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Fosforilación oxidativa y teoría quimiosmótica

Asignatura: Fisicoquímica

Carreras: Bioquímica, Farmacia,

Licenciatura en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Autor: Dra. Tamara Zaobornyj

Año de edición: 2015

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Índice temático

1. Introducción 3

2. La transferencia mitocondrial de electrones es un proceso exergónico 3

3. Translocación de H+ asociada al flujo mitocondrial de electrones. Fuerza proto-motriz 4

4. Fosforilación oxidativa 7

4.1. Teoría quimiosmótica mitocondrial de Peter Mitchell 7

4.2. El rotor molecular de John Walker 9

5. Bibliografía 12

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1. Introducción

La fosforilación oxidativa constituye la etapa final del proceso de transducción de energía en los

organismos aeróbicos y se refiere a la síntesis química de ATP impulsada por el proceso exergónico de

transferencia de electrones desde el NADH al O2.

Todos los pasos enzimáticos de la degradación de

glúcidos, grasas y aminoácidos que ocurren en las

células aeróbicas y los intermediarios catabólicos,

se oxidan reduciendo el NAD a NADH y convergen

en la cadena respiratoria mitocondrial, en la que

los electrones fluyen desde el NADH hasta el O2

reduciéndolo a H2O y produciendo

simultáneamente energía para la generación de

ATP a partir de ADP y Pi. El catabolismo de

aminoácidos, ácidos grasos y glucosa se produce a

lo largo de 3 fases de respiración celular. Fase 1: la

oxidación de los compuestos mencionados,

produce acetil-CoA. Fase 2: la oxidación de grupos

acetilos en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (de

Krebs). Fase 3: en la cadena respiratoria

mitocondrial, los electrones transportados por el

NAD y el FAD son dirigidos a los citocromos y a la

citocromo oxidasa, la cual reduce O2 a H2O. Este flujo electrónico genera la liberación vectorial y transmembrana

de H+, produciéndose un potencial proto-motriz que se utiliza para la formación endergónica de ATP, en el

proceso denominado fosforilación oxidativa. Veamos un video acerca de este último proceso.

Amino

-ácidos

Ácidos

grasosGlúcidos

Glucólisis

Piruvato

CO2

Acetil-CoA

Cadena respiratoria(de transferencia de e-)

y Fosforilación oxidativa

Ciclo de

Krebs

CitratoOxalacetato

CO2

CO2

Fase 1Producción

de Acetil-CoA

Fase 2Oxidación

de Acetil-CoA

Fase 3Transferencia de e- y

Fosforilación oxidativa

NADH, FADH2(transportadores

de e- reducidos)

ADP + Pi ATP

½ O2 + 2 H+

H2O

e-

e-e-

e-

e-

e-e- e-

e-

e-

e-

e-

Amino

-ácidos

Ácidos

grasosGlúcidos

Glucólisis

Piruvato

CO2

Acetil-CoA

Cadena respiratoria(de transferencia de e-)

y Fosforilación oxidativa

Ciclo de

Krebs

CitratoOxalacetato

CO2

CO2

Fase 1Producción

de Acetil-CoA

Fase 2Oxidación

de Acetil-CoA

Fase 3Transferencia de e- y

Fosforilación oxidativa

NADH, FADH2(transportadores

de e- reducidos)

ADP + Pi ATP

½ O2 + 2 H+

H2O

e-

e-e-

e-

e-

e-e- e-

e-

e-

e-

e-

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2. La transferencia mitocondrial de electrones es un proceso exergónico

La transferencia mitocondrial de electrones es un proceso exergónico, el cual libera suficiente energía para

la síntesis de ATP. En la cadena de transporte de electrones, pasan 2 electrones desde el NADH al O2, según:

NADH + H+ + ½ O2 H2O + NAD+

Esta reacción es altamente exergónica.

Teniendo en cuenta: NAD+/NADH Eo’ = - 0.320 V

O2/H2O Eo’ = + 0.816 V

el cambio de energía libre (G’o), se calcula como:

G o’ = - n F E

G o’ = - 2 x 96500 x 1.14 V = - 220 kJ/mol NADH (cada 2 e-)

Como puede observarse, la oxidación del NADH libera una energía (Go’) de aproximadamente -220 kJ/mol.

Cabe mencionar que en mitocondrias respirando activamente, la relación NADH/NAD es mayor que 1, y el G’ es

mucho mayor (más negativo) que -220 kJ/mol, aproximadamente -250 kJ/mol.

Un cálculo similar se puede realizar para la oxidación del succinato, dando un valor de G o’ = - 150

kJ/mol.

