por un plásmido Ti octopina de tipo independiente podríaintegrarse en el genoma de la planta, a veces en varias copias (43, 63,314 ). El análisis molecular sugiere que los T-ADN puede ser integrado en

los sitios enlazados. Estos resultados sugieren que co-transformación sepuede realizar la integración de los transgenes llevado por dos diferentes T-ADN y que tal vez estos de T-ADN que se segregan en las generacionesposteriores. Tres enfoques fueron utilizados posteriormente para la co-transformación: (i) la introducción de dos T-ADN, cada uno de una bacteriadiferente, (ii) la introducción de dos T-ADN realizado por repliconesdiferentes dentro de la misma bacteria, y (iii) la introducción de la de dos T-ADN se encuentra en el mismo replicón en una bacteria.

Los primeros experimentos con estos distintos enfoques indicó quecotransformación podría ser un caso frecuente. An et al. (9) demostró quelas células del tabaco podría ser cotransformed a dos diferentes fenotiposde una sola cepa de Agrobacterium que contienen un plásmido Ti(fitohormonas independiente de crecimiento) y un vector binario de T-ADN(resistentes a la kanamicina de crecimiento). Este experimento representaun "un esfuerzo de dos replicón" para la co-transformación. Cuando lascélulas fueron seleccionados para la resistencia a la kanamicina, de 10 a20% de ellos también se muestra fitohormona independiente decrecimiento, cuando las células fueron seleccionados para la fitohormonaindependiente de crecimiento, el 60% del resultado callos eran tambiénresistentes a la kanamicina. Los autores acreditan estas frecuencias

diferentes a la mayor número de copias (5-10) del vector binario de labacteria en relación con la copia del plásmido Ti solo.

Estos experimentos se extendieron por el de Frammond et al. (69), quemostró que las plantas transgénicas fértiles pueden regenerarse a partir detejido del tabaco que fue clonado cotransformed de T-ADN de un plásmido

Ti y de un micro-Ti (el de una cepa, dos replicón enfoque). Los dos T-ADNseparados en plantas de la progenie, lo que indica que el T-ADN se habíanintegrado en loci genéticamente separables. Otros grupos han utilizado laonestrain, dos replicón enfoque para generar plantas transgénicas que

expresan un principio tanto del T-ADN marcadores pero que posteriormentepodrían segregar los marcadores de los demás (58). Depicker et al. (80)



realizó un experimento similar en el que los marcadores de selección sefitohormona independiente del crecimiento y la síntesis de la nopalina(codificada por un plásmido Ti) y el crecimiento resistentes a la kanamicina(codificado por un vector binario de T-ADN). Se realizó el experimento dedos maneras: o bien los dos T-ADN fueron entregados por dos diferentes

cepas de Agrobacterium (las dos cepas, dos replicones enfoque), o ambos T-ADN fueron lanzadas, desde un único replicón en una cepa (la onestrain , unenfoque replicón). Los resultados de estos experimentos indicaron quecotransfer de T-ADN del plásmido mismo en una de ellas fue mucho máseficaz que fue la transferencia a partir de dos cepas diferentes. El uso deuna cepa de Agrobacterium solo cotransform plantas con dos T-ADN de lamisma replicón, seguida por la segregación del gen de selección paragenerar marcadores libre de plantas transgénicas, ha sido descrito porKomari et al. (178) y Xing et al. (365). En cada uno de estos estudios, losautores fueron capaces de generar marcadores de plantas libres de

transgénicos a alta frecuencia. El uso de dos cepas de Agrobacterium paraofrecer diferentes T-ADN de las células de la misma planta fue estudiada poruna serie de grupos (65, 66, 67, 76, 217). Aunque cotransfer de T-ADN a lossitios no vinculados genéticamente se informó, algunos autores tambiéninformaron de una estrecha vinculación de los dos diferentes T-ADN enmuchos casos. Por lo tanto, no está claro cuál de los tres protocolos de co-transformación será reproducible mejor para la generación de marcador deplantas libres de transgénicos.

Expresión de genes de virulencia y la transformación de plantas

El tratamiento y la transferencia de T-ADN de Agrobacterium a las célulasvegetales está regulada por la actividad de los genes vir. La actividad degenes de virulencia es inducida por los compuestos fenólicos inducidos porla planta de heridas, tales como moléculas acetosiringona y relacionados(28, 74, 75, 92, 228, 293, 295, 298, 300). Sin embargo, puede haber casosen los que los científicos quieren inducir los genes vir a niveles superiores ala realizada por extractos de plantas. Varios grupos han identificado por lotanto, los mutantes vira y virG que la función constitutiva, en la ausencia deinductores fenólicos. Constitutiva mutantes vira se caracteriza por variosgrupos (13, 218, 253). Sin embargo, más énfasis se ha puesto en inductor

independiente de mutantes virG, posiblemente debido a virG funcionesaguas abajo de Vira.

Amplia estudios genéticos como resultado la identificación de una serie demutaciones que hacen que la proteína Virg activo en la ausencia decompuestos que inducen fenólicos (127, 254). Estas proteínas alteradascontienen mutaciones que convierten de asparagina-54 en ácido aspártico(virGN54D) o isoleucina-106 a la leucina (virGI106L). Ambas proteínasmutantes estimulado un alto nivel de expresión de los genes vir,especialmente cuando se expresa de un alto número de copias del plásmido

(118). Cuando se probó en el tabaco transitorio y ensayos de maíz detransformación, las cepas que contienen el mutante virGN54D a cabo un



mayor nivel de transformación que se codifica el gen de las cepas de tiposalvaje virG (130). Un efecto aún mayor se observó cuando el alelovirGN54D fue albergado en un plásmido de alto número de copias, lapresencia de este gen mutante en el Agrobacterium aumentado latransformación transitoria de arroz y soja entre dos y siete (170).

Varios laboratorios han determinado el efecto de las copias adicionales degenes virG de tipo salvaje en la inducción de genes vir y transformación deplantas. Rogowski et al. (273) mostraron que las copias adicionales de tiponopalina virG dio lugar a una mayor expresión de genes vir. Liu et al. (200)mostraron que las copias múltiples de virG alterado el perfil de respuesta depH para la inducción de genes vir. Normalmente, la inducción de genes vires muy pobre con un pH neutro o alcalino, o en medio rico; copiasadicionales de virG permite un alto grado de inducción en medio rico,incluso a pH 8,5. Copias adicionales de virG también aumentó la frecuencia

de transformación transitoria de los tejidos del arroz, el apio y la zanahoria(199).

