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Objetivos biológicos de los radicales libres y especies

reactivas del oxígeno

Se denominan radicales libres a aquellas moléculas que tienen un electrón desapareado en su orbital más externo. Esto les confiere una capacidad de reacción muy elevada, por lo que son capaces de actuar en los sistemas biológicos produciendo cambios en la composición química o en la estructura de los elementos celulares

Aunque son químicamente muy inestables y altamente tóxicospara las células, se producen en condiciones normales en elinterior de éstas.Varios de los metabolitos intermedios que se generan sonradicales libres.Por tanto, el metabolismo normal es una fuente de radicaleslibres.

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La xantina oxidasa (enzima responsable de laconversión de hipoxantina en ácido úrico)genera radicales libres (radicales superóxido).

CATABOLISMO DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA IMPAR(Últimos pasos)

Hay tres etapas:1. Carboxilacióndel propionil-CoA: catalizado por propionil-CoAcarboxilasa. Se realiza a expensas de la hidrólisis de un ATP. Se forma el isómero D del metilmalonil-CoA2. Racemizacióndel D-metilmalonil-CoA: catalizado por metilmalonil CoAracemasa (epimerasa)produciendo el isómero L3. Reordenamiento intramolecular del L-metilmalonil-CoA: catalizado por metilmalonil-CoAmutasa, que contiene como coenzima un derivado de vitamina B12, la cobalamina.

En el ciclo final de degradación se produce propionil-CoA y acetil-CoA en lugar de dos moléculas de acetil-CoA. Esta unidad activada de tres carbonos del propionil-CoA entra en el ciclo del ácido cítrico mediante su conversión a succinil-CoA.

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COBALAMINA (VITAMINA B12)

El mecanismo de reacción implica en una primera etapa la ruptura homolítica del enlace carbono-cobalto de la 5’-desoxiadenosilcobalamina, dando lugar a coenzima B12 con Co+2 y un radical 5’-desoxadenosilo (-CH2•).

Mecanismo de metilmalonil-CoA mutasa

Este radical -CH2• es el encargado de extraer un átomo de hidrógeno de la molécula sustrato para formar 5’-desoxiadenosina y un radical del sustrato

Este se reordena espontáneamente migrando el grupo carbonil-CoA a la posición que antes ocupaba el hidrógeno.

La función del coenzima B12 en estas migraciones intramoleculares es servir de fuente de radicales libres para la extracción de átomos de hidrógeno. Esto es debido a la facilidad de ruptura del enlace cobalto-carbono, que es aumentada en el interior del centro activo del enzima.

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BIOSÍNTESIS DE DESOXIRRIBONUCLÓTIDOSRibonuclétido reductasa

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Estrés Oxidativo

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Estrés oxidativo / Especies reactivas de oxígeno

Se generan especies reactivas de oxígeno (EROS)

üoxígeno singlete 1O2* üradical superóxido O2

-

especies reducidas

üperóxido de hidrógeno H2O2

üradical hidroxilo OH-

üradical hidroperoxilo HO2-

El estrés oxidativo es la oxidación no controlada,

de origen exógeno o endógeno que se produce por

desbalance de los mecanismos antioxidantes a nivel celular.

CARACTERÍSTICAS PRINCIPALES DE LAS ESPECIESREACTIVAS DEL OXÍGENO

(ROS: REACTIVE OXYGEN SPECIES)

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REACCIÓN DE FENTONLos mecanismos propuestos para la formación de las ERO involucranuna reacción de Fenton sitio-específica donde participa un metalreducido (Me(n-1)+) que reacciona con el peróxido de hidrógeno (HO-OH) o con un hidroperóxido orgánico (RO-OH) produciendo la rupturadel enlace peroxilo (-O-O-). Los peróxidos pueden también reaccionarcon el radical superóxido y generar radicales libres más reactivosmediante la reacción de Haber-Weiss, también catalizada por metalesde transición

Me(n-1)+ + H2O2 Men+ + OH- + HO•

H2O2 + O2•- Fe/Cu

O2 + HO• + OH-

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Reacciones en cadena de los radicales libres

