Titulo: Evidencia de Aprendizaje. Mundo microbióticoMateria: Microbiologia y Taxonomía Microbiana Facilitador: Martha Carolina Garcia Chavarria Alumno: Mario Alfredo Salgado Mejia

Introducción Agua para Uso y Consumo Humano: agua que puede ser consumida sin restricción. La calidad de esta es fundamental para prevenir y evitar la transmisión de enfermedades gastrointestinales y otras, para lo cual se requiere establecer límites permisibles en cuanto a sus características microbiológicas, físicas, organolépticas, químicas y radiactivas, con el fin de asegurar y preservar la calidad del agua en los sistemas, hasta la entrega al consumidor. El término se aplica al agua que cumple con las normas de calidad promulgadas por las autoridades locales e internacionales.

Muestra simple: proporciona información sobre la calidad en un punto y momento dado puede ser importante a la hora de establecer las características del agua en un punto de la red de abastecimiento

Límites permisibles de calidad del agua

El contenido de organismos resultante del examen de una muestra simple de agua, debe ajustarse a lo establecido en la tabla

CARACTERISTICA LIMITE PERMISIBLE

Organismos Coliformes totales Ausencia o no detectables

E. coli o Coliformes fecales u organismos termotolerantes

Ausencia o no detectables

Bajo situaciones de emergencia, las autoridades competentes podrán establecer los agentes biológicos nocivos a la salud que se deban investigar.

El agua abastecida por el sistema de distribución no debe contener E. coli o Coliformes fecales u organismos termotolerantes en ninguna muestra de 100 ml. Los organismos Coliformes totales no deben ser detectables en ninguna muestra de 100 ml; en sistemas de abastecimiento de localidades con una población mayor de 50 000 habitantes; estos organismos deberán estar ausentes en el 95% de las muestras tomadas en un mismo sitio de la red de distribución, durante un periodo de doce meses de un mismo año.

Agua potable: para uso de consumo humano, aquella que no contiene contaminantes objetables ya sea químicos o agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos al ser humano

Metodología:

Filtración por membrana: Método para la detección y recuento de las bacterias eventualmente presentes en el agua. Consiste en filtrar un volumen determinado de la muestra de agua a analizar (tomada en un frasco estéril) a través de una membrana con un tamaño de poro tal que retiene las bacterias, y su incubación en placas con medios de cultivo selectivos durante el tiempo y a la temperatura adecuada para cada bacteria a determinar. Si se detecta crecimiento bacteriano, al finalizar la incubación se realiza el recuento.

Ventajas del método de filtración por membrana:

- Proporciona recuentos directos.- Es más preciso (se obtienen resultados más reproducibles) que la prueba de NMP (numero mas

probable).- Rápido y fácil de realizar.- Analiza mayores volúmenes de muestras con bajas concentraciones de organismos

Desventajas del método de filtración por membrana:

- Interfieren los altos niveles de turbiedad.- Los coliformes debilitados pueden sobrevivir mejor en la prueba de NMP.- Las altas concentraciones de no Coliformes interfieren en el recuento.

Coliformes Totales: Coliformes, bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 ºC fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares. Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Los Coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.

El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros:

1. Escherichia 2. Klebsiella 3. Enterobacte 4.Citrobacter

Coliformes Fecales: Son aquellos que fermentan la lactosa a 44,5 – 45,5°C, análisis que permite descartar a Enterobacter, puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecerán en el medio de cultivo principalmente Escherichia coli (90%), y algunas bacterias de los género Klebsiella y Citrobacter. La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90% de probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli

La Escherichia coli de origen animal y la de origen humano son idénticas. Los coliformes fecales en el suministro de agua es un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposición. Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo.

Mesofilos Aerobios: microorganismos unicelulares que derivan del reino vegetal, incluidos en el grupo de los Schycomysetes, su tamaño es variable y oscila entre 0,5-2 µ, algunos tienden a formar filamentos y pueden llegar a medir 30-40 µ. Por su forma se encuentran esféricas (cocos), bastones (bacilos) y espirales (vibrio), se reproducen por bipartición.En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y Levaduras capaces de desarrollarse a 35°C durante 48Horas, en este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos, reflejando la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios no implica la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena, no son recomendables recuentos elevados.

Hongos : Organismos pertenecientes al reino fungi, que se caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, se alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25°C. Son organismos eucarióticos, poseen un núcleo verdadero, formadores de esporas no poseen clorofila. Los hongos viven como saprófitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposición y reciclado de la materia orgánica, utilizando enzimas extracelulares como celulasas y pectinasas, manteniendo de esta manera la fertilidad del suelo. Algunos hongos producen enfermedades al hombre, a los animales y a las planta.

