so REVISTA CLINICA E SPAl\tOLA 15 abril 1946

COMUNICACIONES PREVIAS

NUE VO :METODO DE MICROCULTIVO EN EL BORDE DE UN CUBRE-OBJETOS, QUE PERMITE LA OBSERV ACION Y CLASIFI-

CACION DE LOS HIF ALES

R. DE URIOSTE

Instituto de Biología y Sueroterapia I. B. Y. S.

El diagnóstico del género de un Hifal pará­s ito de un veget al se suele llevar a cabo por visión microscópica de un corte de la parte pa­rasitada, efectuado por un microtomo, y la pe­lícula así obtenida es depositada entre porta y cubre-objetos. juntamente con un colorante, s iendo más usado el azul algodón, lo que permi­t e diferenciar claramente el hongo de las célu­las vegetales circundantes.

La imagen microscópica de las preparaciones hechas de esta forma es la que se considera ideal para el estudio de estos vegetales, ya que el cor­te paralelo a los conidióforos permite la apre­ciación lateral de todas las partes del hongo, :viéndose de esta manera perfectamente la ta­bicación del micelio, color y distribución de los conidióforos y esporas, así como el tamaño y segmentación de estas últimas si las hubiese.

El método que se emplea en los parásitos ve­getales no puede ser seguido para su visión en el microscopio cuando la espora ha germinado en un cultivo artificial , a no ser que se inclu­ya todo el césped formado sobre medio sólido en una sustancia que permita los cortes poste­riores al microtomo, como es la gelatina, sien­do indispensable después de obtenidas estas pe­lículas el teñirlas para hacer resaltar el hongo de la gelatina circundante, cuyo índice de re­fracción es casi idéntico a aquel, teniendo el inconveniente además que el teñido es imper­fecto, las manipulaciones engorrosas y las pre­paraciones muchas veces defectuosas.

Debido a estos inconvenientes, la técnica an­terior es muy poco usada, empleándose en su lugar el mirar directamente la colonia del Hi­fal crecida sobre una placa de Petri con medio sólido al microscopio, con lo que a poco aumen­to se consigue observar con visión perpendicu­lar y generalmente defectuosa la posición na­tural de la parte aérea del hongo.

Se perfeccionó este método empleando porta­objetos, a los cuales se les añadía unas gotas de cultivo sólido en estado de fusión, y una vez crecido el Hifal sobre esta gota solidificada, para lo cual se ponía el porta-objetos en una caja de Petri con algodón empapado en su fon-

do, era observada la colonia al microscopio. ob­teniéndose de esta forma una imagen microscó­pico más clara que la técnica anterior, pero no corrigiéndose la visión vertical.

Asimismo el microcultivo en cubre-objetos con una gota de cultivo sólido o líquido y em­pleando como cámara húmeda un porta-objetos escavado, si bien es excelente para el estudio de hongcs parásitos y para algún Hifal en particu­lar, no es apropiado en general para el estudio de la mayoría de los Hifales.

La técnica más extendida es tomar con una pinza fina o un rsa de platino un trozo de la parte aérea del Hifal a estudiar y ponerlo so­bre una gota de nul de algodón. aplicando a continuación un cubre-objetos dr. modo y ma­nera que el Hifal quede aprisionado entre el porta y el cu bre-objctos.

La técnica anterior, tan empleada, es exce­lente para nprE:'ciar la tabicación del micelio v las esporas. pero no soluciona la ｡ｰｲ･｣ｩ｡｣ｩｾ＠de la disposición de nacimiento del micelio y la distribución de conidióforos y conidias.

La t écnica sencilla que ponemos a continua­ción cubre todos los requisitos para una visión Jateral perfect a de estos deuteromicetos, lo que se consigue cultivándolos en el borde de un cu­bre-objetos impregnado éste previamente en un medio de cultivo. ' Nuestra técnica es la siguiente: crecido el hongo sobre un medio apropiado (SABOUREAUD, CzAPEK, etc. ), y si una preparación hecha entre porta y cubre con azul algodón nos hace supo­ner que e<; una colonia pura por los caract eres homogéneos del micelio conidióforo y esporas, podemos partir del césped observado para su clasificación, que de no reunir los caracteres dichos, habrá oue hacer un a islamiento mono­espóreo con el micromanipulador y partir del cultivo así obtenido para su estudio ulterior.