Por otro lado, la síntesis de ATP, a partir de ADP y Pi, es un proceso endergónico:

ADP + Pi ATP + H2O G o’ = 30.5 kJ/mol

En condiciones fisiológicas, en hepatocitos de rata: [ATP] = 3.38 mM, [ADP] = 1.32 mM y [Pi] = 4.8 mM

A 25 oC, el valor de energía libre resulta, G’ = + 46.1 kJ/mol

Por ello, en las condiciones celulares, la oxidación mitocondrial del NADH o del succinato libera una

energía superior a la necesaria para la síntesis de ATP. Por lo tanto, la fosforilación oxidativa mitocondrial no

plantea un problema termodinámico.

3. Translocación de H+ asociada al flujo mitocondrial de electrones. Fuerza proto-motriz.

La mayor parte de la energía del proceso exergónico de transferencia mitocondrial de electrones, es

utilizada para bombear H+ hacia el espacio intermembranas. Por cada par de electrones transferidos al O2, 4 H+

son bombeados por el Complejo I, 4 H+ por el Complejo III y 2 H+ por el complejo IV, todos ellos desde la matriz

mitocondrial (Lado N), hacia el espacio intermembranas (Lado P). Esto genera un gradiente de H+ y de pH a

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través de la membrana interna mitocondrial. La matriz (pH = 7.5-7.8) se vuelve más alcalina con respecto al lado

citosólico (pH = 6.9-7.0) de la membrana.

NADH + 11 H+ (N) + 1/2 O2 H2O + NAD+ + 10 H+

(P)

La membrana mitocondrial interna separa

dos compartimentos que se diferencian no sólo,

por la concentración de H+ (pH), sino también

por la distribución de cargas (), ya que los H+ se

translocan sin su contraión. La energía

almacenada en dicho gradiente (químico y

eléctrico) se denomina fuerza proto-motriz. (p)

(Mitchell, 1961).

De esta forma, la fuerza proto-motriz (p = pH +

) representa la conservación de la energía de

oxidación, y tiene dos componentes aditivos que

dan cuenta de la diferencia en la concentración de

H+ (pH) y del potencial de la membrana (). En

medios salinos, el término pH contribuye con la mayor parte de la energía del gradiente. La fuerza proto-motriz

se utiliza para impulsar la síntesis de ATP: el flujo de H+ que retorna a la matriz mitocondrial, dirigido por el p,

se hace a través de la proteína F1-ATPasa, que actuando como un rotor molecular acoplado a los cambios de

conformación de la macromolécula, genera la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi.

Aplicando el concepto de potencial electroquímico de Guggenheim (1924), desarrollado en el Apéndice 7

de la Guía de Trabajos Prácticos y Seminarios de Fisicoquímica, para el ión i:

i = o

i + RT ln ai + Z F

siendo: o

i estado de referencia: potencial electroquímico cuando la actividad del ion i (ai) es igual a 1 y el

potencial eléctrico de la solución () es igual a cero

Z número de cargas por ion; el signo corresponde al de las cargas (ZH+ = 1)

F cantidad de carga de un ion monovalente: 96500 C mol-1

potencial eléctrico del compartimento en donde se encuentra el ion

[R T ln ai] [R T ln ci] término relacionado con la actividad y/o la concentración del ion

[Z F ] término del trabajo eléctrico relacionado con la carga del ion

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y aplicando dicho concepto para el H+ a ambos lados de la membrana interna mitocondrial, se tiene:

H

+(2) = o

H+ + RT ln a H

+(2) + Z F (2) Potencial electroquímico de H+ en el EIM

H

+(1) = o H

+ + RT ln a H+

(1) + Z F (1) Potencial electroquímico de H+ en la matriz

H

+ = H+

(2) - H+

(1)

H

+ (2-1) = RT ln (a H

+(2)/ a H

+(1)) + Z F ((2) - (1))

En soluciones diluidas = 1 a = c

y sabiendo que ln (a H+

(2)/a H+

(1)) = 2.3 (log H+2 - log H+

1)

= 2.3 (pH1 – pH2) = 2.3 pH

Entonces,

H

+ (2-1) = 2.3 RT pH(1-2) + Z F (2-1)

En mitocondrias respirando pH(1-2) = 0.75-0.80

(2-1) = 0.15-0.2 V

A 25oC:

H+

(2-1) = 2.3 RT pH(1-2) + Z F (2-1)

H+

(2-1) = 5.7 kJ/mol (0.8) + (96.5 kJ/V mol) (0.15 V)

H+

(2-1) = 20 kJ/mol

Teniendo en cuenta que a través de la membrana interna pasan 10 H+, según,

NADH + 11 H+ (N) + 1/2 O2 H2O + NAD+ + 10 H+

(P)

se deduce que de los 220 kJ liberados por la oxidación de 1 mol de NADH, 200 kJ son conservados a través del

gradiente electroquímico de H+ (fuerza proto-motriz). De esta forma, cuando los H+ regresen espontáneamente

a través de su gradiente electroquímico, hacia la matriz mitocondrial, la energía estará disponible para realizar

trabajo.

