Neuroprotección, neurogénesis y neurorrescate

NEUROGÉNESIS,NEUROPROTECCIÓN Y

NEURORRESCATE

Enrike G. Argandoña

Tarija 2010

sábado 29 de mayo de 2010

Patología SNC

TCEIctusTumoresPatologías neurodegenerativas


Patología SNC

TCEIctusTumoresPatologías neurodegenerativas

Vascularización


Neuroprotección mediante

enriquecimiento ambiental

Patologías neurodegenerativas

Parkinson

Alzheimer

Hungtinton

Ictus

TCEsábado 29 de mayo de 2010

NEUROGÉNESIS

Altman (1965), neurogenesis en ratas

Eriksson (1998), hipocampo humano

Gould (1999), neocortex primates adultos


NEUROGÉNESIS

Bulbo olfatorio

Giro dentado

áreas corticales?

Sustancia negra?

2 regiones fundamentales: ZSV y ZSG del giro dentado

NEUROGÉNESIS


TIPOS CELULARES

celulas troncales (multipotentes) y CPN (células precursoras neuronales)

CT generan muevas CT y CPNs

Origen:

epéndimo?

astrocitos? Parece mas plausible (Garcia-Verdugo)

Aisladas y cultivadas CT en cerebro humano post-mortem

O. ARIAS-CARRIÓN, ET AL

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sarrollo embrionario tardío y posnatal, las células de la glía ra-dial generan astrocitos [24,25] y, en algunas especies, la glíaradial mantiene sus propiedades precursoras aun en el animaladulto [26]. En este contexto, Merkle et al [27] demostraronque, en el adulto, las células de la glía radial provienen de lascélulas progenitoras de la ZSV.

Los estudios realizados sobre el origen de las neuronas cor-ticales apuntan hacia dos direcciones. La primera sugiere queson las células de la ZSV las que las originan, como sucede conlas nuevas neuronas granulares y periglomerulares del bulboolfatorio [28,29]. La segunda teoría se basa en el comporta-miento de células troncales que presentan las células de la glíaradial, las cuales generan neuronas y células gliales [30-33]. Enconjunto, estos datos apoyan la idea de que las células troncalesse desarrollan de un linaje neuroepitelial-glía radial-astrocítico(Fig. 3) [22,34].

Otro punto de controversia ha sido determinar si las nuevasneuronas originadas en el adulto provienen del mismo tipo decélulas neuroepiteliales que producen neuronas durante el de-sarrollo embrionario. Los tipos celulares retenidos dentro delneuroepitelio del sistema nervioso adulto, tales como las célulasependimales o las llamadas células de la glía radial, son proba-blemente los precursores neurales equiparables a las célulasneuroepiteliales embriónicas, de las cuales se derivan y son lasque conservan propiedades que les permiten responder a los pa-trones de señales inductoras de neurogénesis en el embrión [22,35,36]. Por tanto, las neuronas generadas en el adulto puedentener distintos precursores, siendo algunos de ellos cercanospero no directamente equivalentes a los del neuroepitelio em-brionario. Por lo anterior se cree que las células troncales en eladulto pueden ser más especializadas y solamente generar unrango limitado de subtipos neuronales. Además, estas célulasson incapaces de activar las cascadas de señalización que utili-zan las células troncales embrionarias y que involucran a las pro-teínas proneurales bHLH [36].

CÉLULAS TRONCALES/PROGENITORAS DE LA ZSV

Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos se forma, alo largo de los ventrículos laterales, una capa germinativa (lazona ventricular) rica en CPN que da origen a las neuronas quemigran hacia todas las estructuras del cerebro. A finales del de-sarrollo embrionario se origina otra capa de células germinati-vas, la ZSV, la cual está implicada también en generar nuevasneuronas. En el desarrollo posnatal disminuye progresivamentela generación de neuronas y, finalmente, en el cerebro adultodesaparece la zona ventricular germinativa y se mantienen úni-camente nichos de proliferación en la ZSV. En dichas regiones,las nuevas neuronas generadas migran a través de la vía rostralmigratoria (VRM) hacia el bulbo olfatorio (Fig. 4a), donde sediferencian en dos tipos de interneuronas: las células granularesy las células periglomerulares [37-40].

