Morfologia en el diagnòstic de les hemopaties malignes en ... · Diagnóstico Neoplasias...

“ Morfologia en el diagnòstic de les hemopaties malignes en el segle XXI.

És ? ”

Francesc SoléCap de Grup en SMD

Director Científic del IJC Campus ICO-HGTiPJosep Carreras Leukaemia Research Institute

Badalona. Barcelona. Spain

Escola Citologia Hematològica Dra. Woessner


Diagnóstico Neoplasias Hematológicas

Dades de laboratori Clínica

CMFIHQ

Estudi genètic

Citologia

Diagnòstic Integrat



CMFIHQ

Estudi genètic

Citologia


Variabilitat interobservador



CMFIHQ

Estudi genètic

CitologiaCitogenètica convencional

Hibridació in situ fluorescentMés del 50% dels pacients no

presenten alteracionscitogenètiques


Variabilitat interobservador



CMFIHQ

Estudi genètic

CitologiaCitogenètica convencional

Hibridació in situ fluorescentMés del 50% dels pacients no

presenten alteracionscitogenètiques

Variabilidad interobservador


Arrays genòmics: Alteracions en el 70% dels casos

Seqüenciació massivaAlteracions en el 80% dels casos

Que veu la morfologia i que veula genètica?

Citologia vs Cito/Genètica

Citologia

Poc intel·ligentSuperficial

Poc espavilada


Citologia


Poc espavilada

Intel·ligentCoherent

Espavilada


Citologia


Poc espavilada


Espavilada


Citologia La Citología és com els homes…, sols es fixa en lo de fora…


Citologia La Citología és com els homes…, sols es fixa en lo de fora…


Poc espavilada


Espavilada


“Mientras que los hombres se enamoran de lo que ven, las mujeres se enamoran de lo que escuchan y leen”

Els homes semblen més citòlegs i les dones més genetistes… al revés que en

la hematologia..

• Valor diagnòstic: – Alteracions característiques de cada malaltia

Aplicació del Estudi Citogenètic/Genètic

Índice

LMC t(9;22)

LAM t(15;17), t(8;21), inv(16), t(11q23)/MLL…

LAL Hiperdiploide, pròxim a haploide, MLL transloc.

SMD 5q-, -7/7q-, +8, 20q-, i(17)(q10)

MM t(11;14), t(4;14), t(14;16)

LLC 11q-, +12, 13q-, 17p-

LNH t(8;14), t(11;14), t(14;18), t(3;14), t(11;18)

Diagnòstic


• Valor diagnòstic: – Alteracions característiques de cada malaltia

• Valor pronòstic:– IPSS (1997) i IPSS-R (2012) en SMD, Cariotip

monosòmic en LAM, 17p- en MM i LLC…

• Selecció del tractament en funció del canvi genètic(ex. Imatinib i t(9;22); Acid retinòic i LAM M3/t(15;17); Lenalidomida i 5q-, etc)


ÍndiceCitologia vs Cito/Genètica

Variabilitatintersobservador Sensibilitat

Morfologia Alta Baixa

Citogenètica Baixa/Mitja Baixa

FISH Baixa Mitja

NGS ? Alta

Diagnòstic


Variabilitat intersobservadorMORFOLOGIA/CITOLOFIA

Diagnòstic

Objectiu: reproducibilidad WHO 2008 i IPSS-R (categoríes de 0-2 i 2-5%blastes)

N=110 casos11 hospitals i 11 citòlegs. Cada un va evaluar 20 mostres

Baixa concordança en els casos amb RCUD (citopenia refractaria ambdisplasia unilineal (21%) i RARS (18%)El tall de blastes del 2% no va ser reproduïble (taxa de discordança del32/108, 29%)


Variabilitat intersobservadorDiagnòstic

ANYS CENTRES PARTICIPACIÓ CONCORDANÇA

2000 30 13 25%

2001 24 15 66,7%

2002 28 17 70,6%

2003 29 17 98%

2004 31 12 99%

2009-2015 30 27 94%

CQ SEHH. Citogenètica convencional



CQ EUROGENTEST. Citogenètica convencional


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

2.5 4.5 5 6 8 9.5 10 10.5 11 11.5 12

Num

ber o

f lab

orat

orie

s

Total Score


CQ EUROGENTEST. Citogenètica convencional. LLA



ANYS CENTRES CONCORDANÇA RESULTAT CORRECTE

2012-15 28 (19-32) 88% (71-100) 70% (45-100%)

CQ SEHH. FISH


Variabilitat intersobservadorCITOGENÈTICA

Diagnòstic

CQ EUROGENTEST. Microarrays N= 23 laboratoris


NGS ?

