Evaluación histológica y mediante microscopía electrónica de ...
Microscopía y Técnica Histológica (1)
-
Upload
cardenasperezjazmin -
Category
Documents
-
view
36 -
download
5
description
Transcript of Microscopía y Técnica Histológica (1)
Microscopía y Técnica Histológica
Dr. C. Guillermo Moreno Fernández
Universidad Nacional Autónoma de México
Facultad de medicina
Departamento de Biología Celular y Tisular
Reflexión inicial
“La verdadera sabiduría está en reconocer la propia ignorancia.”
Sócrates
“Tropezar no es malo, encariñarse con la misma piedra si”.
L U Z • Issac Newton introduce el término
“ fotón”,
• LUZ.- Es la energía en forma de ondas, que se propaga en todas direcciones y siempre en línea recta, a través de agua o aire
La luz es una forma de energía radiante electromagnética que percibimos con el sentido de la visión. La luz es la porción visible de la energía radiante
• Longitud de Onda: Es la distancia que existe entre dos crestas o dos valles sucesivos de la onda luminosa. Determina la visibilidad y color de la luz. La longitud de una onda luminosa se expresa por la letra griega lambda l
• Amplitud de Onda: Es la distancia que existe entre la parte superior e inferior de la onda. Determina la
intensidad de la luz
• Luz visible 400 nm violeta
700 nm roja
FENÓMENOS DE LA LUZ
REFLEXIÓN
• El rayo de luz incide en un
ángulo de 45° sobre una
superficie, devolviéndolo al
medio, de esta manera se hace
visible (espejo)
REFRACCIÓN
• Es el cambio de velocidad
que experimenta una onda
que pasa de un medio con
un índice de refracción
dado a otro diferente.
• Ejemplo: cuando la luz
pasa a través del aire sobre
una superficie caliente,
produciendo un
“espejismo”
ÍNDICE DE REFRACCIÓN
• Es la modificación en la velocidad de
la luz al incidir un rayo
perpendicularmente a través de un
cuerpo transparente
Velocidad de la luz en el aire IR= Velocidad de la luz en el medio
Índices de refracción de una serie de sustancias transparentes. • Agua = 1.3300 • Aceite de inmersión = 1.5150 • Fluorita = 1.4340 • Vidrio (crown) = 1.5200 • Flint = 1.6600
MESCLA DE COLORES
COLORES TRANSPARENTES: SUSTRACCIÓN DE COLORES
COLORES OPACOS: SUMA O ADICIÓN DE COLORES
Microscopía
Fotografía de una réplica mostrando los componentes del
microscopio compuesto fabricado por los Jansen.
MICROSCOPÍA
Microscopía
• Es uno de los métodos de estudio de la Biología Celular y Tisular
• Es un instrumento óptico que sirve para obtener imágenes aumentadas de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos.
• La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.
MICROSCOPIO FOTÓNICO
• Microscopio de luz
• Fotónico
• De Luz Blanca
• De Campo Claro
Esta constituido por: Componentes ópticos. : Condensador. : Objetivos. : ocular(es) Componentes mecánicos. : Base o pie. : Brazo o columna. : Platina. : Revolver. : Tubo óptico. : Carrito o pinzas. Componentes de iluminación. : Bombilla de luz
Microscopía
• Definición etimológica
– Mikrós = pequeño
– Skopéoo = Observar
• ¿Es lo mismo VER que OBSERVAR?
Observar es ir más allá….
Microscopía
Microscopía
• Bichat (20 tejidos)
• 4 Tejidos Básicos:
– Epitelial
– Conectivo
– Muscular
– Nervioso
Microscopio
INSTRUMENTO DE PRECISIÓN QUE PROPORCIONA IMÁGENES AMPLIFICADAS DE
LOS OBJETOS Y MAS DETALLES QUE LOS OBSERVADOS A SIMPLE VISTA.
Variedades de Microscopía
• Microscopio fotónico: Simple o Compuesto
• Microscopio electrónico
• Microscopio de rayos x
• Microscopio de fuerza atómica
Microscopio fotónico
• Instrumento de precisión por medio del cual se modifican las propiedades de la luz por sistemas ópticos para ver propiedades físicas y químicas de la materia.
• Simple: Lupa
• Compuesto: Más de dos lentes
Componentes del microscopio fotónico compuesto
Ópticos Mecánicos Iluminación
• Condensador • Oculares • Objetivos
• Base o pie • Brazo o columna • Platina • Revolver • Tubo óptico • Platina • Tornillos
macrométrico y micrométrico
• Fuente luminosa
Sistema óptico: Lentes
• Cuerpos transparentes limitados por 2 caras esféricas, una puede ser plana.
• Convergentes (+)
• Divergentes (-)
Lentes
Convergentes Positivas
Biconvexo Cóncavo-Convexo Plano-Convexo
Divergentes Negativas
Bicóncava Convexo-Cóncavo Plano-Cóncavo
F
EP
R
F
R
LC: LENTE CONVERGENTE
EP: EJE PRINCIPAL O EJE OPTICO
F: FOCO PRINCIPAL
R: RAYOS DE LUZ
F
EP
LD
R
F
R
LD: LENTE DIVERGENTE
EP: EJE PRINCIPAL O EJE OPTICO
F: FOCO PRINCIPAL
R: RAYOS DE LUZ
Características de las imágenes obtenidas
• De acuerdo a su tamaño
– Aumentadas (mayor tamaño)
– Disminuidas (menor tamaño)
– Mismo tamaño
Características de las imágenes obtenidas
• De acuerdo a su posición que adopta en el espacio:
• Derecha
• Invertida
Características de las imágenes obtenidas
• De acuerdo a su orientación que toma con respecto a la lente:
• Real (Del otro lado, se recoge con una pantalla)
• Virtual (Mismo lado)
Imágenes obtenidas en sistemas ópticos
Sistemas Imagen Final Esquema
Lupa Ocular
Mayor, Derecha, Virtual
Proyector Objetivo
Mayor, Invertida, Real
Condensador Ojo humano Cámara digital
Menor, Invertida, Real
Microscopio Mayor, Invertida, Virtual
Sistema Óptico
• Son tres las lentes que lo componen:
– Condensador
– Objetivo
– Ocular
• Solo el objetivo y el ocular amplían las imágenes
Condensador
• Lentes convergentes (1 a 2)
• Reúnen los rayos luminosos y los orienta hacia la muestra
• Diafragma
Objetivos
• Son los elementos mas importantes en la formación de la imagen.
• Formado por lentes convergentes y divergentes
• Forman la imagen primaria del microscopio
Objetivos
Aumentos de los Objetivos
• Capacidad de ampliar la imagen del objeto observado
Aumentos de los Objetivos
• Tipos:
– 5x : Lupa
– 10x : Objetivo seco de poca amplificación (aumento)
– 40x : Objetivo seco de gran amplificación (aumento)
– 100x : Objetivo de inmersión de gran amplificación
Seco de poco aumento
Seco de gran aumento
De inmersión de gran aumento
Poder de resolución
• Capacidad que posee el objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos para que se vean visualizados como separados
Límite de resolución
• Distancia mínima requerida para distinguir dos puntos como separados
• Entonces, ¿PODER = LÍMITE?
– A mayor poder de resolución (mas potente) menor será el límite de resolución.
Límite de resolución
PODER DE RESOLUCIÓN
• Es la capacidad del ojo o de un sistema óptico para individualizar DOS puntos cercanos entre sí
LR = K x lambda
AN
• Lambda = Longitud de onda (luz blanca 550nm (0.55 micras)
LÍMITE DE RESOLUCIÓN
• Es la distancia mínima de separación que puede existir entre dos puntos o estructuras, para se reconocidos por un sistema óptico
• A mayor AN, mayor resolución • PR (d) ojo= 0.2 mm • PR (d) ML= .2 micras • PR (d) MET = 0.5-1 nm • PR (d) MEB = 5-20 nm
Límite de resolución
Apertura Numérica
• Capacidad de un objetivo de captar los rayos luminosos refractados
• Tamaño del cono de luz que entra en la lente del microscopio después de pasar por la muestra
Apertura Numérica
APERTURA NUMÉRICA (AN)
• Cifra que corresponde a la capacidad de la lente frontal, para captar la mayor cantidad de rayos de luz.
