Métodos generales de análisis de alimentos

Bioq. Ruth WolfgorFarm. Viviana RodríguezFarm. Viviana RodríguezDra. Carola B. GrecoDr. Néstor Pellegrino

Dr. Luis Dyner

NUTRICIÓN y BROMATOLOGÍA

2017

ANÁLISIS DE ALIMENTOS

¿Con qué finalidad se realiza?

A nivel de la utilidad PúblicaVerificar adecuadas

Como parte de programas de investigación y desarrollo

A nivel de la utilidad PúblicaVerificar adecuadas

condiciones higiénico-sanitariasEvaluar sus características

organolépticasDeterminar su valor nutritivoDeterminar su composición en

macro y micronutrientesVerificar el cumplimiento de

la legislación vigente (CAA y REGLAMENTO MERCOSUR)

Como parte de programas de investigación y desarrollo

Caracterizar las propiedades de productos naturales, procesados e industrializados

Estudiar su estabilidad y vida útil

Diseñar nuevos alimentosEstudiar sus características

toxicológicas y microbiológicas

ANÁLISIS DE ALIMENTOS

¿Quiénes son los responsables?

Laboratorios Oficiales de Contralor (Bromatologías municipales, provinciales, INAL, SENASA, RENALOA).

Laboratorios Oficiales que no son de Contralor (INTA, INTI, Universidades)INTI, Universidades)

Laboratorios de Control de Calidad de las industrias o empresas.

Laboratorios particulares independientes.Métodos basados en:

CAA (Código Alimentario Argentino)IRAM (Instituto Argentino de Normalización y Certificación)AOAC (Association of Official Analytical Chemists)

Métodos independientes validados con estudios intra e inter laboratorios

MUESTREO

¿Qué cantidad de muestra se debe tomar?

� Muestreo basado en métodos estadísticos(Norma IRAM N° 15, ISO 3951, etc.)

� Muestreo no estadístico, solo para muestras homogéneas (√n)

¿De dónde se debe obtener la muestra?

Muestreo aleatorioMuestreo sistemáticoMuestreo estratificadoMuestreo arbitrario

MUESTREO

¿Con qué se realiza el muestreo?

¿Qué se realiza luego del muestreo?

Debe reducirse el tamaño de la muestra a una cantidad manipulable (muestra de laboratorio).

En el caso de semillas, granos y polvos habitualmente se realizan cuarteos con equipos o en forma manual.

A

C B

D

Rifle de Cuarteo

¿Cómo se guardan las muestras? ¿Qué precauciones se deben tomar?

� Para optimizar la conservación de las muestras se deberán tener encuenta sus características organolépticas y su composición.

� Deben guardarse en recipientes herméticamente cerrados paraprever la evaporación o absorción de agua o en recipientescerrados y al abrigo de la luz para evitar la oxidación decomponentes.cerrados y al abrigo de la luz para evitar la oxidación decomponentes.

� Si es una muestra perecedera, conservarla en freezer hasta suanálisis o en heladera si el análisis es a corto plazo.

� Prever la posible evaporación de sustancias volátiles.� Prever cambios por actividad enzimática.� Prever el desarrollo de microorganismos.� Si la muestra es parte de una transacción comercial o de una

inspección sanitaria se guardará por triplicado en sobres o envaseslacrados y firmados (Formalización del muestreo – Acta de toma demuestra) hasta el momento de ser analizada.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

Establecer la presencia o no de materiales extraños(pelos, pelusas, huesos, plumas, piedras, arena, etc.)

La fracción de muestra sobre la que se realizarántodas las determinaciones debe ser HOMOGÉNEA

Por la heterogeneidad de los productos alimenticios esfundamental la aplicación del SENTIDO COMÚN paradecidir el mejor método de homogeneización(inversión, agitado, molienda, rallado, picado, secado yrallado, licuado, congelado y rallado, fundición, etc.)

ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN CENTESIMAL DE UN ALIMENTO

CONTENIDO DE AGUA

CONTENIDO DE MINERALES TOTALES

CONTENIDO DE GRASASe calcula el

CONTENIDO DE GRASA

CONTENIDO DE PROTEÍNAS

CONTENIDO DE FIBRA DIETARIA

CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS

Se calcula el VALOR

ENERGÉTICO usando los FACTORES

DE ATWATER

Determinación del contenido de agua

En tejidos animales y vegetales agua librey en alimentos procesados agua ligada

Los alimentos en general pueden considerarse integrados por dos fraccionesintegrados por dos fracciones

Agua o Humedad Sólidos totales, Materia seca o Extracto seco+

Determinación del contenido de agua

Métodos a utilizar

INDIRECTOSCalor solamente

Calor y presión reducida

DIRECTOS Físicos Índice de refracciónPor destilación: Dean Stark

Químicos Karl Fischer

MÉTODOS INDIRECTOS

.

Son métodos por desecación en estufaque se basan en la determinaciónque se basan en la determinacióngravimétrica del residuo que quedaluego de evaporar el agua del alimento.Ese residuo corresponde a los sólidostotales y se considera que se haevaporado totalmente el agua cuando se

alcanza un peso constante.

MÉTODOS INDIRECTOS

Calor solamente: Se utilizan estufas con circulación de aire quetrabajan a presión atmosférica normal y temperatura reguladaa 100–105 ºC.Se aplica a productos que no se descomponen a elevadastemperaturas.Ej: harinas, fideos, leches, productos cárnicos, etc.

Muestra homogénea en cristalizador (~ 5 g)

Calentar en estufa a 100–105 ºC

Enfriar en desecador hasta temperatura ambiente y pesar

Repetir hasta alcanzar peso constante

Si la muestra que se analiza es líquida, antes de llevarla a la estufa debe evaporarse a baño María hasta sequedad aparente

MÉTODOS INDIRECTOSCalor y presión reducida: Se utilizan estufas de vacío y setrabaja a una presión entre 25 y 50 mm de Hg y a unatemperatura no mayor de 70 ºC.Se aplica en alimentos con alto contenido en azúcares, comofructosa, o con principios volátiles.Ej: miel, mermeladas, jugos de fruta, frutas secas, etc.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS

HUMEDAD: alimentos sólidos y semisólidos

(% Agua)= Peso de agua en la muestra (g) x 100Peso de muestra húmeda (g)

EXTRACTO SECO: alimentos con alto contenido acuoso

(% Sólidos totales)= Peso de muestra seca (g) x 100Peso de muestra húmeda (g)

Son métodos rápidos y en algunos alimentos se han estandarizado las condiciones. Ej.: harinas

MÉTODOS DIRECTOS

Método por destilación: Dean Stark

� Se realiza una destilación a reflujo con solventes no miscibles con el agua, de similar punto de ebullición y de menor peso específico (Ej: tolueno, heptano, benceno, xilol, etc.)

� Se aplica a una gran cantidad de alimentos. Es recomendado para determinar el contenido de agua en productos con bajo contenido de humedad, como son los productos deshidratados o bien en alimentos que contienen alto contenido de compuestos volátiles como las especias, pimentón, cebolla, margarina, manteca.

H2O

Sv.

M+Sv.

H2O+Sv.

MÉTODOS DIRECTOS

Métodos químicos: Karl Fischer

� Se fundamenta en la oxidación del dióxido deazufre con yodo en una solución de piridina enmetanol (reactivo de Karl Fischer) en presenciade agua. Se cuantifica el exceso de I2 de formavolumétrica o potenciométrica.volumétrica o potenciométrica.

� Es útil en alimentos con muy bajo contenido deagua tales como chocolate, aceites, especias,productos deshidratados, melazas, etc.

