UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICASESCUELA DE MICROBIOLOGÍA Y

PARASITOLOGÍA

PRUEBAS DE INFECTIVIDAD EN VIRUS Y DIAGNOSTICO SEROLOGICO

AUTORES: AYCACHI INGA ROMULOARIAS MATOS LISBETHCHAFLOQUE MILLONES ALEXCULQUI LOZADA LILIANA

Seminario Monografía que se presenta como requisito parcial del curso de Virología.

LAMBAYEQUE, 2007

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DEDICATORIA

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A nuestros padres por ser los que día a día nos dan fuerza para continuar luchando por la vida y hacer posible nuestras metas, a nuestros profesores por ser los que nos forman profesionalmente.

CUANDO LA VIDA TE PRESENTE MIL RAZONES PARA LLORAR, DEMUESTRALE QUE TIENES MIL Y UNA RAZONES PARA SONREIR

Facundo Cabral

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AGRADECIMIENTO

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A Dios por permitirnos vivir. A quienes con su comprensión y cariño nos han

permitido la elaboración de este Seminario - Monográfico

INDICE

PÁG.

I. INTRODUCCIÓN

II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD

2.1 Inoculación de animales susceptibles

2.2. Inoculación de huevos embrionados (fecundados)

2.3 Aislamiento en cultivos celulares

2.3.1 Sistemas de cultivo más utilizados

2.3.2 Aislamiento y detección

III. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

3.1 METODOS DIRECTOS

3.1.1 La Presencia de Antígenos Virales (técnicas inmunológicas)

A.-INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)

B.-TEST DE AGLUTINACION EN LATEX

C.- INMUNOENSAYO

3.1.2 El Virus Como Partícula Viral

A. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

3.1.3 Técnicas de Diagnóstico Molecular

A. ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN.

B. TÉCNICAS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO

NUCLEICO.

C. VENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES.

D. DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES.

3.2. MÉTODOS INDIRECTOS

3.2.1 Pruebas serológicas Indirectas que dependen de la capacidad

del anticuerpo que se une al antígeno para ejercer alguna

función no relacionada con el virus. Dentro de estoas pruebas

tenemos:

A. Fijación del Complemento: (FC)

B. Hemoaglutinación Indirecta.

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C. Aglutinación de látex.

3.2.2 Pruebas Serológicas Indirectas que revelan la capacidad de los

anticuerpos para bloquear la infección viral especifica; dentro

de estas pruebas tenemos:

A. Neutralización Viral.

B. Inhibición de la Hemoaglutinación : (IH)

3. 2.3. Pruebas Serológicas que miden la Interacción Antígeno-

Anticuerpo

A. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

B. Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA)

C. Inmunoblot o Western Blot

Referencias

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I. INTRODUCCIÓN

Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo dentro de

células vivas, la investigación sobre virus requiere el uso de hospedadores apropiados.

Para el estudio de los virus bacterianos se usan cultivos axénicos en medio líquido o en

medio semisólido con agar. Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar,

resulta relativamente simple estudiar los virus bacterianos y por esta razon se dispone de

un crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus.

En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puede ser un

animal susceptible al virus, pero a efectos de investigación es deseable disponer de

hospedadores mas manejables. En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville

Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera

de su órgano original. Este fue el comienzo para el desarrollo de los cultivos de tejidos y

mas adelante el de los cultivos celulares (lineas celulares). Muchos virus animales

pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o cultivos celulares, y el uso de tales

cultivos ha facilitado enormemente la investigación sobre los virus.

Los anticuerpos, al ser específicos de antígeno y por tanto específicos del patógeno,

son componentes críticos de la respuesta inmune, interaccionan específicamente con el

antígeno sobre las células diana pero no matan a las células. Existe un grupo de enzimas

inespecíficas conocido en conjunto como complemento que puede fijarse a los

anticuerpos unidos al patógeno y lisar las células con el anticuerpo unido. La respuesta

inmune es específica para anticuerpos individuales y depende de anticuerpos

específicos, pero puede ser mediada o estimulada a través de mecanismos específicos

como el complemento.

En muchos casos, la inmunidad mediada por anticuerpos no es un mecanismo eficaz

para controlar la diseminación de la infección. Algunos agentes infecciosos parasitan el

organismo desde el interior de las células. P.ej. los virus animales se reproducen

utilizando los sistemas celulares del hospedador y, en consecuencia, gran parte de su

ciclo vital transcurre en el interior de las células del hospedador. Teniendo en cuenta

que los anticuerpos están armados para reconocer al patógeno libre en la sangre, o a

nivel de las superficies mucosas, las células infectadas del hospedador deben ser

identificadas y destruidas por diferentes medios, generalmente a través de interacciones

célula a célula propias de la inmunidad celular. Por fortuna, todos los patógenos

endógenos producen antígenos que a su vez son presentados sobre la superficie de

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células diana infectadas. El antígeno es reconocido por una célula T citotóxica (TC) u

actúa directamente sobre la célula diana infectada secretando proteínas citolíticas,

llamadas perforinas, que destruyen la célula infectada.

En el diagnostico de una enfermedad infecciosa no siempre es posible el aislamiento

del patógeno. Una posible alternativa, en estos casos, es cuantificar el título de

anticuerpos frente al patógeno que se sospecha. Cuando un individuo sufre una

infeccion de la que se sospecha el patógeno etiológico, el título de anticuerpos, puede

medirse mediante aglutinación, precipitación, enzimoinmunoanálisis (ELISA), métodos

de inmovilización o radioinmunoensayo (RIA). La tecnica general consiste en

establecer una serie de diluciones del suero (habitualmente diluciones al doble: 1:2, 1:4,

1:8,1:16, 1:32, y así sucesivamente) y determinar la dilución máxima a la que se

produce la reacción antígeno-anticuerpo.

