MONITOREO SEROLÓGICO DE HOSPEDEROS INTERMEDIARIOS E ... · La infección lleva a un estado de...

MONITOREO SEROLÓGICO DE HOSPEDEROS

INTERMEDIARIOS E INMUNIDAD CONFERIDA POR

LA VACUNACIÓN

Poggio Thelma Verónica, PhD

Centro de Virología Animal – CEVAN-ICT Milstein (CONICET)

Sitio Argentino de Producción Animal

1 de 34

¿Es posible desarrollar vacunas contra parásitos

helmintos?

¿Es posible lograr un alto nivel de protección contra

la infección, utilizando antígenos recombinantes?

"sí" Protección segura entre 90 y 100% con antígenos

recombinantes contra :

Taenia ovis en la ovinos, Taenia saginata en bovinos

Echinococcus granulosus en ovinos, caprinos y

bovinos y Taenia solium en porcinos


2 de 34

¿Por que las vacunas recombinantes desarrolladas

“exitosamente “ y que confieren protección,

involucran solo a las tenias (cestodes)?

¿Existen aspectos inmunológicos relacionados entre

metacestodes de tenias y sus hospederos?


3 de 34

“SI” 1. La infección lleva a un estado de inmunidad a la

reinfección.

2. Hospederos naive pueden ser protegidos contra la

infección inicial por inmunización con extractos de parásitos

inactivados.

3. Los hospederos naive pueden ser protegidos contra la

infección inicial por transferencia pasiva de suero de un

hospederos infectado o un hospederos anteriormente

inmunizados activamente.

4. Existe un alto grado de reactividad cruzada entre

antígenos de diferentes especies de tenias y se reflejó tanto

en la inmunización activa como en la transferencia pasiva de

inmunidad utilizando antígenos o suero inmune de especie

heterologas.


4 de 34

Red Institucional de I&D de Providean Hidatil EG95®

Invg


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PROCEDIMIENTOS INCORPORADOS PARA OPTIMIZAR LA

PRODUCCION DE LA VACUNA EN ARGENTINA

1. Expresión de la Proteína y Purificación

a) Expresión Intracitoplasmatica de EG95

b) Semi-purificacion

2. Selección del adyuvante

a) EG95 + Montanide ISA 70 Seppic mas Saponina

b) EG95 + Hidroxido de Aluminio (Hydrogel) mas Saponina

3. Respuesta inmune inducida en ovinos por vacunacion con

EG95 combinada con diferentes adyuvantes

El objetivo de nuestro desarrollo en Argentina fue asegurar la

efectividad de Providean Hidatil EG95 y su bioequivalencia con la

formulación Australiana


6 de 34

y = 6,1143x + 99,1 R² = 0,9997

100

105

110

115

120

125

0 1 2 3 4 5

D.O

.

ug/ul

EG95 Antigen quantification

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Product: Providean Hidatil Eg95 (ug/mL in aqeuous phase)

Batch Number:

Image J

Vol (µl) Densitom. (µg) in 20ul µg/ 1mL

1 20 108,625 1,052 52,6

2 20 106,781 1,035 51,75

3 20 105,484 1,024 51,2

4 20 108,387 1,05 52,5

5 20 105,936 1,028 51,4

6 20 109,047 1,058 52,9

7 BSA 1mg/mL 1 105,1 Average: 52,05

8 BSA 1mg/mL 2 111,5

9 BSA 1mg/mL 4 123,5

001/10

Expresión de EG95 Cuantificación de Antígeno

Rendimiento: EG95 500ug/mL


7 de 34

Establecimiento: “La Isla” (42° 25´ S–64° 31´ O)

Familia Iriarte. Depto Biedma, Prov. Chubut

Fecha iniciación: 09 de Mayo de 2009

Ultimo sangrado: 14 febrero 2012

♦ Cuatro grupos de 10 ovinos, de 6 meses fueron inmunizados (subcutaneamente)

con 2 dosis (0-30 DPV), y refuerzo a los 453 dpv con diferentes formulaciones

conteniendo la proteína EG95 :

♦ Dos grupos fueron inmunizados con 50 g EG95 ya sea combinada con hidróxido

de aluminio + 0.125 mg saponina o Montanide ISA70 + 0.125 mg saponina.

