Mireya Martínez Legaria - 148.206.53.231
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Mireya Martínez Legaria
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Mireya Martínez Legaria
INTRODUCCIÓN
La tilapia es un pez teleósteo, del orden perciforme perteneciente a la familia
Cichlidae originario de África, habita la mayor parte de las regiones tropicales del
mundo, donde las condiciones son favorables para su reproducción y crecimiento
(13).
Es una especie muy apreciada a nivel mundial, por su carne y su composición
nutritiva. En México ocupa el cuarto lugar en las pesquerías y representa un valor
económico entre 600 y 800 millones de pesos anuales. Su alta precocidad
representa la principal desventaja (21).
Es un pez de buen sabor y rápido crecimiento, se puede cultivar en estanques y
en jaulas, soporta altas densidades, resiste condiciones ambientales adversas,
tolera bajas concentraciones de oxígeno, es capaz de utilizar la productividad
primaria de los estanques, y puede ser manipulado genéticamente (13).
La producción de la tilapia en México alcanzó en el año 2002 alrededor de 62 000
t, con un valor estimado de más de 50 000 000 US$. De este total
aproximadamente 793 t fueron producidas en sistemas controlados de cultivo y el
resto correspondió a la captura por pesquerías en los cuerpos de aguas
epicontinentales (21).
Actualmente se cultivan con éxito unas diez especies. Como grupo las tilapias
representan uno de los peces más ampliamente producidos en el mundo. Las
especies más cultivadas O. aureus, O. niloticus O. Mossambicus, así como varios
híbridos de éstas especie (13).
La menos deseable es O. mossambicus a pesar de que fue la primera especie en
distribuirse fuera de África; tanto O. aureus como O. niloticus O. crecen más
rápido y alcanzan mayor tamaño que O. Mossambicus (13).
1
En años recientes, se ha impulsado la producción masiva de crías 100% machos,
a través de la reversión sexual, que consiste en la aplicación de hormonas
esteroides en las etapas tempranas de su desarrollo, cuando aún no se
diferencian los tejidos gonádicos, para producir poblaciones masculinizadas. El
cultivo monosexado constituye la mejor alternativa (10,14).
En el caso de la tilapia, se puede señalar que aunque ya existen en el mercado
alimentos elaborados específicamente para este grupo de organismos, todavía no
son de la calidad requerida, especialmente para crías y alevines.
Hormonas en peces El empleo de los términos determinación y diferenciación sexual frecuentemente
es erróneo, Se entiende como diferenciación sexual (morfológica, celular y
molecular), al sexo que previamente se ha determinado. La determinación del
sexo propiamente es usado para describir aquellas variables, procesos genéticos
y ambientales, que influyen en la diferenciación sexual, la cual a su vez es usada
para describir el mecanismo anatómico funcional de eventos que para que se
desarrolle un ovario ó un testículo (2 en 5).
El ciclo reproductivo en la vida de los peces Teleósteos, inicia desde la propia
concepción del sexo. Cuando es fecundado el óvulo de los peces como en la
mayoría de los vertebrados, la información genética aportada por el
espermatozoide determina el sexo genético, y gracias a estos procesos
genómicos, en los peces influenciado principalmente por factores sociales y
ambientales, inicia el proceso de la diferenciación sexual (2 en 5).
Como en otros organismos, los cromosomas sexuales en los peces presentan
muchas formas cariotípicas debidas a reordenamientos cromosómicos (2 en 5).
2
La estructura de las gónadas de los peces es similar a la de otros vertebrados, con
células germinales asociadas a un soporte de células somáticas, como en los
vertebrados. Sin embargo, el origen y desarrollo de estos dos grupos de células es
diferente en los peces. Evidencias en muchos organismos, ponen de manifiesto,
que en el huevo indiferenciado se forma una región citoplasmática especializada
(de apariencia granular), denominada región vegetal (2 en 5), en la que se
desarrollan células alrededor de este material citoplasmático hasta el momento
indiferenciado, y físicamente es separado desde los primeros eventos. Estas
células especiales, se desarrollarán en células germinales primordiales (CGPs),
las cuales a su vez serán las que formen los gametos dentro de las gónadas. La
sustancias citoplásmicas responsables de formar y desarrollar las CGPs no están
bien definidas aún, pero parecen ser material maternal específicamente RNAs que
son codificados por genes maternos. Esta inclusiones de citoplasma granular, han
sido identificado como CGPs en Teleósteos (5,8,9), sugiriendo que productos
genéticos únicos son probablemente requeridos para que se diferencien las CGPs
de los demás grupos celulares.
En los peces Teleósteos, la diferenciación gonadal, dependiendo de la familia de
que se trate, puede entenderse de varias formas, Desde individuos, donde
directamente desarrollan a testículo o ovario y de ahí a una maduración sexual,
hasta las especies hermafroditas sincrónicas, que poseen tejidos gonádicos de
machos y hembras funcionales al mismo tiempo (4).
La posibilidad de una actividad esteroidogénica temprana de las gónadas en
peces hembras, ha sido motivo de algunos estudios histológicos y de
ultraestructura (16,17,18) han demostrado que las células productoras de
esteroides aparecen inicialmente al mismo tiempo que ocurre la diferenciación
gonadal en tilapias (Oreochomis niloticusy y Sarotherodon nilóticus).
3
Sistema neuroendocrino y la maduración sexual. La reproducción en peces Teleósteos, como en otros vertebrados, está controlada
por ritmos biológicos endógenos (15), y es un proceso complejo, que demanda
una coordinación fisiológica; la cual esta regulada por hormonas secretadas por el
eje Hipotálamo - Hipófisis-Gónadas (HHG) y estimulada por factores ambientales
(por ejemplo: el fotoperiodo y la temperatura), los que son detectados por órganos
sensoriales (20), los cuales transmiten esta información a el hipotálamo, que es el
mayor centro de integración del cerebro, provocando un cambio en la liberación de
algunos neurotransmisores como la serotonina (12) y el ácido γ-aminobutírico
(GABA) (18), en núcleos hipotalámicos específicos.
Los neurotransmisores, modulan la síntesis y secreción de un decapéptido
llamado: Hormona Liberadora de las Gonadotropinas (GnRH – por sus iniciales en
inglés) por medio de neuronas neurosecretoras hipotalámicas, las cuales a su vez,
regulan la secreción en la hipófisis de dos hormonas glicoprotéicas, la
gonadotropina I y II (GtH I y GtH II) (19). Otras formas de GnRH. han sido
identificadas en otras regiones del cerebro en Teleósteos y probablemente tienen
diferentes funciones. Rutas metabólicas inhibitorias (Factores Inhibitorios de la
liberación de las gonadotropinas [GRIFs], por ejemplo los dopaminérgicos),
también están presentes en los peces Teleósteos (7,19). Ambas rutas
metabólicas, se sirven de terminales nerviosas que irrigan directamente en células
secretoras de la Hipófisis llamadas gonadotropos, para regular la secreción de las
GtH I y GtH II. Las dos gonadotropinas son liberadas a la circulación en respuesta
a la estimulación del GnRH, y por medio de receptores específicos, estas son
captadas por las gónadas de los peces, para estimular la producción de hormonas
esteroides sexuales y la inducción de la gametogénesis, desarrollo folicular, la
ovulación ó espermiación y finalmente la liberación de los gametos (desove).
4
Figura 1. Resumen de las hormonas exógenas utilizadas para inducir la
maduración y desove en los teleósteos y nivel de acción (4).
5
ANTECEDENTES
1974 Jalabert y colaboradores.
Reversión sexual de O. niloticus con 17- α– metiltestosterona, empleando 60 mg/kg en 120 dias. Con 100 % de reversion.
1978 y 1981 Tayamen-Shelton y
Owusu y colaboradores.
Probaron en O. niloticus. Diferentes dosis y diferentes días la eficiencia de la 17 α–metiltestosterona con 100% de reversión
1993 Hiot y Phelps. Evalúan por primera vez la biometría de organismos revertidos de O. niloticus con17 α–metiltestosterona.
1994 Ladu y Madara. Compararon la hormona testosterona de macho cabrio y la 17 α–metiltestosterona con resultados del 60 % y 88 % de reversión.
1996 Carvalho y Floresti. Utilizaron la 17 α–metiltestosterona en O. niloticus Examinaron el perfil histologico de la gonadas. Observaron alteraciones estructurales en los testículos.
1998 Jiménez y colaboradores.
Probaron las combinaciones de talla-edad en tilapia Rocky Mountain (híbrido de O. niloticus x O. aureus) con fluoximesterona. Obteniendo 100% de reversión.
2000 Badillo y Arredondo. Publican la efectividad de diferentes andrógenos en la reversión sexual en tres variedades de tilapias.
2003 Moreno y colaboradores.
Comprobó la eficiencia de la Fluoximesterona en sistemas de recirculación cerrados obteniendo una reversión del 98%.
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JUSTIFICACIÓN
La acuicultura se presenta como una nueva alternativa de producción en el sector
agropecuario, con excelentes perspectivas, sin embargo, es necesario desarrollar
tecnología en este campo que mejore los sistemas de producción de las especies
acuícolas. Representa una alternativa para mejorar la alimentación de las
comunidades rurales, elevar sus ingresos económicos y el bienestar de las
familias.
HIPÓTESIS
Si se suministran los andrógenos 17- α- metiltestosterona y la fluoximesterona,
durante los estadios ontogénicos tempranos en O. niloticus entonces la
diferenciación gonadal se dirigirá hacia la formación del testículo obteniendo una
población 100% de machos.
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OBJETIVOS
General:
Evaluar el efecto de la 17-α-metiltestosterona y la Fluoximesterona en el desarrollo
gonadal de alevines de tilapia del Nilo Oreochromis niloticus.
Particulares:
1. Evaluar la eficiencia de la 17-α-metiltestosterona y de la fluoximesterona en el
proceso de reversión sexual gonadal.
2..Caracterizar histológicamente las gónadas de los organismos sometidos a los
tratamientos hormonales comparados con los organismos testigos (TC).
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MATERIALES Y MÊTODOS Reproductores y producción de alevines En el estanque de reproducción de la planta acuícola se introdujeron 16 hembras
y 8 machos seleccionados de tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), cuyos
progenitores fueron obtenidos del centro acuícola de Zacatepec, estado Morelos
(México), perteneciente a la secretaría de agricultura, ganadería, desarrollo rural,
pesca y alimentación (SAGARPA) y cultivados y seleccionadas durante cinco años
en la PExPA. Las hembras tenían un año de edad, un peso total promedio de 370
± 35.4 g y una longitud total promedio de 21.7 ± 0.6 cm y los machos un peso
promedio de 462 ± 23.5 g y una longitud total promedio de 29.0 ± 0.5 cm;
manteniendo una relación macho-hembra de 2:1. A los reproductores se les
alimento con el 2% de su peso total al día, con balanceado extruído marca Tilapia
Chow (Ralston, Purina, St. Louis Missouri, EE.UU.) en piensos de 1/8 de pulgada,
con 25% de proteína, 5% de lípidos y 5% de fibra cruda.
Cuando se observaron hembras manchadas con una conducta territorial agresiva,
que es un indicador de la presencia de alevines en la boca, el estanque se vació
casi por completo, lo que permitió que las hembras liberaran a los alevines, se
recolectaron 500 alevines (Figura 2) y éstos fueron separados del estanque y
colocados en los sistemas de recirculación.
Figura 2. Alevín de tilapia Oreochromis niloticus de 3 semanas de edad.
9
El Sistema I. Con 5 acuarios con una capacidad de 60 l, 4 acuarios
(repeticiones) son utilizados para el tratamiento de 17-α-metiltestosterona y 1
acuario (TC) fue utilizado como control, cada acuario tenia 50 alevines de tilapia
Oreochromis niloticus .
Sistema II. Se encontraba el sistema II. Con 5 acuarios (repeticiones) con una
capacidad de 60 l son utilizados para el tratamiento de fluoximesterona (stenox) y
1 acuario fue utilizado como control, cada acuario tenia 50 alevines de tilapia
Oreochromis niloticus.
Figura 3. Sistema de recirculación cerrado, cada sistema tenía un biofiltro y un
calentador. Preparación del alimento hormonado. Se llevo a cabo en un cuarto limpio en condiciones de obscuridad y ventilación,
se preparo 1 kg de alimento hormonado el cual rinde para revertir 2,000 alevines
se utilizaron 2 pastillas de stenox que equivalen 5 mg de fluoximesterona, las
10
cuales fueron finamente molidas en un mortero y 500 ml de alcohol etilico al 95%
(475 ml de alcohol comercial y 25 ml de agua). Debe tenerse cuidado de que la
hormona quede completamente disuelta en el alcohol antes de ser incorporada
en el alimento (11).
Sobre una superficie plana y limpia se coloca un plástico y sobre el se esparce
un kilogramo de alimento comercial de tilapia en etapa de iniciación con el 52%
de proteína. La solución ya preparada se coloca en un atomizador que posterior
mente va a rociar al alimento comercial.
Con el atomizador que contiene la solución de la hormona disuelta en el alcohol
se rocía el alimento removiendo constantemente hasta lograr una mezcla
homogénea. Una vez preparado el alimento se debe almacenar en recipientes de
plástico oscuros , que impidan la oxidación por efecto de la luz y mantenerse en
un lugar fresco y seco para evitar la formación de hongos (11).
Andrógenos sintéticos utilizados Nombre: Androst-4-en-3-one, 9 fluoro 11,
17-hidroxi-1,7-metil-(11b,7b).
Formula: C20H29FO3
Peso molecular: 336.45 kd
Fluoximesterona
11
Nombre:17(beta)-hidroxi-17 metilandrost-4-en-3 Formula: C20H30O2 Peso molecular: 302.46 kd
17- α-metiltestosterona Caracteristicas ó propiedades de los andrógenos.
Efecto androgénico. Efecto anabólico. Soluble en alcohol. Fotolabil.
Proceso de reversión sexual Los alevines de los tratamientos T1-T4 fueron alimentados con el alimento
hormonado y los TC fueron alimentados con alimento con iniciaharina (Chow
Purina 45% proteína), por un periodo de 35 dias , los cuales se alimentaron
diariamente ad libitum. Se aplicaron 5 raciones al día, cada 2 h iniciando a las 9:00
y terminando a las 18:00 h descrita por Jiménez y Arredondo (11).
12
Cada 8 días, 10 alevines de cada uno de los tratamientos fueron pesados en una
balanza analitica y medidos sobre papel milimétrico. De esos 10 alevines se
sacrificaban 2 alevines y se fijaban en solución fijadora de Davidson por 24 horas
para después transferirlos a solución conservadora de Davidson y se dejaron
indefinidamente hasta el procesamiento histológico de la muestra (11).
Después de las ocho semanas los alevines, fueron sometidas al proceso de
engorde, este duro 5 meses, alimentándolos ad libitum con alimento libre de
hormonas, se introdujeron en jaulas como se muestra en la (Figura 4) que
estaban dentro de estanques circulares de 4.5 m3 donde, permanecieron hasta
alcanzar la talla promedio, los organismos fueron pesados y medidos, hasta el
final del experimento. Con los datos obtenidos, se realizaron curvas de peso y
longitud contra las 8 semanas de crecimiento como se muestra en la (Figura 9).
Durante todo el experimento se hizo un monitoreo de la calidad del agua: T °C,
oxígeno diariamente y pH semanalmente (Tabla 1).
Figura 4. Jaula con alevines en proceso de engorde, dentro del estanque de la
PExPA.
13
PROCESO HISTOLOGICO
Los alevines sacrificados fueron puestos en solución fijadora de Davidson, se
colocaron en un casete para histología (Histosette). Las muestras mas pequeñas
se envolvieron previamente en papel arroz (Figura 5) para luego colocarlas dentro
del casete histológico previamente etiquetado. Para después someter las
muestras a una descalcificación: Se separaron las muestras y se dividieron en
tres tallas para poder descalsificar de acuerdo al tamaño del organismo se fija el
material en formol al 10% por 24 horas se lava en agua corriente por 10 minutos,
se preparan 60 cc de solución acuosa de acido nítrico al 5%, a las muestras mas
pequeñas de talla 1 se les dejo 5 horas, a las medianas de talla 2 se les dejo 17
horas y a las de talla 3 se les dejo 24 horas en proceso de descalcificación para
posteriormente deshidratarlas (6).
Figura 5. Organismos de la talla 1 envueltos en papel arroz colocados en casete
para su proceso histológico. 14
1. Deshidratación.
Para la deshidratación se utilizo alcohol al 50% por 1 hora se pasaron los tejidos
a alcohol al 60% durante 1 hora para después ponerlos en alcohol al 70% por 1
hora, se escurrieron y se mandaron a alcohol al 70% durante 2 horas, se pusieron
durante1 hora en alcohol al 80% y por último se colocaron en alcohol al 96%
durante 2 horas (6) .
2. Aclaración.
Las muestras se colocaron en alcohol absoluto durante 1 hora, posteriormente se
pasaron a alcohol absoluto – Xileno durante 30 min y Xileno durante 40 minutos.
Para la infiltración se utilizo parafina-Xileno por 1 hora y posteriormente se
mandaron a parafina I durante 1 hora y después se pasaron a la parafina II
durante 1 hora (6).
* Para esta metodología se utilizó el procesador Leica, modelo TP 1020. 3. La Inclusión. Se coloco un espejo de parafina los moldes de plástico para después, tomar el
tejido con pinzas y colocarlo de modo que quede en dirección del corte requerido
ya sea de forma longitudinal ó transversa. Sedejo enfriar para fijar el tejido sin que
solidifique totalmente, se termina de llenar el casete con parafina, de manera
uniforme. Se dejó enfriar inmediatamente para solidificar la parafina a 4°C (6).
* Para este proceso se utilizó el incluidor marca Leica EG1140C y el solidifador
marca Leica Modelo EG 1140H.
15
4. Los cortes histológicos y el montaje
Se colocó el tejido embebido en parafina (casete), bien frío en el micrótomo y se
alineo con la navaja para realizar un primer corte grueso para emparejar la
muestra, posteriormente se efectuaron cortes seriados de entre 5 y 8 micras de
espesor. Despues extendieron en baño con agua desionizada, grenetina y alcohol
a una temperatura de 50°C, se colocaron en portaobjetos, se dejaron secar al aire
durante 20 minutos y se metieron a la estufa a 37- 40 °C durante 24 horas ó a 58
°C durante una hora para adherir el tejido (6).
* Se utilizó un microtomo marca Microm Hm 315 y se utilizó una estufa marca
Felisa.
5. Desparafinación de las muestras.
Las muestras se metieron en xileno I durante 2.5 min y xileno II durante 2.5
minutos para colocarlos a alcohol absoluto I durante 2.5 minutos y pasarlos a
alcohol absoluto II durante 2.5 minutos y se posteriormente se pasaron a alcohol
etílico I al 96% durante 2.5 minutos, se escurrieron y se mandaron a alcohol etílico
I I al 96% durante 2.5 minutos, alcohol 70% durante 5 minutos y finalmente se
lavaron con agua destilada durante 5 min (6).
* La desparafinación y la tinción se realizaron el mismo día, el trabajo se realizó
en secuencia para no ocasionar daños a los tejidos.
16
6. Tinción Hematoxilina-Eosina
Lavar el exceso sumergiendo en agua corriente 2 min.
Hematoxilina en exceso 4 min.
Sumergir en agua destilada 10 min.
Decoloración con alcohol ácido (alcohol etílico 96% HCl 1%) 5 a 10 sumergidas
Sumergir en agua amoniacal 2 o3 seg Observar vire (cambio de color)
Teñir con Eosina 2 min.
Alcohol-Xileno 2.5 i
Se monta en resina sintética disuelta en Xileno, cuidando que no queden burbujas sobre el corte
Dejar secar al aire 5 horas mínimo
Alcohol 80% 2 min.
Alcohol etílico I al 96% 2.5 min. Alcohol etílico I I al 96% 2.5 min.
Alcohol absoluto I 2.5 min. Alcohol absoluto II 2.5 min.
Xileno I 2.5 min. Xileno II 2.5 min.
Adaptado por M. en B.R.A. Guillermo Blancas Arroyo, M. en C. Cecilia Morales Ortiz y M. en Biol. Exp.
Xochitl Guzmán G. 2006, para UAM-Iztapalapa PExPA, Ecotoxicología.
17
Evaluación de sexos. Para evaluar la eficiencia de la reversión sexual se sacrificaron a los organismos
restantes, se utilizo la técnica de aceto-carmín, para esta evaluación se extrae la
gónada (figura 6) y posteriormente se coloca en un portaobjetos se pone una gota
de aceto-carmín y encima un cubreobjetos posteriormente se presiona levemente
con la goma de un lápiz de manera tal que la gónada quede dispersa sobre el
porta objetos. Algunas gonadas fueron conservadas para procesarlas
histológicamente y observar algunas diferencias estructurales entre los
tratamientos de la 17-α-metiltestosterona y la Fluoximesterona (11).
E
Figura 6. Muestra la disección de tilapia para la extracción de la gónada,
señalando la gonada que se encuentra atrás del estomago (E).
18
En un microscopio estereoscópico se monta la preparación y se observa. Si es
una hembra se observaran claramente los óvulos como se muestra en la (figura
8) y si es macho se observaran las espermatogonias y los espermatozoides como
se muestra en la (figura 7).
Espermatozoides
Figura 7. Espermatogonias y
espermatozoides de tilapia 400x.
Figura 8. Ovocitos de tilapia 400x.
19
RESULTADOS
Calidad del agua
RESULTADOS 4.70 + 0.6 2 - 7 Oxigeno mg/l
7 + 1 7 - 8 pH
25 + 4 0C 28 – 35 0C T 0C
Condiciones de cultivo en PExPA.
Datos óptimos para el cultivo. *
*Jiménez y Arredondo (10).
Tabla 1. Valores obtenidos durante el experimento comparados con los reportados en la literatura.
Mortalidad del 2 % Resultados de la eficiencia hormonal
La prueba de tinción con solución de aceto-carmín mostró que la población testigo (TC) estaba constituida por un 50 % de machos y un 50% de hembras.
Esta misma prueba demostró su efectividad al obtener para ambos tratamientos hormonales, una composición sexual del 100% de machos.
20
Gráficas de incremento en peso
0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.2001.4001.600
1 2 3 4 5 6 7 8
Semanas
Peso
en
(g)
Tc MT FM
Figura 9. Crecimiento de los alevines a lo largo del periodo experimental.
TCMTFM
Peso
en
(g)
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
Figura 10. Peso de las tres poblaciones incluyendo el valor medio, la desviación
estándar y sus valores extremos.
21
Resultados histológicos
Figura11. Corte transversal de ovario de TC. H–E 400X
Figura 13. Corte transversal de testículo con tratamiento MT. H-E 1000x
Figura 12. Corte transversal de testículo de TC. H-E 400x
Figura 14. Corte transversal de testículo con tratamiento FM. H-E a 1000x
(f) Epitelio folicular, (fp) folículos en previtelogénesis, (L) Luz, (Eg) Espermatogonias, (Ec) Espermatocitos, (E) Espermatozoides, (t) Trabéculas y (n) núcleo.
22
CONCLUSIONES
La 17- α- metiltestosterona y la Fluoximesterona propiciaron el 100 % de
masculinización en la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus.
Los cortes histológicos de las gónadas evidencian la eficiencia hormonal en
el proceso de masculinización de ambas hormonas. Además muestran un
proceso de espermatogénesis normal.
En las 8 semanas de tratamiento, no se observó un efecto anabólico sobre
los alevines, solo un efecto androgénico (figura 9).
La técnica utilizada en este trabajo, refuerza el hecho de que es posible
obtener un 100% de masculinización de esta especie y asegurar a los
productores de tilapia mejores rendimientos.
23
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