Una sola medida del título de anticuerpos no indica infección activa. Después de la

infeccion, muchos anticuerpos dan títulos altos durante mucho tiempo; para establecer

que una enfermedad aguda se debe a un determinado patógeno, es esencial demostrar

una elevación del título de anticuerpos en muestras sucesivas de suero del mismo

enfermo.

En algunos casos, sin embargo, la mera presencia de anticuerpos puede ser

suficiente para indicar infección. Así sucede cuando el patógeno se presenta raramente

en la población. La presencia de anticuerpos es suficiente para indicar la existencia de

una infección en el individuo. Un ejemplo significativo es el síndrome de

inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se dispone actualmente de una prueba de ELISA

muy sensible y fiable para la detección de anticuerpos contra el VIH. La exquisita

sensibilidad del ELISA permite incluso la detección de título de anticuerpos muy bajo,

por lo que se utiliza el ELISA rutinariamente para el rastreo de la infección por VIH en

muestras de sangre.

II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD

2.1 Inoculación de animales susceptibles

En los primeros intentos para cultivos de virus, se utilizaba el huésped animal

definido del agente por estudiar. Estos intentos tropezaban con la complejidad

propia del animal entero, y las grandes diferencias de sensibilidad de un animal a

otro, incluso dentro de una misma especie. El descubrimiento y desarrollo de

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cultivo in Vitro de células capaces de mantener la duplicación hizo que ya no se

requiriera a los animales para la conservación ordinaria de la mayor parte de

agentes virales. Hoy en dia la inoculación de animales susceptibles es usada en

estudios de infectividad, ya que algunos virus no provocan efectos reconocibles

en cultivos celulares pero originan la muerte en animales. También es usada para

estudiar la oncogénesis viral, la patogenia de los padecimientos virales, la

respuesta inmune a los virus y el efecto de los factores ambientales sobre las

infecciones virales, así como el aislamiento primario de ciertos agentes.

El método que se utiliza para inocular los virus a los animales depende de la

sensibilidad del huésped respecto al virus, así como de la naturaleza de la prueba

o del experimento. Es frecuente recurrir a las siguientes vías de inoculación:

- Intravenosa

- Intracerebral

- Intraperitoneal

- Intranasal

- Intratraqueal

- Intradermica

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Una vez lograda la duplicación del virus, se recogen tejidos pertenecientes a las

zonas correspondientes del organismo, se les secciona u homogeniza y se almacena

(generalmente a baja temperatura) para emplearla después como fuente de virus.

El procedimiento general para una prueba de infectividad es realizar una dilucion

seriada de la muestra desconocida, normalmente por diluciones decimales sucesivas,

e inyectar muestras de cada dilucion a un cierto número de animales sensibles. Tras

un periodo de incubación adecuado, se cuentan los animales vivos y muertos

inyectados con cada una de las diluciones de la serie. Se suele considerar como valor

de referencia la dilucion a la cual la mitad de los animales mueren. Aunque los

métodos de diluciones seriadas son más prolijos y menos exactos que los basados en

cultivos celulares, resultan esenciales en el estudio de algunos tipos de virus.

Otros usos de las inoculaciones en animales susceptibles son la comprobación de la

inocuidad y poder protector de vacunas (poliomielitis), elaboración de éstas (rabia,

viruela), efecto neutralizante de sueros inmunes y de pacientes (con fines

comerciales y diagnósticos), etc., aunque su importancia se restringe cada vez más

por los avances logrados con los cultivos de tejidos. Entre los animales que se

emplean están monos, conejos, aves, ratas y ratones; estos últimos más que ningún

otro.

Diferentes tipos de animales usados en laboratorio para la inoculación de virus

2.2. Inoculación de huevos embrionados (fecundados)

Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante mas de 15 años. El

cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por

Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible

para el aislamiento de estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso.

Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo

fecundado, o en el propio embrión en desarrollo. También se emplearon huevos de

pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de

incubación mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usandose huevo de

gallina de 6 a 8 días de incubación aproximadamente (a veces se usa huevos de mas

tiempo de incubación).

Para preparar los huevos para el cultivo, en primer lugar se desinfecta la superficie

de la cáscara con yodo, y se perfora con un pequeño taladro estéril. Tras la

inoculación, el agujero del taladro se sella con gelatina y se incuba el huevo. Los

virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por

consiguiente, se deben inyectar en la region apropiada, P. ej. los mixovirus crecen

bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere

la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion tisular local conocida

como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus.

El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del

virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de

material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de

embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana

alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras

(“adaptación”) en el amnios. Los focos mas utilizados para la inoculación, a parte de

las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco

vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en

desarrollo, recurriendo a la inculacion intravenosa, intraperitoneal o intracerebral.

Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del

embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una

buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema

respiratorio del embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al liquido

amniótico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros

virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana

corioalantoidea, siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se

forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucion salina isotónica

las membranas, logran liberarse estos virus.

En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar

la muerte del embrio (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la

membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar

hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar

virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2).

En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica

de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas

contadas con la dilucion viral inoculada.

Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la

inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos

negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de

las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de

incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones

muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se

refrigeran a 4ºC y el líquido alantoideo se chequea con la prueba de

hemaglutinación. Si se detecta actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad

alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos

que den reacción negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.

Inoculación de huevos embrionados para cultivo de virus de la gripe aviar

Estructura y puntos de inoculación en un huevo embrionado

2.3 Aislamiento en cultivos celulares

Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar

sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. Los cultivos

celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagación de los virus,

constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y propagación de

la mayoría de los virus, consisten en un sistema formado por células provenientes de un

órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición

química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad

controladas. Dentro de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque

hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos

en microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de

células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos

cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un agente que

dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados) para

luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico en

donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a través

de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas complementarias.