♦ Otro grupo recibió vacuna Australiana (50 g EG95+1mg QuilA)

♦ Un grupo servió como control y recibió solo adjuvante oleoso.

0 30 45 453 730 1000

DPV Inmunización

Sangrado

Ensayo a campo Sitio Argentino de Producción Animal

8 de 34

Establecimiento: “La Isla” (42° 25´ S–64° 31´ O)

Familia Iriarte. Depto Biedma, Prov. Chubut

Fecha iniciación: 09 de Mayo de 2009

Ultimo sangrado: 14 febrero 2012

Cuatro grupos de 10 ovinos, de 6 meses fueron inmunizados (subcutaneamente)

con 2 dosis (0-30 DPV) de diferentes formulaciones conteniendo la proteína EG95 :

♦ Grupo 1. 50 g EG95 + Hidroxido de aluminio + 0.125 mg saponina

♦ Grupo 2. 50 g EG95 + Montanide ISA70 + 0.125 mg saponina

♦ Grupo 3. 50 g EG95 + 1mg QuilA (Vacuna Australiana)

♦ Grupo 4 Control (solo adjuvante oleoso)

Providean Hidatil EG95 y su bioequivalencia con la

Formulacion Australiana

0 30 45 453 730 1000

DPV Inmunización

Sangrado

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 30 45 465 730 1000

Quil A

ISA 70+saponina

Alum+saponina

Adyuvante

Niveles de IgG anti-Eg95 inducidos en ovinos vacunados con 3 dosis de diferentes formulaciones

O.D

40

5 n

m

Días

1:200


9 de 34

Inmunización ovinos con 2 dosis de diferentes formulaciones

Titulos séricos obtenidos a 45dpv

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

QuilA ISA70+saponin Alum+saponina

Lo

g Ig

G a

nti

EG

95 t

iter-

1

A A B

4,14±0,18 4,04±0,25 3,08±0,27

n=10 ovinos/grupo

El grupo vacunado con la proteina recombinante combinada con ISA70/saponina

mostró títulos de anticuerpos mayores a 4 Log, similares a los observados en el

grupo vacunado con la proteína EG95 combinada con QuilA.

Poggio TV y col 2012


10 de 34

Duración de la inmunidad (días)

n=10 ovinos/grupo

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

QuilA ISA70/saponina Alum/saponina

30

45

453

730

1000

A B C B C A B C B C E F E E E

D C C G F G

D D G G

Se determinó la longevidad de la inmunidad luego de 2 inmunizaciones, antes y después

del refuerzo anual y a los 1000 dpv. Luego de 2 dosis, en los grupos vacunados con EG95

ya sea con ISA70/saponina o QuilA mostraron títulos séricos que persistieron por mas de

12 meses. Luego del refuerzo anual, a 730 y 1000 dpv se alcanzaron títulos similares a los

obtenidos a 453dpv. Mientras que los títulos obtenidos con la formulación acuosa luego de

luego de 2 dosis mas refuerzo fueron significativamente menores a los mostrados por la

formulaciones oleosa y australiana.

Poggio TV y col 2012


11 de 34

Cierto nivel de anticuerpos es requerido para mantener la

protección…

1:200

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

EG95+ISA70-SaponinaEG95+QuilA

O.D

. 40

5n

m

30 45 453 730 1000 30 45 453 730 1000 dpv

n=10 ovinos/grupo

Con el paso del tiempo, el titulo de anticuerpos específicos van disminuyendo

y durante ésta etapa parte del grupo puede mostrar cierta susceptibilidad, o

los niveles de anticuerpos pueden no ser suficiente para proteger al grupo

completamente, a menos que se realice una tercera vacunación anual.

Poggio TV y col 2012 1:200


12 de 34

Monitoreo inmunidad inducida por

Providean Hidatil EG95® Con el objetivo de contribuir al sistema de vigilancia epidemiológica y

demostrar potencia de la vacuna Providean Hidatil EG95.

0 30 60 180 360 720

DPV Inmunización

Sangrado

Grupo 1: Vacuna comercial Providean Hidatil EG95®

Grupo 2: Placebo formulado sin antígeno proteico EG95

(n= 10 animales menores de 6 meses)

Grupo 3:

a) Diseño de PROTOCOLO DE ENSAYO: POTENCIA!!!