Una vez que tengamos la certeza de la pu­reza de la colonia, dej amos secar varios porta­objet os y cubre-objetos, los cuales habrán es­tado sumergidos en una mezcla de 3 partes de alcohol y una de éter durante veinticuatro ho­ras, con objeto de que las esporas adheridas a ellos por contaminación del a ire estén muertas. cosa que se puede también conseguir teniéndo­los esterilizados a la estufa a seco, envueltos en papel. Una vez seco el porta-objetos, se ca­lientan uno de ellos con la llama del mechero. de forma que la t emperatura sea alrededor de los 100° C. , y hecho ésto, lo depositamos hori· zontalmente sobre la mesa de trabajo, y sobre este porta-objetos echamos una gota de cultivo sólido calentado a 100° C., el cual lleva un 2

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NUEVO METODO DE MIOROOULTIVO SI

por 100 de agar (medio de SABOUREAUD, CZAPEK, medio de patata, etc.), y sobre esta gota, que se mantendrá líquida por el calor del porta­objetos, se hace pasar uno de los bordes del cu­bre-objetos de modo y manera que quede im­pregnado dicho borde con una fina capa de me­dio de cultivo. Conseguido ésto, los cubre-ob­jetos así preparados se dejan solidificar con el medio adherido en uno de sus bordes, ponién­dolos en posición inclinada y hacia abajo en un pequeño soporte de madera con ranuras y el todo cubierto con un pequeño cristalizador, cuyo interior previamente habremos flameado con el mechero.

L". operación anteriormente dicha se repite de igual forma, variando solamente la posición de los cubre-objetos en el momento de la de­secación, que esta segunda vez será con el bor­de impregnado hacia arriba; de esta forma con­ｒ･ｾｵｩｭｯｳ＠ una mayor fijeza del medio de culti-

Fig. l. P:ocerlimiento de mlcrocultivo en el borde de un ｰｯｲｴ｡Ｍｯ｢ｪ･ｴｯｾＮ＠ ｄｩｾｰｯｳｩ｣ｩｮ＠ en conjunto.

vo adherido al borde por este segundo baño de medio de cultivo.

Una vez seco este segundo baño de medio de cultivo, adherido a los cubre-objetos (lo que ocurre a los ｾｈ･ｺ＠ minutos), se hace pasar ese borde pcr encima de la colonia del Hifal en es­tado de esporulación y que deseamos estudiar de forma que algunas esporas queden ｡､ｨ･ｲ￭ｾ＠ｾ｡ｳ＠ a la pequeña banda de medio de cultivo su­Jeto al borde. ｄ･ｳｾｵ￩ｳ＠ de esta maniobra se pega este cu­

b:e-obJetos a uno de los porta-objetos por me­diO ｾ･＠ una ｾｯｴ｡＠ de bálsamo del Canadá, y trans­curridos qumce minutos, durante los cuales se mantendran el porta y el cubre horizontalmen­ｾ･＠ en una caja de Petri estéril, se pone el con­Junto así obtenido en una cubeta de las em­pl.eadas para teñir ｐＮｲ･ｰｾ｡｣ｩｯｮ･ｳ＠ histológicas Ｈｦｩｾｲ｡＠ 1), que permite mcubar varias prepa­ｲｾ｣ｩｏｮｾｳ＠ ｾ＠ ｾ｡＠ vez, en cuyo fondo ponemos algo­don h1drofllo empapado en agua estéril y ta-

pado todo ello con una placa de vidrio, después de lo cual se lleva a la estufa de 24° C., con observación diaria de los cultivos en desarrollo por exámen microscópico.

Al cabo de veinticuatro horas de cultivo po­dremos apreciar, por examen microscópico, el

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Fig. 2.- Alternaria.

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desarrollo de un pequeño micelio que hace pro­minen.cia del borde desarrollado de las esporas adheridas al medio de cultivo, y más ta1de, al cabo de cinco o siete días, podremos ver con el aumento que deseemos el desarrollo perfec­to de. ｾ＿､ｯ＠ el sistema del Hifal (figs. 2 y 3) , permitlendonos de esta forma una visión late­ral de todo el vegetal y apreciando la posición, color y forma de nacimiento del micelio, así

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Fig. 3.-Aspergillus niger.

como su tabicación y la posición de los coni­dióforos y esporas, y, por último, la tabicación de estas últimas, si las hubiere, caracteres to­dos ellos indispensables para el diagnóstico y clasificación de un Hüal.