Levaduras: Son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca.

DESARROLLO

Reactivos y Materiales

-Placas preparadas con Agar ENDO (para determinación de Coliformes Totales y E. coli) (Ver anexo 1).-Placas preparadas con Agar Métodos Estándar (Para determinación de Mesofilos Aerobios) (Ver anexo 2)-Placas preparadas con Agar M-Green (Para determinación de Hongos y Levaduras) (ver anexo 3)

-Membranas de 0,45 μm, esteriles 47mm millipore o equivalente (embudo, soporte del embudo y portafiltros)

-Placas previamente Hidratadas con 1ml de solución de fosfato de Sodio monobasico (solución de trabajo) de Pretrifilm para determinación de E. coli (a), Mesofilos aerobios (b), Hongos y Levaduras (c) (estas solo se deberán utilizar únicamente cuando no se tengan placas preparadas de BD)

Aparatos e instrumentos

-Equipo Manifold de millipore o equivalente

-Filtros Millipore o equivalente estériles

a) b) c)

-Abrazaderas para filtros millipore o equivalente

-Bomba de vacío

-Manguera de látex -Matraz Kitazato de 2000ml -Tapón de hule horadado del No. 8

-Pinzas estériles

-Campana de flujo laminar- Incubadoras con termostato que evite variaciones mayores de ± 1°C, provista con termómetro.-Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.-Lámpara de luz ultravioleta (ver procedimiento TU-LAB-PR-154-V Preparación del área de siembra).

Preparación de la muestra Las muestras de análisis deberán contener mas de 400ml de agua , ya que se inocula un total de 100ml por análisis, esto es 100 ml para determinar coliformes, 100 ml para Mesofilos aerobios y 100ml para Hongos y levaduras, la muestra sobrante se utilizara para determinar pH y cloro

El análisis de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su recolección. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el análisis, se inicie dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y en ningún caso, este lapso debe de exceder de 24 horas para agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua para que sea válido el resultado del análisis.Durante el período que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a 4 °C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados falsos o dudosos.

La muestra se debe recibir con la siguiente Identificación:

Nombre del lugar donde se tomo Fecha del muestreo Nombre de quién muestreo Hora en que se muestreo

Una vez recibida la muestra registrar en bitácora con pluma indeleble tinta negra, en cada pozo se analizan diferentes puntos de muestreo por lo cual cada muestra lleva doble identificación

Resultados

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

AGAR ENDO (COLIFORMES TOTALES, E. coli)

A) El recuento de las placas preparadas debe hacerse en un contador de colonias estándar u otra fuente de luz amplificada. Una vez transcurridas 24hrs a 35± 1°C sacar de la incubadora las placas observar la morfología colonial

B) Placas sin colonias, cuando las placas no muestren colonias reportarlas como 0 UFC/100ml

C) Si las placas presentan crecimiento revisar la morfología colonial como a continuación se describe

Deberán contarse todas las colonias independientemente de su tamaño o de la intensidad del color D) Altas concentraciones de colonias en las placas ocasionará que toda el área de crecimiento se vuelva roja o rosada. Ocasionalmente, en placas demasiado cargadas, el centro de la placa puede carecer de colonias visibles pero pueden apreciarse muchas colonias pequeñas en los bordes. Cuando esto ocurra se reportara incontable E) Las colonias puede aislarse para una posterior identificación. Únicamente seleccionando la colonia que creció sobre la membrana. Proceder al análisis siguiendo métodos standard.

AGAR METODOS ESTANDAR (MESOFILOS AEROBIOS)

A) El recuento de las placas preparadas debe hacerse en un contador de colonias estándar u otra fuente de luz amplificada. Una vez transcurridas 48hrs a 35± 1°C sacar de la incubadora las placas observar la morfología colonial según sea el caso.

B) Placas sin colonias, cuando las placas no muestren colonias reportarlas como 0 UFC/100ml

C) Si las placas presentan crecimiento revisar la morfología colonial como a continuación se describe:

1.- Tamaño: Diámetro en mm, los límites de tamaño de las colonias varían desde fracciones de milímetros has 10 mm de diámetro. La mayoría de los microorganismos forman colinas de tamaño limitado al tiempo de incubación.

2.- Forma: La forma de la colonia es la apreciación general de su figura la cual puede ser puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, como huso.

3.- Elevación: esta puede ser, elevada , plana, convexa, pulvinada, umbonada, umbilicada.

4.- Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser, entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso, rizado.