Diversas investigaciones han permitido determinar la pre-sencia y el fenotipo de las células troncales en la ZSV del cere-bro adulto de roedores [7,19,41,42]. Estudios cuantitativos indi-can que la tasa de neurogénesis en la ZSV del cerebro adulto derata es de aproximadamente 80.000 nuevas neuronas granularespor bulbo olfatorio, lo que representa el 1% de la población decélulas granulares olfatorias por día [43].

A partir de los estudios realizados se ha determinado que enla ZSV existen al menos cuatro tipos diferentes de células de

acuerdo con su morfología, ultraestructura, propiedades elec-trofisiológicas y marcadores específicos que permiten su identi-ficación (Fig. 4b). Estos tipos celulares son:

– Células ependimales ciliadas, o células tipo E, ubicadas ha-cia el lumen del ventrículo y que participan en la circulacióndel líquido cefalorraquídeo.

– Neuroblastos proliferativos, o células tipo A, que presentanmigración en cadena hacia el bulbo olfatorio.

– Células astrocíticas de proliferación lenta, o células tipo B.– Células transitorias amplificadoras, o células tipo C, con pro-

liferación activa y que forman cúmulos espaciados entre las ca-denas constituidas por las células tipo A en toda la ZSV [44].

La división de las células tipo B (astrocitos monociliados de laZSV) y C (células transitorias amplificadoras) sugiere que uno oambos tipos celulares están implicados en la generación de nue-vas neuronas (células tipo A o neuroblastos). Sin embargo, lascélulas tipo A son incapaces de autorrenovarse in vitro [45]. Aun-que se propuso que las CPN de la ZSV podrían ser células tipo E,Doetsch et al [19] y más recientemente Spassky et al [23] contra-dicen esta hipótesis y muestran a las células astrocíticas como lasprotagonistas de la neurogénesis en la ZSV. En los experimentosde Doetsch et al se observó que la administración del antimitóti-co citosina-!-D-arabinofuranósido (AraC) elimina las células ti-po A y C, pero no las células tipo B. Una vez que cesa el trata-miento con AraC, la población de células tipo C se regeneran yposteriormente se observa la formación de neuroblastos.

Figura 1. Cé lulas troncales con potencial capacidad neurogénica. La figu-ra muestra, en orden jerárquico, las cé lulas troncales que en los mam ífe-ros pueden dar origen a neuronas.


NEUROGENESIS

Vía migratoria al bulbo olfatorio

En hipocampo, se incorporan 250000 neuronas/mes (6%)

Participan en aprendizaje y memoria


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al bulbo olfatorio [39,40,47]. Los neu-roblastos presentes en la VRM mues-tran una morfología alargada y formancadenas entre ellos, lo que facilita sumigración hacia el bulbo olfatorio [39,48,49]. Estas cadenas de neuroblastosse desplazan entre estructuras tubula-res integradas por células gliales (as-trocitos), las cuales secretan factoresde crecimiento que favorecen el pro-ceso de migración [48,50,51]. Los tu-bos de células gliales (conocidos tam-bién como glía radial o glía de Berg-mann) [52,53] sirven de soporte direc-cional y contribuyen a la superviven-cia de los neuroblastos, evitando queéstos salgan prematuramente de las ru-tas de migración [44]. Los neuroblas-tos en migración presentan conos decrecimiento muy desarrollados y enproceso activo de extensión y retrac-ción, lo que sugiere que estas célulasutilizan los mismos mecanismos de lo-comoción usados por los axones encrecimiento [50].

Distintos estudios han demostradola importancia de las moléculas deadhesión (como las integrinas) y de lamatriz extracelular (como la tenascinay el sulfato de condrointina) en la mi-gración de los neuroblastos a lo largode la VRM [54-57]. Concretamente,la PSA-NCAM parece estar implica-da en el establecimiento de contactosentre los neuroblastos de las cadenasmigratorias y las células gliales queforman los tubos de neuroblastos [58].Además, la presencia de factores qui-miorrepulsivos –tales como los inhi-bidores migratorios Slits– en el áreaseptal parece desempeñar un papel im-portante en prevenir la migración delos neuroblastos hacia ciertas zonascerebrales [51].