Diagnòstic

SMD Bioinformàtic 1 A, B, C, D,…Bioinformàtic 2 E, F, G, H,…Bioinformàtic 3 …CSNK1A1

Pilot 4 centres, dues plataformes diferents

Variabilitatintersobservador Gens mutats

Diagnòstic-Seguiment-Sensibilitat


NGS

Citogenètica


Pronòstic


Citologia

Pronòstic


Genètica

Pronòstic


Pronòstic

Genètica

NGS > Citogenètica

Alteracions Genètiques en LAM

Pronòstic

Alteracions Genètiques en MM

Pronòstic

Alteracions Genètiques en LLA

Pronòstic

Alteracions Genètiques en SMD

Variable pronòstica

0 0.5 1 1.5 2 3 4

Citogenètica Molt bo Bo Int. Dolent MD

Blastes MO %

≤2 >2-5% 5-10% >10%

Hb ≥10 8-<10 <8

Plaquetes ≥100 50-<100 <50

Neutròfils ≥0.8 <0.8

Blood (2012)


Bejar et al., N Engl J Med (2011)


Pronòstic

Bejar et al., JCO (2014)


Pronòstic

Prognostic models beyond IPSS-R

Model 1: 14 gens + edat + WBC, Hb, Plt, % blastes, Citogenètica IPSS-R

Model 2: 14 gens únicament (13/14 del Model 1)

Haferlach et al., Leukemia (2014)

Alteracions Moleculars en SMD


Cargo et al., Blood (2015)

– Imatinib: LMC t(9;22)/BCR/ABL1

– ATRA: LAM M3 t(15;17)/PML/RARA

– LENALIDOMIDA: SMD 5q-• Mutacions de TP53 s’associen a pitjor resposta (Jädersten et al., JCO,

2011)

– AZACITIDINA: -7/7q-, cariotip complexe• Mutacions de TET2 s’associen a millor resposta (Itzykson et al.,

Leukemia, 2011)

• Cariotips amb >3 alteracions s’associen a baixa supervivencia (Hwanget al., Blood Research, 2014)

– LAM: inhibidors IDH1 mutat (AG-120, IDH305) i IDH2 mutat (AG221), inhibidors FLT3 (FLT3-ITD)…

– LAM: amb MLL reordenat

Nueva Propuesta 2.010 (n=2901)Nueva Propuesta CitogenéticaAlteracions Genètiques i Tractament

Stein i Tallman, Blood (2016)

• La major part dels gens mutats en pacients amb NH es troben en menys del 5% dels pacients

• Molt poques mutacions són específiques d’una NH

• Es detecten mutacions en individus d’edat avançada que són les mateixes que s’observen en pacients amb SMD (Genovese et al., NEJM 2014; Jaiswal et al., NEJM 2014)

• Es difícil introduir l’us de tests moleculars per al diagnòsticdels pacients:

– Valor pronòstic i selecció de tractaments dirigids a canvis genètics

Nueva Propuesta CitogenéticaAlteracions Moleculars

Morfologia ben imprescindible…

Maig (2015)

Diagnòstic

Pronòstic

Seguiment

Definir tractament


Citologia Cito/Genètica

CG, NGS

PCR

CG, NGS

ARRAYSPCR

FISH

Últims 10 anys

¿Quina tècnica Utilitzarem en el Futur?

CITOGENÈTICACITOLOGIA

NGS

NGS

NGS

Present-Futur


CITOGENÈTICAARRAYS

CITOLOGIA

NGS

NGS

NGS

CITOGENÈTICAARRAYS

CITOLOGIA

Present-Futur


Citologia+ CMF


FISHCariotip


Citologia+ CMF

FISH

SequencingArrays

Cariotip


Citologia+ CMF

FISH

ArraysSequencingArrays NGS(panell de gens)

Cariotip


Citologia+ CMF

Arrays NGS(panell de gens)

Citologia + CMF Cariotip

DIAGNÒSTIC, PRONÒSTIC, DEFINIR TRACTAMENT


Arrays NGS(panell de gens)

SENTIT COMÚ


CariotipCitologia + CMF

ÍndiceEns necessitem, tots fem falta…. millor sumar


Citòleg Citòmetrista Citogenetista Molecular

Gràcies!!!