No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de

diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus

herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y líneas celulares

(MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el

citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de pulmón fetal humano o bien

en algunas cepas celulares derivadas del mismo órgano y especie (MRC-5). Por otro

lado, una línea celular como HEp-2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS,

parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de

CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es posible que los pasajes sucesivos de una

línea la hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, como sucede con Hep-2 en

relación a VRS.

Tipos caracteristicos en cultivos celulares

Medio de cultivo para tejidos Coloración de Giemsa

2.3.1 Sistemas de cultivo más utilizados

Cultivos primarios: Se caracterizan por tener varios tipos de células. La

mayoría son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10

subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón

embrionario humano (REH).

Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la

producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales

tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su número

cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón.

Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n)

número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores

malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero (riñón

de mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1 (también de

tejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de células humanas

malignas. Éstas generalmente tienen un número variable de cromosomas y a veces

también son denominadas líneas celulares heteroploides. Otras líneas celulares

existentes son A9 (fibroblastos subcutáneos de ratón), BHK21 (fibroblastos de

hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epitelio de rata), L929,

LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitos de ratón),

MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3-A31

(fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de rata). Algunos

ejemplos de lineas celulares son:

HEP-2: Células heteroploides humanas derivadas de carcinoma laríngeo.

Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS.

MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para INFLUENZA y

ocasionalmente PARAINFLUENZA.

LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomienda

para el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina

cristalina al medio.

MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Se

recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.

Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células Hep-

2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas de

fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento de

citomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón humano

embrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como el

herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV)

etc. En todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se

quiera evidenciar.

2.3.2 Aislamiento y detección

Aunque el aislamiento viral es una buena técnica para el diagnóstico de

infecciones virales asintomáticas, crónicas y recurrentes, su eficacia depende del

momento en que se tome la muestra, del transporte óptimo y rápido de las

muestras; además que se debe escoger el tipo de células que sean permisivas para

el virus que se va a demostrar.

Para los cultivos virales se utilizan monocapas celulares adheridas al lecho de un

tubo, que requieren de sustratos esenciales para su mantenimiento, una solución

amortiguadora y un pH adecuado, además se deben suplementar con suero fetal

bovino, que contiene múltiples factores promotores de crecimiento celular. Una

vez que la monocapa se inocula con una muestra pretratada que proviene de un

individuo infectado, el virus se puede descubrir por:

EFECTO CITOPATICO (ECP):

El efecto citopático son cambios degenerativos específicos observados en una línea

celular como consecuencia de la replicación de un virus infectante. Éste puede

aparecer después de 3 ó 4 días.

A través de éstos cambios morfológicos celulares es posible poner en evidencia la

presencia de un virus en determinado tipo de cultivo de células. La observación

microscópica de las células en busca de ECP debe realizarse diariamente. El ECP

puede ser de varios tipos: la formación de sincicios, o de vesículas o inclusiones o

el redondeamiento y desprendimiento de la monocapa celular.

A veces la inoculación de una muestra o el virus semilla produce efectos tóxicos

transitorios o irreversibles sobre el cultivo celular. Estos pueden tener un efecto

parecido al ECP. Tal toxicidad puede hacerse evidente dentro de las 24 horas y

puede ser reducida o evitada cambiando el medio.

Algunos ECP caracteristicos de virus son:

1. Virus Respiratorio Sincicial: formación de sincicios o células gigantes en Hep-2.

2. Adenovirus: células redondeadas en Hep-2 con formación de racimos dejando

áreas sin células.

CUERPOS DE INCLUSION: En ciertas virosis es posible comprobar la

presencia de estructuras anómalas dentro del citoplasma o núcleo de las células

parasitadas, demostrables por tinción según métodos de Mann, Sellers o Giemsa.

Por lo general estas estructuras, llamadas cuernos de inclusión, muestran

afinidad por colorantes ácidos (eosina o fucsina ácida) y son eosinófilas.

Las inclusiones intracitoplásmicas son redondas u ovales, de aspecto granular, y

caracterizan a algunas infecciones, como la rabia (cuerpos de Negrí) y la viruela

(cuernos de Guarnieri). Las intranucleares son de dos tipos, A y B; la primera

provoca fuerte reacción de la materia nuclear, de modo que la inclusión se

aprecia con un halo claro a su alrededor, libre de cromatina. Estas formas se ven

en la fiebre amarilla y el herpes simple; las de tipo B ocasionan poca respuesta

en la célula y por lo común ocupan los espacios sin cromatina. Se observan en la

poliomielitis.

Los cuerpos de inclusión son de distintos tamaños; se presentan uno o varios en

el citoplasma o en el núcleo y, por fusión, algunos ocupan todo el espacio

nuclear, como sucede en el sarampión. Por medio del microscopio electrónico se

ha comprobado en unos cuantos su integración por agregados de cuerpos

elementales, aunque falta conocer su verdadera estructura.

Los cuerpos de inclusión son de enorme valor en determinadas virosis (los

cuerpos de Negri son peculiares de la rabia), pero en tejidos sanos y en

enfermedades no virales se han encontrado formaciones parecidas a ellos.

El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar

sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión

ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares

infectados.

Aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un

virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados

por el virus y expresados en la superficie celular.

HEMADSORCIÓN:

Existen otros métodos para descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular

cuando todavía no se produce el ECP, o éste no es evidente o en los casos en que

el virus se debe reconocer por otras propiedades o características en cultivo.

Dentro de las técnicas que ayudan a identificar estas propiedades virales está la

hemadsorción, que consiste en que cuando el virus infectante incorpora proteínas

virales con propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las células

infectadas se pueden descubrir por la adsorción de eritrocitos de ciertas especies

animales, que se puede observar al microscopio de luz. Es el caso de los

ortomixovirus y paramixovirus que se pueden reconocer por la hemadsorción de

eritrocitos de cobayo a las células; la identificación se confirma con la

inmunofluorescencia directa mediante anticuerpos específicos.