Las nuevas interneuronas, gene-radas a partir de CPN de la ZSV delcerebro adulto que migran hacia elbulbo olfatorio por la VRM, presen-tan potenciales de acción de formaespontánea y reciben contactos sináp-ticos hasta que se integran a la redneuronal del bulbo olfatorio (Fig. 6).

Las nuevas interneuronas que seintegran a la capa periglomerular ex-presan marcadores neuronales y reci-ben contactos sinápticos una vez quese integran en los circuitos neuronales(Fig. 6) [46]. El continuo recambio delas interneuronas del bulbo olfatoriose modifica por cambios en el micro-ambiente o por modificaciones signi-

Figura 4. Neurogénesis en e l sistema zona subventricular (ZSV)-bulbo olfatorio: a) Vista sagital de l cere-bro de una rata adulta que muestra las cé lulas progenitoras neuronales (CPN) en la ZSV y su m igraciónhacia e l bulbo olfatorio; b) Secuencia de los tipos ce lulares involucrados en e l linaje neuronal y sus mar-cadores específicos (modificado de [26] y [53]).

Figura 5. Esquema sagital de l cerebro de una rata adulta que muestra la m igración tangencial y radialde las nuevas neuronas desde la zona subventricular (ZSV) hasta e l bulbo olfatorio siguiendo la vía ros-tral m igratoria (VRM). La m igración tangencial de las nuevas neuronas en la VRM se divide en tres fasessimultaneas: 1) Las cé lulas ya están m igrando, pero aún son capaces de dividirse; las cé lulas m igrato-rias con actividad m itótica se observan en las regiones más cercanas a la ZSV adyacente a los ventrícu-los laterales. 2) En un momento determ inado dentro de la VRM , las cé lulas salen de l ciclo ce lular y con-tinúan su proceso de m igración hacia e l bulbo olfatorio. 3) Una vez dentro de l bulbo olfatorio, las cé lulascambian su m igración tangencial por radial e invaden e l parénquima de esta estructura, diferenciándo-se en cé lulas granulares y periglomerulares. N O: nervio olfatorio; G l: cé lulas glomerulares; PG , cé lulasperiglomerulares; M: cé lulas m itrales; Gr: cé lulas granulares.

a

b


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al bulbo olfatorio [39,40,47]. Los neu-roblastos presentes en la VRM mues-tran una morfología alargada y formancadenas entre ellos, lo que facilita sumigración hacia el bulbo olfatorio [39,48,49]. Estas cadenas de neuroblastosse desplazan entre estructuras tubula-res integradas por células gliales (as-trocitos), las cuales secretan factoresde crecimiento que favorecen el pro-ceso de migración [48,50,51]. Los tu-bos de células gliales (conocidos tam-bién como glía radial o glía de Berg-mann) [52,53] sirven de soporte direc-cional y contribuyen a la superviven-cia de los neuroblastos, evitando queéstos salgan prematuramente de las ru-tas de migración [44]. Los neuroblas-tos en migración presentan conos decrecimiento muy desarrollados y enproceso activo de extensión y retrac-ción, lo que sugiere que estas célulasutilizan los mismos mecanismos de lo-comoción usados por los axones encrecimiento [50].

Distintos estudios han demostradola importancia de las moléculas deadhesión (como las integrinas) y de lamatriz extracelular (como la tenascinay el sulfato de condrointina) en la mi-gración de los neuroblastos a lo largode la VRM [54-57]. Concretamente,la PSA-NCAM parece estar implica-da en el establecimiento de contactosentre los neuroblastos de las cadenasmigratorias y las células gliales queforman los tubos de neuroblastos [58].Además, la presencia de factores qui-miorrepulsivos –tales como los inhi-bidores migratorios Slits– en el áreaseptal parece desempeñar un papel im-portante en prevenir la migración delos neuroblastos hacia ciertas zonascerebrales [51].

Las nuevas interneuronas, gene-radas a partir de CPN de la ZSV delcerebro adulto que migran hacia elbulbo olfatorio por la VRM, presen-tan potenciales de acción de formaespontánea y reciben contactos sináp-ticos hasta que se integran a la redneuronal del bulbo olfatorio (Fig. 6).