Determinación del contenido de minerales

Métodos a utilizar para la oxidación de la materia orgánica

DIGESTIÓN POR Para establecer el contenido

DIGESTIÓN POR VÍA HÚMEDA Para cuantificar uno o más

minerales de forma individual

DIGESTIÓN POR VÍA SECA

Para establecer el contenido total de minerales

DIGESTIÓN POR MICROONDAS

MINERALIZACIÓN POR VÍA SECA: CENIZAS

Son métodos gravimétricos que involucran la oxidación total de la

materia orgánica mediante el empleo de calor, sometiendo a la muestra a de calor, sometiendo a la muestra a

una carbonización en mechero y luego a una calcinación en mufla (500-

550°C), hasta la obtención de cenizas de aspecto blanquecino y peso

constante.

MINERALIZACIÓN POR VÍA SECA: CENIZAS

Muestra homogénea en cápsula de porcelana (~ 2 g)

Calentar sobre mechero hasta que cese el desprendimiento de humos blancos

Llevar la cápsula con la muestra carbonizada a mufla a 500-550°C

EXPRESIÓN DEL RESULTADO

% Cenizas = Peso cenizas x 100Peso muestra

Enfriar en desecador hasta temperatura ambiente y pesar

Repetir hasta obtener cenizas blanquecinas de peso constante

Si la muestra que se analiza es líquida, debe evaporarse a baño María hasta sequedad aparente antes de carbonizarla

Determinación del contenido de grasa

Las grasas o aceites son sustancias de origen animalo vegetal, insolubles en agua y solubles en éter uotros solventes no polares como cloroformo, hexano.

Compuestos que se extraen:Compuestos que se extraen:

� Ésteres de ácidos grasos con glicerol� Fosfolípidos, lecitinas, esteroles� Ceras� Ácidos grasos libres� Carotenos, clorofila, pigmentos

Métodos a utilizar

DIRECTOS

Extracción continua Más drástica(Butt, Twisselman)

Formación de canales

Extracción discontinua Más suave(Sohxlet)

Sifón

CON ATAQUE PREVIO

Butirométricos o Gerbervolumétricos

Babcock

Gravimétricos Hidrólisis básicaHidrólisis ácidaHidrólisis mixta

Sifón

MÉTODOS DIRECTOS

Extractor Discontinuo- Soxhlet Extractor Continuo

MÉTODOS DIRECTOS

Método de extracción discontinua: Soxhlet�Se debe trabajar sobre muestra seca y el

solvente de extracción debe ser anhidro�Es aplicable a alimentos en los cuales la

grasa está disponible. Ej.: cereales, carnes y derivados, vegetales, etc.y derivados, vegetales, etc.

�Es un método gravimétrico

EXPRESIÓN DEL RESULTADO

% grasa (base seca) = Peso grasa extraída x 100Peso muestra seca

EXPRESIÓN DE RESULTADOS EN BASE SECA Y EN BASE HÚMEDA

% Base húmeda (BH) = % Base seca (BS) x (100 - % agua)100

% Base seca (BS) = % Base húmeda (BH) x 100 % Base seca (BS) = % Base húmeda (BH) x 100 100 - % agua

Cuando el análisis de un componente del alimento se realice a partir de una muestra seca, el resultado final

quedará expresado en base seca.

Luego, con el dato de contenido de agua del alimento,el resultado deberá expresarse en base húmeda.

MÉTODOS CON ATAQUE PREVIO

Implican la liberación del glóbulo degrasa por acción de agentes ácidos obásicos permitiendo la coalescenciabásicos permitiendo la coalescenciay medida volumétrica de la grasa obien su extracción con solventes yla posterior medida gravimétrica del

residuo graso.

Método butirométrico: Gerber

MÉTODOS CON ATAQUE PREVIO

Se colocan en el butirómetro el H2SO4, la muestra y el alcohol amílico.

El H2SO4 digiere las proteínas, genera calor, libera la grasa. El alcohol amílico favorece la separación de la grasa y la protege de la acción del ácido.protege de la acción del ácido.

Por centrifugación se separa la capa de grasa y se lee directamente en el vástago del butirómetro el % de grasa (p/v) .

Método butirométrico: Babcock (H2SO4 + agua)

Método gravimétrico: Hidrólisis básica (Rose Gottlieb)

MÉTODOS CON ATAQUE PREVIO

Se realiza una hidrólisis en frío con NH4OH y etanol.Luego se extrae con éter etílico y éter de petróleo.

