IMPORTANCIA CLINICA DE CUANTIFICACION DE CELULAS NATURAL KILLER SUBPOBLACION LINFOCITARIADr. Edgar Matos BenavidesMdico Inmunlogo

Las clulas NK participan activamente en la defensa del organismo frente a infecciones, principalmente de tipo viral y frente al crecimiento de clulas tumorales.

DIFERENCIACIN DE LAS CLULAS NK

Las clulas NK, a diferencia de lo que ocurre con los linfocitos de la inmunidad adaptativa circulan en un estado de activacin parcial, listas para penetrar y actuar en los tejidos infectados en cuanto los macrfagos den la alarma

Diferencias funcionales entre Clulas NK y linfocitos T

FUNCION DE CELULAS NK

FUNCION DE CELULAS NKHoy se sabe que las clulas NK mas positivas para el CD56 (CD56bright) poseen mayor capacidad para producir citocinas que las clulas mas dbiles para esta molcula (CD56dim). A su vez las clulas NK CD56dim poseen mayor capacidad citotxica que las CD56 bright

RECEPTORES DE CLULAS NKla accin final de las clulas NK depende del equilibrio entre las seales inhibidoras y activadoras procedentes de sus receptores de superficie.

Receptores de tipo activante en clulas NK

Receptores de tipo Inhibitorios en clulas NK

INMUNOPATOLOGIA DE LAS CLULAS NK.Son de especial importancia en las primeras fases de la infeccin, especialmente frente a virus, de ah que cuando estas clulas no actan correctamente, el individuo se hace ms vulnerable a las infecciones virales. Ejm HIV.

INMUNOPATOLOGIA DE LAS CLULAS NKDe igual manera ha podido ser comprobado que las clulas NK infiltrantes de tumores poseen menor capacidad citoltica que las clulas NK normales, probablemente por un aumento de expresin de receptores de tipo inhibidor.

INMUNOPATOLOGIA DE LAS CLULAS NKPor otra parte una excesiva capacidad citotxica de las clulas NK puede inducir estados de prdida de la tolerancia normal y contribuir al desarrollo de enfermedades de tipo autoinmune.

INMUNOPATOLOGIA DE LAS CLULAS NK.

IMPORTANCIA CLNICASe ha visto que las clulas NK, pueden ser utilizadas en terapia antitumoral.Para ello despus de su extraccin del individuo y cultivo con iL-2, IL-12 o IL-15, son posteriormente reinyectadas en el enfermo en forma de clulas LAK (citokyne activated lymphocytes).

INMUNOTERAPIA

APLICACIN DE TUMINMUNE

MODELO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

INCREMENTO DE NK

En enfermos con SIDA, tambin se esta tratando de potenciar la respuesta inmune innata y en especial estas clulas NK, mediante la administracin de IL-2, con resultados que son prometedores

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIASObjetivos: Establecer los Intervalos de Referencia (IRs) de Linfocitos CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD19+ y CD56+, en adultos sanos de la ciudad de Lima, Per.

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIASMtodos: Se emplearon criterios basados en la gua (CLSI C28-A3), 318 muestras de donantes de sangre aptos, con serologa negativa a marcadores de VIH, Hepatitis B, Hepatitis C, Sfilis, HTLV, Enfermedad de Chagas y Protena C Reactiva,

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS(121 mujeres y 197 varones, edad: 18-55 aos). Los recuentos de las Subpoblaciones Linfocitarias (SPL) fueron realizados en un citmetro de flujo de plataforma simple (Cytomics FC500 MCL-Beckman Coulter);

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIASResultados:

INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIASDr. Edgar Matos BenavidesMdico Inmunlogo

Clase N 15: Fisiologa de la sangre (1 parte) Fisiologa Humana (Ciencias de la actividad fsica y del deporte)

Para establecer el diagnstico de certeza de una IDP, se necesitan dos factores: Pensar en esta posibilidadContar con un laboratorio de diagnstico especializado

EVOLUCION DE DIAGNOSTICO DE IDPS EN LATINOAMERICALeiva et al. J.Clin. Inmunol,27(1):101,2012

El sistema inmune tiene 2 tipos de respuesta

TIEMPO DESPUES DE LA INFECCIONINNATA

TIEMPO DESPUES DE LA INFECCIONADAPTATIVA

ANALISIS BASICO DE INMUNODEFICIENCIAS

LINFOCITOS BLINFOCITOS TCOMPLEMENTOPMNNKCuantificacin de Inmunoglobulinas

Determinacin de subclases de IG

Deter Linfocitos B

anticuerpos especficos (vacunacin pre / post) anticuerpos Anti-diphteria/tetanus

anticuerpos anti-polisacrido de neumococoIsohemaglutininasRecuento de Linfocitos Totales