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Regresando a la expresión

H

+ (2-1) = 2.3 RT pH(1-2) + Z F (2-1)

y considerando que H

+/F = p

p = 2.3 RT/F pH + 2.3 RT/F = 59 mV ( a 298 K)

p = + 59 pH

En mitocondrias en estado de reposo (estado 4), y considerando pHM = 7.8 y pHEIM = 7.0,

p = + 59 pH = 170 mV + 50 mV = 220 mV

De esta forma, la fuerza proto-motriz (p) expresa, en mV (normalmente 220-230 mV), el potencial

electroquímico del H+, que es utilizado para la síntesis endergónica de ATP a partir de ADP y Pi.

4. Fosforilación oxidativa

4.1. Teoría quimiosmótica mitocondrial de Peter Mitchell

La fosforilación oxidativa se refiere a la síntesis química de ATP impulsada por el proceso exergónico de

transferencia de electrones desde el NADH al O2. Como se mencionó anteriormente, la fosforilación oxidativa no

plantea un problema desde el punto de vista termodinámico, debido a que la energía la oxidación mitocondrial

del NADH o del succinato libera una energía superior a la necesaria para la síntesis de ATP. Pero, ¿cómo el

gradiente electroquímico de H+, se transforma en ATP? ¿cuál es el mecanismo que acopla la cadena de

transporte de electrones con la síntesis de ATP?

En 1961, Peter Mitchell postuló que (a) el transporte de electrones mitocondrial está acoplado a la síntesis

de ATP, (b) la membrana mitocondrial es impermeable a los H+ y a los HO- y (c) el transporte de electrones a

través de la cadena respiratoria genera vectorialmente un gradiente de H+ a través de la membrana interna

mitocondrial. Se propuso que las concentraciones de H+ en las 2 fases acuosas (matriz mitocondrial y espacio

intermembranas) separadas por la membrana interna, constituyen la fuerza molecular responsable de la

formación de ATP a partir de ADP y de Pi, por la acción de la F1-ATPasa de la membrana mitocondrial. Es decir, la

fuerza proto-motriz, lleva a la síntesis de ATP, como consecuencia del flujo pasivo de H+ hacia la matriz

mitocondrial, a través de un poro de H+ (Fo) asociado a la ATP sintasa (o ATPasa, o Complejo V).

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La mayoría de los experimentos realizados han indicado que la oxidación de 1 mol de NADH es compatible

con la producción de aproximadamente 3 moles de ATP (P/O 3), mientras que la oxidación de 1 mol de

succinato, es compatible con la generación de alrededor de 2 moles de ATP (P/O 2). La relación P/O (ATP

formado / ½ O2 consumido) depende de cuántos H+ son translocados desde la matriz mitocondrial hacia el

espacio intermembranas (cuando se oxida 1 mol de NADH ó 1 mol de succinato) y de cuántos H+ ingresan a

través del complejo FoF1-ATPasa que lleva a la síntesis de ATP. El número de H+ bombeados hacia el espacio

intermembranas por par de electrones es 10 para la oxidación de NADH y 6 para la oxidación de succinato.

Determinaciones experimentales realizadas hasta la fecha, indican que el número de H+ necesarios para la

síntesis de una molécula de ATP es 4, de los cuales 1 es utilizado en el transporte de Pi, ATP y ADP a través de la

membrana mitocondrial. De esta forma, de 10 H+ translocados hacia el espacio intermembranas por la

oxidación de 1 molécula de NADH, 4 H+ se utilizan para producir 1 molécula de ATP, dando una relación P/O =

2.5. De la misma forma, para el caso de la oxidación de una molécula de succinato, la relación P/O = 1.5.

Resumiendo, los postulados de la Teoría Quimiosmótica de Mitchell, son:

El transporte de electrones a través de la cadena respiratoria está asociado al transporte de H+ desde la

matriz hacia el espacio intermembranas

La membrana interna es impermeable a los H+

La energía de oxidación de los procesos metabólicos se conserva en forma de potencial electroquímico de H+