Aplicación: principalmente alimentos ricos en carbohidratos tales como leche y derivados lácteos, helados, dulce de leche, etc.

Método gravimétrico: Hidrólisis ácidaAplicación: huevos, harinas, panificados, quesos (Norma FIL), Método gravimétrico: Hidrólisis ácidaAplicación: huevos, harinas, panificados, quesos (Norma FIL), mayonesa, pescado, cacao y derivados.

Método gravimétrico: Hidrólisis mixtaSe realiza una hidrólisis con NH4OH y HCl combinados. Aplicación: quesos (AOAC), etc.

EXPRESIÓN DELRESULTADO

% grasa (BH) = Peso grasa extraída x 100Peso muestra

Método gravimétrico: Hidrólisis ácida (con HCl) Se aplica a todo tipo de alimentos: carnes, embutidos, quesos, mayonesa,huevos, pan, galletas, harinas, alimentos formulados, chocolate, alimentosfritos, horneados, extrudidos, etc. Puede haber limitaciones en alimentosmuy ricos en azúcar.

2 o 3 g de muestra + 2 mL etanol + 10 mL HCl (7+3)

Baño a 80°C durante 30 min. con agitación

Enfriar, trasvasar a mojonier y realizar un lavado con 10 mL de etanol

Agregar 25 mL de éter sulfúrico y agitar durante 1 min. en mojonierAgregar 25 mL de éter sulfúrico y agitar durante 1 min. en mojonier

Agregar 25 mL de éter de petróleo y agitar durante 1 min. en mojonier

Trasvasar la fase etérea a un balón seco y tarado. Usar torunda de algodón

Repetir la extracción con 50 mL de éter mezcla

Evaporar el solvente en rotavapor

Secar balón con grasa en estufa hasta peso constante

Pesar balón con la grasa extraída

MÉTODOS INDIRECTOS

Determinación de proteínas

Determinan el contenido de nitrógenoA partir de este se calcula el contenidode proteínas utilizando un factor deconversión

MÉTODOS DIRECTOS

Método de KjeldhalMétodo de Dumas

Método de Biuret Método de Lowry Otros métodos

Método de DumasMétodos radioquímicos

El contenido de nitrógeno se multiplica por un factor parallegar al contenido de proteínas asumiendo dos supuestos:a) los carbohidratos y las grasas no contienen nitrógeno, yque casi todo el nitrógeno presente en la dieta estápresente en los aminoácidos que forman parte de lasproteínas.b) que el contenido medio de nitrógeno de las proteínas seencuentra alrededor del 16 por ciento, lo que lleva al usodel factor genérico de 6,25.

16 g de nitrógeno ------ 100 g de proteína1 g de nitrógeno -------- 6,25 g de proteína

Este factor general de conversión no es exacto ya que para diferentesproteínas con diferente composición de aminoácidos el contenido denitrógeno puede variar entre 13 y 19 %. Esto equivaldría a factores deconversión de nitrógeno de 5,26 a 7,69.

Factores para la conversión de los valores de nitrógeno en proteínas

(por g de N)*

Producto alimenticio Factor albúmina 6,32

Productos animales

carne y pescado

6,25 Trigo

entero

5,83

Gelatina 5,55 salvado 6,31Gelatina 5,55 salvado 6,31

Leche y productos lácteos 6,38 Arroz y harina de arroz 5,95

Caseína 6,40 Centeno y harina de centeno

Cebada y harina de cebada

Avena

5,83

Leche humana 6,37 Maíz 6,25

Huevos

enteros

6,25 Soja 5,71

Determinación de proteínas por método de Kjeldahl

El análisis se compone de los siguientes pasos de trabajo: • Digestión de muestras con ácido sulfúrico

(CHNO) + H2SO4 ----> CO2 + SO2 + H2O + (NH4)2SO4 + H2SO4

• Destilación de la solución de digestión con vapor de agua

Agregado de NaOH 13 N

Se recoge sobre solución H3BO3 4% + mezcla de indicadores (rojo de metilo y verde de bromocresol)