RESEARCH TEAM: IJC Campus ICO-Hospital Germans Trias i Pujol.

Badalona. Spain

HEMATÓLOGOS: Servei d’Hematologia.

ICO-Hospital Germans Trias i Pujol. Badalona. Spain

“Si vols arribar ràpid camina sol,Si vols arribar lluny camina acompanyat”

(Proverbi Africà) “Jo faig el que no pot, i vostè fa el que jo no puc.

Junts podem fer grans coses”Teresa de Calcuta

Gràcies!!!

https://m.youtube.com/watch?v=m456HkYRvkQ

Cargo et al., Blood (2015)


Estudi retrospectiu de pacients amb citopenia i que varen ser diagnosticats de citopenia idiopàtica de significat incert (ICUS)Un 1.7% d’aquest pacients en 9 anys van evolucionar a SMD o

LAMMarcadors genètics (SNP arrays i NGS) per predir quins

pacients desenvoluparan SMD o LAM

Noves Guies del ELN

Noves Guies del ELN

IPSS-M

>2016


És ? ”

NO!!!!!!...


És ? ”

NO!!!!!!...no és prescindible…

és molt imprescindible…però….ens necessiteu als genetistes,

citometristes….

Diagnòstic-Seguiment-Sensibilitat



Variabilitat intersobservadorCITOGENÈTICA

Diagnòstic

CQ EUROGENTEST. Citogenètica. Mieloide

Diagnòstic

Pronòstic

Seguiment

Definir tractament


Citologia Cito/Genètica

Alteracions Genètiques en LLC

Pronòstic

Guttmann

ICO Badalona

HUGTP

UAB

IGTP

IMPPC

IrsiCaixa

BST

CEEISCAT

ICO-GTP

CLINIC

SANT PAU

Ens necessitem, tots fem falta…. millor sumar

Papaemmanuil et al., Blood (2013)

n=738, NGS en SP i/o MOPanell de 111 gens78% presenten una o mésmutacions


Les early drive mutations, generalment de gens implicats en el splicing alternatiu, marquen el curs de la malaltia amb una gran

varietat de fenotips clínicsPapaemmanuil et al., Blood (2013)


Pronòstic

CHIP. Clonal Hematopoiesis of IndeterminatePotential

Steensma et al., Blood (2015)


“Mientras que los hombres se enamoran de lo que ven, las mujeres se enamoran de lo que escuchan y leen”

Els homes semblen més citòlegs i les dones més genetistes… al reves que en

la hematologia..

Citogenèticaconvencional

FISH

FISH multicolor

HGC

Arrays

1960-70

1980

1990

1990

2000

Cariotip, FISH, Citologia

Evolució dels Estudis Genètics


FISH

FISH multicolor

HGC

Arrays

1960-70

1980

1990

1990

2000

CGH/SNP arraysCariotip, FISH, Citologia



FISH

FISH multicolor

HGC

Arrays

1960-70

1980

1990

1990

2000

SeqüenciacióCGH/SNP arraysCariotip, FISH, Citologia


InteligentCoherent

Espavilada

Poc inteligentSuperficial

Poc espavilada


ÍndiceEns necessitem

• No existeix un simple gen mutat en la majoria dels pacientsamb SMD

• La major part dels gens mutats en pacientes amb SMD es troben en menys del 5% dels pacients

• Les mutacions no són específique de les SMD

• Es detecten mutacions que s’observen en pacients ambSMD en individuus d’edat avanzada

• Es difícil l’us de tests moleculars pel diagnòstic delspacients

• Valor pronòstico i selecció de tractaments dirigids a canvisgenètics

Nueva Propuesta CitogenéticaValor de las Alteraciones Moleculares

Nybakken y Bagg , J Molec Diag (2014)

30-50% presenten alteracions citogenètiquesAlteracions heterogénees

Alteracions Cromosòmiques en SMD

• Alteracions citogenètiques suggestives de SMD en casos amb citopenia persistent però en absencia de tretsmorfològics definitius de SMD:

