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N-acylamino acid racemase 酵素性質之改造及酵素生理功能的研究

(2/3) 計畫編號：NSC 92－2313－B－002－092

執行期間：92 年 08 月 01 日 至 93 年 07 月 31 日

計畫主持人：李佳音(國立臺灣大學農業化學系暨研究所)

中文摘要

本研究以定點突變法之方式，結合突變 PCR 所獲得有益的點突變 V81I、E218G 及 E116K，以提升 N-醯化胺基酸消旋酶的催化活性。研究結果顯示，同

時具有 E218G 及 E116K 兩處胺基酸突變位置之突變酵素 2B-1，其酵素的相對活

性較野生型酵素明顯提升 10 倍；而同時擁有突變點 V81I、E218G 及 E116K 三

處胺基酸突變點的酵素，其酵素的相對活性則提升了 8 倍；擁有突變點 V81I 及E116K 二處胺基酸突變點的酵素，其酵素的相對活性只提升了 2.1 倍。此結果顯

示，突變點 E218G 及 E116K 對於酵素活性有明顯提升的效果。蛋白質結構模擬

顯示，突變點 E116K 及 E218G 雖未位處酵素催化活性中心，但 E116K 位於連結

酵素單元體(subunit)之 TIM barrel domain 及 N-terminal domain 的 loop 上，而

E218G 胺基酸價電性質的改變與鄰近胺基酸的影響，均會使酵素與基質的鍵結特

性發生變化，使得酵素對反應基質的催化能力獲得不同程度的改善。

關鍵詞：定點突變、蛋白質結構模擬

Abstract

The enzyme activity of N-acylamino acid racemase is substantial enhanced by introducing beneficial point mutations obtained from error-prone PCR results. Point mutations E218G and E116K simultaneously introduced into N-acylamino acid racemese lead to relative enzyme activity enhaced 10 fold compared with wild type enzyme. However, evolved enzymes contained three point mutations, V81I, E218G, and 116K or two point mutations, E218G and E116K, the relative enzyme activity were enhanced up to 8 folds and 2.1 folds, respectively. The results elucidate that the point mutations E218G and E116K are the effective mutation for enhance enzyme activity. Protein modeling result indicates that E218G and E116K were not localized at the enzyme catalytic site. However, E116K is located on the loop structure of TIM barrel domain of N-terminal domain. The change of electric charge of E218G would affect the interaction between enzyme and substrate that would improve the enzyme activity.

Keyword: site-directed mutagensis, protein modeling

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ㄧ、前 言

在先前的研究中，由 Amycolatopsis azurea CCRC13413 選殖得到 N-醯化胺基

酸消旋酶基因，並進行其酵素特性分析與功能的探討。N-醯化胺基酸消旋酶在光

學活性胺基酸的生產上，具應用潛力。然而目前為止，N-醯化胺基酸消旋酶因為

催化特性的問題，例如：基質濃度抑制現象，酵素催化活性等問題，還未能大量

被運用於工業化生產光學活性胺基酸 (Palmer et al., 1999)。

天然獲得的酵素蛋白質，通常不易達到應用目的的需求。以目前的重組 DNA技術，雖可有效的改變酵素蛋白質分子的各項特性，包括活性等，但是，由於對

酵素的蛋白質結構瞭解尚不充足，往往無法有效的設計、改造出應用上所需之酵

素功能。相較於定點突變法 (site-directed mutagenesis)，“定向演化”法 (directed evolution) 提供一改變酵素功能更有效的方式，尤其當欲進行改造之酵素欠缺其

蛋白質結構資訊時，更顯其效能 (Arnold, 2001)。定向演化法目前已被廣泛應用，

包括蛋白質工程技術 (Stemmer, 1994. Crameri et al.,1998)、疫苗的開發 (Patten et al., 1997) 及代謝工程等。簡述其進行之過程，首先，藉由突變式 PCR (mutagenic , error prone PCR)，DNA 隨機重組 (DNA shuffling) 等方式，製備大量的隨機突變