Esta técnica se basa en la capacidad de glóbulos rojos de determinada especie

animal de unirse a proteínas virales que están siendo incorporadas en la

membrana plasmática en las células infectadas. Agregando glóbulos rojos a una

monocapa infectada con virus es posible observar microscópicamente la

adherencia de los mismos a células que contienen virus y que están expresando

antígenos virales en su superficie.

Por medio de esta técnica, es posible demostrar la infección por aquellos virus

que presentan proteínas hemoaglutinantes.

III. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden

clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia

del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta

de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico virológico se basan en pruebas

serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas

antigénicas. Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del

diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de

técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.

En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear

nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de

ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido.

3.1 METODOS DIRECTOS

Son aquellos que detectan:

3.1.1 La Presencia de Antígenos Virales (técnicas inmunológicas)

A.-INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)

Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico.

El principio básico de la inmunofluorescencia directa se ilustra en la figura 1.

Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde

se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con

isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se

combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. La reacción

antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la

aparición de fluorescencia de color verde manzana.

Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente

sobre la muestra (por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado

nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático

observado en cultivos celulares. Además con el uso de anticuerpos monoclonales

específicos para los antígenos tempranos inmediatos del Citomegalovirus (CMV) es

posible determinar la presencia del CMV en cultivos celulares días antes del

reconocimiento del efecto citopático. Sin embargo la realización de la reacción es

laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de

fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero,

así como una recolección y preparación de la muestra adecuada. Aun así, el método,

en manos de una persona con experiencia resulta útil para la identificación rápida de

ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagnóstico

etiológico en el curso de una jornada de trabajo. Además puede estudiar varias

muestras simultáneamente. El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha

incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos.

Los anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína pueden

utilizarse para identificar el virus Respiratorio Sincicial (VRS), Influenza A y B,

Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros, así como para subtipificar especies

virales como, por ejemplo, virus Herpes Simple (HSV) de tipo 1 y 2. Esta técnica

requiere sólo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con

cultivos celulares para la identificación de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y

71% para Influenza A. La tinción con inmunoperoxidasa es similar a la de la

inmunofluorescencia y es la técnica de elección en algunos laboratorios. El

procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este caso el

anticuerpo

monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adición de un substrato

para evidenciar la reacción por un cambio de color que es visible micro y

macroscópicamente.

B.-TEST DE AGLUTINACION EN LATEX

Las partículas de látex son esferas de poliestireno que se unen fácilmente al

fragmento cristalizable (Fc) de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) o

inmunoglobulina M (IgM), esta última es mucho más eficiente en aglutinar

partículas naturales. Los fragmentos de unión del anticuerpo (FAb) quedan

expuestos y son capaces de unirse al antígeno que se encuentra en la muestra.

Cuando los antígenos tienen varios epítopes (o estructuras antigénicas repetitivas),

los anticuerpos multivalentes acoplados a múltiples partículas de látex se unen al

antígeno y se produce un entramado de las partículas de látex que dan como

resultado una aglutinación visible. Esta técnica se aplica ampliamente en el

laboratorio de microbiología, porque es fácil de realizar, requiere sólo unos

minutos y no necesita equipo, pues se lee a simple vista. Sin embargo, ofrece como

desventaja la presencia de reacciones cruzadas sobre todo con otros antígenos en la

muestra y también ocurren interferencias por el fenómeno de prozona, en el que un

exceso de anticuerpos no permite la formación del entramado. Esta técnica se usa

comúnmente para la demostración de antígenos de rotavirus en materias fecales.

C.- INMUNOENSAYO

Ensayos de captura del antígeno (sándwich), inmunocromatografía. Son

inmunoensayos en fase sólida donde se fijan los anticuerpos específicos para el

virus en la superficie de una matriz, tubo o microplaca y luego se pone en

presencia del suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere demostrar;

una vez ocurre la reacción antígeno-anticuerpo, se hace un lavado y se agrega un

anticuerpo marcado, que depende de la marcación del anticuerpo. La prueba se

denomina radioinmunoensayo (RIA) o inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA o

EIA) dependiendo del trazador que se utilice para evidenciar la reacción.

Se denomina RIA cuando el anticuerpo se marca con un isótopo radioactivo, el

más utilizado es el yodo, el anticuerpo que reacciona a manera de sandwich, se

pega a los epítopes del antígeno que han quedado expuestos; después de varios

lavados, se mide o cuantifica la radioactividad mediante un contador de

centelleo. El número de destellos por minuto es directamente proporcional a la

concentración del antígeno que reacciona y de acuerdo con una serie de

estándares de concentración conocida, se realiza una curva y se extrapolan los

valores de la muestra.

En la técnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima que puede ser la

fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano (PR) y para revelar la reacción

se coloca el sustrato específico para la enzima que es modificado por ésta y

produce un compuesto coloreado. En el caso de la FA el sustrato es el

paranitrofenilfosfato y para la PR es el peróxido de hidrógeno en una solución de

ortofenilendiamina (OPD) que hace visible la reacción. Para la cuantificación se

mide la absorbancia en una longitud de onda determinada en un

espectrofotómetro. La absorbancia será directamente proporcional a la cantidad

de antígeno descubierto. Estas técnicas se utilizan ampliamente en el diagnóstico

de hepatitis A y B, rotavirus, el agente Norwalk, ADV, el RSV, parainfluenza,

influenza A y B. Para la hepatitis B la demostración de antígeno de superficie

diagnóstica la infección activa y en VIH la demostración del antígeno p 24 es útil

en el diagnóstico de la infección en niños y en pacientes que se encuentran en

ventana inmunológica, además es de gran utilidad en el pronóstico y la

progresión de la infección así como en el control de la terapia antirretroviral.