Rx Trax Lateral

Pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada

Determinacion de CD3, CD4,CD8

OTROSDet de CH50

Determinacin C3

Determinacin. C4

OTROSNeutrfilos Absolutos

NBT

123 DHRQuimiotaxisFenotipos leucocitarios (CD11a/CD18) Citometria de flujo CD!6

CD56

CD19

Clasificacin de las IDPs EjemplosClasificacin de la Unin Internacional de Sociedades de Inmunologia (IUIS) 2011

Clasificacin de las IDPs EjemplosClasificacin de la Unin Internacional de Sociedades de Inmunologia (IUIS) 201

Infecciones recidivantes de las vas respiratorias superiores y/o inferiores, tales como: otitis, sinusitis, neumona, bronquitis.Infecciones severas: meningitis, sepsisLos grmenes capsulados de mayor relevancia clnica son:Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, NeisseriameningitidisExisten 90 serotipos identificados por tipificacin capsular: 10 - 12 son responsables del 80% de las infecciones invasivas23 VALENTE1,2,3,4,5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F,14, 15B, 17F, 18C,19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33FCONJUGADA4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F + TT o TDVALORACION DE RESPUESTA INMUNE HUMORAL

VALORACION DE RESPUESTA INMUNE HUMORAL

VALORACION DE RESPUESTA INMUNE HUMORAL

DEFECTOS EN LA RESPUESTA INMUNE CELULAR O DE LTHay que tomar en cuenta que la biometra hemtica completa o hemograma normal, no descarta la IDPs.Por lo anterior, el mdico deber solicitar citometra de flujo de algunas protenas celulares reportadas como CD

DEFECTOS EN LA RESPUESTA INMUNE CELULAR O DE LTPara medir la funcin de los neutrfilos la primera prueba de laboratorio es la prueba de nitroazul de tetrazolium o NBT (del ingls Nitroblue Tetrazolium).

DEFECTOS EN LA RESPUESTA INMUNE CELULAR O DE LTEsta prueba determina la habilidad de los neutrfilos activados para producir radicales de oxgeno que reducen al NBT a una tincin azul insoluble, que puede ser vista al microscopio en los neutrfilos.

DEFECTOS EN LA RESPUESTA INMUNE CELULAR O DE LTEn neutrfilos, durante la destruccin de los microorganismos fagocitados, se produce la formacin de molculas altamente reactivas (ion superxido y perxido de hidrgeno), en gran parte gracias a la actividad cataltica de la NADPH oxidasa, fenmeno denominado estallido respiratorio (ER).

Oxigeno Molecular O2Radical superoxido O2-H2O2HOClOH-Destruccion de Bacterias y hongos fagocitado

RESULTADOS:PMN (Eventos contados) MFIMuestra basal: 5000 225 Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 29 955Muestra con estimulo PMA: 5000 993 441

NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 33

Muestra Normal

PMN (Eventos contados) MFIMuestra Basal: 5000 1 151Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 8 214Muestra con estimulo PMA: 5000 11 827NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 1.4Muestra de Paciente con EGC

Las IDP son patologas que ameritan mayor atencin por los gobiernos y las instituciones acadmicas y asistenciales en el Per.El diagnstico temprano y manejo adecuado de las IDP resulta en una mejora de la calidad de vida de los pacientes afectados y en una disminucin de los gastos para el sistema de salud.

Estimular a LASID para el establecimiento de una red de laboratorios que realicen pruebas diagnsticas no realizadas en el pas

DIAGNOSTICO DE INFERTILIDAD POR CITOMETRIA DE FLUJODr. Edgar Matos BenavidesMdico Inmunologo

Clase N 15: Fisiologa de la sangre (1 parte) Fisiologa Humana (Ciencias de la actividad fsica y del deporte)

La infertilidad es la incapacidad de la pareja de lograr una gestacin que lleve al nacimiento de un hijo, despus de un ao de mantener relaciones sexuales sin mtodos de planificacin.

La infertilidad es un problema de pareja y no es una enfermedad, sino consecuencia de una o varias enfermedades

Afecta 10-15 % de la poblacin.1 de cada 6 o 7 parejas consultan por esterilidad50 % de las parejas presentan un factor masculino aislado o asociado a un factor femenino complementario

American Journal of Obstetrics & Gynecology 2012 Vol 234 ,45

Una pareja sana tiene el 20% de probabilidad mensual de lograr embarazo que al cabo de un ao se transforma en una probabilidad acumulativa del 97%100 PAREJAS EXPUESTAS A EMBARAZO 50 EMBARAZAN EN PRIMER SEMESTRE 30 EN EL SEGUNDO 20 DESPUES DEL AOAmerican Journal of Obstetrics & Gynecology 2012 Vol 234 ,45

Cuando comenzar el estudio ?Luego de un ao de relaciones regulares sin ningn mtodo anticonceptivoLuego de 6 meses de bsqueda en mujeres mayores de 35 aos

PACIENTES QUE REQUIEREN MANEJO POR INMUNOLOGIALa siguiente tabla es una prueba que determina que pacientes requieren de inmunoterapia.