Incluir

Vacuna australiana


13 de 34

Con fines de organización, las actividades técnicas se han

agrupado de la siguiente manera: -Módulo 1:

a) Diseño de protocolos de ensayo para seleccionar, adaptar y

desarrollar distintas estrategias de detección y cuantificación de

anticuerpos anti-EG95.

b) Preparación, purificación, identificación y caracterización de

antígenos recombinantes

c) Desarrollo de anticuerpos mono y policlonales, sueros controles

positivo, negativo y de referencia de interés epidemiológico,

preparación y provisión de reactivos.


14 de 34

d) Formación de recursos humanos relacionados a la

temática del proyecto tanto a nivel técnico como científico ya

que el personal a entrenar rotará por los diferentes

laboratorios a fin de adquirir formación interdisciplinaria.

e) Transferencia de la tecnología a los laboratorios de

referencia, provinciales y regionales habilitados para el

control de la hidatidosis en la Republica Argentina.


15 de 34

-Módulo 2 :

-Priorizar el cumplimiento de los requisitos técnicos y la

estandarización y validación de las técnicas:

c) Establecer programa de control de calidad de medios,

reactivos, etc. Establecer controles internos de las pruebas

para el cumplimiento de los requisitos para la Certificacion /

GMP/ MERCOSUR.

b) Incorporación al Banco de muestras sueros provenientes

de especies animales susceptibles a la enfermedad (cerdo,

camelidos, llama, bovino, ciervo, caballo, etc).

a) Estandarización y Validación de la técnica


16 de 34

ELISA FASE SÓLIDA

♦ Sustrato ABTS-H2O2

♦ Conjugado anti-especie-HRP

♦ Suero a testear Ac anti-EG95?

♦ Antígeno EG95 recombinante

Y Y


17 de 34

Preparación, purificación, caracterización de Ag /ELISA

EG95

EG95

Lisis celular

centrifugación

Unión a

resina

Lavado

Elución SDS-PAGE WB


18 de 34

Diseño de Placa/Potencia/Validación

Vacuna

Australiana

Providean

Hidatil EG95

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

O1 (-) (+) STD S1 S2 S3 (-) (+) STD S1 S2 S3

A 200

B 400

C 800

D 1600

E 3200

F 6400

G 12800

H 25600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

O2 (-) (+) STD S1 S2 S3 (-) (+) STD S1 S2 S3

A 200

B 400

C 800

D 1600

E 3200

F 6400

G 12800

H 25600


19 de 34

A día 0

♦ Si cualquier suero muestra una O.D. ≥0,4 el ELISA DEBE SER REPETIDO.

A día 60

♦ Si el Coeficiente de variacion (CV) de las muestras por duplicado es > al 15% el

ELISA debe ser repetido.

♦ Si 8 de 10 sueros de ovinos testeados para Providean Hidatil EG95 tienen una

densidad óptica a dilución1:200 ≥ al Suero Estándar a esa dilución la VACUNA

CUMPLE.

♦ Si 8 de 10 sueros de ovinos testeados para Vacuna Australiana tienen una

densidad óptica a dilución 1:200 ≥ al Suero Estándar a esa dilución la PRUEBA

de POTENCIA es VALIDA.

CRITERIOS DE ACEPTACION


20 de 34

MONITOREO SEROLÓGICO DE HOSPEDEROS INTERMEDIARIOS

E INMUNIDAD CONFERIDA POR LA VACUNACIÓN

0

0,5

1

1,5

2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

0 DPV 30 DPV 60 DPV 180 DPV

0O.D

. 40

5

Caravana N°

Proyecto VACUNA EG 95 - Departamento Investigacion en Salud Sarmiento - Chubut

Lugar de aplicación de la vacuna EG95:Estacion Gomez/ Coronel Brandsen Fecha: 13 /11/2011

Establecimiento : Don Gervacio Propietario : German Barrera

Establecimiento : Los Pepinos Propietario : Jose Celio Vanore

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

ICT Miltein-CONICET/Sec Salud Chubut/ SENASA2012


21 de 34

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

0 DPV 30 DVP 60 DPV 180 DPV

Log

IIn

v T

itu

lo d

e A

c an

ti E

G9

5-E

LISA



Proyecto VACUNA EG 95 - Departamento Investigacion en Salud Sarmiento - Chubut

Lugar de aplicación de la vacuna EG95:Estacion Gomez/ Coronel Brandsen Fecha: 13 /11/2011