3.1.2 El Virus Como Partícula Viral

A. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los

viriones presentes en muestras clínicas. La limitación del método además del costo

del microscopio, es que necesita de una alta concentración de viriones

(aproximadamente 109 partículas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en

la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una técnica poco utilizada,

más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de utilidad similar. El

microscopio electrónico nos permite, por ejemplo, obtener resultados positivos

rápidos de muestras de materias fecales de pacientes con diarrea, ya que tanto los

Rotavirus, como los Adenovirus, Coronavirus y Calicivirus pueden ser

visualizados e identificados como causantes de enfermedad. Por ejemplo, los

Rotavirus poseen una forma característica en doble rueda y un tamaño distintivo,

70nm de diámetro, y se los encuentra en concentraciones de hasta 1011 partículas

virales por gramo de heces. También en otras muestras, como líquido vesicular,

biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos,

mediante coloración negativa. Si la concentración de virus en la muestra clínica es

baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrónico, se pueden

utilizar técnicas que aumenten la visualización, por ejemplo, la

inmunoelectromicroscopía, que consiste en el agregado de anticuerpos específicos

antivirales y la formación de agregados de partículas que son más fácilmente

visibles que las partículas solas. Fig. 5.

3.1.3 Técnicas de Diagnóstico Molecular

Para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa, además del diagnóstico directo

(visualización y/o cultivo del agente infeccioso) y del diagnóstico indirecto

(detección de anticuerpos frente al agente infeccioso), disponemos de la

posibilidad de analizar la presencia de los ácidos nucleicos del agente infeccioso

en la muestra clínica mediante técnicas de diagnóstico molecular. Este

procedimiento permite, entre otras ventajas, detectar de una forma rápida

microorganismos difícilmente cultivables, como muchos virus (VIH, hepatitis B) y

bacterias orales (Treponema denticola).

Las ventajas de las técnicas moleculares ha sido ampliamente publicitadas en los

últimos 7 años, lo que sin duda ha aumentado la presión en los laboratorios

clínicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades

infecciosas, genéticas, oncológicas y neurológicas.

Las técnicas de diagnostico molecular comprenden técnicas que evidencian o

descubren el material genético específico viral conservado y replicable ya sea que

se encuentre en un fluido, en una célula o tejido, ya sea activo o latente. Estas

técnicas, que son más rápidas que las tradicionales, permiten hacer estudios en

tejidos almacenados y se pueden clasificar en dos categorías:

A. ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN.

Hibridación con sondas.

La emergencia de la biología molecular ha dado lugar a nuevas herramientas

moleculares que han adaptado rápidamente al campo del diagnostico viral. El

diagnostico basado en el DNA esta revolucionando al abordaje integral de la

identificación y monitorización de las enfermedades infecciosas, genéticas, y

neoplásicas, y otros cuadros clínicos, este nuevo enfoque utiliza factores

genotípicos mas que fenotípicos para identificar patógenos específicos. El poder

del diagnostico basado en el DNA se debe a dos hechos: (1) los ácidos nucleicos

pueden medirse de forma rápida y sensible, y (2) la secuencia de nucleótidos en

una determinada molécula de DNA es tan específica que pueden usarse los análisis

de hibridación para diagnostico clínicos fiables.

En un ensayo de hibridación molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones

pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.

Para realizar este ensayo se dispone de sondas de acidos nucleico, pues esta sonda

es una sola hebra de DNA que contiene secuencias caracteristicas de un

determinado virus.

La sonda de acido nucleico se obtiene, se obtiene la extraer secuencias secuencias

específicas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de

restricción. Luego estas secuencias extraídas, se pueden desnaturalizar y marcar ya

sea con una enzima o con un isótopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que

tienen una secuencia conocida se llaman sondas de ácidos nucleicos. Hoy en día se

están produciendo sondas de ácidos nucleicos sintéticas, con lo que se obtiene

sondas de oligonucleótidos de muy alta especificidad que están disponibles

comercialmente y son las más usadas en los laboratorios.

Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los

ácidos nucleicos. Posteriormente se añade un DNA marcado, complementario del

DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridación. La

muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda

ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.

Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridación: Si está

marcada con un isótopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador

gamma de manera que la cantidad de radiación medida en la columna es

directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente en el suero

problema o también se puede realizar la electroforesis del DNA hibridado con la

sonda marcada en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la

sonda mediante la aplicación de una placa de rayos X (Autoradiografía). Si esta

marcada con una enzima se detecta por una simple evaluación colorimétrica.

ADN blanco Desnaturalización de ADN Hibridización de la sonda con el ADN blanco

Hibridación con sondas

B. TÉCNICAS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO.

Reacción en cadena de la Polimerasa. (PCR)

Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), fue

desarrollada por Saiki et al., para incrementar el número de moléculas de DNA

blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una

única molécula de DNA y una sola copia de genes puede ser extraída, de mezclas

complejas de secuencias genómicas y visualizada como bandas diferentes en geles

de agarosa.

La PCR es, por tanto, una amplificación de secuencias específicas del DNA. Se basa

en la utilización de secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o

cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de

DNA , previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la

reacción tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable

obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucleótidos trifosfatos. La

función natural de la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los

deoxinucleótidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construcción. El

nucleótido al cual se una la polimerasa será complementario de la base en la

posición correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza así una cadena simple

de DNA, complementaria y alineada a cada "primer”.

Este método se basa en una serie repetida de ciclos, cada uno de los cuales esta

compuesto por 3 pasos fundamentales:

1º Desnaturalización del ADN doble cadena 2º Acoplamiento de los cebadores (primers) sintéticos

3º Elongación del cebador usando una ADN polimerasa.

En el primer paso el ADN aislado de la muestra es desnaturalizado a elevada

temperatura (95ºC) quedando las hebras complementarias libres.