樣品，再搭配有效率的篩選方式，挑出具有預期反應的改造酵素。由於 N-醯化

胺基酸消旋酶在應用上，仍有部份催化特性須作改善，故本研究，乃針對酵素的

催化活性，以結合突變 PCR 所到的結果提升酵素活性。再結合蛋白質結構模擬

之方式，試圖提供酵素性質提升的可能解釋，最終評估酵素活性的改善狀況與突

變胺基酸之關聯性。

二、研究方法

定點突變之操作方法

使用 QuickChange (Stratagene, La Jolla,CA) 定點突變反應套組進行實驗。個

別不同的突變 PCR 反應引子，依據所需的突變點進行設計，如表一所示。PCR反應於 GeneAmp PCR 9700 (PE Applied Biosystems)進行，溫度條件如下：95℃，

30 秒將 DNA 變性，隨後，進行 12 個重複循環，分別為 95℃，30 秒、55℃，1分鐘及 68℃，8 分 30 秒。50 µl 的 PCR 反應液內容物包含 1X PCR 反應緩衝液，

50 ng DNA 模板，各為 200 ng 之 PCR 反應引子， 套組內附的 dNTPs 1 µl 以及

1 µl pfu Turbo DNA 聚合酶。PCR 反應後之產物，以 Dpn I 反應一小時後，取 2 µl DNA 轉形送入 E. coli XL1-Blue，塗抹培養於有抗生素 ampicillin 100 µg ml-1 的

Luria-Bertani 固態培養基上培養，挑取的突變篩選菌株，再由 DNA 定序確認其

突變點。

DNA 定序及序列分析

在重組質體 pAr1 上的 N-醯化胺基酸消旋酶基因序列以 dideoxynucleotide

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chain-termination 方式(Sanger et al. 1977)，利用 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 及 ABI PRISM 377-96 DNA 定序儀 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Faster city, CA, USA) 完成定序工作。本篇研究

之 DNA 序列資訊已放置於 DDBJ/EMBL/GenBank 序列資料庫中，序列搜尋代

號為 AF335269。胺基酸序列與序列資料庫之比對搜尋工作以 PSI-BLAST (Zhang et al., 1999) 進行，而多序列比對則以 ClustalW (Thompson et al., 1994) 進行分

析。

酵素純化

將攜有表現載體之 E. coli BL21(DE3)培養於 3 ml Luria-Bertani (含 ampicillin 100 µg ml-1)，37℃，10 小時後接種至內含 100 毫升 Luria-Bertani (ampicillin 100 µg ml-1) 之 500 ml 三角瓶中。在 37℃、 150 rpm 培養 4 小時後，加入

isopropylthio-β-D-galactoside (終濃度為 0.1 mM)，並將培養溫度降至 28℃，繼續

震盪培養 24 小時。所有蛋白質純化程序均於小於 5℃之環境下進行。此階段所

使用的緩衝溶液為 Tris/HCl (pH 7.5, 50 mM)。培養菌株以離心轉速 8,000 g，4℃，10 分鐘回收菌體，並以緩衝溶液清洗菌體。所收集 0.6 L 菌液的回收菌體，

以 30 ml 緩衝溶液重新懸浮，並以超音波破菌方式(Sonicator, Ultrasonic processor XL, Heat Systems)，進行破菌 7 分 30 秒，隨後，再以 12,000 g，4℃，離心 30分鐘。將上清液以 0.45 µm 濾膜過濾之後，通入預先以緩衝溶液平衡之 DEAE Toyopearl 650M (Tosoh Tokyo, Japan) 陰離子交換層析管柱 (1.6 × 12 cm)，其吸附

之蛋白質再以 0~0.5 M NaCl 線性梯度，流速 0.4 ml min-1 之條件下，進行溶離。

具有活性之收集溶液，在藉由 centriprep YM-10 (Amicon)進行濃縮。隨後，再將

此蛋白質液通入預先以含有 150 mM NaCl 之緩衝溶液平衡的 Sephacryl S-200HR膠體層析管柱，以 0.2 ml min-1 之條件進行分離純化，收集具有酵素活性的部份，