AN= SEN ½ alfa x IR
• Alfa= ángulo de admisión de la lente
• IR = Del medio presente entre la muestra y la lente frontal
• AN= sen ½ alfa x IR (aceite de
inmersión)
• AN= sen 58° x 1.56
• AN= 0.85 X 1.56
• AN = 1.33
AUMENTO AN
• SECO DÉBIL 10 .25
• SECO FUERTE 40 .65
• INMERSIÓN 100 1.25 – 1.40
OBJETIVOS EJEMPLO
Relación Objetivo-Aumento-Límite de resolución
Con un aumento de 100x y una apertura numérica, el máximo poder de resolución del microscopio fotónico es de 0.2 μm
Oculares
• Forman la segunda imagen ampliada a partir de la imagen primaria de los objetivos
• Amplían a ciertos niveles:
– 5x
– 8x
– 10x
– 12x
Aumento Total
Aumento Objetivo
Aumento Ocular Aumento Total
Lupa 5x 10x 50x
Bajo aumento seco
10x 10x 100x
Gran aumento seco
40x 10x 400x
De Inmersión 100x 10x 1000x
Variedades de Microscopía Fotónica
Microscopio de campo claro
• Fundamento
• Equipo:
– Común
• Material a observar:
– Muestras procesadas mediante la técnica histológica ordinaria
Microscopio de campo oscuro
• Fundamento – Fenómeno de Tyndall
• Equipo: – Condensador
• Material a observar: – Muestras vivas sin fijar ni
teñir.
– Cultivos
– Cristales
Microscopio de contraste de fases
• Fundamento
• Equipo:
– Anillo condensador PH
– Filtro de color (verde)
• Material a observar:
– Muestras vivas sin fijar ni teñir.
– Estructura interna
– Análisis CUALITATIVO
Microscopio Interferencial Diferencial según Normansky
• Fundamento
• Equipo
• Material a observar: – Muestras vivas sin
fijar ni teñir.
– Estructura externa (superficie)
– Análisis CUANTITATIVO
Microscopio de Polarización
• Fundamento – Luz Polarizada
• Equipo: – Polarizador
– Analizador
• Material a observar: – Muestras vivas sin fijar ni
teñir.
– Estructuras con anisotropía (Hueso, Músculo)
Microscopio de Fluorescencia
• Fundamento – Rayos UV
• Equipo: – Anticuerpos marcados con
fluorocromo
• Material a observar: – Muestras procesadas
mediante técnica histológica especial
Microscopio Confocal (Scanning)
Microscopio Confocal
Microscopía Electrónica
Fundamento de la microscopía electrónica
• El ser humano siempre quiere saber más… SIEMPRE!
• ¿Cómo mejorar lo que se ha hecho?
• ¿Cómo hacerle para ver MÁS?
Fundamento de la microscopía electrónica
Fundamento de la microscopía electrónica
• El microscopio electrónico es un instrumento que: – Permite conocer la ultraestructura biológica.
– Tiene un poder de resolución mayor que el del microscopio fotonico, porque utiliza electrones que tienen una longitud de onda de 0.005 nm.
– Utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo electrostático o electromagnético, igual que un rayo de luz es refractado al atravesar una lente.
Tipos de Microscopía Electrónica
• Microscopia electrónica de transmisión (MET):
a. De bajo voltaje: 50-100 KV.
b. De alto voltaje: 500-3000 KV. Permite estudiar cortes de 5 mm y células vivas en cámaras especiales.
• Microscopia electrónica de barrido (MEB).
Aumentos
• Aumentos que proporciona el MET: 20,000 x
1,000,000 x ( lentes intermedias ).
10,000,000 x ( negativos de fotografías ).
• El microscopio electrónico tiene mayor profundidad de foco.
Técnica Histológica Especial
TECNICA DE PREPARACION DE ESPECIMENES 1. FIJACION EN GLUTARALDEHIDO AL 3% EN AMOTIGUADOR
DE FOSFATO 2. LAVADO EN AMORTIGUADOR. 3. POSTFIJACION EN Os04 al 1%. 4. LAVADO EN AMORTIGUADOR. 5. DESHIDRATACION EN ALCOHOLES A 4° C: R-OH 50% R-OH 70% R-OH 80% R-OH 96% R-OH 100% A TEMPERATURA AMBIENTE: R-OH 100% 6. DIAFANIZACION: OXIDO DE PROPILENO.
Técnica Histológica Especial
7. IMPREGNACION
RESINA-OXIDO DE PROPILENO
RESINA
8. INCLUSION
EN RESINA EN CAPSULAS DE GELATINA
POLIMERIZACION A 60 °C.
9. CORTE EN ULTRAMICROTOMO
CORTES DE 60 A 100 NM
10. TECNICA DE SOMBREADO
SE UTILIZAN SALES DE METALES PESADOS COMO URANIO, PLOMO, ETC., PARA AUMENTAR LA ELECTRODENSIDAD DE LOS COMPONENTES TISULARES.
¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!
¿Dudas ?
EQUIVALENCIAS
• 1 picómetro
• 1 angstrom °A
• 10 °A
• 1 nm
• 1000 nm
• 1000 micrómetros
• 0.01 °A
• 0.1 nm
• 1.0 nm
• 1000 picómetros
• 1.0 micrómetros
• 1.0 mm
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Todo curso de Histología tiene cuatro partes o secciones.
• La primera sección que corresponde a los métodos de estudio, se
divide a su vez en dos nuevas porciones:
a) Técnicas histológicas
b) Microscopio
Histología
Métodos de estudio
Biología celular
Biología tisular
Organografía
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
TÉCNICA HISTOLÓGICA:
• Conjunto de procedimientos por los que una muestra de tejido es sometida a cambios físicos y químicos con el fin de obtener una preparación que puede observarse con un microscopio.
Técnica
Histológica
Esencialmente se trata de tomar una muestra de una estructura en estudio y someterla a diversos
procedimientos que tienen como resultado final la obtención de una preparación histológica que
podemos ver en un microscopio.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
a) Técnica histológica ordinaria
b) Técnicas histológicas especiales
• La técnica histológica ordinaria se define por tres características fundamentales:
a) Fijación en formol al 10%
b) Inclusión en parafina
c) Tinción con hematoxilina y eosina
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
1. Estado vital del individuo.
El individuo del que obtenemos la muestra, ¿está vivo o no?
2. Método de obtención.
¿Qué método empleamos para obtener la muestra?
3. Momento del diagnóstico.
¿Se realiza el diagnóstico después de o durante el acto quirúrgico?
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
1. Estado vital del individuo:
1.1. Vivo = Biopsia
1.2. Muerto = Necropsia
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Biopsia de piel.
Muestra pequeña
Pieza quirúrgica.
Segmento de intestino
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Los términos necropsia y autopsia se usan indistintamente en la práctica médica para referirse al ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO DEL CADÁVER.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• EL ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO DEL CADÁVER.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
La autopsia puede ser:
Médica: Es la que ocurre normalmente en los hospitales. La idea es identificar específicamente las causas del fallecimiento con mayor certeza que lo expresado en el historial médico.
Médico-Legal: Ocurre generalmente en los servicios forenses. Intenta detectar las condiciones legales relacionadas con el fallecimiento.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
2. Método de obtención:
De acuerdo con este criterio, distinguimos al menos cuatro variantes:
2.1. Corte
2.2. Punción
2.3. Impronta
2.4. Raspado
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
El corte.
• Es el método más común de obtención de la muestra, con este fin el médico puede emplear muy variados instrumentos:
a) Bisturí clásico
b) Variantes de bisturí: de diamante, eléctrico, de rayos gamma, laser, etcétera.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Aquí se muestran distintos tipos de instrumentos que se emplean en la práctica médica
para obtener muestras por corte.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• El corte que realizamos en nuestro paciente, puede incidir sobre nuestro sujeto de estudio (corte por incisión: en azul en la foto), o bien, puede extraer completamente nuestro sujeto de estudio (corte por escisión: en rojo en la foto).
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Nuestro sujeto de estudio es la lesión pigmentada.
El corte en azul, incide sobre la lesión, mientras que el corte en
rojo no lo hace.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Punción venosa.
• Es el procedimiento más común para la obtención de sangre que permite el estudio de biometría hemática, química sanguínea y tiempos de coagulación.
• Es sin duda el primer tipo de obtención de la muestra que los médicos realizan en su práctica hospitalaria.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Punción arterial.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
La sangre arterial se usa para el estudio del pH y de las concentraciones de
gases en sangre (gasometría). En general es un procedimiento más
complicado que la punción venosa porque las arterias son profundas.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Punción de médula ósea.
• La médula ósea es el sitio donde se producen las células de la sangre.
• Se pueden obtener muestras para estudio citológico e histológico.
• Se analizan las características anormales en casos de anemias y leucemias (cáncer de células de la sangre).
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Punción con aguja fina (BAAF = Biopsia por aspiración con aguja fina).
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Permite obtener muestras de estructuras superficiales como la tiroides y las
glándulas mamaria y parótida con un procedimiento que no requiere del quirófano,
que se puede realizar en el consultorio.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Punción renal.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Los riñones son órganos cuya localización anatómica hace muy difícil el
abordaje por cirugía. Resulta mucho más sencillo localizar las lesiones a
analizar por medio de estudios de imagen y con esta guía puncionarlas
obteniendo una muestra para estudio histológico.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Punción cerebral guiada por estereotaxia:
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
El aparato de estereotaxia es un dispositivo que permite guiar al cirujano
ayudado por estudios de imagen de modo que se pueda puncionar
exactamente en el lugar en que se encuentra la lesión. Se emplea
frecuentemente en neurocirugía.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
La impronta.