Creemos que este método de microcultivo pue-

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de tener una gran difusión por su sencillez y poco coste, que, unido a la imagen lateral mi­croscópica con una visión clara de todos los elementos del hongo, le hacen fácilmente clasi­ficable, sobre todo si, unido a este método, se

emplea como complementario para ver la tabi­cación de las esporas la preparación del Hifa 1 entre porta y cubre-objetos con una gota de azul 1.lgodón.

RESUMEN.

Se describe un nuevo método de microculti­vo en el borde de un cubre-objetos, el cual da una visión microscópica perfecta y con pano­rama lateral clarísimo, que permite la clasifi­cación de cualquier Hifal y de algunos Ficomi­cetos.

SUMMARY

A new method is described for microcultiva­tion on the edge of a cover-glass which gives a

perfect microscopic sight with a very clear la­teral panorama, permitting of the classification of any Hifal and sorne Phycomicetus.

ZUSAMMENFASSUNG

Man be.schreibt eine neue Methode für Micro­kulturen am Rande eincs Deckglases, die ein perfektes microskopisches Bild mit ganz deut­lichem seitlichcm Panorama gibt. Hiermit kann man alle Hiphen und einige Phykomycecten klassifizieren.

RÉSUMÉ

On décrit une nouvellc méthode de micro-cul­ture sur le bord du couvreobjets, laquelle offre une vision microscopique parfaite et latéral tres clair qui permet la classification de n'importc quel Hyphale et de quelques Phicomicetes.

NOTAS CLINICAS

TROMBOSIS CRONICA AORTO-ILIACA (*)

V. SALLERAS

Hospital de la Santa Cruz y de San Pablo. Servicio de Cirugia General. (Prof. J. PUlG-SUREDA )

Cuando en 1923 ScHW ARTZ presentó a la So­ciedad de Cirugía Francesa una observación clí­nica que TuFFIER etiquetó de insuficiencia ar­terial esencial, LERICHE, al intervenir en su dis­cusión, atribuyó el síndrome a su causa verda­dera: la trombosis de la bifurcación aórtica, y dijo textualmente que "el tratamiento ideal consistía en resecar la zona obliterada, resta­bleciendo la permeabilidad arterial, si eso era posible; me parece, desgraciadamente, poco pro­bable que este ideal llegue a realizarse." Sin embargo, en 1940 el propio LERICHE, al indivi­dualizar como entidad clínica bien caracteriza­da el síndrome de trombosis crónica aorto-ilíaca, después de sistematizar magistralmente el cua­dro clínico, aporta dos casos, uno de ellos cons­tituyendo la primera observación hasta enton­ces publicada de aortectomía como tratamiento de la afección, aunque los resultados no fueron

(*) Comunicación presentada a la Academia de Cien­cias Médicas el 9 de enero de 1946.

lo brillantes que de una indicación precisa y de una t écnica quirúrgica impecable cabía es­perar, con lo que no hacían más que confirmar­se los pronósticos que muchos años antes emi­tiera él mismo.

A partir de esta primera publicación sobre el tema, van apareciendo en la literatur a mé­dica, en especial francesa y española, una ob­servación tras otra que confirman los concep­tos vertidos en el trabajo original del profesor de Estrasburgo, y que contribuyen a estable­cer de forma definitiva las características de todo orden. del que no dudamos en llamar "sín­drome de LERICHE".

MARTORELL, en 1942, aporta tres observacio­nes, en una de las cuales practica una aortecto­mía, con muerte del enfermo a los dos días, sin que en la necro pudiera encontrarse nada que explicase el desenlace. Al año siguiente MOREL publica un nuevo caso, seguido de éxito, y en 1944 CID DOS SANTOS y MARTORELL y V ALLS SERRA añaden tres más a la serie.

Finalmente, en 1945, la casuística aumenta notablemente. MARTORELL recoge en un trabajo recientemente publicado 9 observaciones pro­pias (dos de ellas de origen embólico), SERVELLE comunica un caso a la "Societé Médicale des Hópitaux" y LERICHE, al hacer en "l'Academie de Chirurgie" el "rapport" de una observación