En el segundo paso a una temperatura menor (dependiente de la temperatura de

hibridización de los primers), se acoplan los cebadores a las secuencias complementarias

que se encuentran en regiones adyacentes a la secuencia seleccionada.

El paso final del ciclo consiste en la elongación (extensión) del cebador para sintetizar la

hebra complementaria. En esta última etapa la temperatura generalmente utilizada es de

72ºC, (aunque puede variar según la enzima utilizada) permitiendo la incorporación de

desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) a partir del extremo 3´OH del cebador. Este

proceso es catalizado por la Pol I Thermus aquaticus (Taq pol). Dicha polimerasa

permite el apareamiento de las bases complementarias al ADN molde.

Estos tres pasos básicos ocurren durante varios ciclos (generalmente entre 25 y 35)

en donde el ADN se elonga a una velocidad de 120 nucleótidos/segundo en

dirección 5´→3´.

La repetición de tales ciclos es lo que permite la amplificación del ADN. Es importante

destacar que cada uno de los productos obtenidos en cada ciclo, actúa como molde para

el ciclo siguiente, produciéndose de esta forma una síntesis exponencial del fragmento

inicial de ADN.

Otros componentes necesarios en la PCR son: buffers que contengan Mg+2 (muy

importante para el funcionamiento de la enzima), cationes monovalentes y algunos

solventes que ayuden a estabilizar la enzima.

Las variaciones de temperaturas y los tiempos necesarios son críticos en esta técnica,

para ello se utiliza el Termociclador, el cual realiza estas variaciones automáticamente.

Aunque la PCR ha sido diseñada en base a la amplificación de ADN, ésta técnica puede

ser empleada en el análisis de ARN.

La técnica de RT-PCR ha aumentado considerablemente la sensibilidad en la

detección de virus ARN. Para ello es necesario generar en primer lugar el ADN

complementario (ADNc) a partir del ARN. En esta reacción se utiliza la enzima llamada

transcriptasa reversa. Una vez sintetizado el ADNc, éste se amplifica siguiendo el

mismo

procedimiento descrito para la PCR actuando este último como molde.

Reacción en cadena de la polimerasa

Método de reacción de polimerasa en cadena (PCR), en que se muestra

progresión de la síntesis de nuevas hebras.

OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN.

- Reacción en cadena de la ligasa o LCR.

- Sistema QB replicasa.

C. VENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES.

Sensibles para genes de importancia para la investigación y para

el diagnóstico clínico. Algunas de las ventajas de las técnicas de

sondas de ácidos nucleicos se discuten a continuación.

La unión entre ácidos nucleicos es más fuerte que la avidez del

anticuerpo por el antígeno. También los ácidos nucleicos son

mucho más estables que las proteínas a alta temperatura, alto

pH, solventes orgánicos y otros compuestos.

Los agentes infecciosos involucrados en la patogénesis de una

enfermedad pueden ser cuantificados aun cuando estén

presentes en cantidades de subpicogramos o como infecciones

latentes.

En una infección microbiana, las sondas de DNA o RNA pueden

detectar la presencia de secuencias genéticas en lugar de los

productos de genes. Así, las primeras etapas de la enfermedad

se pueden diagnosticar en pacientes en los cuales las pruebas

serológicas o histopatológicas fallan en descubrir la causa.

La prueba de hibridación in s i tu es suficientemente sensible

para detectar bajos niveles de DNA o transcripciones de RNA

directamente en la células o tejido afectado. Esta técnica es

particularmente útil para la localización de áreas afectadas en

un órgano y para la identificación de fenotipos de células

infectadas. Esto no es posible cuando se extrae el DNA o RNA

total.

Son rápidos para identificar a las partícula viral, en tiempo de

2 a 4 horas (hibridación de sondas)ç, de 4 a 8 horas(PCR).

Permite detectar cantidades muy pequeñas de virus.

Presenta una sensibilidad y especificidad alta.

D. DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES.

Son caros, tienen un alto costo.

La necesidad de cebadores específicos para encontrar determinado

microorganismo y por ello hay la posibilidad de falso (+), lo que implica un

conocimiento adecuado de la secuencia de nucleótidos del agente.

la aplicación de estas técnicas exige una infraestructura y entrenamientos

adecuados.

La prueba se tiene que efectuar en condiciones adecuadas de astringencia es

decir, a una temperatura, pH y concentración de cebadores y nucleótidos

adecuados. Si hay fallas, pueden ocurrir amplificaciones inespecíficas y

contaminaciones con DNA extraño.

3.2. MÉTODOS INDIRECTOS

Las métodos indirectos a comparación de las pruebas directas son aquellas en

lasque se demuestra, un contacto del huésped con el agente viral, mediante la

determinación de anticuerpos específicos contra el virus.

Estos métodos o técnicas serológicas son las que se usan con mas frecuencia para

descubrir anticuerpos contra un determinado agente viral, teniendo en cuenta que

la exposición al agente viral produce una respuesta por parte del sistema inmune

del huésped.

Las técnicas serológicas indirectas se clasifican en tres grupos, teniendo como base

la cuantificación de la reacción antígeno – anticuerpo:

3.2.1 Pruebas serológicas Indirectas que dependen de la capacidad del

anticuerpo que se une al antígeno para ejercer alguna función no relacionada con el virus. Dentro de estoas pruebas tenemos:

A. Fijación del Complemento: (FC)

Es un sistema semicuantitativo, que proporciona de manera exacta la

cantidad de antígenos o de los anticuerpos contra esos antígenos. Este

método de cuantificación de las proteínas virales es particularmente útil para

la detección de las infecciones virales abortivas, es decir cuando solo se

expresa parte de la información genética presente en el genoma viral y no se

producen partículas virales. Hoy en día se utiliza como estándar de

comparación para las nuevas pruebas comerciales. Una de sus aplicaciones

consiste en determinar anticuerpos contra agentes de baja prevalencia como

los virus coxsackie, o también para determinar la actividad de ciertas

infecciones como por ejemplo la rubéola.