• La obtención de la muestra por impronta (Huella) consiste en la aplicación directa del portaobjetos sobre la muestra que se pretende estudiar.
• En la actualidad su uso se circunscribe casi de manera exclusiva a los estudios transoperatorios.
• En el estudio de los ganglios linfáticos en que se sospecha linfoma resulta una maniobra imprescindible.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La obtención de la muestra por raspado consiste en emplear un instrumento romo con el que raspamos la superficie del tejido que deseamos estudiar, dejando numerosas células en el mismo.
• El ejemplo más frecuente e importante es el caso del raspado del cérvix uterino para la detección oportuna del cáncer.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La muestra cervical se obtiene por raspado (actualmente se recomienda el cepillo citológico).
• Se extiende sobre la lámina portaobjetos
• Se fija con una solución de base alcohólica
• Se tiñe con el colorante de Papanicolaou.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
3. Momento del diagnóstico:
3.1. Diagnóstico post-operatorio (rutina)
La mayor parte de las veces el diagnóstico histológico se realiza después de que ha concluído el acto quirúrgico que permite la obtención de la muestra.
3.2. Diagnóstico transoperatorio.
En otros casos, es importante contar con un diagnóstico histológico antes de que termine el proceso quirúrgico ya que de hecho, el propio diagnóstico histológico permite elegir una u otra posibilidad de tratamiento.
LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La disminución resultante en las concentraciones de oxígeno en el tejido, condiciona una serie de cambios metabólicos que eventualmente alteran las características morfológicas y funcionales del mismo.
• Evitar estos cambios secundarios a hipoxia (déficit de oxígeno en un organismo).
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• En condiciones normales, las células de un tejido se encuentran en un estado que conocemos como de equilibrio u homeostasis.
• Para que se de el “equilibrio vital tisular” es necesario que se cumplan varias condiciones.
a) Condiciones intrínsecas:
a.1. Integridad del genoma. El mensaje genético no debe tener alteraciones.
a.2. Integridad del metabolismo. Todas las reacciones químicas que ocurren en el citoplasma deben estar normales.
b) Condiciones extrínsecas:
b.1. Interacción con el entorno. Las relaciones de la célula con otras células vecinas y con la matriz extracelular.
b.2. Factores tróficos. Incluye la sangre, así como estímulos nerviosos y hormonales.
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Equilibrio vital tisular
LA FIJACIÓN TISULAR
O2
Aminoácidos
Glúcidos
Lípidos
Vitaminas
Hormona
H
H
Hormona
1
2
3a
3b
4
5
6
Las células no se encuentran aisladas del entorno. Su estabilidad depende de factores
intrínsecos como el genoma (1) y el metabolismo (2). Además es necesaria una adecuada
interacción con otras células vecinas (3-a) y con moléculas de la matriz extracelular (3-b), a lo
que debemos agregar el estímulo trófico de los nutrientes que llegan por la sangre (4) y los
efectos del sistema endocrino (5) y nervioso (6).
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Equilibrio vital tisular
LA FIJACIÓN TISULAR
O2
Aminoácidos
Glúcidos
Lípidos
Vitamina
H
H
H
H
1 2 3a
3b
4
5
6
En condiciones patológicas cada uno de los elementos aquí señalados puede fallar y como regla
termina afectando a todos los demás. Por ejemplo, un defecto en el genoma puede traducir un
tipo anómalo de proteína que afecta el metabolismo celular. La célula así dañada puede alterar
las condiciones de las células vecinas y su interacción con la matriz extracelular.
X
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Equilibrio vital tisular
LA FIJACIÓN TISULAR
O2
Aminoácidos
Glúcidos
Lípidos
Vitamina
H
H
H
H
1 2 3a
3b
4
5
6
El aporte adecuado de oxígeno a los tejidos es resultado de muy diversas condiciones. Aquí hay
que considerar todos los elementos involucrados en que este proceso ocurra. Por ejemplo,
puede ser que los pulmones estén dañados y no capten suficiente cantidad de oxígeno. Puede
ser que los eritrocitos tengan algún problema y aunque se capte por los pulmones, no lo puedan
transportar, etcétera. A la condición en que falta oxígeno en los tejidos se le llama hipoxia.
X
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• En condiciones en que falte el aporte de oxígeno a los tejidos, el metabolismo intermediario se cambia a la ruta anaeróbica.
• De este modo, ocurren dos consecuencias fundamentales:
a) Disminuye la cantidad de ATP intracitoplásmico
b) Aumenta la cantidad de ácido láctico y por lo tanto el pH citoplásmico disminuye.
La disminución en la cantidad de ATP intracitoplásmico tiene como consecuencia el que todas las funciones celulares que dependan de energía irán disminuyendo gradualmente.
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza I. Metabolismo intermediario.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Lactato
Piruvato
Glucosa
Glucosa-P
[O2] [O2]
Acetil CoA
Ciclo de
Krebs
e
e
e
ATP
ATP
ATP
Cuando el tejido se ve sometido a hipoxia (disminución de los niveles normales de oxígeno)
entonces la vía metabólica es la anaeróbica y ya no pasamos a piruvato sino a lactato. Al
bloquear la vía del piruvato, bloqueamos el paso al ciclo de Krebs y a la cadena respiratoria, por
lo que las concentraciones de ATP disminuyen importantemente.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Las reglas de la difusión establecen:
a) Las partículas en solución se
desplazarán desde un sitio de
mayor concentración hacia un sitio
de menor concentración.
b) Si tienen carga, las partículas
serán atraídas por la carga
contraria y rechazadas por cargas
iguales.
En condiciones normales, la cantidad o
concentración de sodio (Na+) fuera
de la célula es mucho mayor que la
que se encuentra en el interior.
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+ Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Si dejamos así como está representada en nuestro esquema a la célula, la diferencia de
concentraciones de sodio entre el medio interno y el externo impulsará al sodio hacia el
interior. Si agregamos el hecho de que el interior es menos positivo, por lo que se
considera negativo, entonces las cargas positivas del sodio, también lo impulsarán hacia
el interior.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+ Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
De acuerdo con lo que acabamos de mencionar, existen dos fuerzas que impulsan al
sodio hacia el interior de la célula:
a) Gradiente (o diferencia) de concentraciones
b) Gradiente (o diferencia) de cargas.
Estas dos fuerzas se mantienen mientras que existan las diferencias o gradientes, por lo
que cesarán hasta que dichos gradientes lleguen a desaparecer.
Gradiente de carga
Gradiente de concentración
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Una vez que se ha alcanzado el equilibrio de concentraciones y de cargas entre el medio
interno y el externo, los gradientes ya no existen, por lo que el movimiento neto de
partículas se suspende.
Resulta interesante el hecho de que este “estado de equilibrio” es incompatible con la
vida.
Para que el proceso vida ocurra es indispensable que se mantenga el desequilibrio.
TERMODINÁMICAMENTE POCO PROBABLE Y MANTENIDO GRACIAS A LA
INVERSIÓN CONSTANTE DE ENERGÍA.
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Si queremos mantener la diferencia de concentraciones para el sodio, será necesario
contar con un sistema que tenga la capacidad de sacar el sodio que entre. Semejante
sistema deberá transportar sodio en contra de las fuerzas establecidas por los gradientes
de carga y de concentración. Para realizar esto, será necesario gastar energía.
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
El sistema encargado de mantener la diferencia de concentraciones para el sodio es una
molécula protéica de membrana que tiene la capacidad de transportar sodio contra
gradiente, para lo cual debe obtener energía al romper una molécula de ATP. Dado que
esta misma proteína hace lo propio con el potasio (K+), se conoce como bomba de
Na+/K+ ATPasa. Al mecanismo de transporte contra gradiente con gasto de energía se le
conoce como transporte activo.
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
ADP + Pi
ATP
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
El trabajo constante de la bomba de Na+/K+ ATPasa, por medio del consumo de ATP y
por el mecanismo de trasporte activo, mantiene las diferencias de concentración para
sodio y para potasio entre el medio interno y el externo de la célula.
“TERMODINÁMICAMENTE POCO PROBABLE Y MANTENIDO GRACIAS A LA
INVERSIÓN CONSTANTE DE ENERGÍA”.
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+ Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
ADP + Pi
ATP
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Aquí tenemos una tina con agua y sodio. En el compartimiento A, encontramos menos sodio
que en el compartimiento B. Dado que el nivel de agua se encuentra igual, pareciera que hay
la misma cantidad de agua en A que en B. Pero si consideramos que el sodio ocupa un lugar
en el espacio, entonces resulta que hay más agua en A que en B. De este modo, existe un
gradiente de concentraciones para sodio de B hacia A y simultáneamente un gradiente de
concentraciones de agua de A hacia B. El caso es que la membrana que separa los
compartimientos sólo deja pasar el agua (Membrana semipermeable).
A Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
B
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Como resultado de este experimento, se aprecia un flujo neto de agua desde A hacia B
debido a un proceso de difusión simple a través de una membrana semipermeable. A
este fenómeno se le conoce como ÓSMOSIS. Pareciera que el “SODIO JALAGUA” pero en
realidad no ocurre así.
Este fenómeno de ÓSMOSIS se puede presentar con otros solutos, podríamos cambiar el
sodio por proteínas y tendríamos el mismo efecto.
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
B
Na+ Na+
A
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza II. El transporte transmembrana.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
SODIO JALAGUA, SODIO JALAGUA, SODIO JALAGUA, SODIO JALAGUA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza III. El destructor de todo.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Uno de los organelos que se encuentran
flotando en el citoplasma, está limitado por
membrana y en su interior contiene
numerosas enzimas que tienen la
capacidad de destruir casi todo lo que
tocan.
Dado que la destrucción que condicionan
estas enzimas ocurre en un medio acuoso,
se conocen como enzimas hidrolíticas.
Dado que el pH óptimo de estas enzimas es
de alrededor de 5.0, se conocen como
enzimas hidrolíticas ácidas o hidrolasas
ácidas.
Este organelo, originalmente descubierto
por el Dr. Christian de Duve, se conoce
como lisosoma. Si aceptamos que cuando decimos todo, nos referimos a las macromoléculas, entonces
al decir que las enzimas lisosomales destruyen todo, decimos que destruyen:
a) Proteínas: Proteasas (colagenasas, elastasas)
b) Lípidos: Lipasas
c) Carbohidratos: Glucosidasas
d) Nucleasas: (ADNasa y ARNasa)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Pieza III. El destructor de todo.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
El hecho de que el pH en el interior de un
lisosoma sea de 4.8, mientras que el pH en
el citoplasma que le rodea sea de 7.2.,
implica que la concentración de
hidrogeniones dentro del lisosoma es muy
alta.
Para mantener este gradiente de protones
es indispensable que la membrana del
lisosoma cuente con un sistema de
proteínas con capacidad de ATPasa que
constantemente bombeen protones hacia el
interior del lisosoma.
Así, la membrana de este organelo tiene
bombas de protones en abundancia, que
requieren para su funcionamiento, de
adecuadas concentraciones de ATP
citoplásmico.
En condiciones normales, si las enzimas lisosomales salieran del organelo, no tendrían
actividad destructora debido a que se encontrarían en el citoplasma con un pH muy
alejado de su nivel óptimo.
Pero si por alguna razón ocurriera que el pH del citoplasma descendiera, entonces sí
estaríamos en problemas ya que estas grandes destructoras sí podrían ejercer su efecto
lítico.
pH = 4.8
pH = 7.2
Bombas
de
protones
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• El tejido que deseamos estudiar con fines diagnósticos en nuestro paciente, se encuentra en las condiciones del equilibrio vital tisular.
• En el momento en que obtenemos la biopsia, separamos al tejido de su fuente nutricia vascular, por lo que obligadamente, las concentraciones de oxígeno en el mismo descienden gradualmente, de modo que entra en condiciones de hipoxia.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Lactato
Piruvato
Glucosa
Acetil CoA
Ciclo de
Krebs
ATP
pH
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Esto conlleva la desviación hacia la glucólisis anaeróbica, por lo que se bloquea el paso al ciclo de Krebs y a la obtencion de ATP en la cadena respiratoria.
• Esto tiene como resultado la disminución de las concentraciones de ATP en el citoplasma y la acumulación de ácido láctico con la consecuente disminución del pH citoplásmico.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Lactato
Piruvato
Glucosa
Acetil CoA
Ciclo de
Krebs
ATP
pH
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La disminución en la cantidad de ATP disponible en el citoplasma tiene como consecuencia que las funciones que dependan de esta molécula irán disminuyendo gradualmente.
• Si empieza a fallar la bomba de Na+/K+ el resultado será la entrada de Na+ al citoplasma y como dice mi amigo el fisiólogo, SODIO JALAGUA. Por lo que la célula literalmente se hinchará (Edema celular).
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Lactato
Piruvato
Glucosa
Acetil CoA
Ciclo de
Krebs
ATP
Na+
Na+
H2O
H2O
EDEMA
CELULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Las bombas de protones de los lisosomas, tanbién irán disminuyendo gradualmente su función, con lo que la cantidad de protones citoplásmicos aumentará llevando a una disminución gradual del pH citoplásmico.
• El edema celular favorece la salida de enzimas lisosomales, que ahora entrarán en contacto con un pH ácido por lo que sí funcionarán, destruyendo todo lo que encuentren a su paso: AUTÓLISIS.
LA FIJACIÓN TISULAR. LA HIPOXIA.
Lactato
Piruvato
Glucosa
Acetil CoA
Ciclo de
Krebs
ATP
Na+
Na+
H2O
H2O
EDEMA
CELULAR
pH = 4.8
PROTEASAS
LIPASAS
GLUCOSIDASAS
NUCLEASAS
ACTIVAS
AUTÓLISIS
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La fijación química se logra por la aplicación de diversas sustancias disponibles para el histólogo:
a) Formaldehído e) Glutaraldehído
b) Formol f) Osmio
c) Alcohol g) Ácido pícrico
d) Acetona
• La más sencilla y barata – aunque no ideal – es la inmersión de una muestra en alcohol etílico al 96%. Este método se puede emplear en caso en que no tengamos otro fijador a la mano y resulte urgente mantener la preservación del tejido.
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• El fijador más comunmente empleado en la investigación y en la práctica médica es el FORMOL AL 10%
• El formol, también conocido como formalina, es una solución que contiene aproximadamente 60% de agua y 40% de un gas conocido como formaldehído.
• FORMOL Y FORMALDEHÍDO NO SON LO MISMO.
LA FIJACIÓN TISULAR
+ =
Gas formaldehído
40%
Agua
60% Formol al 100%
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Para hacer una mezcla de formol al 10%, en un recipiente ponemos una parte de formol y nueve partes de agua.
• En la mezcla resultante, el formaldehído queda a una proporción de 4%
• El agente activo fijador de el formol es el gas formaldehído.
• Con el fin de obtener una fijación óptima del tejido a estudiar, es muy importante tomar en cuenta que el formaldehído tiene una velocidad de penetración tisular de aproximadamente 1 mm/hr.
LA FIJACIÓN TISULAR
Agua
Formol
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• En general, mi amigo el histólogo recomienda que por cada unidad de volumen de tejido, agreguemos de 20 a 40 unidades de volumen de fijador.
• Si la biopsia que obtenemos es de 1cm3, entonces necesitaremos de 20 a 40 cm3 de fijador. Si igualamos 1 cm3 con 1 ml; entonces bastarán entre 20 y 40 ml de fijador.
• De este modo, nos queda claro que la fijación de biopsias pequeñas no representa problema alguno.
• Pero, ¿qué ocurre en el caso de la fijación de las piezas quirúrgicas que suelen ser mucho más grandes?
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Pensemos en el caso de que queremos estudiar un útero en el que el ultrasonido detectó varios tumores y queremos el estudio debido a que nos interesa saber si son benignos o malignos.
• La pieza que se recibe en el servicio de Anatomía patológica es muy grande. Si aceptamos que la pieza midió: 15 x 10 x 5 cm, entonces su volumen aproximado es de 15 x 10 = 150 x 5 = 750 cc = 750 ml.
• Siguiendo las recomendaciones del histólogo, deberemos sumergir la pieza en un volumen de fijador igual a:
750 x 20 = 15,000 ml = ¡15 LITROS!
• Semejante circunstancia es inaceptable en un hospital.
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• ¿Cómo solucionar este problema?
• Es imperativo que las piezas quirúrgicas que lleguen al servicio de Anatomía patológica sean estudiadas a la brevedad.
• De las zonas seleccionadas – por ejemplo en el caso del utero con miomas – los tumores, se deben cortar rebanadas de tejido que tengan un espesor máximo de 0.5 cm. De este modo, la rebanada resultante podría medir 3 x 2 x 0.5 cm. Dimensiones que permiten una rápida y adecuada entrada del fijador.
• .
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LA FIJACIÓN TISULAR
Aquí vemos un segmento de intestino delgado que una vez cortado muestra la
superficie interna o mucosa. Note que se ha seleccionado un pequeño fragmento
para estudio histológico.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LA FIJACIÓN TISULAR
Los cortes seleccionados
se introducen en las
cápsulas de inclusión.
Aquí se muestran unas de
metal y una de plástico.
Note que estos
dispositivos cuentan con
numerosos agujeritos que
permiten el contacto del
tejido con distintas
soluciones que se
emplean en el
procesamiento histológico.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Los fijadores, como es el caso del formol al 10% tienen varios efectos importantes sobre el tejido, incluyendo:
A) Detienen la mayor parte de los procesos metabólicos tisulares. Esto tiene como consecuencia que DETIENEN EL PROCESO DE AUTÓLISIS, pero además, matan a todo elemento viviente, lo que incluye a bacterias que podrían causar putrefacción y a las propias células que queremos estudiar.