CALIFICACION1.- 0 a 5 puntos: Sin riesgo.2.- 5 a 10 puntos: Riesgo leve3.- 10 a 15 Puntos: Riesgo moderado4.- > 15 puntos: Alto riesgo

PERDIDA GESTACIONAL RECURRENTE DE ORIGEN INMUNEExisten 5 categoras de problemas inmunolgicos que pueden causar prdidas recurrentes de la gestacin, falla en ciclos de IVF e infertilidad. La categora I es la menos severa y la categora 5 es la ms grave. Sin tratamiento un paciente en categora I presentar abortos recurrentes lo cual puede activar otras categoras como 2, 3, 4 o 5.

Categora I Compatibilidad al HLA como causa de prdida gestacional recurrente

Categora 2de Problemas Inmunolgicos.Anticuerpos antifosfolpidos (APA).Abortos recurrentes, fallas en IVF, endometriosis y otras causas, pueden inducir la formacin de anticuerpos contra los fosfolpidos.Los APA evitan la formacin del sincitiotrofoblasto lo cual retarda el crecimiento del bebe produciendo muerte fetal temprana hasta en un 97%

de los casos, pero tambin puede causar muerte fetal en etapas tardas de la gestacin.

Categora 3 de problemas inmunolgicos: Ac contra DNA

Los anticuerpos contra DNA, histonas y polinulceotidos pueden ser detctados en una muestra de sangre.Los ttulos por arriba de 1:40 son significantes. Los patrones obtenidos son reportados de la siguiente manera:Homogneo:Atc contra SS-DNA y dd-DNA Nucleolar: Atc contra polinucleotidos. Moteado: Atc contra Histnas.

Categora 4 Respuesta autoimmune a los antgenos espermticos.El 10 % de la mujeres con problemas de infertilidad, falla de implantacin y perdidas recurrentes del embarazo, producen anticuerpos espermticos, Cuando esto sucede , la pareja es incapaz de concebir normalmente

Cuando la mujer desarrolla anticuerpos antiesperma estos pueden estar inactivos o atacar los espermas del esposo o de un donador. Estos anticuerpos pueden ser detectados en una muestra de sangreimmunobead binding antisperm antibody assay, y Citometra de flujo para deteccin de Atc. AE que se considera el GE

Categora 5 de problema inmunolgico. Existen mltiples variedades de linfocitos designados con las siglas CD, que conforman el sistema inmune. Una funcin balanceada se tienen en una persona sana. Dos de ellas pueden producir infertilidad, falla de implantacin y aborto. La mujer nace con ellas .En algunas mujeres incrementas su numero y actividad resultando en falla reproductiva.

Disregulacion LinfocitariaTH-2 ("T Helper 2") La respuesta es balanceada correctamente durante el Embarazo TH-1 ("T Helper 1") La respuesta es citotoxica autoimmune, respuesta que nos lleva a la infertilidad, falla de implantacin y aborto CD3, CD4, CD8 Producen anticuerpos bloqueadores y una respuesta correcta.

Disregulacion LinfocitariaCD19+ 5+ Produce anticuerpos antifosfolipidos CD19+ 5+, CD3, CD8 Producen anti DNA y anticuerpos histonas CD19+ 5+ Producen anticuerpos antiespermas. CD56, CD57 CD16 son clulas asesinas naturales.

Un aumento del 2 -12% es normal. Por arriba del 12% produce infertilidad y perdida gestacional. La citotoxicidad se valora mediante Determinacion de NK por citometria de flujo.La Citotoxicidad mayor del 15% o en una dilucin 50:1 pueden daar el embrin. Producen citoquinas toxicas (TH-1 citoquinas) incluyendo el factor de necrosis tumoral alfa.

La mayor edad paterna esta implicada en alteraciones, reproductivas y genticas, que incluyen: Disminucin de la calidad seminal,Aumento de la fragmentacin del ADN en los espermatozoides eyaculados, Disminucin de la fertilidad,

Aumento de la frecuencia de abortos espontneos Mayor incidencia de algunas enfermedades genticas

Un creciente nmero de trabajos reportan una asociacin entre la mayor edad en el varn y el aumento de espermatozoides eyaculados que presentan dao en el ADN nuclear.. Se sugiere, como posibles factores involucrados, a las alteraciones de la apoptosis testicular y a la disminucin de los mecanismos de defensa antioxidante

Se han desarrollado varios procedimientos para detectar rupturas de hebra simple o doble en el ADN espermtico. Estas incluyen mtodosDirectos, TNEL Cometa

Indirectoscomo el anlisis de la estructura de la cromatina (SCSA). evala la susceptibilidad de los espermatozoides a la denaturacin acida. En general, estos procedimientos son complejas y se realizan por citometra de Flujo

Clase N 15: Fisiologa de la sangre (1 parte) Fisiologa Humana (Ciencias de la actividad fsica y del deporte)

Qu es La Alergia?

PROCESO INMUNOLOGICO2Fase Formacin de Anticuerpos

1 Fase de Reconocimiento

3Fase Reaccin Ag-Ac

4 fase proceso Proinflamatoria

Reaccion de Hipersensibilidad Tipo 1

Componentes principales que se requieren para que la reaccin alrgica se desencadene

IgE

ALERGENOS

Mastocitos

HistaminaLeucotrienos

COMO SE Dx ALERGIAS2PRUEBAS CUTANEASIg E Srica

1 HISTORIA CLINICA

3PRUEBAS DE PROVOCACIONTEST DE ACTIVACION BASOFILOS

BASOFILOS

TAB

CITOMETRIA DE FLUJO

CITOMETRIA DE FLUJOProcedimiento que mide caractersticas de dispersin y fluorescencia que poseen las clulas conforme pasan por un rayo de luzLas clulas interaccionan con un rayo de luz causando dispersin dependiendo del tamao y la complejidad

CITOMETRIA DE FLUJODIGITALIZACION REPRESENTACION GRAFICA ANALISIS

Clase N 15: Fisiologa de la sangre (1 parte) Fisiologa Humana (Ciencias de la actividad fsica y del deporte)

Test de Activacion de Basofilos (TAB)Es una herramienta til en el diagnstico in vitro de las reacciones de hipersensibilidad inmediata a los Alergenos, Medicamentos, si estas son causados por mecanismos dependientes de IgE u otros mecanismos que conduzcan a la liberacin de histamina.

MARCADORES CELULARESCD63CD203cEs una protena granular tetraespan de 53 Kda Est anclada en los grnulos de la membrana de los basfilos Por CM se detecta Anti CD63 PE y anti IgE FITC

Es un Ag de superficie, expresado en basfilos humanos recientemente reconocida por el Acm 97A6Es una ectoenzima multifuncional llamada pirofosfatasa ectonucleotide phophodiesterase 3 (E-NPP3)

Fuente: Expert Rev Clin Immunol 2011 Expert Reviews LtdFuente: Expert Rev Clin Immunol 2011A Se observa el entrecruzamiento de la IgE unido a la membrana, del basfilos en estado de inactivacin B Activacin especfica de basfilos y sobreexpresin de CD63 y CD203.c,

AB

La poblacin celular de inters se marca con anticuerpos monoclonales en presencia del alrgeno. Previamente al anlisis por citometra de flujo, los eritrocitos se someten a lisis. A continuacin se excluyen los linfocitos T (clulas positivas CD3) y despus se analizan los basfilos utilizando la expresin de CRTH2 y CD203c. Los basfilos no activados y en reposo se identifican como CRTH2posCD203cdimCD3neg, mientras que los basfilos activados in vitro se identifican como CRTH2posCD203cbrightCD3neg. FUNDAMENTO

muestra

En un estudio multicntrico realizado por la Red Europea de Alergia a Medicamentos (ENDA), fueron analizados los resultados de 181 pacientes con una historia de reaccin alrgica tipo inmediata a beta-lactmicos y 81 controles. La sensibilidad de BAT fue del 60% y la especificidad vari de 89 a 97%.Mara L. Sanz et al. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2009; 9: 298-304

.Se compar la activacin de los basofilos usando el CD 203 y CD63 en el diagnostico de alergia al ltex ,se encontr que la sensibilidad fue considerablemente mayor con CD203c (75% frente al 50% con CD63).Boumiza R, Monneret G, Foreseer MF, Savoye J, Gutowski MC, Powell WS, Bienvenu J: Marked improvement of the basophil activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clin Exp Allergy 2003, 33:259-265

DISCUSIONLa BAT constituye una herramienta diagnstica valiosa de inters en el estudio de reacciones de hipersensibilidad inmediata a los medicamentos. Reproduce in vitro mecanismos de hipersensibilidad involucrados en reacciones alrgicas inmediatas.

Tambin permite el diagnstico de reacciones alrgicas y pseudoalrgicas, particularmente por medicamentos que a menudo no son detectables por tcnicas serolgicas como la determinacin de IgE especfica.

DISCUSIONLa reproducibilidad intra-ensayo es muy notable en la alergia a medicamentos con coeficiente de variacin intra-ensayo de 0.89 (P

DISCUSIONAdems, varios medicamentos pueden ser probados simultneamente, con una pequea cantidad de sangre La colaboracin internacional ser til para facilitar un consenso sobre el uso de BAT en la evaluacin de alergia inmediata a medicamentos.

GRACIAS

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