Teniendo en cuenta estos resultados en su totalidad, se puede concluir queel aumento del número de copias de Vira o virG o disminuir la dependenciade las proteínas codificadas en inductores fenólicos en general, aumentaríala eficiencia de transformación de las cepas resultantes. Sin embargo, lasituación es probable que sea más compleja. Belanger et al. (23)demostraron que los genes individuales vira puede ser especialmenteadecuado para funcionar en ciertos contextos genéticos y Krishnamohan etal. (183) ha demostrado recientemente que los plásmidos Ti puede haberevolucionado para optimizar las combinaciones específicas de Vira, virG, ylas cajas de vir. Como se señaló anteriormente, la pTiBo542 plásmido Ti enel fondo C58 cromosómicas es hipervirulenta en ciertas especies deleguminosas, posiblemente debido a un gen asociado virG (41, 146, 159),pero no en su nativo Bo542 fondo cromosómicas (143). Los resultadosrecientes de mi laboratorio indican que la inducción de genes vir y laproducción de T-cadena por la eficiencia y la transformación dedeterminadas cepas de Agrobacterium no se correlacionan bien. A.tumefaciens A277, que contiene el plásmido Ti pTiBo542 en el fondo C58cromosómicas, es mucho más virulenta que las cepas A348 y A208, que

contenían los plásmidos Ti pTiA6 y pTiT37, respectivamente, en el fondomismo cromosoma. Sin embargo, la inducción de genes vir por exudados deplantas y la producción de T-cadena son los más altos en A. tumefaciensA208 (L.-Y. Lee y Gelvin SB, datos no publicados). Estos datos sugieren quela inducción de genes vir mayor y T-cadena de producción nonecesariamente pueden ser predictores confiables de la eficiencia detransformación.

T-ADN de Integración y la expresión del transgén

transformación de la planta no siempre se traduce en la expresión deltransgén eficiente. La literatura está repleta de ejemplos de los niveles deexpresión variable de los transgenes, que a menudo no se correlacionan con



el número de copias del transgén (véase, por ejemplo, referencia 255). Estafalta de correspondencia fue inicialmente atribuido a los efectos de posición,es decir, la posición dentro del genoma en el que los integrados T-ADN fueacreditado con la capacidad de los transgenes que expresan. T-ADN podríanintegrar cerca o lejos de la activación de la transcripción o elementos

potenciadores, lo que resulta en la activación (o su ausencia) de T-ADNrealizado transgenes (22, 35, 296, 308). T-ADN también podrían integrarseen regiones transcripcionalmente competente o en silencio transcripcionaldel genoma de la planta. El alto porcentaje (30%) de los eventos deintegración de T-ADN que resultó en la activación de un transgén reporteropromotor situado cerca de la frontera de T-ADN sugieren que el T-ADNpreferentemente puede integrarse en regiones transcripcionalmente activasdel genoma. Sólo los eventos de integración que uniría el transgén promotorcon un activo promotor se traduciría en la actividad del reportero (180). Sinembargo, un inconveniente para algunos de estos experimentos fue que los

eventos transgénicos pueden estar sesgados por la selección de plantasresistentes a los antibióticos que expresan un gen marcador antibióticorealizado por el T-ADN. No está claro si el ADN-T inserciones en regionestranscripcionalmente inerte del genoma que han pasado desapercibidosdebido a la falta de expresión del gen marcador de resistencia a losantibióticos.

Una manera obvia de evitar los problemas de la supuesta influencia de laposición es la integración de T-ADN en conocidas regionestranscripcionalmente activas del genoma de la planta. Sin embargo, la

orientación de genes en las plantas mediante recombinación homóloga hasido el mejor de los extremadamente ineficiente (72, 173, 223, 237, 238,269, 270). Un sistema alternativo para la selección de genes es el uso desistemas de integración en sitios específicos, tales como Cre-lox. Sinembargo, una sola copia transgenes introducidos en un sitio de salmón en lamisma posición del genoma de la planta también mostraron nivelesvariables de expresión de los transformantes independientes. Elsilenciamiento de transgenes en estos casos puede ser el resultado de lametilación del ADN transgénico (61). Metilación asociados, el silenciamientose informó a principios de origen natural del T-ADN genes (135, 340). Por lo

tanto, el silenciamiento transcripcional puede ser consecuencia de laintegración de los transgenes en las regiones del genoma de la plantasusceptible a la metilación del ADN y puede ser una consecuencia naturaldel proceso de transformación de plantas.

Ahora sabemos no sólo que los transgenes silenciar los resultados de"transcripción" de mecanismos, por lo general asociados con la metilacióndel promotor del transgén (222), sino también que el silenciamiento detransgenes es a menudo "posttranscriptional", es decir, el transgen setranscribe, sino que es el resultado de ARN inestables (219). Elsilenciamiento de genes tales posttranscriptional se asocia con frecuencia

copias de transgenes múltiples dentro de una célula. Las plantastransgénicas generadas por métodos directos de transferencia de ADN (por



ejemplo, polietileno glicol, o la transformación mediada por liposomas,electroporación, o el bombardeo de partículas) a menudo integran un grannúmero de copias del transgén en las matrices de repetición en tándem oinvertido, en loci múltiples o individuales ( 176). Aunque la transformaciónde Agrobacteriummediated por lo general resulta en un menor número de

copias de transgenes integrados, es común encontrar copias en tándem deunos pocos T-ADN integrados en un solo lugar (165).

Silenciamiento de transgenes puede ocurrir en las plantas que alberga unúnico e integrado de T-ADN (95). Sin embargo, la integración de lasrepeticiones de ADN-T, sobre todo repeticiones invertidas de cabeza acabeza "en torno a la frontera de T-ADN derecha, con frecuencia resulta enel silenciamiento del transgén (51, 164, 304). Por lo tanto, una cepa deAgrobacterium procedimiento o que se podrían utilizar para generar plantastransgénicas con un único e integrado de T-ADN podría ser una bendición

para la industria de la biotecnología agrícola y biología molecular de plantasen general. Grevelding et al. (117) señaló que plantas transgénicas deArabidopsis derivada de un procedimiento de transformación de raíz tiendena tener menos del T-ADN inserciones que se derivan de las plantas dediscos de hojas. Sin embargo, no está claro si esta observación puede seraplicable en general a otras especies vegetales. La información anecdóticade varios laboratorios indican que las cepas de Agrobacterium que sonmenos eficientes en la entrega de T-ADN puede ser más eficiente en laproducción de una sola copia del ADN-T inserciones. Sin embargo, estoshallazgos deben ser probados rigurosamente, es posible que el ADN-T el

número de copias también se pueden correlacionar con el estado decrecimiento de la bacteria o las plantas a transformar.