5.- Color: Blanco, amarillo, negro, marrón anaranjado.6. - Superfície: Lisa o rugosa.7. - Aspecto: Húmedo, seco, algodonoso, pulverulento, aterciopelado, velloso, granuloso8. - Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura.9.- Luz reflejada: Las colonias pueden ser brillantes o mate10.- Luz transmitida: pueden ser traslúcidas o transparentes

Algunas de las colonias pueden presentarse de las siguientes formas:

1.- Cadenas de colonias no separadas claramente entre si, que parecen se causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias.

2.- Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar.

3.- Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del crecimiento

Cuando las colonias se presenten como en el punto 1, 2, 3 contarlas como provenientes de una sola fuente, si la caja contiene una sola cadena contar como una sola colonia y si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual, no contar cada colonia de la cadena individualmente.

Deberán contarse todas las colonias independientemente de su tamaño o de la intensidad del color

D) Altas concentraciones de colonias en las placas ocasionará que toda el área de crecimiento se vuelva color crema o rosada. Ocasionalmente, en placas demasiado cargadas, el centro de la placa puede carecer de colonias visibles pero pueden apreciarse muchas colonias pequeñas en los bordes. Cuando esto ocurra se reportara incontable.

AGAR M-GREEN (HONGOS Y LEVADURAS)

A) El recuento de las placas preparadas hacerse en un contador de colonias estándar u otra fuente de luz amplificada. Una vez transcurridos 5 días a 25± 1°C sacar de la incubadora las placas observar la morfología colonial según sea el caso.

B) Placas sin colonias, cuando las placas no muestren colonias reportarlas como 0 UFC/100ml FC/ml

C) Si las placas presentan crecimiento revisar la morfología colonial como a continuación se describe:

1.-Morfología colonial: Las levaduras unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el diámetro oscila entre 2-4mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. Cóncavas de aspecto brillante o mate, opacas, de bordes lisos. Los hongos filamentosos (mohos), tiene colonias de 2-3 cm de diámetro, de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. Con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado, algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares.

2.- Morfología microscópica: Se observa con la ayuda del microscopio a seco fuerte, identificando las siguientes estructuras:

a) Tipos de micelioSegún su nivel de organización celular pueden ser:-Unicelulares (levaduras).-Pluricelulares (mohos).-Dimórficos (posee ambos tipos de micelio).

Por su función:-Micelio vegetativo: se encarga de la captación de nutrientes.-Micelio aéreo o reproductor: producción de esperoas (sexual o asexual).

b) De acuerdo al color de las hifas:

-Hialino: Cuando no está pigmentado.-Dematiáceo: Cuando posee color café oscuro.

Por el tipo de la hifa puede ser:-Septado: Posee divisiones.-Cenocítico: No tiene divisiones.

c) Su sistema de reproducción es asexual y sexual:

Las esporas asexuales son:Talosporas:A) Artrosporas: Son esporas que se forman por fragmentación de las hifas.B) Blastosporas: Se forman en las levaduras por la gemación a partir de una célula ya

preexistente.C) Clamidosporas: Estas son redondeadas y poseen una doble pared gruesa que les confieren

gran resistencia.Conidiosporas:Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo, por una estructura llamada esporangióforo.

Las esporas sexuales son:- Zigosporas: Esporas contenidas en cigosporangios en los Zigomycetes.- Ascosporas: Esporas contenidas en saquitos denominados ascas en los Ascomicetes.- Oosporas: Esporas contenidas en oosferas correspondientes a los oomycetes.- Basidiosporas: Esporas contenidas en basidios correspondientes en basidiomicetes

Deberán contarse todas las colonias independientemente de su tamaño o de la intensidad del color

D) Altas concentraciones de colonias en las placas ocasionará que toda el área de crecimiento se vuelva verde, blanca o azul, o podran apreciarse muchas colonias pequeñas en toda la superficie de la placa. Cuando esto ocurra se reportara incontable.

REFERENCIAS

Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe somete el agua para su potabilizaciónNorma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994 Método para la cuenta de Mohos y Levaduras en alimentos. Microbiología General Enero 2001 UPIBI IPN.Método Analítico Hongos y Levaduras LC-MI-05 2005.Método UMA 0323 Cuenta de Hongos y Levaduras, por vaciado en placa.Método UMA 0322 Cuenta de Hongos y Levaduras, por difusión en placa.Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa Microbiología General Enero 2001 UPIBI IPNMétodo Analítico Cuenta Total (Mesofilos Aerobios) LC-MI-03 2005Método UMA 0318 Cuenta de Mesofilos Aerobios Instrucciones de uso medio en placa listo para uso BD Junio 2009