B) Endurecen los tejidos. Esta circunstancia favorece el corte de los mismos.
C) Favorecen la tinción (efecto mordente). Los tejidos bien fijados se colorean mucho mejor, mientras que un tejido mal fijado, se colorea mucho menos.
D) Causan pérdida de sustancias intracelulares. En general, se pierde agua y elementos grasos.
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• En la práctica médica, los primeros dos pasos de las técnicas histológicas: LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Y LA FIJACIÓN, las lleva a cabo el médico tratante.
• Si el médico tratante pasa por alto este detalle, puede arruinar el estudio diagnóstico de un paciente.
LA FIJACIÓN TISULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
EL PROCESAMIENTO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Una vez que las muestras de tejido se encuentran adecuadamente fijadas y en las cápsulas de inclusión, están listas para la parte de la técnica histológica que conocemos como el procesamiento histológico.
• En términos básicos podemos plantear a partir de este momento 3 metas fundamentales:
A) Realización de cortes translúcidos
B) Tinción de los cortes
C) Protección del preparado final
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• La observación con el tipo de microscopio que tenemos en los laboratorios requiere de cortes o rebanadas de tejido lo suficientemente delgadas como para que pase la luz a través de ellas. Es decir, se requiere de cortes translúcidos.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Una manera para solucionar este problema es congelar el tejido y realizar los cortes en un medio con muy bajas temperaturas. Es el caso de los cortes por congelación.
• No hace daño recordar que el instrumento para realizar estos cortes es el criostato y que en la práctica médica tiene aplicaciones en los siguientes casos:
a) Estudios transoperatorios
b) Estudios de inmunofluorescencia en biopsias renales y de piel.
c) Estudios de histoquímica enzimática en casos de patología muscular.
d) Estudio de grasas neutras en tejido adiposo
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
a) Parafina
b) OCT (Mezcla comercial de alcohol polivinílico, polietilenglicol y excipientes) empleada para los cortes por congelación. Es un compuesto hidrofílico.
c) Resinas acrílicas, poliéster y epóxicas (empleadas para estudios de microscopía electrónica)
* Como ya hemos comentado, la técnica histológica ordinaria requiere de inclusión en parafina, por lo que partiremos de esta.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Si queremos sustituir el agua que se encuentra en el interior de la célula por parafina, lo primero que debemos hacer es eliminar el agua.
• Una manera muy conocida por algunos caballeros, es la deshidratación con alcohol.
• Con el fin de evitar el efecto de encogimiento del tejido como resultado de la deshidratación brusca, los tejidos pasan a varios baños con etanol en grados crecientes. Al final del proceso, donde había agua en la célula, ahora hay etanol.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
ETANOL
AL 60%
ETANOL
AL 70%
ETANOL
AL 80%
ETANOL
AL 96%
ETANOL
AL 100%
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Con la DESHIDATACIÓN EN ETANOL EN GRADOS CRECIENTES hemos logrado eliminar el agua del tejido. Ahora donde había agua, hay etanol.
• Pero resulta que el etanol no se mezcla con la parafina, por lo que también deberemos eliminarlo. Obviamente debemos emplear una sustancia que se mezcle tanto con el etanol como con la parafina.
• Para lograr este fin la mayor parte de las veces empleamos XILOL también conocido como XILENO. Podemos emplear también TOLUENO o BENCENO.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
ETANOL
AL 100%
XILOL
• Aquí no usamos grados crecientes de XILOL.
• Este proceso se conoce como ACLARAMIENTO.
• Al final, donde había etanol, ahora hay xilol.
• Estamos listos para pasar nuestro tejido a parafina.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Terminada la etapa de ACLARAMIENTO, donde primero había agua y después había alcohol, ahora hay XILOL.
• Enseguida la muestra pasa a un recipiente con parafina caliente de modo que se encuentra líquida y podemos sumergir la muestra.
• La parafina entra ahora reemplazando al xilol. A este paso se le llama INFILTRACIÓN.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
PARAFINA
LÍQUIDA
XILOL TEJIDO
INFILTRADO
• Hasta aquí hemos logrado nuestra meta fundamental que era sustituir el agua por un material más duro que facilitara la realización de cortes delgados, tan delgados que sean translúcidos.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• A la secuencia de pasos que incluye la deshidratación en alcoholes de grados crecientes, el aclaramiento y la infiltración del tejido, el histotecnólogo le conoce como EL PROCESO – no el de Kafka – o en ocasiones le llama más adecuadamente, EL PROCESAMIENTO.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
TEJIDO
BIEN
FIJADO
ETANOL
60%
ETANOL
70%
ETANOL
80%
ETANOL
96%
ETANOL
100%
XILOL
PARAFINA
LÍQUIDA TEJIDO
BIEN
INFILTRADO DESHIDRATACIÓN
EN ALCOHOL
EN GRADOS CRECIENTES
ACLARAMIENTO
INFILTRACIÓN
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Es importante considerar que cada uno de estos pasos, requiere un tiempo que varía entre una y dos horas. Los tiempos y soluciones pueden variar levemente entre uno y otro laboratorio, pero esencialmente siguen los principios aquí marcados.
• Si aceptamos un procesamiento como el aquí señalado, entonces el tiempo desde el primer paso a etanol hasta tener un tejido bien infiltrado, consume un total de ¡7 a 14 horas!
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
TEJIDO
BIEN
FIJADO
ETANOL
60%
ETANOL
70%
ETANOL
80%
ETANOL
96%
ETANOL
100%
XILOL
PARAFINA
LÍQUIDA TEJIDO
BIEN
INFILTRADO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• En los viejos tiempos, el procesamiento histológico se hacia a mano. ¡Uf!
• Por suerte, ahora los laboratorios cuentan con aparatos que hacen automáticamente el procesamiento. Su nombre, muy imaginativo, es el de PROCESADOR AUTOMÁTICO DE TEJIDOS.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• La muestra completamente infiltrada, pasa ahora a un recipiente cuadrilongo en el que se vierte parafina líquida y posteriormente se deja enfriar. De este modo, la parafina se solidifica y queda un bloque de parafina con tejido incluido en su interior. A este paso se le conoce como INCLUSIÓN.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
C B A
PARAFINA
LÍQUIDA TEJIDO
INFILTRADO
BLOQUE
DE
PARAFINA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• El resultado final es un bloque de parafina que en su interior contiene el tejido – que se puede ver a través de la parafina – y que está listo para realizar un corte lo suficientemente delgado como para que pase la luz a través de él.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Para la realización de un corte muy delgado se emplea un instrumento especial que se conoce como microtomo.
• En realidad existen varios tipos de microtomos, el que se usa para las técnicas ordinarias se conoce como microtomo rotativo.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
• El microtomo contiene un soporte para el bloque de parafina (flecha roja) y otro para un cuchilla muy afilada que debe manejarse con mucho cuidado (flecha azul)
• Cuenta con un sistema que permite un avance muy gradual del bloque de modo que al acercarse a la cuchilla, salen los cortes.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• En esta imagen vemos el detalle de la cara frontal del microtomo rotativo. Se puede idenfificar el bloque de parafina con una muestra de tejido incluida en su interior. Se aprecia además la cuchilla y sobre ella, una tira de cortes.
• Conforme sale cada una de las rebanadas o cortes de tejido, una se va quedando pegada a la que sigue y se forma una tira de cortes delgadísimos que se conocen como cortes de parafina.
• El técnico puede tomar con mucho cuidado la tira de cortes de parafina para continuar con el procedimiento.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• El técnico pone con mucho cuidado un fragmento de la tira de cortes de parafina sobre una lámina portaobjeto y le agrega unas gotitas de alcohol, con el fin de que los cortes se estiren.
• Enseguida, los pasa a una tina con agua que tiene un sistema que permite regular la temperatura. Con cuidado pone los cortes sobre la superficie del agua que se encuentra en el baño de flotación, donde se siguen estirando un poco más.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Para terminar, el técnico selecciona los cortes que tienen mejor aspecto y los captura con una lámina portaobjetos, de modo que quedan adosados a la superficie de la misma.
• Al final, se cuenta con numerosos cortes de parafina ya en las láminas portaobjetos y se ponen en rejillas especiales que permiten manipular hasta cincuenta laminillas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
A) Realización de cortes translúcidos
• Con estos pasos hemos cumplido la meta primaria: obtener cortes tan delgados que sean translúcidos, de modo que ahora podemos estudiarlos con nuestro microscopio.
• Los cortes obtenidos con el microtomo rotativo tienen espesores que varían entre 4 y 8 micrómetros o micras.