Las nuevas interneuronas que seintegran a la capa periglomerular ex-presan marcadores neuronales y reci-ben contactos sinápticos una vez quese integran en los circuitos neuronales(Fig. 6) [46]. El continuo recambio delas interneuronas del bulbo olfatoriose modifica por cambios en el micro-ambiente o por modificaciones signi-

Figura 4. Neurogénesis en e l sistema zona subventricular (ZSV)-bulbo olfatorio: a) Vista sagital de l cere-bro de una rata adulta que muestra las cé lulas progenitoras neuronales (CPN) en la ZSV y su m igraciónhacia e l bulbo olfatorio; b) Secuencia de los tipos ce lulares involucrados en e l linaje neuronal y sus mar-cadores específicos (modificado de [26] y [53]).

Figura 5. Esquema sagital de l cerebro de una rata adulta que muestra la m igración tangencial y radialde las nuevas neuronas desde la zona subventricular (ZSV) hasta e l bulbo olfatorio siguiendo la vía ros-tral m igratoria (VRM). La m igración tangencial de las nuevas neuronas en la VRM se divide en tres fasessimultaneas: 1) Las cé lulas ya están m igrando, pero aún son capaces de dividirse; las cé lulas m igrato-rias con actividad m itótica se observan en las regiones más cercanas a la ZSV adyacente a los ventrícu-los laterales. 2) En un momento determ inado dentro de la VRM , las cé lulas salen de l ciclo ce lular y con-tinúan su proceso de m igración hacia e l bulbo olfatorio. 3) Una vez dentro de l bulbo olfatorio, las cé lulascambian su m igración tangencial por radial e invaden e l parénquima de esta estructura, diferenciándo-se en cé lulas granulares y periglomerulares. N O: nervio olfatorio; G l: cé lulas glomerulares; PG , cé lulasperiglomerulares; M: cé lulas m itrales; Gr: cé lulas granulares.

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FACTORES REGULADORES

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Genéticos (Notch, BMO, Eph,...)

Factores de crecimiento (BDNF, IGF-I, VEGF, EPO) Administrando BDNF al ventrículo se incrementa la neurogenesis, el BDNF necesario para mantener el ritmo.

Neurotransmisores (Glutamato, serotonina, dopamina, noradrenalina) Sobre todo glutamato mediante el NMDA

Hormonas (estrogenos). Neurogénesis sube 65% durante embarazo con pico en el parto (prolactina)



Edad. Se reduce en Hipocampo, pero no en ZSV

Factores externos:

Reguladores positivos: Actividad física, ambientes enriquecidos, restricción calórica, modulacion actividad neuronal, antidepresivos, electroshock

Reguladores negativos: Stress, edad, glucocorticoides, drogas de abuso


ENRIQUECIMIENTO AMBIENTAL Y NEUROGÉNESIS

Ejercicio mejora el carácter y la cognición

Cambios vasculares, gliales, en neurotrofinas y en neurotransmisores

Tambien neurogenesis

Las celulas neoformadas implementan su morfologia

Mejora el aprendizaje (LTP)


ENRIQUECIMIENTO AMBIENTAL Y NEUROGÉNESIS

use of different lines of transgenic mice, their background

strain, gender, age, and degree of amyloid pathology.

Therefore, it may be of interest to examine neurogenesis inthe recently generated triple mutant mouse model of AD, in

which the mice express FAD, APP, and PS1 mutations

together with a tau mutation (Oddo et al. 2003). Thesemice show age-dependent Ab deposition and tau pathology

in the hippocampus and cerebral cortex, associated with

impaired synaptic plasticity and spatial learning (Halag-appa et al. 2007).

Similar to the disparate results under basal conditions,

there is a lack of concordance with regard to the effects ofexercise in mouse models of AD. Studies have found

beneficial effects of exercise on cognition and amyloid

deposits (Adlard et al. 2005), even after the onset ofpathology (Nichol et al. 2007), whereas other researchers

report no benefit of wheel running (Wolf et al. 2006;

Cracchiolo et al. 2007) on learning in APP mutant mice.Environmental enrichment has been reported by several

labs to improve cognition in mouse models of Alzheimer’s

disease (Jankowsky et al. 2005; Lazarov et al. 2005; Wolfet al. 2006; Costa et al. 2007; Cracchiolo et al. 2007).