El uso de las Regiones de Fijación a la Matriz Para mejorarsilenciamiento del transgén

En la actualidad, la generación de una sola copia de las plantas transgénicases todavía un poco al azar. Los científicos suelen producir un númerorelativamente grande de los transformantes independientes y la pantallapara que las plantas que contienen una sola copia del ADN-T de inserción.Mejor de los casos, esto puede ser una molestia mucho tiempo. Sin

embargo, para las especies de importancia agronómica, los cultivares deélite, o líneas que son recalcitrantes a la transformación, puede convertirseen un paso limitante. Una alternativa a este enfoque puede ser lageneración de plantas transgénicas que contienen unas cuantas copias de

T-ADN que están aislados unos de otros. Un mecanismo propuesto paralograr esto es a los transgenes en el flanco de T-ADN con las regiones deunión de la matriz (Marte). Marte son secuencias de ADN que o bien estánasociadas con el cromosoma "matrices" en forma aislada o puede asociarsecon estas matrices in vitro (121, 122, 294, 350). Entre otras propiedades,que se han atribuido el papel de los genes de aislamiento dentro de un

dominio de la cromatina en bucle de la transcripción de activación osilenciamiento de los efectos de los campos vecinos. En las células



animales, como los efectos de aislamiento pueden hacer que la expresióndel transgén proporcional al número de copias del transgén (306). Sinembargo, algunos de los MARs inicialmente utilizado en los experimentoscon animales también pueden contener elementos potenciadores,confundiendo la interpretación de los experimentos originales (29, 259).

Cuando los transgenes flanco entregados a las centrales a través detransformación mediada por Agrobacterium, Marte parecen tener sólo unefecto pequeño sobre la expresión del transgén (128, 198, 201, 225, 226,227, 334). Mayores aumentos en la expresión del transgen se hanobservado con bombardeo de partículas mediada por la transformación (5,6, 236). Sin embargo, este aumento se asocia generalmente con laexpresión de transgenes en células de las plantas en lugar de plantasenteras (330, 333). Es posible que los efectos de los transgenes más altaexpresión de Marte usando el bombardeo de partículas refleja el número

transgén copia mayor integración resultante de esta técnica encomparación con el número de copias relativamente más bajos de T-ADNintegrado entregado por Agrobacterium (7). Como tal, no está claro si Marteserá, por su propia cuenta, de gran utilidad para reducir el silenciamiento detransgenes entregados a las centrales de transformación mediada porAgrobacterium.

El uso de supresores virales de silenciamiento de genes paraaumentar la expresión del transgén

Los datos recientes de una serie de laboratorios indican que algunos virus

de plantas, tanto de virus ADN y ARN, contienen genes que suprimen elsilenciamiento de genes (4, 11, 21, 31, 38, 55, 169, 210). Variosinvestigadores han especulado que antisilencing viral ha evolucionado comoun mecanismo para que los virus para evadir la defensa de la planta através de silenciamiento de los genes virales (55, 266). Independientementede la razón y el mecanismo de antisilencing, supresores virales desilenciamiento puede ser útil para mitigar el silenciamiento de transgenes.

Como se indica en algunas de las referencias citadas anteriormente, lossupresores virales de silenciamiento de los genes puede activar un transgén

estable antes silenciadas. Uno podría preguntarse si tales supresoressilenciador podría evitar el silenciamiento de transgenes introducidos en lasplantas de forma estable por transformación mediada por Agrobacterium.Aunque esta hipótesis aún no ha sido probado y las posibles consecuenciasnegativas (como el aumento de la susceptibilidad del virus) puedenderivarse de la incorporación estable de los genes antisilencing en ungenoma de la planta, los experimentos en los que los supresores desilenciamiento viral han sido utilizados para aumentar los niveles de laexpresión transitoria de Agrobacterium transgenes introducidos parecenprometedores. O. Voinnet y sus colegas (datos no publicados) han

demostrado recientemente que cuando cotransformed con transgenes quecodifican varias proteínas verdes fluorescentes, el virus de la papa Y Niaproteína, o tomate Cf-9 y CF-4 proteínas resistencia a las enfermedades,



varios supresores de silenciamiento viral aumentó drásticamente laexpresión de estas proteínas otros. Los niveles de expresión de hasta 50veces superiores a los alcanzados en las transformaciones de control (quecarecen de los genes supresores de silenciamiento viral) se obtuvieron.Varios supresores de silenciamiento viral diferentes, incluyendo la proteína

p25 de PVX, la proteína P1-HcPro del virus del grabado del tabaco, y laproteína p19 del virus de la atrofia de tomate espesa, fueron capaces demejorar la expresión del transgén transitoria tanto del promotor del virusdel mosaico de coliflor 35S y del promotores nativos transgén. De estos, laproteína p19 fue el más efectivo, tanto en el aumento transitorio laexpresión del transgén y la disminución de los niveles de pequeña (21 - 25pb) las moléculas de ARN asociada con el silenciamiento génicopostranscripcional. Los autores concluyeron que los supresores virales desilenciamiento de los genes podría ser útil para la producción de grandescantidades de proteínas en las plantas.

Cuando la expresión del transgén no es para siempre

Experimentos para expresar transgenes en las plantas inicialmente utilizóelementos, como el virus del mosaico de la coliflor 35S y 19S promotores opromotoras opinan sintasa, que expresan el transgen de una manerarelativamente constitutiva (24, 133, 179, 196 , 234, 280, 343). Sin embargo,como los experimentos de ingeniería genética de plantas se hizo másrefinada, los científicos recurrieron a los promotores regulados queexpresan un transgén en un determinado patrón de desarrollo, medioambiente, o en tejidos específicos. Los sistemas fueron desarrolladostambién que permitiría a los científicos para inducir la expresión de lostransgenes a voluntad, lo que permite la sobre-expresión de undeterminado producto o la expresión de un producto que puede ser tóxicodurante ciertas etapas del desarrollo de la planta. Estos sistemas inducibleincluidos los regulados por la tetraciclina (108), alcohol (279), cobre (221),choque térmico (284), y las hormonas esteroides (14, 282) (véase lareferencia 158 para una revisión reciente de los sistemas de inducción delgen inducible químicamente ). Muchos de estos sistemas con fugas, lo quepermite la expresión de transgenes en las condiciones noninduced.