Estrés oxidativo - enfermedad

Estrés oxidativo

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Equilibrio - salud

Enfermedad Salud

Enfermedad Salud

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Fuera de la mitocondria el NADPH proviene de:- Ciclo de las pentosas- Actividad de enzima málica sobre Malato

Dentro de la mitocondria el NADPH proviene de:

glutatión peroxidasa

glutatión reductasa

glucosa 6-fosfato deshidrogenasa

Glutatión (reducido)

Glutatión (reducido)

Participación del NADPH en: regeneración del Glutatión reducido

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ANTIOXIDANTES NATURALES (DIETARIOS)ANTIOXIDANTES NATURALES (DIETARIOS)

Ascorbato (Vitamina C)Tocoferoles (Vitamina E)Carotenoides (identificados más de 600)

Ej.: Licopeno (tomate)Flavonoides (más de 4.000)

antocianidinacatequinasflavanonasflavonas-isoflavonasflavonoles

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Índices y métodos para evaluar el estrés oxidativo

Estos ensayos se usan para evaluar la eficacia de un antioxidante, en Soluciones.

Enfermedades relacionadas con procesos REDOX

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El estudio de las ERO aporta nuevos conocimientos sobre la causa de diversas enfermedades:1) Se descubre cómo sustancias antioxidantes son efectivas en el tratamiento de estos desórdenes 2) Cómo fármacos, de eficacia comprobada en diferentes enfermedades, poseen propiedades antioxidantes.

El estudio de los ERO y de su control es importante para determinar su papel en

patologías que implican una degeneración de los mecanismos moleculares del organismo, desde

el cáncer hasta el Parkinson.

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Son múltiples los procesos patológicos asociados con el desequilibrio del balance oxidación/antioxidación

Cáncer

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Reactive Oxygen Species (ROS)1O2

•OH O2 H2O2

Reactive Nitrogen Species (RNS)NO ONOO N2O3

•

MDA(malondialdehyde)

4HNE(4-hydroxynonenal)

DNA Damageand Mutation

Nitrosamines/Deamination8-oxo-dG8-nitroguanineEtheno AdductsM1G AdductS-nitrosothiolSSB’sDSB’s

Lipid Peroxidation

Arachidonic AcidCascade

Eicosanoids

Cell Proliferation

Protein Damage(DNA Repair Enzymes, Caspases)

Cancer

NFκBAP-1

Survival

ROS + Daño en el DNA = Cáncer

La combinación de ambos fenómenos impulsa la aparición de células malignas.

Con respecto al daño en el DNA, se han establecido patrones de expresión o mutación en tipos concretos

de cáncer.

Si se pudieran definir los marcadores tumorales que permitan detectar estos procesos en estadios

tempranos se lograría, además de un avance en el tratamiento de la enfermedad, valorar la posibilidad de

la utilización de sustancias antioxidantes como terapéutica de la misma.

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Relación entre Artritis Reumatoidea y ERO

La activación de leucocitos polimorfonucleares, característica del proceso inflamatorio que acompaña a la Artritis Reumatoidea , cursa con un marcado incremento del estrés oxidativo. Los ERO no neutralizados por las defensas antioxidantes reaccionan con proteínas, ADN, ARN y lípidos de membranas celulares determinando bloqueos en pasos del metabolismo celular y disfunción mitocondrial, que conducen al fracaso energético celular .Simultáneamente con el proceso inflamatorio ocurre aumento en la producción de óxido nítrico (NO) por inducción de la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS). La superproducción de NO determina su reacción, con el anión superóxido dando peroxinitrito (ONOO), especie altamente reactiva capaz de oxidar y nitrar componentes celulares y tisulares.

Artritis Reumatoidea

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Ocurre un daño estructural y funcional a nivel mitocondrial, que se torna irreversible debido a la oxidación y nitración de componentes mitocondriales. El ONOO también oxida y produce depleción de antioxidantes endógenos tales como ascorbato, glutatión y superóxidodismutasa.El estrés oxidativo y nitrosativo actúan perpetuando el proceso inflamatorio por diferentes mecanismos. Las ERO y las Especies Reactivas derivadas del Nitrógeno (ERN) tienen efectos quimiotácticos, favoreciendo el reclutamiento de neutrófilos. Además, las moléculas mediadoras de estrés oxidativo se constituyen también en mensajeros intracelulares para la transducción de señales del proceso inflamatorio.

Diabetes Mellitus

Diabetes Tipo 2

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Transporte de glucosa en músculo

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La glucosa, al igual que otros alfahidroxialdehídos, es capaz de autooxidarse a enedioles (enolizarse) en solución acuosa y en presencia de metales de transición, como el Fe+3, reacción en la cual se producen citoaldehídos intermediarios oxidados y RL con un alto poder oxidante como el O2

°-

Se ha demostrado que la hiperglucemia favorece la producción de O2°- mitocondrial, lo que ocasiona la activación de la vía de los polioles (vías de los hexosominas) y, consecuentemente, una disminución de NADPH, que constituye el cofactor de las enzimas generadoras de GSH.

La hiperglicemia sostenida favorece la autooxidación de la glucosa por disminución del NO, lo cual causaría desbalance en los mecanismos de oxidación y antioxidación que conllevaría a hiperproducción de ERO, los cuales producen oxidación de las lipoproteínas de baja densidad e inactividad de vitaminas antioxidantes, y conlleva a fenómenos aterogénicos, hipertensión y microangiopatía diabética.

Glicosilación no enzimática de proteínas

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Diabetes tipo-2

Hemoglobina glicosilada

Antioxidantes Totales en plasma

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Desorden del transporte del cobre ligado al cromosoma X, estemetal entra en la célula intestinal pero está impedido de llegar a lacirculación por lo que resulta una severa deficiencia de cobre en lamayoría de los tejidos.

Al disminuir el cobre circulante se originan patologías pordeficiencia o ausencia de las actividades enzimáticas querequieren cobre como cofactor. Disminuyen enzimas como Cu-Zn-SOD y citocromo c oxidasa por lo que se genera un aumento deespecies reactivas del oxígeno. Se afecta el metabolismo delhierro y por lo tanto se altera la formación del hemo y lasferroenzimas como la catalasa también disminuyen. Como el cobreparticipa en el metabolismo del Se (selenio) que es un cofactor dela glutatión peroxidasa, al disminuir el cobre disminuye también laactividad de esta enzima.

El gen que está alterado en esta enfermedad codifica para unaATPasa tipo-P que transporta cobre.

Enfermedad de Menkes

Esquema del metabolismo del cobre

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Etimológicamente, arterioesclerosis significa endurecimiento de lasarterias.Incluye tres entidades diferentes:- Aterosclerosis- Esclerosis de la media (enfermedad de Mönckeberg)- Arteriolosclerosis

Arterioesclerosis - Aterosclerosis

La aterosclerosis puede comenzar cuando ciertos factores causan daños en las capas internas de las arterias. Estos factores son:•El hábito de fumar•Las cantidades altas de ciertas grasas y colesterol en la sangre•La presion arterial alta•Las cantidades altas de azúcar en la sangre debido a resistencia a la insulina o a la diabetes

Enfermedad caracterizada por el desarrollo de múltiples lesionesfocales (ateroma o placas ateromatosas) en la pared de la aorta ylas arterias de gran y mediano calibre.Esas placas están compuestas por lípidos, como el colesterol, ypor células inflamatorias, como los monocitos, que desde lasangre penetran en el interior de la pared arterial. Una vez dentrode ésta, los monocitos atrapan el colesterol y se convierten encélulas espumosas. Estas células provocan una serie de cambiosen la pared que provocan el crecimiento desordenado de lascélulas musculares de ésta y la formación de tejido fibroso. Alfinal, la placa está compuesta por una mezcla de elementosdistintos, lo que le confiere su denominación de ateroma, quesignifica engrudo.

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Este ateroma puede formarse encualquier arteria, pero usualmente seencuentra más en las arteriascoronarias, en la arteria aorta, en lasarterias del cerebro, en las arterias de lasextremidades, sobre todo las localizadasen los muslos y piernas.

La demencia es un desorden cerebral que afecta en mayoro menor grado la habilidad de una persona para llevar acabo sus actividades diarias.

Enfermedades Neurodegenerativas

Enfermedad de Alzheimer Enfermedad de Alzheimer

En la actualidad, esta enfermedad es la forma máscomún de demencia. Involucra las partes delcerebro que controlan el pensamiento, la memoriay el lenguaje.

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Los síntomas de la Enfermedad de Alzheimer puedenpasarse por alto ya que se asemejan a las señales delenvejecimiento natural, o debido fatiga, aflicción odepresión.

Estos síntomas incluyen* olvido en general de cosas y hábitos* pérdida de la concentración* disminución en la capacidad de leer* incapacidad para comprender el significado

de las palabras* pérdida de la audición* debilidad física general

pérdida de peso sin explicaciónproblemas motricesdificultades leves para caminar

Origen genético de la enfermedad:

a) Inicio precoz (30-60 años): üMutaciones en APP (precursor de la proteína β-amiloide) üMutaciones en PS1 y PS2 (presenilina 1 y 2) enzimas proteolíticas responsables de la fragmentaciónde APP

b) Comienzo tardío (después de los 60 años) üPresencia de apolipoproteína ApoE4

c) Otros genes implicadosüAnormalidades genéticas en la mitocondria üMutaciones en la proteína Tau

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Desarrollo de la enfermedad similar a la Enfermedad deCreutzfeldt-Jakob :

*Formación de la placa amiloide, formada por péptidos fibrilaresde unos 40-45 aminoácidos (configuración espacial beta)a partir de APP.

*Aumento del estrés oxidativo (se han encontrado en la placaamiloide altos niveles de cobre, hierro y zinc).*Formación de ovillos neurofibrilares.*Apoptosis celular.*Muerte de las nueronas.

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En primer lugar, se determinó que unamutación en el gen de αS causaba unaforma temprana y hereditaria de estaenfermedad, y en segundo lugar quelos cuerpos de Lewy, presentes encasos esporádicos de la EP eranfuertemente inmunoreactivos para αS,determinándose luego que estaproteína era su principal componente.

La enfermedad de Parkinson (EP), clínicamente descripta por primera vezen 1817 por James Parkinson, es un desorden neurodegenerativo. Estaenfermedad surge de la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicasen la substancia nigra y su principal característica neuropatológica laconstituyen inclusiones proteináceas intracelulares conocidas comocuerpos de Lewy. En los últimos años, se ha vinculado fuertemente a laproteína α-sinucleína (αS) con la etiología de la EP.

Enfermedad de Parkinson Enfermedad de Parkinson

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La cinética de fibrilación de αS es consistente con un mecanismonucleación-dependiente, siendo modulado por factores tales comola temperatura, pH, y la interacción con poliaminas e ionesmetálicos. De los factores biológicos vinculados a la agregación deaS in vivo, las interacciones metal-proteína y proteína-proteínaconstituyen el objeto principal de muchos estudios. De lainteracción de αS con iones metálicos se determinó que el Cu(II) seune específicamente al N-terminal de αS e induce su agregaciónbajo condiciones que podrían ser relevantes para la EP. Mediante unanálisis comparativo sobre el rol de Cu(II) en otros desórdenesneurodegenerativos como la EA y la enfermedad de priones, se haconcluido que las perturbaciones en la homeostasis de Cu(II)podrían constituir un elemento común en la etiología de estosdesordenesEn condiciones normales, el H2O2 es inactivado por el glutatión-glutatión peroxidasa, pero si este sistema no funcionaadecuadamente, el H2O2 puede transformarse en el radical OH-·,desencadenándose así la peroxidación lipídica de la membrana y lamuerte celular.

Apotosis o muerte celular programada

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La apoptosis o "suicidio" celular es un mecanismo de destrucción controlado de las células

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1. Estimulos extrinsecos: Ligandos a

receptores de muerte

2. Estimulos intrinsecos (via

mitocondrial): Estrés celular (radiacion,

quimicos, infeccion viral, etc); Estrés

oxidativo (Aumento de

ROS/disminucion de antioxidantes)

3. Via Reticulo endotelial: alteracion de la

homeostasis del Ca2+- Activacion de la

caspasa12

INDUCCIÓN DE LA APOPTOSIS

Se pueden establecer tres estadios en el proceso apoptótico: üfase inductora (génica, por ejemplo, una mutación en p53) üfase efectora (donde entran en juego las ROS)üfase de degradación (con la producción de cuerpos apoptóticos)

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X. Páez Fisiología Medicina ULA 2010

Proceso APOPTÓTICOProceso APOPTÓTICOProceso APOPTÓTICOProceso APOPTÓTICO

Se frunce la célula Se frunce la célula cromatina se condensacromatina se condensa

Bulas de membranaBulas de membrana

Colapso núcleoColapso núcleomás Bulasmás Bulas

Formación Formación cuerpos apoptóticoscuerpos apoptóticos

LisisLisisCuerpos Cuerpos apoptóticosapoptóticos

Vías de APOPTOSISVías de APOPTOSISVías de APOPTOSISVías de APOPTOSIS

1

Muerte neuronal

X. Páez Fisiología Medicina ULA 2010

Caspasas Caspasas ejecutorasejecutoras

Recep.Recep.muertemuerteVía Vía

mitocondrialmitocondrial

2

Estrés REEstrés RE3

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X. Páez Fisiología Medicina ULA 2010

ATPATP

ROSROS

MitocondriaMitocondria

Apoptosis Vía Intrínseca 2

fosforilación oxidativa producción ATPgeneración ROS

Vía Intrínseca MitocondrialVía Intrínseca MitocondrialVía Intrínseca MitocondrialVía Intrínseca Mitocondrial2

SEÑALESSEÑALESque inducenque inducenLIBERACIÓNLIBERACIÓNde mediadores de mediadores de apoptosisde apoptosisde la de la mitocondriamitocondria

SEÑALESSEÑALESque inducenque inducenLIBERACIÓNLIBERACIÓNde mediadores de mediadores de apoptosisde apoptosisde la de la mitocondriamitocondria

InducciónInducciónInducciónInducción

X. Páez Fisiología Medicina ULA 2010

MuerteMuertecelularcelularMuerteMuertecelularcelular

EstrésEstrésCelularCelularRadiacionesRadiacionesQuímicosQuímicosInfección viralInfección viral

EstrésEstrésOxidativoOxidativo

Deprivación Deprivación

F. CrecF. Crec..

MitocondriaMitocondria

Flia. BclFlia. Bcl22 ROSROS

AIFAIFEndonucleasaEndonucleasa GG Cit cCit c

Inhibe Inhibe inhibidoresinhibidores

ApoptosomaApoptosomaCaspasa Caspasa independindepend

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Moléculasmitocondrialesque MEDIAN víasapoptóticas

Moléculasmitocondrialesque MEDIAN víasapoptóticas

11. Caspasa. Caspasaindependientesindependientes

CascadasCascadasCascadasCascadas

X. Páez Fisiología Medicina ULA 2010

MuerteMuertecelularcelular

Vía Intrínseca MitocondrialVía Intrínseca MitocondrialVía Intrínseca MitocondrialVía Intrínseca Mitocondrial2

22. Caspasa. Caspasadependientesdependientes

Flia. BclFlia. Bcl22 ROSROS

MitocondriaMitocondria

AIFAIFEndonucleasaEndonucleasa GG Cit cCit c

Inhibe Inhibe inhibidoresinhibidores

ApoptosomaApoptosomaCaspasa Caspasa independindepend

Citoplasmase constriñe

Núcleo se condensa en “herradura”

Continua constricción

Cuerpos apoptóticos

X. Páez Fisiología Medicina ULA 2010

http://www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/apoptosis/index.htm

Apoptosis: cambios

morfológicos

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