La transferencia de electrones está acoplada a la síntesis de ATP

El flujo de H+ a favor de su gradiente electroquímico proporciona la energía libre para la síntesis de ATP. Las

concentraciones de H+ en las 2 fases acuosas (EIM y M) separadas por la membrana interna, constituyen la

fuerza responsable (fuerza proto-motriz) de la formación de ATP a partir de ADP y de Pi, por acción de la F1-

ATPasa de la membrana mitocondrial

Membrana

mitocondrial

interna

Matriz

mitocondrial

Espacio

intermembranas

Fp b c a a3

ADP + Pi ATP

O2

H+

H+

H+ H+

ATPasaMembrana

mitocondrial

interna

Matriz

mitocondrial

Espacio

intermembranas

FpFp bb cc aa a3a3

ADP + Pi ATP

O2

H+

H+

H+ H+

ATPasa

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4.2. El rotor molecular de John Walker

La ATPasa es un gran complejo enzimático, que cataliza la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi,

acompañado del flujo de H+ desde el lado P al N. La reacción de formación de ATP es formalmente una

condensación entre el ADP y el Pi, con remoción de H2O. La ATPasa está formada por dos componentes: (1) el

componente F1, una proteína periférica de membrana (33), y (2) el componente Fo, una proteína integral

(poro de H+) (ab2c10-12). Las subunidades c (de Fo) forman 2 círculos concéntricos, la subunidad pasa a través

del centro esférico 33 y las subunidades y (de F1) se unen firmemente al anillo de subunidades c. Las

translocación de H+ a través del poro Fo provoca que el cilindro de subunidades c y la subunidad adjunta, roten

alrededor del eje de (perpendicular al plano de la membrana). El pasaje de H+ a través de Fo llevan a cambios

conformacionales de la subunidad de la F1-ATPasa, secundarios al movimiento circular de la subunidad

dentro de una cavidad formada por 3 subunidades y 3 subunidades . Así, el proceso endergónico de rotación

de las subunidad es impulsado por el proceso electroquímico exergónico de la translocación de H+ del lado P al

N. El funcionamiento es tal que la F1-ATPasa es denominada rotor molecular.

Fig. 9.A. Estructura del Complejo ATPasa Fig. 9.B. Rotación de F0 y de la subunidad

No hay de esta forma intermediarios químicos comunes entre las reacciones de óxido reducción y

aquellas que llevan a la formación de ATP. El acoplamiento no es químico, sino electroquímico y físico: es físico

en cuanto a la rotación de la subunidad en la cavidad dejada por las subunidades y ; y es electroquímico

F1

F0

Matriz

EIM

F1

F0

Matriz

EIM

-ADP -ATP -vacío Alta afinidad

por ATP

Baja afinidad

por ATP

-ADP -ATP -vacío Alta afinidad

por ATP

Baja afinidad

por ATP

-ADP -ATP -vacío Alta afinidad

por ATP

Baja afinidad

por ATP

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por la orientación específica de los centros activos de las proteínas componentes de los complejos de la cadena

respiratoria hacia los lados N y P. Para ver un video sobre el funcionamiento de la ATP sintasa, haga clic aquí

sobre la imagen.

Cabe mencionar que Peter Mitchell obtuvo el Premio Nobel de Química en 1978 por la hipótesis

quimiosmótica, y que John Walker y Paul Boyer obtuvieron el Premio Nobel de Química en 1997 por su trabajo

sobre los cambios conformacionales de la F1-ATPasa y la dilucidación del mecanismo enzimático subyacente a la

síntesis de ATP. La hipótesis quimiosmótica de Mitchell de 1961 se transformó en su Premio Nobel de 1978 por

la estricta aplicación de la definición de potencial electroquímico de Guggenheim (1924) al H+ a ambos lados de

la membrana interna mitocondrial. Sería más adecuado hablar de la Teoría Electroquímica de la Conservación de

la Energía, pero la denominación de Teoría Quimiosmótica se ha conservado por razones históricas. La

determinación experimental de los valores de pH y de y de definió el viaje de Mitchell a Estocolmo.

La hipótesis quimiosmótica de Mitchell permitió explicar observaciones experimentales, al tiempo que

produjo predicciones que pudieron comprobarse experimentalmente. Así, esta teoría permite explicar que:

La fosforilación oxidativa requiere una membrana interna mitocondrial intacta

La membrana interna mitocondrial es impermeable a iones tales como H+, OH-, K+, Cl-, cuya difusión libre

descargaría el gradiente electroquímico

El transporte de electrones conlleva un transporte de H+ hacia el espacio intermembranas (lado P)

generando un gradiente electroquímico de H+ los lados de la membrana mitocondrial interna

Los compuestos químicos (llamados desacoplantes) que permiten el paso de los H+ a través de la membrana

interna mitocondrial, disipan el gradiente electroquímico y mantienen el transporte de electrones e inhiben

la síntesis de ATP.