• Frecuentemente estaremos mencionando medidas microscópicas por lo que conviene recordar algunas de ellas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
B) Tinción de los cortes
• Ahora sí, estamos listos para observar con nuestro microscopio. Tomamos nuestra laminilla que tiene un corte de parafina con un espesor de sólo 6 micrómetros por lo que la luz facilmente puede atravesarla y nos asomamos a ver cómo se ve.
• ¡Mmmmh! Pues sí se ve algo, pero como que no muy bien ¿no crees?
• ¿Cómo se vería coloreado?
• ¡Mmmmh! Se ve mucho mejor. Tal vez sí debemos colorearlo.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
B) Tinción de los cortes
• El problema con el que topamos ahora es que los colorantes son generalmente soluciones acuosas y nuestro corte es de parafina – lo que implica un medio graso – por lo que así no es posible colorearlo.
• Nos estorba ahora la parafina. Debemos eliminarla.
• Para esto necesitamos ahora repetir los pasos que realizamos antes, pero en sentido inverso. Es decir, será necesario quitar la parafina – desparafinar – y sustituirla por xilol – aclaramiento – para finalmente hidratar los cortes – hidratación en alcoholes de grados decrecientes.
• ¡Osh! ¡qué lata!
• Ni modo, manos a la obra.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
B) Tinción de los cortes
• Para lograr la tinción de los cortes de parafina por la técnica histológica ordinaria, el técnico tiene una serie de recipientes de vidrio que contienen las soluciones necesarias.
• Las laminillas montadas en una canastilla pueden pasarse manualmente de una a otra solución. Por suerte, en este procedimiento los tiempos son mucho más cortos.
• Ponemos nuestra canastilla en xilol durante unos 15 minutos para que se desparafinen. Algunos técnicos ponen las laminillas en xilol en una estufa de modo que se acelere el proceso. Esto debe hacerse con mucho cuidado ya que el xilol es inflamable.
• Después, las laminillas pasan a dos baños de etanol al 96% seguidos de otros dos en etanol al 100%
• El tiempo entre cada paso es de medio minuto a dos minutos.
• Por lo tanto el tiempo de deshidratación es de 15 + 2 = 17 minutos a 15 + 8 = 23 minutos.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
B) Tinción de los cortes
• Una vez hidratados los cortes, pueden pasar a tinción con hematoxilina y eosina en el caso de la técnica histológica ordinaria. Si pasan a otra tinción, entonces se trata de una técnica histológica especial.
• Note Usted que el procedimiento de obtención de cortes de parafina fue el mismo tanto para la técnica histológica ordinaria (hematoxilina y eosina) como para una técnica histológica especial.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
C) Protección del preparado final
• Ahora sí podemos observar muchos detalles histológicos en nuestro corte recién teñido con hematoxilina y eosina.
• Pero, tomando en cuenta que su espesor es de sólo 6 micrómetros, resulta ser muy frágil, por lo que si nos equivocamos y pasamos un dedo por su superficie, podemos dañarlo de manera permanente.
• La idea es que el corte pueda ser estudiado hoy y también dentro de 20 años, por lo que debemos protegerlo.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
C) Protección del preparado final
• Para proteger nuestro corte y lograr una preparación histológica permanente, le vamos a pegar un fragmento laminar de vidrio que llamamos cubreobjetos.
• El problema reside en que nuestro corte está hidratado y el “pegamento” para el cubreobjetos es una resina de naturaleza grasa.
• Por lo que… ¿qué crees? Deberemos de nueva cuenta deshidratar los cortes en alcoholes de grados crecientes, aclararlos en xilol, y finalmente agregar la resina y pegar el cubreobjetos (montaje).
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Con el fin de visualizar desde otra perspectiva los pasos de la técnica histológica, vamos ahora a revisar un esquema que además nos facilitará el recordarlos.
• Vamos a imaginar que sobrevolamos un misterioso país con una geografía muy peculiar. Tenemos dos grandes avenidas que llamamos medio acuoso y medio graso.
• Estas se encuentran separadas por dos ríos peculiares. Uno es maravilloso para algunos caballeros porque ¡es de alcohol! El otro, no es muy amigable porque es de xilol.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
MEDIO GRASO
MEDIO ACUOSO
XILOL
ETANOL
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Con más detalle observamos que el río de etanol está separado en canales que implican graduaciones.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
MEDIO GRASO
MEDIO ACUOSO
XILOL
100% ETANOL 96%
80%
70%
60%
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La obtención de la muestra y la fijación ocurren en medio acuoso. La primera porque el tejido es rico en agua y la segunda porque la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
MEDIO GRASO
MEDIO ACUOSO
XILOL
100% ETANOL 96%
80%
70%
60%
1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
2. FIJACIÓN
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La infiltración, la inclusión y el corte ocurren en medio graso. Por lo que, para llevarlas a cabo, deberemos atravesar los dos ríos, pasando primero por grados crecientes de etanol – deshidratación – y luego por xilol – aclaramiento, como marca la flecha ascendente.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
MEDIO GRASO
MEDIO ACUOSO
XILOL
100% ETANOL 96%
80%
70%
60%
1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
2. FIJACIÓN
5. INFILTRACIÓN
6. INCLUSIÓN
7. CORTE
3. DESHIDRATACIÓN EN
ALCOHOLES DE
GRADOS CRECIENTES
4. ACLARAMIENTO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
MEDIO GRASO
MEDIO ACUOSO
XILOL
100% ETANOL 96%
80%
70%
60%
1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
2. FIJACIÓN
5. INFILTRACIÓN
6. INCLUSIÓN
7. CORTE
3. DESHIDRATACIÓN EN
ALCOHOLES DE
GRADOS CRECIENTES
4. ACLARAMIENTO
• Nuestra siguiente meta es la tinción. Pero ésta ocurre en medio acuoso. Por lo que deberemos cruzar de nueva cuenta los dos ríos, pero ahora en sentido inverso. Aclaramiento y la hidratación en etanol en grados decrecientes. Como marca la flecha descendente.
8. TINCIÓN (H Y E)
8. ACLARAMIENTO
9. HIDRATACIÓN EN
ALCOHOLES DE
GRADOS DECRECIENTES
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
MEDIO GRASO
MEDIO ACUOSO
XILOL
100% ETANOL 96%
80%
70%
60%
1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
2. FIJACIÓN
5. INFILTRACIÓN
6. INCLUSIÓN
7. CORTE
3. DESHIDRATACIÓN EN
ALCOHOLES DE
GRADOS CRECIENTES
4. ACLARAMIENTO
• Por último, para el montaje que ocurre en medio graso, deberemos de nueva cuenta pasar al medio acuoso. Deshidratación en etanol en grados crecientes y aclaramiento, como marca la segunda flecha ascendente.
10. TINCIÓN (H Y E)
8. ACLARAMIENTO
9. HIDRATACIÓN EN
ALCOHOLES DE
GRADOS DECRECIENTES
11. DESHIDRATACIÓN
EN ALCOHOLES DE
GRADOS CRECIENTES
12. ACLARAMIENTO
13. MONTAJE
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
MEDIO GRASO
MEDIO ACUOSO
XILOL
100% ETANOL 96%
80%
70%
60%
1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
2. FIJACIÓN
5. INFILTRACIÓN
6. INCLUSIÓN
7. CORTE
3. DESHIDRATACIÓN
4. ACLARAMIENTO
• Le recomendamos repasar los pasos de la técnica histológica relacionados con el esquema, de modo que trate de memorizar un gráfico, más que un texto.
• Note que las tres flechas – ascendente, descendente y ascendente – marcan la secuencia de procedimientos.
10. TINCIÓN (H Y E)
8. ACLARAMIENTO
9. HIDRATACIÓN 11. DESHIDRATACIÓN
12. ACLARAMIENTO
13. MONTAJE
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• El resumen mínimo de este procedimiento se constituye por 3 flechas
• La primera flecha ya fue revisada. Incluye los pasos que van desde la obtención de la muestra, fijación, deshidratación, aclaramiento, infiltración e inclusión y corte.
• Nos habíamos quedado en la etapa en que poníamos numerosas laminillas con cortes de parafina en una canastilla.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• En el laboratorio de histología, los técnicos han dispuesto una serie de frascos de vidrio que contienen las soluciones necesarias para llevar a cabo las flechas 2 y 3 del esquema – descendente y ascendente.
• A esta disposición en fila, también se le conoce como “en batería”. Por eso, el técnico llama a este arreglo: batería de tinciones.
• Vamos ahora a identificar las soluciones.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
El técnico va pasando la rejilla con
laminillas por las distintas soluciones. El técnico sumerge las laminillas en el
colorante hematoxilina.
Aquí vemos dos rejillas con
numerosos cortes que ya están
teñidos.
El técnico pone resina sobre el corte
para terminar el paso del montaje.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• El resultado final de todo este proceso es una preparación histológica de acuerdo con los principios de la técnica histológica ordinaria.