El proceso que se lleva a cabo es el siguiente:

En un principio el antígeno reacciona con anticuerpo que se encuentra en

la muestra de suero del paciente y en presencia de complemento, titulado

previamente.

Si el antígeno y el anticuerpo reaccionan se activa la vía clásica del

complemento.

Seguidamente se añade el indicador constituido por eritrocitos cubiertos

con anticuerpos y de esta forma, si el complemento se fija y es activado por

el complejo antígeno viral – anticuerpo, los eritrocitos no se lisarn; pero si

no hay unión antígeno - anticuerpo, el complemento permanece libre y se

une al complejo indicador y produce lisis de los eritrocitos.

En conclusión este método emplea el complemento para lisar eritrocitos que

a su vez funcionan como indicadores.

La interpretación de la prueba de fijación de complemento es que la lisis es

resultado negativo de la prueba y la ausencia de lisis un resultado positivo.

Fijación de complemento Positiva

Antígeno Anticuerpo

en suero

Reacción Ag-Ac

fija complemento

Hematíes

No hay lisis

prueba positiva

Fijación de complemento Negativa

B. Hemoaglutinación Indirecta.

Para realizar esta prueba se utilizan antígenos ligados a glóbulos rojos o

eritrocitos, para detectar anticuerpos específicos. Los eritrocitos se pueden

sensibilizar con diversos antígenos y se pueden utilizar como sistema

indicador; la variedad de antígenos que pueden unirse a glóbulos rojos

pueden ser: Carbohidratos, proteínas etc.

Esta prueba se usa para demostrar anticuerpos contra virus como fiebre

amarilla, influenza, parainfluenza y dengue; dado que este método es

altamente exacto y rápido para cuantificar partículas virales.

El proceso se lleva a cabo realizando diluciones seriadas en una placa

multipocillos de fondo en U: en los pocillos se realizan las diluciones

seriadas de los sueros y sobre ellos se depositan la suspensión de hematíes

sensibilizados con el antígeno.

Antígeno Anticuerpo inespecífico en suero

No hay reacción

C libre Hematíes

Presencia de lisis

prueba negativa

Si hay anticuerpos suficientes para aglutinar se forma una malla que se

deposita y se observa una especie de velo que cubre el fondo del pocillo.

Cuando no existan anticuerpos o estén en cantidad insuficiente, entonces las

células sedimentarán de forma independiente y resbalaran por los bordes del

pocillo hasta acumularse en el punto mas bajo del mismo, el cual se observa

como un acumulo nítido en el fondo.

C. Aglutinación de látex.

Similar a la técnica de látex ya descrita sólo que en este caso el antígeno se

encuentra fijo a la partícula de látex y, por tanto, se espera descubrir los

anticuerpos que se encuentran en la muestra.

Este ensayo generalmente son pruebas de filtro (tamizaje) pues sólo

determinan la presencia o no de anticuerpos y los resultados se pueden

interpretar como «inmune» (si es positivo) o «susceptible» (si es negativo),

como en el caso de determinar el estado inmune para el virus de la rubéola,

VIH, rotavirus del grupo C, virus de Epstein-Barr(EBV). La información que

suministra corresponde a exposición al agente o infección pasada;

generalmente las pruebas de látex no son específicas para ésta. En virología se

utiliza con más frecuencia la técnica de aglutinación de látex directa.

3.2.2 Pruebas Serológicas Indirectas que revelan la capacidad de los anticuerpos para bloquear la infección viral especifica; dentro de estas pruebas tenemos:

B. Neutralización Viral.

La neutralización de los virus se define como la disminución del poder

infectante del virus a consecuencia de su interacción con el anticuerpo

especifico, la unión que se da entre el antígeno viral y el anticuerpo no altera

irreversiblemente a ninguno de los componentes que forman el complejo, puesto

que dichos componentes se pueden recuperar por disociación tanto el virus

como el anticuerpo.

Dicho ensayo es bastante relativo y el mecanismo por el cual el anticuerpo

neutraliza el poder infectante del virus va depender de los siguientes factores:

- virus.

- Variedad de anticuerpo.

- de la relación cuantitativa.

- Del comportamiento especial de determinada célula huésped frente al

complejo antígeno – anticuerpo.

Los mecanismo por los cuales los anticuerpos de neutralización logran su efecto

es mediante.

Inhibición de la absorción viral sobre las células.

Cuando los anticuerpos se unen a la superficie del virión para impedir la

adsorción como por ejemplo la IgG que posee 2 focos de fijación al antígeno

permitiendo, así el establecimiento de 2 enlaces específicos con 2 grupos

determinantes sobre un mismo visión. El coeficiente de temperatura, cuando se

da el complejo antígeno – anticuerpo es elevado, lo cual da lugar a cambios de

conformación en ambos moléculas. Estos cambios bastan para inhibir la

fijación del virus que se combinarían con los receptores celulares.

Aumento de la degradación del virus

Se dan en los casos en los que la interacción del virus con el anticuerpo no

impide su fijación sobre las células sensibles, a pesar de que las proyecciones

superficiales del virus estén cubierto de anticuerpos, para esto el virus cubierto

de anticuerpos es fagocitado y el anticuerpo ejerce su efecto de neutralización

dentro de la célula impidiendo la liberación normal de núcleos virales.

En conclusión el complejo antígeno anticuerpo se desarrolla como unidad dentro

del fagosoma por efecto de enzimas de lisosomas y volviéndose el genoma

vírico soluble e impidiendo su duplicación del Acido - Nucleico. Esta técnica se

ha utilizado para el diagnostico de las infecciones por dengue.