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En mitocondrias de hígado:

El potencial de membrana a través de la membrana interna es 180 mV, siendo el espesor de 80 Å y el

campo eléctrico resultante de 180000 V/cm

El pH de la matriz mitocondrial es 0.75 unidades mayor que el pH en el espacio intermembranas

El potencial de la membrana interna mitocondrial es también utilizado para la homeostasis del Ca2+

citosólico que es acumulado en la matriz mitocondrial; el relativamente alto pH de la matriz mitocondrial (pH =

7.5-7.8) estabiliza al Ca2+, el cual forma compuestos con ácidos orgánicos y con aniones fosfato, en este último

caso formando la sal insoluble hidroxiapatita. El acoplamiento entre la extrusión de H+ y la síntesis de ATP no es

perfecto, debido a la no perfecta impermeabilidad de la membrana interna mitocondrial a los H+: parte de los H+

vuelven a la matrix mitocondrial sin pasar por la F1-ATPasa y sin generar ATP en un proceso denominado “la

entrada pasiva de H+” (H+ leak). Se ha propuesto que este proceso tiene un papel en al gasto energético

correspondiente al metabolismo basal.

El mecanismo quimiosmótico de transducción de energía (cambio de un tipo de energía a otro tipo de

energía) es un mecanismo bioquímico central para los sistemas vivos y se aplica a células animales, vegetales y

bacterias. En todos los casos hay una membrana acoplante, que en los animales es la membrana interna

mitocondrial, en las plantas verdes es la membrana de los tilacoides y en las bacterias es la membrana celular.

La energía adquirida por los seres vivos en los alimentos se transforma finalmente en moléculas de ATP,

siendo ésta la forma de energía útil para los procesos endergónicos celulares. En los mamíferos,

aproximadamente el 95% del ATP se genera en las mitocondrias; y la energía química que se obtiene a partir de

la hidrólisis del ATP (para dar ADP y Pi), se utiliza para la realización de funciones celulares (reacciones

endergónicas) tales como la biosíntesis, el transporte de moléculas e iones a través de membranas y el trabajo

mecánico.

Resumiendo…

La fosforilación oxidativa ocurre en la mitocondria.

Comienza con la entrada de electrones en la cadena respiratoria.

Los electrones pasan a través de una serie de transportadores incluídos en la membrana

interna mitocondrial.

La transferencia mitocondrial de electrones es un proceso exergónico, que libera energía

suficiente para la síntesis de ATP.

El transporte de electrones está asociado al transporte de protones desde la matriz hacia el

EIM (fuerza proto-motriz).

El flujo de protones a favor de su gradiente electroquímico proporciona la energía libre para la

síntesis de ATP, por acción de la ATP sintasa.

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5. Bibliografía

1. Abrahams, JP; Leslie, AG; Lutter, R; Walker, JE. (1994) Structure at 2.8 A resolution of F1-ATPase from

bovine heart mitochondria. Nature. 370(6491): 621-628

2. Boyer, PD. (1997) The ATP synthase-a splendid molecular machine. Annu Rev Biochem 66: 717-749.

3. Lehninger, A. (1965) The Mitochondrion: Molecular Basis of Structure and Function, WA Benjamin, Inc. New

York.

4. Lehninger, AL; Cox, MM. (2002-3a edición) En “Principles of Biochemistry”, Oxidative phosphorilation and

Photophosphorilation. Pp 659

5. Lehninger, AL; Nelson, DL; Cox, MM. (1998-2a edición) En “Principios en Bioquímica”, Fosforilación

oxidativa y Fotofosforilación. Pp 542

6. Mitchell, P. (1976) Vectorial chemistry and the molecular mechanics of chemiosmotic coupling: power

transmission by proticity. Biochem Soc Trans. 4(3): 399-430.

7. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of

mechanism. Nature. 1961 Jul 8;191:144-8.

8. Mitchell, P; Moyle, J. (1967) Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature 213(5072): 137-

139.

9. Stoppani, AOM; Boveris, A. (1983) La mitocondria y la estructura de la cadena de transporte de electrones

y Fosforilación oxidativa. En “Bioquímica General” (Eds. Torres, HN, Carminati, H; Cardini, CE) El Ateneo, Buenos

Aires, Argentina. Pp: 453-493.

10. Tzagoloff, A. (1982) Mitochondria, Plenum, New York

11. http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates