Molinos de BolasLos molinos de bolas a gran escala constan de: una cmara de molienda con perlas de vidrio (elemento activo de la molienda) un eje giratorio que posee: discos barras anillos que provocan el movimiento del contenido del molino. El tipo de agitador est directamente relacionado con el transporte ptimo de la energa

1

Los discos, barras o anillos permiten solo el paso de las clulas a travs de la cmara, no as el de las bolas. Los molinos de perlas tienen una relacin longitud a dimetro de las cmara de molienda de 1: 2.5 a 1:3.5 Los volmenes de las cmaras van entre: Laboratorio 50 ml Industrial 250 lts para flujos de 2000l/h

Mecanismo 1. Se produce un transporte de energa cintica desde el agitador a las bolas de vidrio. 2. Se forman diferentes perfiles de velocidad en el interior de la cmara. 3. Se generan fuertes esfuerzos de corte, junto con el hecho de aumentar la frecuencia y fuerza de las colisiones entre las bolitas y las clulas lo que provoca la desintegracin de stas.

2

Parmetros operacionales 1. Velocidad del agitador 2. Diseo del agitador 3. Velocidad de alimentacin de la suspensin 4. Tamao de bolas de vidrio 5. Carga de bolas 6. Concentracin celular 7. Temperatura 8. Tiempo de residencia

Ecuacin de Diseo

1.- Velocidad del agitador () La velocidad promedio se define como:

u=Donde n: Velocidad de agitacin

Dm n 60000

Dm. Dimetro promedio de los anillos

A medida que: aumenta de la velocidad del agitador: Aumenta la fuerza de corte y la frecuencia de colisiones Aumenta la temperatura Aumenta la erosin de las bolitas

3

Protena Liberada (%)

Diferentes tipos de agitador

Velocidad del Agitador

2.- Diseo del agitador El tipo de agitador promueve una mezcla del tipo flujo pistn, pero con una distribucin de tiempos de residencia, lo cual afecta el nivel de ruptura de las clulas.Ejemplo Anillos Excntricos Anillos Concntricos

D =2 e +d2 m

2

4

Enzima Liberada (%)

4

3.- Velocidad de alimentacin de la suspensin La potencia consumida es funcin de la velocidad de agitacin y levemente de la velocidad de alimentacin, por lo cual considerando este punto se recomienda operar a los flujos ms altos posible.

4.- Tamao de bolitas de vidrio Dependiendo la escala, el tipo de clula y la localizacin del producto de inters se recomiendas diferentes tamaos de bolitas.

5

Escala Laboratorio : 0.2-1.5 mm Industrial : 0.4-1.5 mm Tipo de clula Levadura > 0.5 mm Bacterias < 0.5 mm Localizacin Espacio periplasmtico (ms fcil) Mayor Tamao Protoplsmatico (ms difcil) Ms pequeas

EficienciaRazn = Volumen Volumen Molino Bolitas

Cuando hay un mayor nmero de bolitas aumenta el nmero de colisiones y aumenta la eficiencia, para poder mantener la Razn se debe trabajar con bolitas ms pequeas. Al disminuir el dimetro de las bolitas, stas tienden a flotar EXISTE UN DIAMETRO OPTIMO DE BOLITAS QUE SE DETERMINA EXPERIMENTALEMENTE

6

5.- Carga de bolitas La carga ptima de bolitas depender del tipo de clulas y del dimetro de stas. Nivel de la carga Baja provoca baja eficiencia Alta provoca un alto consumo de potencia y alta liberacin de calor. CARGA OPTIMA ENTRE 80-90% Si = 0.5 mm 85% Si = 1.0 mm 80%

6.- Concentracin de la suspensin celular El peso hmedo de clulas ptimo es entre 40-50%. 7.- Efecto de la temperatura La temperatura facilita el rompimiento pero puede afectar el producto. Temperatura ptima entre 5-15C, para ello se requiere de sistemas de enfriamiento

7

8.- Tiempo de Residencia A mayor tiempo de residencia mayor rompimiento

DISE O DE UN MOLINO DE BOLAS Este tipo de equipos puede operar en forma batch o continua. Operacin Batch El grado de rompimiento se mide en forma: Directa: Contando clulas rotas Indirecta: Midiendo componentes liberados durante el rompimiento, por ejemplo Protenas Actividad de enzima

8

Ecuacin de DISE O Al igual que los homogenizadores de alta presin los molinos de bolas presenta una cintica de rompimiento de 1 orden respecto al tiempo. Del balance de masa para la protena liberada:

Vm

dR = k ( RM R ) Vm dT

VM: Volumen libre del molino R: Producto liberado. RM: Producto mximo que se podra liberar. t: Tiempo de operacin o residencia k: Constante cintica [t-1] f(T,tipo y concentracin de clulas, carga, velocidad de agitacin, dimetro de las bolitas)

Integrando entre t =0

R =O

ln

RM = k t RM R

En el caso de trabajar evaluando actividad Integrando entre t=0 A =0

ln

AM = k t AM A

A: Actividad de la enzima liberada A M: Actividad mxima que se podra liberar. t: Tiempo de operacin o residencia k: Constante cintica [t-1] f(T,tipo y concentracin de clulas, carga, velocidad de agitacin, dimetro de las bolitas)

9

Ejemplo 1:En un estudio de liberacin de protenas intracelulares en funcin de la velocidad de agitacin empleando un molino de bolas, con bolas de entre 0,55 y 0,85 mm de dimetro, utilizando una suspensin celular de una concentracin 50% (peso / volumen), un flujo de alimentacin igual a 50 L/h y una carga de alimentacin de 85%. Bajo estas condiciones se obtuvieron los siguientes datos: Velocidad de Agitacin (rpm) 1200 1500 1750 2000 2250 Protena liberada (mg/mL) 15,88 22,35 22,90 22,94 23,00

a) Determine la velocidad de agitacin ptima para este agitador.

Ejemplo 2:Seleccionada la velocidad de agitacin se vari el dimetro del agitador, obtenindose los siguientes datos: Tiempo de residencia (min) 3 5 10 15 20 Agitador 1 log(Rm/(Rm-R)) 0,037 0,090 0,160 0,225 0,300 Agitador 2 log(Rm/(Rm-R)) 0,060 0,150 0,225 0,325 0,425

1. 2.

Estimar las constantes cinticas de desintegracin para cada tipo de agitador. Calcular el tiempo requerido para obtener un 80% de rompimiento para cada agitador.

10

Escalamiento Transferencia de calorEl principal problema es remover la energa , que debe ser disipada. Toda la energa entregada por los agitadores es transferida al interior del molino como calor. Este calor debe ser removido por las paredes. As se defini:

R=

Area de transferencia de calor T L 4 = = T 2 L T Volumen de molino 4

Donde T: Dimetro del Molino L: Largo del Molino Esta razn disminuye cuando se aumenta el dimetro

Escalamiento PotenciaLa potencia entregada se determina como:

Potencia = c N 3 D 5Donde : Densidad de la suspensin N: Velocidad de rotacin de los impeler D: Dimetro del impeler C: constante Si se aumenta el dimetro del impeler se aumenta la energa o potencia entregada. Si el dimetro del molino se duplica el rea de transferencia se reduce y no se disipa toda la energa. SE DEBEN EVALUAR LAS DIMENSIONES PARA OPTIMIZAR NIVEL DE ENFRIAMIENTO Y MINIMIZAR EL CONSUMO DE POTENCIA

11

Caractersticas de las clulas

Membrana celular Estructura de la membrana celular La caracter sticas de las membranas nos permiten diferenciar a las bacterias en 2 tipos: - Gram-negativas Como modelo se utilizar un bacteria Gram-negativa, no tiene ncleo y todo su material gentico se encuentra en una simple cadena de DNA, un ejemplo es la E.coli. - Gram-positivas Entre ellas las bacterias del tipo Bacillus

12

Gram-negativas La estructura de una Gram-negativa involucra tres capas :

Membrana externa: 8nm de ancho, polmero que contiene protenas y lipopoliscaridos Peptidoglucano: Delgada capa de peptidoglucano Espacio periplasmtico : 8 nm de ancho, donde a menudo se localizan algunas enzimas

Membrana plasmtica : Compuesta de fosfolpidos, pero contiene protenas dispersas e iones metlicos, estas molculas de lpidos, tienen dos partes una parte hidrofbica y una hidroflica. La parte hidrofbica o cola, a menudo contiene dos grupos alquilos, y la parte hidroflica o cabeza a menudo tiene un grupo cargado, zwitterion, o un grupo alcohol. La cola hidrofbicas suelen agruparse con otros grupos hidrofbicos y las cabezas son expuestos al agua

13

Gram-positivas Gram-positivas involucra slo dos capas : Peptidoglucano Espacio periplasmtico Membrana plasmtica En el caso de las bacterias de este tipo la capa de peptidoglucano presenta condiciones de mayor resistencia que en bacterias gramnegativas, motivo por el cual no resultan necesariamente ms fciles de romper.

Funciones de las membranas Cada membrana tiene diferentes funciones: La membrana externa y la capa de peptidoglucano proporcionan la resistencia mecnica y su ruptura es lo fundamental para la ruptura de clulas. La membrana plasmtica es muy dbil y controla la permeabilidad de la clula, lo que incluye el transporte de nutrientes al interior de la clula y la exportacin de metabolitos en el interior de las soluciones circundantes. El interior de la clula llamado citoplasma, es una solucin acuosa de sales, azcar, amino cidos y biopolmeros. En los biopolmeros se incluyen protenas, muchas de ellas enzimas, RNA y DNA.

14

Clulas Procariontes En los procariontes ocurre que las protenas se encuentran en solucin, pero en muchos procariontes modificados se sintetiza un exceso de protenas las cuales precipitan en el interior del citoplasma (muchas veces stas son las protenas que se desean recuperar). En algunos casos s lo se quiere remover algunas de las capas para liberar alguna protena especfica.

Clulas Eucariontes En el caso de las clulas eucariontes, que poseen un ncleo y son estructuras m s complejas que las procariontes, tienen una membrana alrededor de las c lulas similar a las que tienen las procariontes. La membrana de las eucariontes contiene organelos, como las mitocondrias que son las responsables de la respiracin y los ncleos que contienen el DNA en los cromosomas. Cada estructura est rodeada de una membrana similar a la membrana celular interna de los procariontes.

15

Rompimiento Celular Mtodos No- Mecnicos

Mtodos No-mecnicosTcnicasPermeabilizacin Enzimtico

PrincipiosPermeabilizacin de la pared celular, lo cual produce el rompimiento de la clula

StressSuave

CostosCaro

EjemplosTratamiento de M. lysodeikticus con lisozima.Ruptura de Clulas de Glbulos Rojos.

Shock OsmticoSolubilizacin

Ruptura Osm tica de la membrana Disolucin de la membrana celular con detergentesSolventes orgnicos que disuelve la pared celular y tambin la desestabilizan Solubilizacin de la membrana por saponificacin de los lpidos

SuaveSuave

BaratoModeradamente Caro

Rompimiento de bacterias con SDS.

Disolucin de Lpidos

Modera do

Barato

Rompimiento de levaduras con tolueno.

Tratamiento con lcalis

Fuerte

Barato

16

Tratamiento enzimtico Teora Existen enzimas que pueden hidrolizar la membrana celular de microorganismos. Cuando la membrana ha sido suficientemente permeabilizada, algunos compuestos intracelulares pueden ser liberados al medio. Comparacin entre permeabilizacin. un proceso de rompimiento y otro de

Metodologa El modo de accin es muy simple basta con agreg rselo a una suspensin y se produce una reaccin muy rpida la cual deteriora la pared celular. La reaccin es selectiva y ataca a determinadas estructuras de la pared celular como son las glucanasa, mananasas. Ventajas: Mtodo suave y selectivo escalable Costo de la enzima lo hace difcil de utilizar a gran Enzima Lisozima EfectoRuptura de los enlaces -1,4 entre N-acetil murmico y Nacetil glucosamida

Desventajas: escala.

Microorganismo Bacterias

Levaduras

Complejo glucanasamananasa

Rompe la capa de glucano y de manano Rompen capa de celulosa y peptino

Clulas de plantas

Celulosas y peptinasas

17

Shock Osmtico Teora Resulta ser uno de los mtodos ms simple: 1. Las clulas se colocan en una volumen de agua 2 veces mayor que el volumen de clulas. 2. Bajo estas condiciones las clulas se hinchan, debido a un simple flujo osmtico que se produce debido a que las clulas contienen solutos (los causantes del flujo osmtico de agua al interior de la clula). 3. Las clulas se hinchan y algunas llegan a reventarse. La susceptibilidad de las clulas es relativa y depende fuertemente de su tipo.

18

Ejemplos 1. Los glbulos rojos son fciles de lisar. 2. Las clulas vegetales son muchos ms difciles, dado que sus paredes contienen compuestos que son impermeables al flujo osmtico. Se puede calcular la presin necesaria para romper clulas a partir de la ley vant Hoof. La cual se deduce desde la condicin de equilibrio : DP = - R*T*c1 Donde c1 : Concentracin de solutos en el interior de la clula. En el caso de una clula que contiene una concentracin de solutos del orden de 0.2 M, calculando la diferencia de presin alcanzara valores del orden de -5 atm (dentro mayor presin que afuera).

Solubilizacin Teora Es uno de los mtodo no-mecnico rompimiento de clulas. ms utilizado para el

Los detergentes tienen una zona hidroflica y otra hidrofbica, por esta razn pueden interactuar tanto con el agua como con los lpidos. Su habilidad se basa en la solubilizacin de los lpidos de la pared celular. Los detergentes ms utilizados son de tres tipos: Detergente aninico Detergente catinico Detergente no-inico y polidispersante

19

Detergentes aninicos Ejemplos Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) CH3 (CH2 )11 SO3 - Na + Sulfonato de Sodio CH3 (CH2 )9 -Phenyl-SO3 - Na + Tauroclorato de SodioEl SDS es uno de los detergentes aninicos ms ampliamente estudiados. Entre los materiales aninicos se encuentran los jabones (sales de cidos grasos), estos jabones dependen del grupo de cido carboxlico que tengan y resultan efectivos a altos pH donde el grupo se encuentra ionizado. A su vez resultan ineficientes en aguas duras que contengan iones calcio que pueden reaccionar con ellos y formar compuestos insolubles. Las desventajas de los detergentes tradicionales se puede superar si se reemplazan los grupos carboxilos por grupos sulfatos. Los sulfatos que contienen grupos fenilos son ms efectivos que los compuestos que contienen grupos alquilos, debido principalmente que no son fciles de degradar microbianamente, como son los detergente utilizados para lavado.

Detergentes cationicos Ejemplos Bromuro de Catiltrimetil Amonio (CTAB) CH3 (CH2 )15 N+ (CH3 )3 BrSon detergentes m s suaves (tipo shampoo), por lo cual se produce un rompimiento ms suave de las clulas.

Ejemplos Triton X-100

Detergente no-inicos C8 H17 -Phenyl-(OCH2 CH2 )9.5 OH

Son generalmente polmeros solubles en agua, se utilizan en los detergente para lavar vajilla. Estos detergente tambin tienen una parte hidrofbica y una hidroflica, pero la parte hidroflica no es ni un sulfato ni un tetraalquilamonio sino un alcohol. .

20

A bajas concentraciones de detergente no se produce degradacin de los lpidos, pero a alta concentracin se produce una degradacin que resulta lineal a la concentracin de detergente, junto a esta variable tambin se altera la tensin superficial de la solucin. La relacin que se produce entre la solubilizacin y otros fenmenos es que el detergente forma micelas, en cuyo interior se encapsulan los lpidos digeridos (Cabezas hidroflicas y colas hidrofbicas que estn en contacto con la sopa de lpidos).

Procedimiento 1. Se coloca un determinado volumen de detergente concentrado por un volumen de clulas. Generalmente la mitad de volumen de detergente que de volumen de clulas. 2. El detergente rompe la membrana celular. 3. La suspensin resultante se centrifuga para remover los fragmentos de clulas y luego se pasa a travs de una columna de adsorcin o por etapas de extraccin para aislar el producto.

21

Tratamiento con solvente (disolucin de lpidos) Es una t cnica la cual no ha sido muy documentada, s lo se requiere de informacin experimental. Una buena forma de seleccionar el solvente es analizar la volatilidad (desde manuales), este parmetro puede relacionarse con las interacciones lpido solvente, poniendo atencin en el calor de mezcla. Solventes con similar solubilidad atacarn los l pidos de forma similar. Procedimiento 1. El mtodo consiste en adicionar la suspensin de biomasa un volumen de tolueno del orden de un 10% de biomasa. 2. El tolueno es absorbido por las clulas, las cuales se hinchan y luego explotan. 3. El contenido de las clulas se libera al medio y luego puede ser separado.

Existen otros solventes que puede ser utilizados como : Benceno ( que es cancerigeno y de una alta volatilidad, el tolueno tambin es cancerigeno pero de m s baja volatilidad). Cumeno Clorobenceno Xileno Octanol (Altos alcoholes)

22

Tratamiento alcalino Es un tratamiento bastante fuerte, no selectivo y barato. Algn lcalis es agregado a un suspensin de clulas, el lcalis reacciona con la pared celular en diversas formas, produciendo la saponificacin de lpidos. Desventajas : Una alta concentracin de lcalis puede hasta producir la denaturalizacin de las protenas (destruyendo el producto). Resulta la opcin menos utilizada.

23