Puede haber casos, sin embargo, cuando uno no quiere un transgén o suproducto para estar presente después de las primeras horas o días despuésde la transformación. Dichos rasgos son los que ayudan en el proceso detransformación en sí o que efecto reordenamientos de ADN de plantasdeseadas sólo durante el evento inicial de transformación (por ejemplo, laorientación de genes usando sitespecific sistemas de recombinación). Dosestrategias se están desarrollando actualmente para permitir la expresióntransitoria única de productos de los genes en las plantas. Estas son el usode "nonintegrating" sistemas tDNA y la transferencia de las proteínas, enlugar de las moléculas de ADN, de Agrobacterium a las células vegetales.

Nonintegrating T-DNA de los sistemas incluyen el uso de cepas mutantes deAgrobacterium y / o células de las plantas que son competentes en T-ADN



de transferencia nuclear, pero deficiente en la integración de T-ADN.Durante un registro para los dominios de VirD2 necesarias para laorientación nuclear de la T-DNA, Shurvinton et al. (290) se define undominio C-terminal, denominado, que mostró alta homología de secuenciade aminoácidos de los genes virD2. A pesar de este dominio no se requiere

tanto para la actividad endonucleasa VirD2 o nucleares objetivo de la T-ADN, la sustitución de cuatro aminoácidos conservados por dos residuos deserina dio lugar a una proteína mutante que hizo el esfuerzo de codificaciónAgrobacterium muy atenuada en la virulencia. Narasimhulu et al. (233) yMysore et al. (229) mostró además que las cepas de Agrobacteriumalbergar esta sustitución VirD2 fueron muy deficientes en la transformaciónestable (con un 2% de la eficiencia de las cepas de tipo salvaje), pero aúneran capaces de transformar las células de la planta transitoria en el 20%de la eficiencia de tipo salvaje cepas. Por lo tanto, esta mutación prestadoscepas de Agrobacterium muy deficiente en la integración de T-ADN, pero

sigue siendo relativamente competentes en la entrega de T-ADN al núcleode la planta. Este mutante VirD2 proteína por lo tanto puede ser utilizadapara combatir T-hilos en el núcleo, donde se pueden expresar de formatransitoria, pero no integrar de manera eficiente.

Nam et al. (231) utilizaron una prueba para detectar la raíz de casi 40ecotipos de A. thaliana por su capacidad de ser transformados porAgrobacterium. Entre estos ecotipos, UE-1 se transforma fácilmente deforma transitoria, pero mal transformado de forma estable. Caracterizacióngenética y molecular de este ecotipo indicó que el bloque en la

transformación se produjo en la etapa de integración del ADN-T. Nam et al.(232) más identificado un gran número de Arabidopsis mutantes deinserción de T-ADN que eran resistentes a la transformación deAgrobacterium (mutantes rat). Del período inicial de 21 mutantes, 5 fuerontransitoriamente transformado de manera eficiente, pero fueron muyrecalcitrantes a la transformación estable, un fenotipo asociado con unadeficiencia en la integración de T-ADN. Mysore et al. (230) caracteriza unode estos mutantes, el mutante rat5, con mayor detalle. Este mutante segeneró mediante la inserción de T-ADN en la región 3 no traducida del gende la histona H2A (HTA1). Los datos bioquímicos y moleculares indican que

este mutante podría ser transitoriamente transformado de manera eficiente,sino que la integración del ADN-T fue interrumpido. Aunque la funciónprecisa del gen HTA1 en la integración del ADN-T todavía no se hadilucidado, transformación de la raíz de este mutante (y quizás otros de T-DNA de mutantes deficientes en la integración) se puede utilizar para laprestación transitoria del T-ADN, sin eficientes posteriores T-ADN deintegración. El uso del gen HTA1 para mejorar la eficiencia detransformación de plantas silvestres se discute a continuación.

Vergunst et al. (349) descrito recientemente un nuevo procedimiento parala transferencia de las proteínas directamente de Agrobacterium a las

células vegetales. Este sistema se basa en la capacidad del sistema desecreción tipo IV de proteínas codificadas por los genes y virB



Agrobacterium virD4 la transferencia de ciertas proteínas Vir a las célulasvegetales. VirD2, VirE2 y VirF son las tres proteínas identificadas hasta lafecha que se pueden transferir por este sistema. Estos autores mostraronque las fusiones traduccionales de la proteína recombinasa Cre en elextremo N de cualquiera de VirE2 o VirF podría ser transferido a las células

vegetales y la recombinación del efecto en los sitios lox. Asimismo, mostróque el C-terminal de 37 aminoácidos de VirF eran suficientes para latransferencia de la proteína de fusión. Estos experimentos conducen a laposibilidad de utilizar las proteínas Vir como portadores de introducir otrasproteínas de forma transitoria en las células vegetales.

Manipulación de los genes de plantas para mejorarTRANSFORMACIÓN

Respuesta de la planta a la infección por Agrobacterium

A pesar de los grandes avances se han hecho en la última década paraaumentar el número de especies de plantas que se pueden transformar yregenerar con Agrobacterium, muchas especies importantes o las líneaspuras siguen siendo muy recalcitrantes a transformación mediada porAgrobacterium. La cuestión ha surgido a menudo, "¿Quién tiene el problemade la transformación, Agrobacterium o el investigador?" El rango dehospederos muy amplio de Agrobacterium, incluyendo las gimnospermas ytal vez menor de plantas phyla, una variedad de hongos, e incluso célulasanimales, sugiere que la T- la transferencia de ADN para el receptor (esdecir, la exclusión de entrada) no puede ser el problema. Agrobacterium

que transitoriamente puede transformar un número de estas especies demanera eficiente, incluyendo las especies de importancia agronómica comoel maíz y la soja (170, 271, 288), sugiere que en muchos casos de T-ADN deintegración puede seguir siendo el paso limitante. Alteración de lascondiciones de cultivo de tejidos, por ejemplo, el uso de antioxidantes en latransformación de la uva, arroz, maíz y soja, ha aumentado la probabilidadde transformar de manera estable los tipos de células que pueden serregenerados (96, 102, 239, 240, 258 ). Sin embargo, tales manipulacionesde las condiciones de transformación pueden tener limitaciones.

Infección por Agrobacterium de los tejidos vegetales, en algunos casosresultado de la necrosis de tejidos vegetales. Varios grupos han descrito unanecrosis lenta, la difusión de uvas infectadas por cepas de Agrobacteriumen particular (79, 263). Más recientemente, Hansen (129) se describe unarespuesta apoptótica de maíz a la infección por Agrobacterium. Larespuesta incluyó una rápida necrosis de los tejidos y la escisión del ADNnuclear en oligonucleosome del tamaño de los fragmentos por nucleasasendógenas y es característico de una cascada de la caspasa-proteasa. Laexpresión de dos genes supresores de células baculovirus muerte, p35 y elIAP, en gran medida inhibe tanto la necrosis del tejido y la escisión del ADN

endógeno. La manipulación de estos genes durante el proceso detransformación mediada por Agrobacterium por lo tanto puede ser útil paraaumentar tanto la viabilidad de las células de plantas y la eficiencia de



transformación de las especies de plantas con una respuesta de apoptosis aAgrobacterium.

Varios grupos han empezado a identificar los genes de plantas y productosde proteína implicada en el proceso de transformación. Una de las razones

de estos experimentos es la esperanza de que la identificación de estosgenes puede llegar a producir en su manipulación ya sea para mejorar latransformación o para hacer plantas resistentes a la enfermedad de laagalla de corona. Varios enfoques han sido empleados para identificar estosgenes de plantas, incluyendo (i) el uso de la levadura de dos híbridos desistemas de identificación de proteínas de origen vegetal que puedeninteractuar con las proteínas de virulencia, (ii) directa "hacia adelantegenética" de selección para identificar plantas mutantes que no pueden setransforma, (iii) "genética inversa" de cribado para detectar si los genes deinterés en particular pueden estar involucrados en la transformación, y (iv)

los diversos enfoques genómicos para identificar genes de plantas quepueden ser inducidos o reprimidos después de la infección porAgrobacterium.

Identificación de Genes vegetales que codifican proteínas queinteractúan con las proteínas de virulencia de Agrobacterium

Varias proteínas de virulencia de Agrobacterium se espera que interactúecon proteínas vegetales. Estos incluyen la forma procesada de VirB2, elcomponente principal de la T-pilus que se requiere para la transformación;VirD2, la proteína que cubre el extremo 5 de la transfiere T-capítulo; VirE2,

la proteína ADN de cadena única unión que, presumiblemente, abrigos la T-hebra, y VirF, que se transfiere a las células vegetales, pero cuya función sedesconoce. Varias proteínas Vir otros que están en la superficie celular delas bacterias, tales como VirB5 y VirB7 (componentes menores de la T-pilus), y VirB1 (un producto elaborado de VirB1 que se pueden encontrar enel medio extracelular), también puede interactuar con proteínas en lasuperficie de las células vegetales.

Los primeros trabajos (16) utilizados VirD2 como la proteína cebo en unalevadura de dos sistema híbrido para identificar a un A. thaliana importina

(AtKAP, ahora conocido como importina-1) como un socio que interactúan.Importina-proteínas están involucradas en la translocación nuclear demuchas proteínas albergar secuencias NLS, y Arabidopsis codifica por lomenos nueve de estas proteínas (Bhattacharjee y Gelvin, inédito). Ballas yCitovsky (16) mostraron que la interacción de VirD2 con importina-AtKAPNLS se depende tanto de la levadura e in vitro. La importancia de laimportina proteínas en el proceso de transformación con Agrobacterium seha sugerido recientemente al demostrar que una inserción de T-ADN en elgen importina-7, o la inhibición antisentido de la expresión de la importina-1(AtKAP) de genes, los resultados en un muy atenuada fenotipo de la

transformación (Bhattacharjee y Gelvin, inédito).



VirD2 también interactúa con al menos dos proteínas de plantas por mediode una levadura sistema híbrido de dos. Deng et al. (78) identificaron tresVirD2 y dos proteínas interactúan VirE2. Se caracteriza más a fondo uno delos VirD2 interactores, una de ciclofilina Arabidopsis. Esta proteína, como laglutatión S-transferasa fusión, interactuó intensamente con VirD2 in vitro.

Los autores mostraron que el dominio de interacción de VirD2 fue en laparte central de la proteína, una región para que no se había atribuido lafunción anterior. La ciclosporina A, un inhibidor de la ciclofilinas, inhibe latransformación mediada por Agrobacterium de las raíces de Arabidopsis ycultivos de tabaco suspensión celular. Los autores sugieren que estaproteína vegetal puede servir como un acompañante para ayudar en la T-complejo tráfico dentro de la célula vegetal. Los experimentos en milaboratorio identificado un tipo de tomate la proteína fosfatasa 2C comosocio de la interacción con VirD2. Esta puede ser la fosfatasa implicada en lafosforilación y desfosforilación de un residuo de serina cerca del motivo C-

terminal de NLS VirD2. La sobreexpresión de esta fosfatasa en el tabacotransfectadas AP-2 células resultó en disminución nuclear objetivo de unaGUS-VirD2 NLS-proteína de fusión, lo que sugiere que la fosforilación de laregión NLS VirD2 pueden estar implicados en objetivos nucleares delcomplejo VirD2/T-strand (Y . Tao, Rao P., y Gelvin SB, pendiente depublicación).

Utilizando VirE2 como la proteína cebo en una levadura sistema híbrido dedos, Tzfira et al. (329) identificado dos proteínas que interactúan deArabidopsis, VIP1 y VIP2. VIP1 pueden estar implicados en objetivos

nucleares de la T-complejo debido a la inhibición antisentido de VIP1expresión dio lugar a una deficiencia en la orientación nuclear de VirE2. Tabaco VIP1 plantas antisentido también fueron muy recalcitrantes a lainfección por Agrobacterium. Los resultados recientes sugieren además unuso para VIP1 en la mejora de la transformación de plantas: las plantastransgénicas que sobreexpresan VIP1 se hipersusceptibles detransformación por Agrobacterium (327, 330). VirE2 también interactúa enla levadura con varias de las proteínas de Arabidopsis importina, lo quesugiere que VirD2 y VirE2 puede haber un mecanismo común deimportación nuclear (Bhattacharjee y Gelvin, inédito).