Indeed, Lazarov and colleagues (2005) showed

that enrichment results in decreased Ab levels and amy-loid deposits, as well as in increased activity of the

Ab-degrading protease neprilysin.

In the studies where environmental enrichment and

exercise were compared directly in AD transgenic mouse

models, enrichment seems to be more beneficial for cog-nition than exercise (Wolf et al. 2006; Cracchiolo et al.

2007). Long-term exercise (8 months duration) did not

change the survival of new neurons in APP23 mice and didnot improve spatial performance in the water maze (Wolf

et al. 2006). However, in both studies where physical

activity was shown to not to be beneficial (Wolf et al.2006; Cracchiolo et al. 2007), mice were group housed.

Therefore, it is not clear how much each mouse ran and if

mice were still running after 8 months of housing with thewheel (Wolf et al. 2006). In addition, in the study by

Cracchiolo and colleagues it appears that in the physical

activity condition the mice are housed with a rotating dishand that only the enriched environment contains at least

two running wheels (Cracchiolo et al. 2007).

Huntington’s Disease

Neurogenesis has also been studied in the context of HD.

Similar to AD where cell genesis was reportedly increasedthe DG (Jin et al. 2004a), a post-mortem study of human

brains showed that neurogenesis may be enhanced in the

SVZ (Curtis et al. 2003). In addition, in excitotoxic modelsof HD cell genesis was found to be increased in the rodent

Fig. 1 Neurogenesis in the young and aged dentate gyrus. Young(3 months) and aged (19 months) male C57Bl/6 mice were injectedwith BrdU (50 mg/kg) daily for 1 week and perfused 4 weeks later(a–d). Confocal images of immunofluorescent triple-labeled sectionsfor BrdU (red), the neuronal marker NeuN (green), and the glialmarker S100b (blue), [BrdU-labeled neurons are orange (red plusgreen)]. Exercise enhanced neurogenesis in young (c) and aged (d)runners as compared to sedentary young (a) and aged (b) controls. In

another set of experiments, retrovirus expressing green fluorescentprotein (GFP) was injected into the dentate gyrus of young and agedrunners. Photomicrographs show GFP+ new neurons in young (e) andaged (f) running mice at 4 weeks after virus injection. The boxedareas in e and f correspond to the enlarged images of spines in young(g) and aged (h) mice (DAPI, blue), (van Praag et al. 2005).Copyright 2005 by the Society for Neuroscience

132 Neuromol Med (2008) 10:128–140


NEUROPROTECCIÓN

Reserva cognitiva:

Actividad física y mental reduce el riesgo de Alzheimer y otras demencias en humanos (epidemiologia)

Ratas:

Enriquecimiento ambiental

Ejercicio físico

Estimulación sensorial


NEUROPROTECCIÓNamount of A!40 (6.80 nmol/g control vs 13.56 nmol/g enriched;F(1,16) ! 55.15; p " 0.0001) (Fig. 2d).

Enrichment augments amyloid deposition inAPPswe/PS1dE9 miceSilver staining of brain sections verified that at the ages tested, thecortex and hippocampus of only double-transgenic APPswe/PS1dE9 mice contained amyloid plaques. Using nonbiased stere-ology, we estimated the fractional area of the hippocampus cov-ered by neuritic plaques in each double-transgenic animal.Ubiquitin immunohistochemistry, which identifies plaques bythe accumulation of this protein in dystrophic neurites, was cho-sen for stereology because it labels plaques with well defined bor-ders and little nonspecific background as required for counting athigh-power magnification. Consistent with the A! levels ob-served by ELISA (Fig. 2), the area occupied by neuritic plaques inenriched APPswe/PS1dE9 mice was 25% greater than instandard-housed double-transgenic animals ( p " 0.005) (Fig. 3).Importantly, the variance in neuritic plaque measures was nogreater in the enriched mice than in standard-housed controls(1.415 vs 0.748%; p ! 0.20), suggesting that the wide range inneuritic plaque burden observed in our previous study of hybridanimals (Jankowsky et al., 2003) was influenced by genetic vari-ation between individuals.