並進行分析。

酵素分析

N-醯化胺基酸消旋酶活性分析方法如下。酵素活性分析之總反應體積 (0.5 ml) 中包含 Tris/HCl buffer (25 µmol, pH 7.5)，N-乙醯基-D-methionine (12.5 µmol)，Co2+ (1 µmol) 以及適當量的酵素。酵素液添入之後，放置於 30℃反應 30分鐘後， 95℃加熱 5 分鐘終止反應。再以 ChiroBiotic TTM (0.46 × 25 cm) (Astec) 同時測定反應液中的 N-acyl-D-methionine，N-acyl-L-methonine，D-methionine 以

及 L-methionine。檢測之條件為流速 0.5 ml min-1，移動相 0.1 % triethyl acetic acetate (TEAA, pH 4.0)，ddH2O 及 methanol (5:15:80, v/v)，以 UV 210nm 波長進

行偵測。

另外，N-醯化胺基酸消旋酶活性也可藉由結合 L-胺基酸氧化酶氧化法，進

行呈色反應後再由分光光度計，520 nm 波長之條件進行測定分析。酵素反應液

的製備反應方式如同前述，另再加入 5 U 之 L-aminoacylase 後，反應液置回 30

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℃繼續反應 30 分鐘。隨後，取出 10 µl 反應液，與 150 µl，50 mM Tris/HCl (pH 7.5)，20 µl L-amino acid oxidase (3.5U ml-1)，20 µl 呈色試劑 (500 U horse radish peroxidase，10 mg 之 4-aminoantipyrine，0.2 ml phenol 以 50 mM，pH 7.2 之potassium phosphate 溶於終體積 5 ml 製成) 分裝混勻置於 96 孔微量分析盤中，

室溫下反應 10 分鐘，測定 520 nm 之吸光值，由已知濃度的 L-methionine 製成的

檢量曲線推算產物濃度。1 U 之酵素活性定義為上述標準分析條件下，酵素每分

鐘催化生成1 µmol L-m ethionine之量。蛋白質濃度測定採用Bradford法(Bradford, 1976)。

蛋白質結構模擬

N-醯化胺基酸消旋酶目前尚無蛋白質結構被解出，利用 Swiss-Model (http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html) 搜尋蛋白質結構資料庫中

合適作為結構模板的蛋白質胺基酸序列。其中，合適作為結構模板的蛋白質為同

屬於 enolase superfamily 之 L-Ala-D/L-Glu epimerase (PDB code: 1JPM) ( Gulick et al., 2001)，序列相同性 (identity) 為 37.25 %；另外，亦選用與 N-醯化胺基酸消

旋酶在催化機制特性分類上相同的 Psudomonas putida 之 muconate lactonizing enzyme (PDB code: 1BKH) (Hasson et al., 1998 )，序列相同性 (identity) 為26.35%。所使用的蛋白質結構模擬程式為 MOLSCRIPT (Kraulis, 1991; Esnouf, 1997 )。

三、結 果

N-醯化胺基酸消旋酶基因在 E. coli 之表現及酵素之純化

建構於表現載體上之 N-醯化胺基酸消旋酶基因，以 Ar-Sac (5’-GCGG GAGCTCGATTATGAAACTCA-3’) 及 Ar-Xho3 (5’-TCTACCTCGAGAATTCGT AGTTGGCTA-3’)進行 DNA 增幅反應。PCR 引子 Ar-Sac 設計有 SacI 限制酶截

切點 (底線標示)，且更換蛋白質轉譯起始點密碼 GTG 為 ATG (粗體字表示)，引

子 Ar-Xho3 設計有 XhoI 限制酶截切點 (底線標示)。PCR 增幅反應生成之 DNA片段帶有 N-醯化胺基酸消旋酶基因，經過 SacI 及 XhoI 截切後再與經相同限制酶

處理的之表現載體 pET17b 接合，最後再以 NdeI 及 HindIII 去除載體上的 T7 tag，獲得最終用於 N-醯化胺基酸消旋酶基因蛋白質表現之重組質體。E. coli BL21 (DE3)的蛋白質表現方式，依照 Novagen 公司所提供之步驟完成。以破菌方式獲

得基因表現選殖株的胞外上清液，其單位比活性為 30 mU mg-1。

酵素純化及特性分析

定點突變後之變異酵素 2B-1 與野生型酵素以 HiPrepQ 16/10 FF 及 Resource Q 陰離子交換管柱層析分離之方式，進行蛋白質純化。所獲取的純化結果如 圖二所示。

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定點突變之酵素活性分析

為探究這些突變點對酵素活性之影響，將先前研究所得到的突變位置，以

QuickChange Kit 進行定點突變，目前已建構出 2B-1，2B-2，2B-4 三個新的突變

酵素(圖二 A)。若以 50 mM N-acetyl-L-methionine 為反應測試基質，蛋白質濃度

約相同的粗製備酵素液進行反應活性分析，由結果發現，所產生之新突變酵素 2B-1，可在相對反應速率的比值上，展現約是野生型酵素的 10 倍 (圖二 B)，明

顯提升酵素的催化活性。

蛋白質結構模擬

利用 1JPM 及 1BKH 作為 N-醯化胺基酸消旋酶蛋白質結構模擬的對象，N-醯化胺基酸消旋酶蛋白質單元體模擬結構如圖三所示，胺基酸突變位置分別為位

於形成金屬鍵結位置附近的 E218G，以及位於連結酵素單元體(subunit)之 TIM barrel domain 及 N-terminal domain 之 loop 上的 E116K。雖然，兩者雖未位處酵

素催化活性中心，但由於所處位置的胺基酸特性之改變，可能會使得酵素與反應

基質結合效能產生變化。位處於連結酵素單元體不同 domain 之 loop 上的

E116K，其可能造成酵素開合結構上的變化，間接影響酵素與反應基質的作用；

而由圖四的酵素八倍體模擬結構中，更可發現到不同單元體之間，E116K 變異位

置彼此之間的立體空間距離很近，此亦顯示其兩兩之間的影響性與酵素、基質催

化效能的變化關係不容被忽視。而另一突變位質，E218G，由於附近原本所出現

的胺基酸特質為連續帶有價電荷之 Glu，改變為不帶電荷的 Gly 之後，值得觀察

的是與其它鄰近單元體的關連性變化。

四、討 論

藉由 error-prone PCR 隨機突變之方式，以及定點突變之方式，分別挑出了

在酵素催化活性表現上有所改善之突變酵素 8E-1，15C-6，最終並建構得到具有

E116K，E218G 兩處胺基酸突變點之變異酵素 2B-1。利用搭配了 D-aminoacylase協同反應之微量分析盤呈色篩選法，我們所要進行的光學活性催化酵素之催化活

性改造實驗，得以順利有效的進行。研究中搭配使用 D-aminoiacylase 的優點是，

其 與 N- 醯 化 胺 基 酸 消 旋 酶 搭 配 反 應 時 ， 反 應 基 質 可 以 選 用 N-acetyl-L-methionine，而產生的終產物為 D-methionine (右旋)。在測定時，較不

易受分析液中原本的左旋 (L-form) 胺基酸背景值所干擾。

已知 N-醯化胺基酸消旋酶被歸類於 enolase superfamily，蛋白質序列並列分

析的結果指出其中具有高度保守性的“KXK” acid/ base 催化活性區及預測的金

屬離子鍵結位置 D179，D239 及 E214 (Babbitt et al., 1996; Palmer et al., 1999)。本

篇研究中所建構的變異酵素 2B-1，其突變的胺基酸位置 (E116K, E218G) 若參照

模擬的蛋白質結構顯示，分別位於影響酵素結構開合的 loop 上及與金屬離子形

成鍵結之胺基酸區域。由前述之實驗結果推論，雖然此兩處胺基酸變異位置均未

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直接與催化活性中心發生關聯。由結果顯示，變異酵素 2B-1 在催化活性的表現

上，已較野生型酵素為佳，此顯示以蛋白質工程技術對 N-醯化胺基酸消旋酶進

行功能改造之部份，仍有很多值得開發的空間。在未來的工作目標中，除了再多

建構新的變異酵素之外，進一步更希望嘗試完成 N-醯化胺基酸消旋酶蛋白質結

晶研究之工作，對此一具有特殊催化功能的酵素做更清楚的瞭解。

參考文獻

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表一、用於定點突變之 PCR 反應引子 Table 1. Primers used for site-directed mutagenesis

Mutation Primers

E116K 5’- GAA CTC CGC GCG CAC AAA AGG TCC TTC GCG-3’ 3’- CTT GAG GCG CGC GTG TTT TCC AGG AAG CGC-5’

V81I 5’-TGG CCG CCG ACG ACA TCA CCG CGT ACA AGG-3’ 3’-ACC GGC GGC TGC TGT AGT GGC GCA TGT TCC-5’

* Bold type word means the mutation site.

圖一、N-醯化胺基酸消旋酶變異酵素之胺基酸取代位置圖及相對活性比較值。 Fig. 1. (A) Amino acid substitutions in the evolved N-acylamino acid racemase, and (B) the relative activity value compared with wild-type enzyme. The mutants 8E-1, 15C-6 and 5G-2 were isolated from the first round of mutagenesis and screening, and mutants 2B-2, 2B-2, 2B-4 were isolated form site directed mutagenesis. Black block means the mutation site, dotted line region means the “KXK” motif, and the arrows indicate the metal binding site.

Enzyme Relative activity (%)

8E-1 390

15C-6 330

5G-2 20

2B-1 1000

2B-2 210

2B-4 800

Wild-type 100 E218GE116K V81I

E218G

E116K

E116K

V81I

E116K

E218G

V81I

8E-1

15C-6

5G-2

2B-1

2B-2

2B-4

KXK

A B

Metal ion binding site

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圖 二、純化之野生型及變異的 N-醯化胺基酸消旋酶 SDS-PAGE 蛋白質電泳分

析圖

Fig. 2. SDS-PAGE analysis of purified N-acylamino acid racemase from E.coli BL21(DE3) harboring wild-type pAr3 and mutant p8E-1( E218G), p2B-1 (E218G, E116K). Lane M: protein marker; lane 1: Variant enzyme 2B-1; lane 2: variant enzyme 8E-1; lane3: wild-type enzyme. The arrow indicated the N-acylamino acid racemase.

kDa 94 67 43 30

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圖三、N-醯基胺基酸消旋酶蛋白質單元體結構模型。

Fig. 3. Model of the subunit of N-acylamino acid racemase constructed based on homology to muconate lactonizing enzyme (PDB code: 1BKH) from Pseudomonas putida and L-ala-D/L-glu epimerase (PDB code: 1JPM) from E. coli. Two mutations identified in variant 2B-1 are shown. The positions of the mutated residues Glu116 and Glu218 are shown as blue and red ball, respectively. The 2-hydroxy-6-succinyl-2, 4-cyclohexadiene carboxylate (SHCHC) is the substrate of o-succinylbenzoate synthase. Asp179, Glu 214, Asp 239 are the predicted metal ion ligand residues, Lys163 and Lys263 are the acid/base catalysis site. The model was created using MOLSCRIPT (Kraulis, 1991). (A) and (B) are the same but rotated 90 o.

A B

103

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圖 四、 N-醯基胺基酸消旋酶八倍體蛋白質結構模型及變異酵素 2B-1 胺基酸突

變位置相對關係。

Fig. 4. Octameric state of N-acylamino acid racemase and the interaction of the mutation residues of variant enzyme 2B-1. The positions of the mutated residues Glu116 and Glu218 are shown as blue and red ball, respectively. (A) and (B) are the same but rotated 90 o. The mutation residue Glu116Lys at different subunits located closely, revealed there were noticeable interaction occur between them.

A

B