Schrammeijer et al. (285) identificaron recientemente un Arabidopsis Skp1proteína como un interactor con el dominio de la caja de VirF. Skp1proteínas pueden estar involucrados en la selección proteínas como ciclinasque el proteosoma 26S, lo que sugiere que VirF puede funcionar en elestablecimiento del ciclo celular de las plantas para obtener una mejortransformación. La interacción de VirF con VIP1, pero no VirE2, tambiénpuede sugerir un mecanismo de rotación de proteínas Vir: si VirF estádirigido a los proteosomas, que puede ayudar a otras proteínas de la metaVir para la proteólisis.

El T-pilus es esencial para la transformación mediada por Agrobacterium.Las mutaciones en las proteínas de diferentes virB alterar la transformación,



pero no de T-ADN de procesamiento (301, 344). Como se mencionóanteriormente, el principal T-pilus componente es el procesado y cicla VirB2proteína (189), aunque otras proteínas de virulencia, incluyendo VirB5 VirB7y posiblemente, también son menores T-pilus componentes (278, 283).Aunque el papel preciso de la Tpilus sigue siendo controvertido, se espera

que el T-pili podrían interactuar con la pared celular de las plantas o de lamembrana. Los experimentos en mi laboratorio han comenzado a abordarlos posibles socios plantinteracting con T-pilus componentes. Utilizando unalevadura sistema híbrido de dos y la forma procesada, pero no cicla, deVirB2 como cebo de proteína, se han identificado dos clases de proteínas deArabidopsis que con fuerza y ??específicamente interactuar con este gran T-pilus constituyentes (H.-H. Hwang y SB Gelvin, datos no publicados). Una deestas clases de proteínas de origen vegetal está codificada por un gen de lafamilia de tres miembros. Aunque la identidad de estas tres proteínasrelacionadas no se conoce actualmente, sus perfiles de hidroterapia

sugieren que contienen dominios que atraviesa la membrana. La interacciónde proteínas otra es una GTPasa Rab tipo. Cada una de estas cuatroproteínas vegetales en la levadura interactúa consigo misma y con losdemás, pero no con otras proteínas de virulencia de prueba, incluyendoVirB1, VirB1, VirB5, VirD2, VirE2 y VirF. En vivo los datos indican que cadauna de estas proteínas está implicada en la transformación mediada porAgrobacterium. Antisentido o RNAi inhibición de la expresión de los genesque codifican estas proteínas en un fenotipo transformación deficientes.Además, una línea de Arabidopsis mutante que contiene una inserción de T-ADN en la región promotora de uno de los "desconocidos de proteínas"

genes también es muy recalcitrantes a la transformación mediada porAgrobacterium.

Adelante Selección genética para identificar genes de la planta.Involucrados en transformación mediada por Agrobacterium

Los científicos han demostrado una base genética para la susceptibilidad ala enfermedad de la agalla de corona, en algunas especies de plantas (15,214, 231, 246, 272, 292, 312). En un esfuerzo por identificar los genesinvolucrados en la planta de transformación mediada por Agrobacterium, milaboratorio se embarcó en un proyecto importante para identificar el ADN

de Arabidopsis mutantes de inserción de T-que son resistentes a latransformación por Agrobacterium (mutantes rat [232]). Estos estudios handado como resultado la identificación de más de 70 mutantes hasta lafecha. Las funciones de muchos de los genes mutados en el proceso detransformación han sido revelados por diversos ensayos. Por lo tanto, rat1(que codifica una proteína arabinogalactano) y rat3 (probablemente codificauna proteína de la pared celular de las plantas) están implicados en laadhesión bacteriana a las raíces (23). Otros genes de ratas que puedenafectar a la estructura de la pared celular son una sintasa xilano (rat4 [232])y un expansina (A. Kaiser, Kopecki A., Y. Zhu, y Gelvin SB, datos no

publicados). Debido a la adhesión bacteriana a los orígenes del mutante



rat4 parece casi normal (A. Matthysse, datos no publicados), RAT4 puedenestar involucrados en la transferencia de T-ADN en el citoplasma.

El uso de este enfoque con visión de la genética, hemos identificado unaserie de mutantes otra rata en las etapas posteriores del proceso de

transformación. T-DNA de las inserciones en los genes que codifican - yimportins son probablemente bloqueado en el T-ADN nuclear proceso defocalización (S. Bhattacharjee, Cao H., J. Humara, Zhu Y., y Gelvin SB, datosno publicados). Otros mutantes, entre ellos el rat5 (a las histonas H2Amutante [230, 232]), rat17, rat18, rat20, y los mutantes rat22,probablemente están involucrados en la integración de T-ADN (232). Unainserción de T-ADN entre dos genes de reemplazo muy próximas entre sí histona H3 (histona H3 y H3-4-5) también se traduce en el fenotipo de larata (J. Li, Zhu Y., y Gelvin SB, datos no publicados).

El hallazgo de que la histona H2A-1 gen afecta a la T-ADN de la integraciónha dado lugar a una caracterización más amplia de este gen. La Arabidopsisde la familia de genes histona H2A incluye 13 miembros. Hemos iniciado unestudio del patrón de expresión de cada uno de estos genes y un examendel papel que cada uno de estos genes pueden jugar en la transformaciónmediada por Agrobacterium (370; H. Yi, Fujinuma T., y Gelvin SB, datos nopublicados) . La histona H2A-1 gen, codificado por RAT5, se expresa ennumerosos tipos de células, incluyendo células que no se encuentran enrápida división. Este patrón de expresión es una característica de un"reemplazo" de genes histona. En las raíces, el gen se expresa en losprimordios de las raíces laterales, la región de meristemas, y la zona deelongación. Curiosamente, la zona de elongación de la raíz es la región mássusceptible a la transformación mediada por Agrobacterium (370). Otrosexperimentos indican que las histonas H2A-1 la expresión génica y lasusceptibilidad a la transformación Agrobacteriummediated están altamentecorrelacionados. Así, la expresión de este gen puede ser predictivo de lostipos de células que son más sensibles a la transformación. El conocimientode las competencias de transformación de células vegetales puede serimportante para la ingeniería genética de las especies de plantasrecalcitrantes y cultivares.