• Esta laminilla puede ser estudiada con un microscopio fotónico compuesto de iluminación común, como el que tenemos en nuestros laboratorios que equivale al o los que se encuentran en la mayoría de los laboratorios del mundo.
• En su interior se encuentra un corte o rebanada de tejido muy delgada – en el caso de la imagen mostrada, de 5 micrómetros – que puede ser estudiada al momento o muchos años después.
EL PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Ya hemos mencionado que la técnica histológica ordinaria se define al cumplir tres requisitos esenciales:
A) Fijación en formol al 10%
B) Inclusión en parafina
C) Tinción con hematoxilina y eosina
• La gran mayoría de las muestras obtenidas a partir de nuestros pacientes en los hospitales, se fijan originalmente en formol al 10% y pasan a procesamiento histológico hasta inclusión en parafina y obtención de cortes de 4 a 8 micrómetros; los que finalmente se tiñen con hematoxilina y eosina (H y E).
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La tinción con hematoxilina y eosina emplea dos colorantes por lo que constituye una técnica bicrómica.
• La hematoxilina es un compuesto que se obtiene a partir de la planta leguminosa Haematoxilum campechianum conocida como palo de Campeche.
• Es nativo de México, particularmente del estado de Yucatán, aunque se encuentra también en Guatemala y Belice.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La hematoxilina es un producto natural que al oxidarse produce una sustancia de color morado obscuro conocida como hemateína.
• Para aumentar la eficacia de la coloración, la hematoxilina debe combinarse con iones metálicos como hierro o aluminio que funcionan como mordentes, o sea, favorecedores de la tinción.
• En los textos de histotecnología se relata una gran variedad de mezclas de hematoxilina, algunas con hierro y otras con aluminio.
• La más comunmente empleada es la llamada hematoxilina de Harris que incluye aluminio en sus componentes.
• NOTA: Fue en 1880 que Wilhelm Waldeyer introdujo el empleo de la hematoxilina en las tinciones histológicas.
• La hematoxilina de Harris, al igual que la mayoría de las otras mezclas de hematoxilina, se comporta como una sustancia básica.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La eosina es una sustancia que resulta de la acción del bromo sobre la fluoresceína. El resultado es un polvo rojo que se usa ampliamente como colorante en la industria textil y en las técnicas histológicas.
• Existen al menos dos variantes de eosina, la eosina Y amarilla y la eosina B azul.
• La más empleada en las técnicas histológicas es la eosina Y amarilla. En general la eosina es un compuesto ácido.
• En conclusión, la hematoxilina es morada y básica; mientras que la eosina es rosa a rojo y ácida.
• Estas características son fundamentales para comprender los resultados tintoriales de la técnica de H y E.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Como recordamos, un tejido está constituido por dos elementos fundamentales: células y sustancias intercelulares.
• Aceptando que la sustancia intercelular más común y fácilmente identificable es la colágena, podríamos plantear un dibujo muy esquemático de un tejido de la siguiente manera.
• En el dibujo podemos identificar una célula más o menos cuadrada con su núcleo redondo en el centro. Junto a la célula tenemos una fibra de colágena representada por una barra rectangular.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Si bien las proteínas en general pueden comportarse como bases o como ácidos, la mayor parte de ellas cuando son sometidas al procesamiento histológico se comportan como bases.
• Dado que la colágena – sustancia intercelular – es una proteína, se comporta generalmente como base.
• El citoplasma celular contiene grandes cantidades de proteínas, por lo que también se comporta como base.
• El núcleo celular, por otro lado, tiene grandes cantidades de ácidos nucléicos, por lo que su comportamiento general es ácido.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
ÁCIDO
BASE
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Debemos recordar que de acuerdo con el Dr. Johannes Nicolaus Brønsted (1879-1947), los ácidos son donadores de protones y las bases o alcális, son aceptores de protones.
• Cuando una molécula dona un protón – comportamiento ácido – pierde una carga positiva, por lo que queda con carga negativa.
• De este modo, un ácido tiene carga negativa y una base, carga positiva.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
- -
- -
- ÁCIDO BASE
CARGA NEGATIVA CARGA POSITIVA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Como sabemos bien: cargas del mismo signo se repelen, mientras que cargas de signos contrarios se atraen.
• De este modo, las estructuras tisulares que tienen comportamiento ácido, como es el caso de los ácidos nucléicos que fundamentalmente se encuentran en el núcleo, mostrarán afinidad o apetencia por sustancias básicas. A esta afinidad se le conoce como basofilia.
• Así, el núcleo celular resulta ser basófilo por lo que “atrae” al colorante básico que es la hematoxilina. Dado que la hematoxilina es morada, entonces los núcleos se verán morados.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Hemos dicho que las proteínas generalmente se comportan como bases. Por lo tanto tendrán afinidad por las sustancias ácidas, propiedad que conocemos como acidofilia.
• Dado que la eosina es un colorante ácido, entonces todos los componentes tisulares ricos en proteínas como es el caso de la mayor parte de los citoplasmas y el caso de la colágena, serán acidófilos por lo que se teñirán con la eosina que les imparte un tinte rosado.
• De este modo, tenemos el contraste fundamental de la tinción con H y E; los núcleos se ven morados y el citoplasma rosa al igual que la colágena.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Un caso particular de la tinción con H y E lo constituyen los eritrocitos.
• Los eritrocitos humanos son células que normalmente no tienen núcleo. Su citoplasma tiene grandes cantidades de una proteína muy importante que conocemos como hemoglobina. Es tan notable la cantidad de esta proteína en los eritrocitos que en vez de verse rosa, se ven con tinte rojo escarlata.
• En los cortes histológicos teñidos con H y E se identifican como estructuras redondeadas – sin núcleo – de color rojo brillante y con una zona central más pálida.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La gran mayoría de los campos microscópicos teñidos con H y E que revisemos, siguen las reglas de tinción aquí señaladas.
• Sin embargo, también es posible encontrarnos células que muestren basofilia en el citoplasma.
• Esto se debe a la presencia de ribosomas. Como ya mencionamos, los ribosomas son organelos constituidos por ARN y proteínas que se encargan de la síntesis de proteínas.
• Por lo tanto, la presencia de basofilia citoplásmica nos representa que esa célula está sintetizando grandes cantidades de proteínas.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
CÉLULA SIN BASOFILIA CITOPLÁSMICA CÉLULA CON BASOFILIA CITOPLÁSMICA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• De este modo podemos apreciar que la tinción con H y E no sólo nos da un buen contraste del detalle celular, sino que además nos permite establecer inferencias funcionales.
• Las células con basofilia citoplásmica tienen una mayor actividad de síntesis (anabólica) que las células sin basofilia citoplásmica.
• Ahora sí estamos listos para estudiar algunos campos microscópicos teñidos con H y E.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
CÉLULA SIN BASOFILIA CITOPLÁSMICA
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS MODERADA
CÉLULA CON BASOFILIA CITOPLÁSMICA
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS INTENSA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Observe detenidamente la imagen. Note el detalle de los núcleos celulares teñidos de morado con la hematoxilina. Observe el contraste de los núcleos con el citoplasma rosado. Este es un corte de hígado. En el centro de la imagen tenemos a un hepatocito – célula del hígado – que le está haciendo “ojitos”.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Aquí tenemos otra preciosa imagen de hígado teñida con H y E. De nuevo, note el contraste entre los núcleos y los citoplasmas. En el núcleo del centro se identifica claramente un gran nucléolo.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
En este corte, de nuevo notamos el contraste entre los núcleos y los citoplasmas. Las zonas más pálidas corresponden a tejido conjuntivo de la dermis. Las zonas más obscuras, corresponden a tejido epitelial de la epidermis.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
En este corte de páncreas, usted puede identificar claramente los núcleos. Pero ahora es posible notar que los citoplasmas tienen una zona basófila (presencia de abundantes ribosomas. flechas amarillas) y otra zona acidófila (presencia de abundantes proteínas. Flechas rojas).
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
En algunas células como estas (células plasmáticas) el citoplasma, además de mostrar basofilia intensa, permite identificar una zona clara perinuclear que corresponde al aparato de Golgi. Por eso a esta imagen clara sobre fondo basófilo, se le conoce como imagen negativa de Golgi.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La técnica histológica ordinaria tiene muchas ventajas en términos de costo y de identificacion de detalles de estructuras celulares y tisulares.
• Sin embargo, como todo, tiene sus limitantes. Es importante conocerlas entre otras razones, porque en algunos casos tiene relevancia en el estudio de pacientes.
• Las limitantes de la técnica histológica ordinaria se basan esencialmente en la naturaleza del propio proceso.
• El paso de la deshidratación elimina el contenido de agua del tejido y el paso del aclaramiento, elimina en gran medida las grasas neutras.
• También es posible que el procesamiento elimine del tejido grandes cantidades de carbohidratos complejos, entre los que sobresale el moco producido por las glándulas.