Valoración con H 2SO4 0,1N

Determinación del contenido de fibra dietaria

CelulosaFibra dietaria total Fibra insoluble Hemicelulosa

Lignina

Pectina

Es cualquier material comestible que no es hidrolizado por las enzimas endógenas del tracto digestivo humano

PectinaFibra soluble Gomas

MucílagoMétodos a utilizar

Enzimático-gravimétricos

Fibra crudaGravimétricos

Fibra dietaria total

Método gravimétrico: fibra cruda

Recupera parte de la fibra insoluble y se pierde toda la fibra soluble.Su uso se limita a ciertas muestras como granos de cereales, té, alimentospara animales.

No se emplea para determinar el contenido de fibra de un alimento a los fines del rotulado nutricional.

Método enzimático-gravimétrico: fibra dietariaMétodo enzimático-gravimétrico: fibra dietaria

Recupera todos los componentes de la fibra. Implica el tratamientoenzimático de la muestra y posterior pesada y análisis del residuo comofibra dietaria, previa corrección por cenizas y proteína.

Se emplea para determinar el contenido de fibra de un alimento a los fines del rotulado nutricional.

Método de fibra dietaria total (por duplicado)Muestra con menos del 10% grasa y seca + Buffer fosfatos pH= 6

α-amilasa termoestable (hidrólisis uniones α-1,4)15 min. Baño María en ebullición

Ajustar pH a 7,5 con NaOH 0,275 NProteasa (hidrólisis de proteínas)30 min a 60°C con agitación

Ajustar pH a 4,5 con HCl 0,325 NAmiloglucosidasa (hidrólisis uniones α 1,4 y α 1,6)20 min a 60°C con agitación

Agregar 280 mL de etanol 96° y dejar en reposo 1 hora a temp. ambienteFibra soluble precipita con etanol 78º

Filtrar a través de crisol con celiteFiltrar a través de crisol con celiteLavar el residuo

Secar a 100 - 105°C

Pesar el crisol filtrante + residuoRESIDUO: RESTOS DE PROTEÍNAS + MINERALES + FIBRA DIETARIA

%FDT= Peso residuo x 100 – (% proteína residuo + % cenizas residuo)Peso muestra

Proteínas por Kjeldahl Cenizas a 500 - 550°C

Determinación del contenido decarbohidratos o glúcidos

Métodos a utilizar

Son todos los mono, di y polisacáridos, incluidos los polialcoholes presentes en el alimento, que son digeridos, absorbidos y metabolizados por el ser humano.

POR DIFERENCIA(Trabajo Práctico)

% HC= 100 – (% Humedad + % Proteínas + % Grasas totales + % Cenizas + % Fibra dietaria)

FÍSICOS

QUÍMICOS

MICROBIOLÓGICOS

ENZIMÁTICOS

Para soluciones puras de azúcares

(Trabajo Práctico) dietaria)

PolarimetríaDensitometríaRefractometríaEspectroscopía

Método químico por reducción R-C=O + Cu2+ R-C=O + Cu+ Se determina por

H OH - / calor OH

Como la solución de ensayo se vierte desde la bureta, sobre el reactivo de Fehling en ebullición, es una valoración inversa.Reactivos SO4Cu Cu2+

NaOH OH- exalta las propiedades reductorasTartrato de Na y K compleja al Cu2+

Ferrocianuro de K compleja al Cu+

Método Fehling – Cause Bonnans

GravimetríaVolumetríaColorimetría

Ferrocianuro de K compleja al Cu

Cálculo del Título del reactivo

*15 mL reactivo son reducidos por A ml de solución de glucosa anhidra con T g de glucosa (concentración conocida).

Cuantificación de la muestra (solución a analizar):

*15 mL reactivo son reducidos por V mL de solución a analizar (concentración desconocida).

V mL T gr de glucosa100 mL T x 100 = gr glucosa en 100 mL de sol. a analizar

V