DiscussionIn the present study, we show that environmental enrichmentsignificantly improves several measures of cognitive performancein a mouse model of Alzheimer’s disease. Transgenic animalsoverproducing APPswe and A! kept in standard cages show sub-stantial cognitive deficits in learning and memory compared withtheir NTg littermates. Exposure to complex housing before theonset of amyloid formation essentially eliminates these deficits inAPPswe single-transgenic mice, consistent with a previous,more-limited study of similar mice (Arendash et al., 2004). Weshow that enrichment also enhances the performance of APPswe/PS1dE9 mice with fulminant amyloid pathology, although theirimprovement was more limited. This behavioral recovery oc-curred in the enriched mice despite elevated steady-state levels ofboth endogenous- and transgene-derived A!. We suggest thatthis outcome is consistent with the theory of cognitive reserve inhuman patients; the enriched mice were able to withstand agreater degree of pathological insult than their standard-housedcounterparts with less cognitive decline. Our findings show thatenvironmental factors can strongly modulate the pathologicaland behavioral progression of Alzheimer’s in a mouse model thatrecapitulates these aspects of the disease.

Several decades of work have established that environmental en-richment can dramatically improve the cognitive abilities of healthyanimals. Recent studies have shown that environmental stimulationalso aids recovery from multiple forms of brain injury, includingtraumatic brain lesion (Will et al., 1977; Kolb and Gibb, 1991; Rose etal., 1993; van Praag et al., 2000, and references therein), status epi-lepticus (Faverjon et al., 2002; Rutten et al., 2002), and ischemia(Farrell et al., 2001; Dahlqvist et al., 2004; Gobbo and O’Mara, 2004).Enrichment also rectifies genetically induced cognitive deficits, suchas those associated with hippocampal deletion of NMDA receptor 1(Rampon et al., 2000). Even innate cognitive decline associated withaging is forestalled by exposure to enriched housing (Kubanis et al.,1982; Soffie et al., 1999; Frick and Fernandez, 2003). Our findingsdemonstrate that the benefits of environmental enrichment also ex-tend to a mouse model for Alzheimer’s disease, in which exposure to

environmental stimulation can abate the behavioral consequencesof APPswe and/or A! overproduction.

In the course of this study, we discovered a previously unrec-ognized sexual dimorphism in the age at which cognitive deficitsfirst appear in C57BL/6 congenic mice overexpressing APPswe.We find that standard-housed female APPswe mice show signs ofcognitive decline by 8 months of age, long before the appearanceof amyloid deposits. In contrast, previous studies of male animalsfrom the same APPswe and PS1dE9 lines have found that cogni-tive deficits do not appear in male mice until much later, corre-sponding to the onset of amyloid deposition (Savonenko et al.,2005). We also note that in some transgenic mouse models (Cal-lahan et al., 2001), including ours (Wang et al., 2003), femalemice develop amyloid pathology earlier than males. Collectively,these data indicate that gender strongly influences the response to

Figure 3. Enriched mice develop more amyloid than age-matched controls. a– d, Hip-pocampal sections stained for amyloid with 4G8 (a, b) or Hirano modified silver (c, d). Theseimages were taken from an APPswe/PS1dE9 sibling pair separated after weaning into enriched(b, d) or standard (a, c) housing and killed at 9 months of age. Magnification, 100#. e, Ubiq-uitin immunostaining, which labels dystrophic neurites surrounding dense-core deposits, wasused to quantify amyloid burden by nonbiased stereology. Magnification, 400#. f, Averageplaque load (percentage of surface area occupied by ubiquitin-positive neuritic deposits) foreach animal (n ! 11 control; n ! 8 enriched). g, Average plaque load in each cohort. Error barsrepresent mean $ SEM. ***p " 0.005. h, Plaque load versus age at harvest for each animal.Most enriched mice have higher amyloid burdens than controls of similar age. EE, Enriched.

Jankowsky et al. • Enrichment Prevents Cognitive Decline in APP/PS1 Mice J. Neurosci., May 25, 2005 • 25(21):5217–5224 • 5221


NEUROPROTECCIÓN

Mecanismos celulares

Plasticidad sináptica

Neurogenesis

gliogénesis

angiogénesis


NEUROPROTECCIÓN

Moleculares

Modulación expresión génica

Neurotrofinas

Neurotransmisores

Sinaptogénesis

angiogénesis


Introducción

Entorno Enriquecido (EE)

“La combinación de objetos inanimados y la estimulación social” (Hebb, 1949)

Efectos celulares y moleculares sobre:

Plasticidad neuronal

Niveles de neurotrofinas

Genes neuroprotección

Efectos sobre el sistema visual Acelera el desarrollo


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Blackwell Publishing Ltd

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NEUROPROTECCIÓN

Entornomiméticos


NEURORRESCATE

Ictus 1 millón casos/año EU (25% de hombres y 20% mujeres sufrirán a los 85 años)

TBI

Especialmente en desarrollo

Material and methods

The cerebral cortexes of 30 anaesthesized Sprague-Dawley rats (weighing 200–250 g) were directlyexposed to an ultraviolet beam for 6 minutes througha 2!2mm left parietal craniotomy (for anaesthesia,Ketamine hydrochloride 15mg=100 g and Xylazinehydrochloride 2mg=100 g body weight were i.p.injected). An Osram-HBO-200 ultraviolet lamp wasused after a warm-up period of 10 minutes. The lampwas placed 15 cm above the cortexes. The skulls werecovered with reflective material in order to avoid theheat effect. Animals were monitored and vital param-eters during the experiments remained constant. Afterseveral survival times (1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48h,72 h, 1 week, 2 weeks and 1 month), groups of threeanimals were transcardially perfused with 4% freshparaformaldehyde solution in saline buffer phosphatesolution preceded by a washout with a 0.9% salinesolution. Five rats with a left parietal craniotomy werenot irradiated and were used as controls. Water andfood were available ad libitum. Every effort wasmade to minimise animal suffering and to reduce thenumber of animals used. All animal experiments wereperformed in accordance with the European Com-munity Council Directive of 24 November 1986(86=609=EEC).

After postfixation of the whole brain for 24 hours at4"C, histoprocessing of coronal sections including thelesion was performed. Routine 4-mm paraffin sliceswere obtained for histology (HE), lectins histochemis-try for LEA, and conventional immunohistochemistryfor Flk-1, GluT-1 and EBA.

Histochemistry of lectins

Paraffin was removed from the tissue through xyleneimmersion; the tissue was rehydrated with ethanol.Endogenous peroxidase activity was blocked by incu-bation in 4% H2O2=methanol for 20min. Sections werewashed in a Tris buffer at pH 7.4 and incubated over-night with biotinylated lectin from Lycopersiconesculentum (LEA 5mg=ml; SIGMA L0651) at 4"C.Sections were rinsed with a Tris buffer and incubatedwith avidin biotin peroxidase complex (Elite ABC kit,Vector laboratories, Burlingame, CA, USA). Finally,the reaction product was detected using 3,30-diamino-benzidine (DAB 0.25mg=ml) and hydrogen peroxidesolution (0.01%). Slides were lightly counterstainedwith haematoxylin, dehydrated and covered.

For immunohistochemistry, paraffin was removedfrom the tissue through xylene immersion; the tissuewas rehydrated with ethanol. Endogenous peroxidaseactivity was blocked with 4% H2O2=methanol for20min. Sections were kept in a Tris buffer at pH 7.4,then incubated for 30min. at 37"C in Trypsin 0.1%

CaCl2 for antigen retrieval. Sections were incubatedovernight with an anti-Flk-1 monoclonal antibody(A-3, m-Ab antiFlk-1, Santa Cruz, working dilution:1:1000), an anti-EBA monoclonal antibody (Sternber-ger Monoclonals SMI-71; working dilution: 1:2000)and anti GluT-1 polyclonal antibody (Chemicon AB1340 working dilution: 1:1000). Biotinylated secondaryantibodies were used (Vector, USA) and the immuno-histochemical reaction was revealed by the avidin-bio-tin complex using diaminobenzidine as a chromogen.Sections were lightly counterstained with haematoxylinand finally dehydrated and covered. Also included ineach staining run were negative controls in which theprimary antisera and the lectin were omitted.

To estimate the number of vascular profiles perarea, we counted the number of positive sections foreach marker in an area delimited by a grid fixed inthe eyepiece, excluding those intersected by boththe X and Y axes. The grid was a square 250mm inlength, and thus the total surface was 62.500mm2 at20!magnification, randomly placed to demarcate 6different fields in every affected region (lesion centre,marginal zone and remote area, Lafuente et al., 1994)on consecutive slices. The average values per group andregion were compared via variance analysis (ANOVA)on Statview IITM (Abacus Concepts, USA).

Results

No animal died as a result of the surgery norbefore the established survival times, andall recovered without complications or func-tional deficits. Neuropathological changeswere examined by HE staining in order to

Fig. 1. Schematic representation of a coronal sectionthrough the centre of the cortical lesion showing thethree considered areas, 1. the core of the lesion, 2. the

marginal region and 3. the edematised areas

Flk-1 distribution related to BBB markers in brain injury 489


Objetivos terapeúticos

Neuroprotección/neurorescateIncremento vascularización


TCE en Desarrollo

Mayor capacidad de plasticidad

Interferencia en los mecanismos fisiológicos

Apoptosis

Plasticidad sináptica (NMDA)


Effectos de la administración e inhibición del VEGF en la corteza visual de ratas en desarrollo

Linea de trabajo


Introducción

Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF)

Angiogénesis

Angioneurina Neurogénesis Neuroprotección

Proliferación astroglial


Introducción

Muerte celular programada durante el desarrollo

Texto


VEGF infusion

18 dpn Long Evans rats

Alzet minipumps for 1 week at a 1 µl /h rate.VEGF. 25 ng/ml.

anti-VEGF. 25 µg/ml.

PBS.

Untreated rats.


Minipump placement


EBA


HSP-70


GFAP


Vascular density


Vascular density

0

12,5

25,0

37,5

50,0

Ipsilateral cortex Contralateral cortex18 dpn PBS aVEGF VEGF 25 dpn 18 dpn PBS aVEGF VEGF 25 dpn

4646

3835

3130

2729

2626


Neuronal density


Neu

rona

l Den

sity

(Op

tica

l dis

sect

or)


Neuronal density

0

27.500

55.000

82.500

110.000

Ipsilateral cortex Contralateral cortex18 dpn PBS aVEGF VEGF 25 dpn 18 dpn PBS aVEGF VEGF 25 dpn

82.16182.161

102.15895.775

85.839

75.425

86.54286.60890.52090.520


Estrategia sinergikoa?

P0 P18 P25

VEGF

PBS

Kontrolak

SC-SC

SC-EE

EE-SC

EE-EE


Caspase-3


Material y Métodos

Histoquimia

- Butiril Colinesterasa

Inmunohistoquimia

Microscopia óptica

- NeuN

- Caspasa-3 activa

Microscopia confocal

- Glutamina sintetasa/Caspasa-3 activa

- MAP-2/Caspasa-3 activa


Material y Métodos

Morfometría

Cuantificación de la densidad vascular (a), densidad neuronal (b) y la densidad de células Caspasa-3 activa (c).


Resultados

Cualitativos

Glutamina sintetasa/Caspasa-3 activa MAP-2/Caspasa-3 activa


Densidad vascular

15000

17500

20000

22500

25000

SC-SC SC-EE EE-SC EE-EE

Ipsilateral

nº v

asos

/mm

3

controlVEGFPBS

Resultados

Ipsilateral

15000

17500

20000

22500

25000


Contralateral

nº v

asos

/mm

3

controlVEGFPBS

Contralateral


50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000


Densidad neuronal (CL)

nº n

euro

nas/

mm

3

controlVEGFPBS

Densidad neuronal

Resultados

50000

67500

85000

102500

120000


Densidad neuronal (IL)

nº n

euro

nas/

mm

3

control VEGF PBS

Ipsilateral

Contralateral


Resultados

Densidad células Caspasa-3 activa

12000

13833

15667

17500

19333

21167

23000


Densidad Caspasa-3 activa (IL)

nº c

élul

as c

aspa

sa-3

/mm

3

controlVEGFPBS

12000

15250

18500

21750

25000


Densidad Caspasa-3 activa (CL)

nº c

élul

as c

aspa

sa-3

/mm

3

controlVEGFPBS

Ipsilateral

Contralateral


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50


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Neuroprotección, neurogénesis y neurorrescate

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