Resultado Positivo

Partícula viral

Anticuerpos en suero

Bloqueo Ac + Ag

Células no infectadas

Resultado Negativo

B. Inhibición de la Hemoaglutinación : (IH)

Esta prueba demuestra la capacidad de algunos antígenos virales para aglutinar

eritrocitos. Esto lo hacen debido a que sus proteínas, para poder absorberse a

las células interactúan con receptores sobre la superficie del eritrocito: sin

embargo la interacción es impedida por anticuerpos específicos en el suero del

paciente evitando la aglutinación de los eritrocitos por tales antígenos; los

antígenos implicados en esta reacción son los componentes de la superficie de

la partícula viral, los cuales poseen determinantes antigénicos mas específicos

de tipo.

Esta prueba de la inhibición de la hemoaglutinación es un medio altamente

específico para la caracterización de los virus.

Para realizar la prueba se hacen diversas diluciones del suero con el fin de

hacer una titulación y determinar el nivel de anticuerpos del paciente.

La reacción constituye la base para numerosas pruebas diagnosticas, las

enfermedades en la que se puede demostrar la respuesta de anticuerpos por la

prueba de IH son: Influenza., Enf.de New Castle, Rubéola, Sarampión,

Dengue, infecciones por reovirus, etc.

La interpretación de la prueba de IH se lee de la siguiente manera:

- Aglutinación positiva; se forma un recubrimiento rojo granular difuso

en el fondo del tubo.

Partícula viral Anticuerpos en suero

No hay reacción

Células infectadas por virus libre no neutralizado

- Aglutinación negativa; botón rojo compacto en el fondo del tubo que se

desliza al inclinarlo.

3. 2.3. Pruebas Serológicas que miden la Interacción Antígeno-Anticuerpo

A. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

IFI; es un método rápido y confiable que permite la detección de

anticuerpos o antivirales en el suero de paciente. Se basa en la unión de

anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antígenos

virales expresadas en la superficie de células infectadas. El procedimiento

se basa en lo siguiente:

Primeramente se fija el antígeno (células infectadas y no infectadas) a

un portaobjetos y se incuba con el suero; si existe anticuerpos

específicos, se unirán a los determinantes antígenicos.

Seguidamente se realiza un lavado y se lleva a incubar la muestra con

la antiglobulina marcada para revelar la presencia del primer

anticuerpo.

Luego el conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente; y si la

reacción es positiva se revelara el inmunocomplejo que vendría hacer

el anticuerpo especifico.

En la prueba de IFI el lavado de ambos pasos elimina los anticuerpos que no

se han fijado específicamente; y la utilización de antiglobulina marcada, que

puede ser anticuerpo antiinmunoglobulina G humana conjugada con

Antígeno viral

Anticuerpos específicos

Ag-Ac bloquean aglutininas

Inhibición de HA

isotiocianato de fluoresceína, que es una sustancia que se vuelve fluorescente

a la exposición de la luz ultravioleta y emite una luz verde característica.

La presencia de anticuerpos de evidencia por la aparición de fluorescencia en

el citoplasma y superficie de células infectadas, mientras que las células

control no fluorescen.

Esta técnica se ha utilizado para descubrir anticuerpos contra rubéola, VIH,

etc. Actualmente ha sido remplazada por la prueba de ELISA debido a que

presenta una especificidad similar y se puede leer mediante equipos

automatizados lo que elimina la subjetividad inherente al observador en IFI y

la necesidad del microscopio de fluorescencia.

B. Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA)

La prueba ELISA indirecta tiene un principio semejante al de la ELISA

directa, sólo que en este caso, un antígeno específico está unido a una fase

sólida que puede ser un tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se añade el

suero del paciente que posee los anticuerpos y después se adiciona el

conjugado constituido por un anti-anticuerpo IgG o IgM unido a una enzima;

posteriormente se adiciona el sustrato específico para la enzima, que lo va a

modificar y produce un compuesto coloreado, cuya intensidad es

proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero del paciente.

Esta prueba se utiliza ampliamente; más aún, con el advenimiento y la

disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo

de 1 a 2 horas. Su utilidad en virología es básicamente para determinar

anticuerpos contra antígenos específicos del dengue, HSV, VIH, RSV, CMV,

rubéola, hepatitis A, B y C principalmente, y en infecciones por EBV se usa

para demostrar marcadores serológicos tempranos de la infección, que se

pueden utilizar en el manejo de huéspedes inmunocomprometidos.

C. Inmunoblot o Western Blot

Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando amplias

aplicaciones en el diagnóstico virológico; esta tecnica utiliza un control para

comparar y poder determinar el tipo de proteína para la cual hay antígenos

específicos; y de esta forma poder definir exactamente contra cuáles

proteínas están dirigidos los anticuerpos del paciente y asimismo determinar

la fase de la infección en que se encuentra.. Son particularmente útiles para el

diagnóstico del HIV.

La técnica de WB se basa en la separación electroforética de proteínas virales

que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto

de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas

proteínas.

Esta técnica se realiza esquemáticamente en 3 pasos:

Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego

son tratados químicamente para su disgregación e inactivación. Los

antígenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de

Poliacrilamida.

Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag

separados a una membrana de nitrocelulosa.

Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa.

Posteriormente se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana unida a

una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por último, se agrega el

substrato enzimático para la visualización de las bandas reactivas con un

producto final coloreado.

Esta prueba es muy específica y se utiliza como suplementaria y confirmatoria

en infección por el VIH o HTLV-I cuando ELISA da resultados contradictorios o

difíciles de interpretar. También se utiliza para diferenciar entre infección por

VIH1 y VIH2.

Referencias

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- MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiología de los Microorganismos.

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Edit. El Manual Moderno. Mexico D.F.

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- METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL. disponible en:

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- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (LA PCR) Jean-Pierre

HERVEG y Maritza BARCIA-MACAY. Disponible en:

www.icampus.ucl.ac.be/.../PCR/PCR.html