Vardiman et al., Blood (2009)

-5/5q- t(11;16)(q23;p13)-7/7q- t(3;21)(q26;q22)i(17)(q10), del(17p) t(1;3)(p36;q21)-13, del(13q) t(2;11)(p21;q23)del(12p) inv(3)(q21q26)del(9q) t(6;9)(p23;q34)idic(X)(q13) Complexe amb alguna de les alteracions anteriors

NO

+820q-

-Y

Alteracions Citogenétiques Suggestives de SMD

MoltBó

Bó Intermig Dolent Moltdolent

Única:del(11q)

-Y

OS 60.8mHR 0.47(0.3-0.7)

Complex>3 alteracions

OS 5.7 mHR 4.37 (3.5-5.5)

NormalÚnica:del(5q)

del(12p)del(20q)

OS 48.5mHR 1

(0.8-1.3)

Doble amb 5q-

Única:7q-+8

i(17q)+19+21

Altres úniquesUnrelated clones

OS 25.0 mHR 1.59 (1.4-1.9)

Altres dobles

Única:der(3)(q21q26)

-7

OS 15.0 mHR 2.83 (2.2-3.7)

Doble amb–7/7q-

Complex3 alteracions

Nueva Propuesta Citogenética IPSS-RNova Clasificació Citogenètica

Comparison of two MDS Cohorts

(n=1,682)

Rose et al., BJH (2014)

E. Papaemmanuil et al.T. Haferlach et al.

p < 10-9


T. Haferlach et al., Leukemia, 28, 241-247, 2014

Incidence PrognosisGene % mutated Gene Hazard RatioTET2 33.7 PRPF8 2.91

SF3B1 32.9 NPM1 2.42

ASXL1 23.8 RUNX1 2.40

SRSF2 17.5 TP53 2.34

DNMT3A 13.1 LAMB4 2.22

RUNX1 10.6 KRAS 2.10

U2AF1 7.7 NF1 1.82

ZRSR2 7.6 ASXL1 1.74

STAG2 7.5 ETV6 1.44

TP53 7.1 TET2 1.31

EZH2 5.5 STAG2 1.26

CBL 5.1 CBL 1.25

JAK2 4.8 EZH2 1.25

BCOR 4.0 NRAS 1.19

R. Bejar et al., NEJM, 364, 2496-2506, 2011

**

**

*

*

Valor Pronòstic de les Alteracions Moleculars

ÍndiceIndice

• Aspectos técnicos y metodológicos

• Valor pronóstico de las alteraciones citogenéticas

• Valor pronóstico de las alteraciones moleculares

• Integración de la citogenética & NGS

Greenberg et al., Blood (1997)¡¡¡¡Únicamente tiene en cuenta 4 alteraciones

citogenéticas distintas!!!!

Buen pronóstico

del(5q)del(20q)

Pérdida cromosoma YCariotipo normal

Pronóstico intermedio Resto

Mal pronósticoAlteraciones cr. 7

Cariotipo complejo (≥3 alteraciones)

IPSS (1997). Estratificación Citogenética

• Base de datos de pacientes con SMD primario procedentes de los registros (n=2901):

– IPSS (IMRAW) (Greenberg et al., Blood; 1997)

– Grupo Alemán-Austriaco (G-AA) (Haase et al., Blood; 2007)

– Grupo Cooperativo Español de Citogenética Hematológica (GCECGH) (Sole et al., Haematologica; 2005)

– International Working Group on MDS Cytogenetics from the MDS Foundation

Nueva Propuesta 2.010 (n=2901)Nueva Propuesta CitogenéticaNueva Propuesta Citogenética

MuyBueno

Bueno Intermedio Malo Muy Malo

Única:del(11q)

-Y

OS 60.8mHR 0.47(0.3-0.7)

Complejo>3 alteraciones

OS 5.7 mHR 4.37 (3.5-5.5)

NormalÚnica:del(5q)

del(12p)del(20q)

OS 48.5mHR 1

(0.8-1.3)

Doble con 5q-

Única:7q-+8

i(17q)+19+21

Otras únicasUnrelated clones

OS 25.0 mHR 1.59 (1.4-1.9)

Otras Dobles

Única:der(3)(q21q26)

-7

OS 15.0 mHR 2.83 (2.2-3.7)

Doble con –7/7q-

Complejo3 alteraciones

Nueva Propuesta Citogenética IPSS-RNueva Propuesta Citogenética

VERYGOOD INTERMEDIATE POOR

INT. VERY POOR

Proposal 2011Nueva Propuesta Citogenética

Las categorías citogenéticas se han utilizado para la estratificación de los pacientes en el IPSS-R

Schanz et al., JCO (2012)

Nueva Propuesta Citogenética

Greenberg et al., Blood (2012)

Nueva Propuesta IPSS-R

Variable pronóstica

0 0.5 1 1.5 2 3 4

Citogenética Muy bueno

Bueno Int. Malo Muy malo

Blastos MO %

≤2 >2-5% 5-10% >10%

Hb ≥10 8-<10 <8

Plaquetas ≥100 50-<100 <50

Neutrófilos ≥0.8 <0.8



ÍndiceIndice


• Valor pronóstico de las alteraciones citogenéticas

• Valor pronóstico de las alteraciones moleculares

• Integración de la citogenética & NGS

Malcovati et al. Blood (2013)

Nuevas Guías del ELN

Importance of Genetic Study

Malcovati et al. Blood (2013)

?

Proposal 2011IPSS-R: Categorías citogenéticas

MuyBueno

Bueno

Intermedio

Malo

Muy Malo



Variable pronóstica

0 0.5 1 1.5 2 3 4

Citogenética Muy bueno

Bueno Int. Malo Muy malo

Blastos MO %

≤2 >2-5% 5-10% >10%

Hb ≥10 8-<10 <8

Plaquetas ≥100 50-<100 <50

Neutrófilos ≥0.8 <0.8




GOOD INT. VERY POOR

Proposal 2011IPSS-R: Blastos en MO

≤2% vs. >2-<5%

>10%



Definiciones Citogenética

Estudio molecular de 22 genes (incluyendo SF3B1, SRSF2, U2AF1, DNMT3A) sobre 288 pacientes con IPSS de bajo o riesgo intermedio

Bejar et al., JCO (2012)

• Mutaciones en el 71% de los pacientes• Mutaciones de DNMT3A no se asocian a mal pronóstico• EZH2, RUNX1, TP53 y ASXL1:

– Corta supervivencia, independiente del IPSS

• EZH2:

– Significado pronóstico en el multivariante

Alteraciones Moleculares en SMD

Coleman et al., Ann Rev Pathol (2012)

complexComplejo-TP53 mut


Valor Pronóstico de las Alteraciones Moleculares



Hasta el momento NO se recomienda el estudio de los

marcadores moleculares


Haferlach et al., Leukemia (2014)

• n = 944, 104 genes, 47 genes con mutaciones• Edad media: 72.8 (range 23.3-90.8) • Pacientes con alteraciones citogenéticas aberrations: 31.4%• Pacientes con alteraciones moleculares: 89.5%


• Valor pronóstico del cariotipo y su utilidad para la confirmación del

diagnóstico en casos con alteraciones cromosómicas típicas de SMD

• Nuevos marcadores moleculares: pendiente de definir su aplicación en el

diagnóstico de los pacientes

• En casos con un cariotipo normal o sin divisiones, considerar la aplicación de

la SNP/CGH array para la detección de ganancias, pérdidas y UPD/CN-LOH

(SNP array)

• El IPSS e IPSS-R se basan en el resultado de la citogenética convencional, no

en los resultados de FISH ni los de SNP/CGH arrays

• Pendiente de actualizar el IPSS molecular (IPSS-M)

• A pesar de las nuevas tecnologías, la citogenética sigue siendo el gold

standard para la caracterización citogenética de los SMD

Conclusiones

MÉDULA ÓSEA

CITOGENÉTICACONVENCIONAL

BANCO DE TUMORES(CONSENTIMIENTO

INFORMADO)

CGH ARRAYSNP ARRAY

CITOLOGÍA

CITOMETRÍA DE FLUJO

BIOLOGÍAMOLECULAR

LMMCBCR/ABL

PDGFRA, PDGFRB

TET2, CBL,ASXL1, EZH2

Diagnóstico Integrado

Escola Citologia Hematològica Soledad WoessnerLab. Citogenètica Molecular Lab. Citologia Hematològica. Servei de PatologiaServei d’Hematologia ClínicaHospital del Mar. BarcelonaICO-Hospital Germans Trias i Pujol. Badalona

Si quieres llegar rápido anda solo, si quieres llegar lejos anda acompañado

Agradeciminetos

LAURAVERA

MAR EULALIA M. JOAO JORDI

MDS-CMML

ALL ALLNHL

Estrategia de Estudio de los SMD(presente-futuro)

Nybakken y Bagg , J Molec Diag (2014)

Casos sin mitosis

Alteraciones Genéticas en SMD

Walter et al., Leukemia (2013)

Cambio aminoácido


• Spliceosome: complejo de proteínas que elimina los intrones del pre-RNAm con el fin de obtener RNAm maduro. Este proceso recibe el nombre de splicing


• Cambios citogenéticos y cambios genéticos

• Valor pronóstico del resultado citogenético: nueva propuesta de IPSS (IPSS-R)

Índice


GOOD INT. VERY POOR

Proposal 2011IPSS-R: Efecto de la edad

Sólo influye en categoría de buen pronóstico



GENES, ALTERACIONES CITOGENÉTICAS

GENES, ALTERACIONES CITOGENÉTICAS

Lindsley and Ebert, Blood (2014)

Bejar and Steemsa 2014


Smith et al, Lancet Hematology (2015)

Tothova et al., Clinical Cancer Research (2013)

Estrategias de test genético mutacional

PRUEBAS RUTINA

CITOGENÉTICAFISH

CGH-SNP ARRAYS



Banco de muestras

PRUEBAS RUTINA

CITOGENÉTICAFISH



Investigación

CITOGENÉTICAFISH

CGH-SNP ARRAYS



Banco de muestras

CITOGENÉTICAFISH

X


Pronóstico

BUENO46,XX,5q-

MALO47,XX,+11

El tipo de alteraciones define el pronóstico

Pronóstico

BUENO46,XX,5q- [2]/46,XX [3]

MALO46,XX,5q- [5]

El número de células alteradas define el pronóstico

Pronóstico

BUENO46,XX,5q-

MALO48,XX,5q-,+11,+13

El número de alteraciones por célula define el pronóstico

Pronóstico

MALO

MUY MALO

El tipo de alteraciones, proporción de células alteradas y número de alteraciones por célula y la adquisición de alteraciones adicionales

durante el curso de la enfermedad define el pronóstico

Pronòstic

• n = 738 pacients, 111 gens, 43 gens amb mutations• Edat media: 68 anys• Pacients amb alteracions citogenètiques: 33%• Pacients amb alteracions moleculars: 78%



Alteracions Moleculars

En un paciente amb sospita de SMD, senseblastes, ni alteracions citogenètiques ni altres marcadors definitius de SMD, la

detecció de mutacions en gens implicats en les SMD, permitiría establir el DIAGNÒSTIC

definitiu de SMD?


The New England Journal of Medicine, Decembre, 2014

Estudi mitjançant secuenciació del exoma de 17.182 persones que no presentavenuna neoplasia hematològica


La majoria de les mutacions afecten a DNMT3A, TET2 i ASXL1.Les persones amb mutacions no presentaven ni SMD ni neoplasies hematològiques.

Increment en la mortalitat dels pacients amb mutacions i risc augmentat de malalties cardiovasculars


En pacients amb sospita de SMD, sense blastes, ni alteracions citogenètiques ni altresmarcadors definitius de SMD, la detecció de mutacions en gens implicats en les SMD, NO

permet establir el DIAGNÒSTIC definitiu de SMD

DIAGNÒSTIC INTEGRAT




If cancer were to be defined primarily by burden of disease, as hashistorically been used to distinguish MGUS from multiple myeloma and MBL from CLL, then CHIP, like MDS, would be considered cancer, since in CHIP a large fraction

of hematopoietic cells are clonal.

Menys sequenciar I que la gent aprengui o comptar blastes (AristotelesGiagounidis, ASH, San Francisco, 2014)

Lindsley i Ebert, Blood (2014)

Morfologia en el diagnòstic de les hemopaties malignes en ... · Diagnóstico Neoplasias...

Documents

Transcript of Morfologia en el diagnòstic de les hemopaties malignes en ... · Diagnóstico Neoplasias...