Establecimiento : Don Gervacio Propietario : German Barrera

Establecimiento : Los Pepinos Propietario : Jose Celio Vanore

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

ICT Miltein-CONICET/Sec Salud Chubut/ SENASA2012


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PROTECCION VS. TITULO DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS

Back-transformed data - trials 1-3

Antibody titre - Eg 95

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

% P

rote

ctio

n (e

xpre

ssed

as

a pr

opor

tion)

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Se asocia con un alto grado de protección que una cierta proporción

del grupo de ovinos vacunados presente una absorbancia de

anticuerpos cercana o mayor a 1,0 y por lo tanto se podría inferir que

la vacuna estaría correctamente formulada y garantizando su buena

calidad. Poggio TV y col 2012


23 de 34

Camelidos Sudamericanos (Lama glama)



ICT Miltein-CONICET/Sec Salud Chubut/ INTA-Abra Pampa 2012

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

0 DPV 30 DPV 60 DPV

N° Caravana

D.O

. 405

nm

1:200


24 de 34

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

0 DPV 30 DPV 60 DPV

N° Caravana

Inv

Log

Titu

lo Ig

G a

nti

EG

95




ICT Miltein-CONICET/Sec Salud Chubut/ INTA-Abra Pampa 2012


25 de 34

IgG IgG camelidos





26 de 34


27 de 34

Orientacion hacia metodos alternativos a la experimentacion

con animales

RRR

(reduction, replacement and refinement)

Test de inactivacion de oncoesferas

activadas


28 de 34

Huevos de Taenia Hydatigena 10X



Oncosfera activada. Tinción Trypan Blue


29 de 34

Conclusiones

Se propone:

■ El desarrollo y validación de nueva tecnología destinada

al monitoreo de anticuerpos vacunales anti-EG95 en

ovinos y caprinos aplicable en los ensayos a campo.

■ Con el objetivo de contribuir al sistema de vigilancia

epidemiológica y a demostrar la potencia de la vacuna

Providean Hidatil EG95.

*En el marco del Plan Nacional de Hidatidosis


30 de 34

• Nuestros resultados muestran que la inmunogenicidad de la

formulación oleosa conteniendo 50 μg/dosis de proteína

recombinante EG95 fue demostrada y la vacuna hoy es

producida en Argentina como: Providean Hidatil EG95, y es

equivalente a la formulación Australiana desarrollada por

AgResearch y la Universidad de Melbourne.

Conclusiones : Sitio Argentino de Producción Animal

31 de 34

● La inclusión de ésta herramienta práctica en un

programa de control de hidatidosis permitirá prevenir

la enfermedad en hospederos intermediarios a través

de la seroprotección inducida y la subsecuente

reducción de la oferta de quistes hidatídicos

disponibles para los perros, posibilitando así la

disminución del riesgo de contraer la enfermedad a la

población.

Conclusiones finales :


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El cumplimiento de los objetivos del proyecto de diseño y

produccion de kits para el monitoreo vacunal en ovinos/caprinos y

camelidos permitirá a nuestro país :

♦ Implementar las estrategias y procedimientos de la norma técnica

en materia de vigilancia y monitoreo de inmunidad.

♦ Generar resultados confiables y aceptables por terceras partes, a

través de la implementación de normas de calidad en laboratorios

de diagnóstico y control, la aplicación de técnicas reconocidas

internacionalmente, adecuadamente validadas por personal

altamente capacitado.

♦ Implementar un sistema operativo para el control de la

enfermedad y así generar mayor información sobre estatus

sanitario de nuestra ganadería.


33 de 34

Grupo de Investigadores Responsables

Dra. Verónica Poggio

Dr. Osvaldo Periolo

Dra. Cristina Seki

Dra. Blanca Robiolo

Grupo de Colaboradores

Lic. Juan Serafino

Tec. Carmen de Vincenzo

Tec. María Delgado

Tec. Horacio Descoins Director: Dr. José La Torre


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