Debido a la mutación de la histona H2A-1 gen dio lugar a la transformacióndisminución de la raíz de Arabidopsis, se examinó si la sobreexpresión deeste gen podría aumentar la eficiencia de transformación mediada porAgrobacterium. Plantas transgénicas de Arabidopsis que contienengenómica adicional (230) o cDNA (H. Yi y Gelvin SB, datos no publicados)H2A-1 copias son de dos a seis veces la transformación más competentesque son las plantas que contienen el normal histona H2A-1 complemento degenes. Además, la expresión transitoria de la histona H2A-1 gen de unaentrada de T-ADN tanto complementa el mutante rat5 (230) y aumenta laeficiencia de transformación de los ecotipos de Arabidopsis normalmente

sensibles y altamente recalcitrantes (L.-Y. Lee y Gelvin SB, datos nopublicados). Finalmente, la sobreexpresión de la histona H2A RAT5-1 gen en



ratas mutantes diferentes (que no sea el mutante rat5) también se restaurala capacidad de transformación (L.-Y. Lee, S. Davis, Sui X, y Gelvin SB, datosno publicados). La expresión del gen es por lo tanto, RAT5 epistáticos sobreel fenotipo de los mutantes de rata rata otros y por lo tanto puedensensibilizar células de las plantas de transformación

Agrobacteriummediated. Sugerimos que la sobreexpresión de la histonaH2A RAT5-un gen puede mejorar la eficiencia de transformación de plantasrecalcitrantes.

Detección genética inversa para los genes de plantas queparticipan en los genes mediada por Agrobacterium transformaciónde plantas

codificación varias proteínas que interactúan con las proteínas de virulenciase han identificado utilizando una levadura sistema híbrido de dos. Talesinteracciones son el mejor de los que sugieren un papel de estos genes enla transformación de plantas. Sus funciones deben ser detectadadirectamente. Una forma de lograr esto es la inhibición de la expresióngenética en las plantaciones, utilizando técnicas tales como el ARNantisentido, RNAi, o mutagénesis. He discutido sobre el uso de ARNantisentido y RNAi para demostrar que VIP1 (un interactor VirE2), unaGTPasa Rab, y varias proteínas de la función no identificados (VirB2interactores) están involucrados en transformación mediada porAgrobacterium. Supresión de la expresión de estos genes puede ser unmétodo para generar plantas resistentes a la enfermedad agalla de lacorona.

Otro método para evaluar el papel de un gen en particular en latransformación sería la mutación de ese gen y después del ensayo de lasusceptibilidad de la planta de transformación. Sin embargo, en laactualidad la mutagénesis dirigida no es un método eficiente para el uso enlas plantas. Un enfoque alternativo genética inversa consiste en identificarlas plantas mutantes que contienen transposones o inserciones de T-ADN enlos genes de interés. Varias estrategias basadas en PCR han sido descritaspara identificar tales mutaciones nocaut en Arabidopsis (98, 104, 184),tomate (52), y el arroz (157). El uso de una estrategia de este tipo, mi

laboratorio ha identificado Arabidopsis mutante que contiene las líneas delas interrupciones en varias importina y importina-genes (supuestamenteimplicados en el transporte nuclear de la T-complejo) y diversos genesimplicados en la estructura de la planta de la cromatina (supuestamenteimplicados en la integración de T-ADN en el genoma de la planta). Algunasde estas mutaciones son moderadamente o altamente resistentes a latransformación mediada por Agrobacterium (S. Bhattacharjee, H. Cao,Humara H., A. Kaiser, Kopecki A., J. Li, Zhao X, y Gelvin SB, datos nopublicados ), y contienen ADN T-inserciones en o cerca de genes quecodifican importina-7 o importina-3, las histonas diferentes (incluyendo las

histonas H2A1, H2A3, H2B5, H2B6, H3-4, H3-5, y H4-1), histonasacetiltransferasas (incluyendo HAC4, HAC6, HAC9, HAC10 y HAC11), y una



histona deacetilasa (hda1). Todavía no hemos, sin embargo, establece lasfunciones precisas de estos genes de la planta en el proceso detransformación mediada por Agrobacterium.

Escobar et al. (97) han descrito recientemente una estrategia inversa novela

genética para producir agallas de la corona de plantas resistentes. Quegeneraron Arabidopsis transgénicas y las plantas de tomate que expresande doble cadena de ARN construcciones destinadas a T-ADN codificadoauxina y citoquinina oncogenes biosintéticas. Estos genes son altamentehomólogos entre una gran variedad de diferentes cepas de Agrobacterium.Muchas plantas transgénicas que expresan estas construcciones RNAi eranaltamente resistentes a la enfermedad de agalla de la corona dirigido poruna amplia gama de cepas oncogénicas, aunque no fueron generalmenteresistentes a la transformación mediada por Agrobacterium per se. Unenfoque similar ha sido utilizado para generar agalla de la corona resistente

a las enfermedades y las plantas de tabaco de manzana (W. Ream, datos nopublicados).

Enfoques genómica para identificar genes de plantas queresponden a la infección de Agrobacterium

Como se describió anteriormente (129), las plantas pueden responder a lainfección por Agrobacterium, y esta respuesta puede implicar la planta laexpresión génica diferencial. Los genes que son inducidos o reprimidosdurante las primeras etapas de transformación mediada por Agrobacteriumpuede proporcionar metas para la manipulación de la máquina para mejorar

la eficiencia de la transformación de las especies de plantas recalcitrantes.Varios laboratorios han iniciado investigaciones por consiguiente, paraidentificar estos genes expresados ??diferencialmente planta.

Ditt et al. (83) recientemente investigó la respuesta de los cultivos celularesAgeratum conyzoides suspensión a la infección por una cepanontumorigenic supervirulent A. tumefaciens (233). Usando cDNA deamplificación del polimorfismo de longitud de fragmentos (AFLP) paraamplificar fragmentos de 16.000, se identificaron 251 bandas que sonregulados diferencialmente 48 h después de la infección. Transcripción

inversa-PCR y análisis de algunos de estos genes se confirmaron losresultados de los análisis de cDNA-AFLP. Algunas de estas bandas tambiénfueron inducidos o reprimidos de 24 horas después de la inoculación.Mientras que la mayoría de las bandas investigadas (codificación, porejemplo, una RNasa, una quinasa recpetor supuesto, una peroxidasa y unaproteína relacionada con la patogénesis) también fueron reguladosdiferencialmente tras la incubación de las células vegetales con E. coli,cuatro genes, entre ellos uno que codifica una nodulin-como la proteína, unarespuesta concreta a la infección por Agrobacterium. Los autoresespecularon que este gen nodulin puede responder a las señales de la

bacteria para regular la división celular de los vegetales o la diferenciación.



Nuestro laboratorio ha realizado un estudio similar, el uso del tabaco AP-2 ola suspensión cultivos celulares inoculados con cinco diferentes notumorigénicos cepas de Agrobacterium (Veena, Jiang H., Doerge RW, yGelvin SB, pendiente de publicación). Una cepa puede transferir ADN-T, perono VirE2 proteína, se podría transferir proteínas de virulencia, pero no de T-

ADN, se puede transferir ninguna de las dos y dos pueden transferir tanto.Mediante hibridación sustractiva supresores seguido por análisis de ADN yARN macrochips de muestras de ARN a partir de ocho diferentes puntos detiempo después de la inoculación (de 0 a 36 h), se identificaron más de 400genes que son regulados diferencialmente después de varios períodos de lainfección. La mayoría de estos genes mostraron una respuesta diferencialgeneral de Agrobacterium inoculación, sin embargo, algunos genesrespondió específicamente a un T-ADN y la proteína de transferencia de Vir-competente cepa. A unos pocos genes respondió específicamente a T-ADN oproteína de transferencia de Vir solamente. Entre los genes que fueron

inducidos (o cuya expresión se mantuvo en un nivel alto) fueron las histonasy codificación de las proteínas ribosomales. La actividad de varios genes deplantas respuesta de defensa y el estrés fue reprimida por la infección porAgrobacterium. Debido a la importancia de las histonas en el proceso deintegración del ADN-T (230), se propone que la infección por Agrobacteriuminduce la expresión de genes de plantas necesarias para la transformación yal mismo tiempo la represión de la respuesta de defensa del huésped. Unanálisis más detallado de estos genes expresados ??diferencialmente senotifiquen si desean desempeñar un papel directo o indirecto en latransformación de plantas mediada por Agrobacterium.

PERSPECTIVAS 1111111 En menos de 20 años, el uso de Agrobacteriumpara transformar genéticamente plantas ha avanzado de un sueño a unarealidad. La biotecnología agrícola moderna depende en gran medida el usode Agrobacterium para crear plantas transgénicas, y es difícil pensar en unárea de investigación de las plantas que la ciencia no se ha beneficiado deesta tecnología. Sin embargo, aún quedan muchos desafíos. Muchasespecies de plantas de importancia económica o variedades de élite de lasespecies en particular, siguen siendo muy recalcitrantes a la transformaciónmediada por Agrobacterium, y el día no ha llegado aún cuando las flores

serán las únicas cosas que veía venir desde los cañones de las pistolas degenes. Sin embargo, creo que ese día no está muy lejos en el futurodistante. También siento que Agrobacterium desarrollado hace millones deaños para transformar genéticamente un rango muy amplio de organismos,sino que ahora a los científicos a aprovechar la capacidad natural de estabacteria. Además de ampliar la gama de huéspedes y la eficiencia detransformación de plantas mediante Agrobacterium, algunos de los retospendientes para la comunidad científica la biotecnología se resumen acontinuación. (I) El primero es la utilización de Agrobacterium parahomóloga o dirigida a un sitio de recombinación. Muchos científicosconsideran que la recombinación homóloga para ser uno de los otros"santos griales" de la biología molecular de plantas. La capacidad derealizar experimentos de sustitución de genes se ha convertido en un



elemento básico de la célula bacteriana, hongos y animales, incluso lainvestigación y la biología molecular. Sin embargo, la recombinaciónhomóloga en las plantas por lo general se produce a 10 5 la frecuencia derecombinación ilegítima (71, 173, 223, 237, 238, 269, 270). Necesitamos unsistema de transformación mediada por Agrobacterium que ofrece T-ADN al

núcleo de la planta de manera eficiente, pero es deficiente en T-ADN al azarde integración.

(Ii) El segundo se refiere a la expresión del transgén estable y predecible enlas plantas. Con demasiada frecuencia, el nivel de expresión de lostransgenes en las plantas es muy variable. A menudo, las líneas de plantastransgénicas que son "expresadores bueno" perder esta característicadespués de varias generaciones de crecimiento bajo condiciones de campo.

Tenemos que entender las funciones de los efectos de posición, los efectosde la cromatina, y T-ADN patrones de integración en el silenciamiento

génico transcripcional y postranscripcional con el fin de desarrollarestrategias para mejorar el alcance y la estabilidad de la expresión deltransgén. (Iii) La tercera es la manipulación del genoma del Agrobacterium.La disponibilidad de la A. tumefaciens C58 completar la secuencia genómica(114, 363) nos presenta una oportunidad sin precedentes para investigarAgrobacterium patrones de expresión génica y las formas en que puedenser alterados durante el co-cultivo de la bacteria con varias especies deplantas. Esta información puede proporcionar pistas a los métodos paramanipular más de Agrobacterium a fin de efectuar un mayor nivel detransformación de las especies de plantas recalcitrantes.

(Iv) La cuarta es la transformación de plastidios genética por Agrobacterium.A pesar de algunas referencias dispersas a la transformación del cloroplastopor Agrobacterium existen en la literatura (véase, por ejemplo, lasreferencias 64 y 346), estos informes no han sido confirmadas por lacomunidad científica. La existencia de secuencias de proteínas NLS VirD2 yVirE2 puede garantizar T-ADN dirigido al núcleo. Incluso si estas secuenciasNLS pueden ser destituidos sin alterar otras funciones esenciales de estasproteínas, el reciente descubrimiento de que el citoesqueleto de actinaplanta está involucrado en transformación mediada por Agrobacterium (P.Rao y SB Gelvin, datos no publicados) puede impedir la redirección de la T-

El ADN del núcleo de plástidos.

(V) La quinta es la transformación genética de hongos patógenos de plantasy animales. Muchos hongos patógenos médicamente o agronómicamenteimportantes siguen siendo muy recalcitrantes a la transformación genética.Los informes recientes de transformación mediada por Agrobacterium devarias especies de hongos filamentosos (1, 71) sugieren que laAgrobacterium puede ser un útil "gen-maniobras de herramientas" por másde especies de plantas justo.

(Vi) El desafío final consiste en la transformación genética de célulashumanas y animales. El reciente informe de la transformaciónAgrobacteriummediated genética de células humanas (187) sugiere que la



excitante posibilidad de la utilización de Agrobacterium, o los procesos deAgrobacterium como por la terapia génica humana y animal.

Agrobacterium Mediated-plant Transformation the Biology Behind the Gene-jockeying Tool

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