• Esto condiciona que en las zonas del citoplasma donde se encuentren estas sustancias – agua, grasa o moco – se identifiquen espacios vacíos, que dado que usamos luz blanca para ver con el microscopio, se ven blancos.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La traducción práctica de esta circunstancia es que, cuando veamos huecos claros en el citoplasma, es posible que hayan estado ocupados in vivo por grasa, moco o agua.
• En general, el principal reservorio de grasas neutras en los tejidos se constituye por el tejido adiposo.
• Las células del tejido adiposo pueden tener una gran gota de grasa en el citoplasma, tan grande que desplaza a todos los órganos hacia la periferia, dándole a la célula una forma que “mi amigo el histólogo” ha comparado con un anillo de sello.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Si ponemos juntos muchos adipocitos – células del tejido adiposo – el aspecto general es el de una reja conformada por numerosas estructuras redondeadas con huecos claros, apiladas entre sí.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Existen variantes sobre el tema de grasa en gotas o inclusiones citoplásmicas.
• En primer lugar debemos mencionar a la llamada grasa parda. En este tipo de tejido adiposo, las células tienen muchas gotitas de lípidos, no sólo una. El aspecto que adquiere el adipocito es el de una célula multivacuolar. De hecho, se conoce también como adipocito multilocular en contraposición con los adipocitos uniloculares que ya vimos.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
ADIPOCITO
UNILOCULAR ADIPOCITO
MULTILOCULAR
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• El aspecto de célula con numerosos huecos claros en el citoplasma, que se observa en los adipocitos multiloculares de la grasa parda, es compartido por otros tipos celulares. Un ejemplo se encuentra en la corteza suprarrenal, que en su capa media tiene células llamadas espongiocitos con numerosas gotitas de lípido citoplásmico. El tercer ejemplo se encuentra en las células de glándulas de la piel llamadas sebáceas.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
ADIPOCITO
MULTILOCULAR ESPONGIOCITO
CÉLULA DE
GLÁNDULA
SEBÁCEA
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
•
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
CORTEZA SUPRARRENAL. LA CAPA MEDIA TIENE CÉLULAS
CUYO CITOPLASMA SE APRECIA CLARO Y ESTÁN DISTRIBUIDOS
EN CORDONES. SON LOS ESPONGIOCITOS.
GRASA PARDA. NUMEROSOS ADIPOCITOS MULTILOCULARES
QUE SE ENCUENTRAN ALTERNANDO CON OTROS
UNILOCULARES EN ARREGLOS EN CONGLOMERADOS.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
•
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
GLÁNDULA SEBÁCEA EN PIEL HUMANA. NOTE QUE DESDE BAJOS AUMENTOS, LA
GLÁNDULA SE VE PÁLIDA. A GRANDES AUMENTOS – RECUADRO – SE APRECIA EL
ASPECTO CITOPLÁSMICO CON NUMEROSAS GOTITAS DE LÍPIDO.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• La gran mayoría de las glándulas producen secreciones ricas en carbohidratos complejos que conocemos comunmente como moco.
• El procesamiento histológico elimina en gran medida el moco de los tejidos y el que queda, debido a sus características químicas, no se tiñe intensamente con H y E, por lo que las células que contienen moco en su citoplasma muestran también un citoplasma claro.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
• Aquí observamos el aspecto de la célula mucoproductora más famosa: la célula caliciforme. Note que la porción superior del citoplasma se encuentra completamente llena por numerosos gránulos de moco que con H y E se ven claros. Note que el resto del citoplasma se encuentra adelgazado hacia la periferia de modo que el núcleo queda rechazado hacia la porción basal de la célula.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• Con bajos aumentos, el aspecto de las células caliciformes es muy característico. Se observan como “bolas blancas” en estrecha relación con otras células, en el caso de la imagen, de intestino.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Aquí observamos otros ejemplos de células productoras de moco cuyo citoplasma muestra un aspecto claro con la tinción con H y E.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
LAS CÉLULAS DEL EPITELIO SUPERFICIAL DEL ESTÓMAGO,
MUESTRAN LA PORCIÓN SUPERIOR CON ABUNDANTE MOCO, DE
MODO QUE SE APRECIA CLARA.
LAS CÉLULAS DE CITOPLASMA MÁS CLARO, CORRESPONDEN A
CÉLULAS MUCOPRODUCTORAS DE UNA GLÁNDULA MUCOSA.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• El glucógeno es un polímero de glucosa de alto peso molecular que se almacena principalmente en el hígado y en el músculo.
• Las células de los epitelios escamosos – planos estratificados con o sin estrato córneo – de mucosas, normalmente almacenan grandes cantidades de glucógeno citoplásmico. Por esta razón suelen mostrar un citoplasma claro, como si estuviera vacío.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• En conclusión, cuando identifiquemos huecos claros en el citoplasma de una célula, las posibilidades son:
A) Agua
B) Carbohidratos
C) Grasa
• Los huecos claros citoplásmicos relacionados con presencia de agua, se observan sólo en condiciones patológicas de lesión celular. Recuerde lo comentado sobre el edema celular.
• Los carbohidratos intracitoplásmicos que se manifiestan como huecos blancos pueden ser de dos tipos fundamentales:
a) Glucógeno
b) Moco
• Los lípidos intracitoplásmicos que forman huecos blancos pueden encontrarse en los adipocitos – uni y multiloculares – y en las glándulas sebáceas de la piel.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
• De este modo terminamos la revisión básica de los conceptos relacionados con la técnica histológica ordinaria (THO).
• Es necesario que ahora el alumno repase imágenes de campos microscópicos para que aprenda a identificar una tinción de H y E.
• Debe quedarnos claro que la tinción bicrómica de H y E puede realizarse en cortes obtenidos por congelación. En este caso, desde luego, ya no es técnica histológica ordinaria; se trata de una técnica histológica especial.
• Recuerde que para ser THO se deben cumplir los tres criterios.
• Por último, para resolver las limitantes que nos plantea la THO, existen numerosas técnicas histológicas especiales…
• Pero, esa es otra historia y será contada en otra ocasión.
LA TÉCNICA HISTOLÓGICA ORDINARIA (THO)
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Histología Médica. Las Técnicas Histológicas.
Departamento de Biología Celular y Tisular
Enrique A. Sampedro Carrillo.
Médico especialista en Anatomía Patológica
Técnicas histológicas
especiales
Técnicas histológicas especiales.
• Debemos recordar que la técnica histológica ordinaria se define por tres características esenciales:
a) Fijación en formol al 10%
b) Inclusión en parafina
c) Tinción con hematoxilina y eosina
• De este modo, las técnicas histológicas especiales quedan definidas como todas aquéllas que no cumplan al 100% con estos requisitos.
Técnicas histológicas especiales.
• Existen muchas maneras de clasificar a las técnicas histológicas especiales, aquí presentamos un esquema simplificado:
Técnicas histológicas especiales
1. THE de primer orden
a) Tinciones b) Histoquímica c) Impregnaciones metálicas
2. THE de segundo orden
a) Microscopia electrónica b) Inmunológicas c) Biología molecular
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• Podemos dividir a las tinciones en dos grandes grupos:
a) Metacromáticas
b) Ortocromáticas
• La gran mayoría de las tinciones son ortocromáticas (color correcto). Esto significa que el color que imparten es el mismo que el color que tienen.
• Un colorante azul, tiñe de azul a varias estructuras.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• En el caso de las tinciones metacromáticas, ocurre que el colorante tiene un color “x”, por ejemplo, azul y las estructuras coloreadas adquieren un color distinto “y”, por ejemplo rojo.
• Esto se debe a que las moléculas de los colorantes metacromáticos, normalmente se encuentran separadas en solución, pero cuando se juntan o polimerizan, adquieren un color distinto.
Moléculas de colorante
en solución (monómeros)
Moléculas de colorante
polimerizadas en el tejido
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• Las estructuras tisulares que son metacromáticas tienen en común en formar polímeros regulares, esto es, con moléculas muy similares entre sí.
• En este grupo se incluye a los mucopolisacáridos conocidos también como glucosaminoglucanos.
• Debido a que la matriz del cartílago es muy rica en glucosaminoglucanos, resulta que el cartílago es metacromático.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• En los tejidos conjuntivos se encuentra un tipo de célula que se caracteriza por poseer numerosos gránulos de secreción en el citoplasma.
• Estos gránulos contienen sustancias reguladoras asociadas con los fenómenos alérgicos.
• Entre estas, se encuentra un tipo especial de glucosaminogucano que se denomina heparina.
• Por esta razón, los gránulos de estas células que se conocen como mastocitos o células cebadas, son metacromáticos.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• En la práctica médica existen condiciones diversas en las que el número normal de células cebadas se encuentra aumentado.
• La mayoría de estas condiciones conocidas globalmente como mastocitosis, se manifiestan con lesiones en la piel, por lo que suele ser necesario el estudio de una biopsia.
• Para identificar a las células cebadas se emplean rutinariamente tinciones metacromáticas como el azul de toluidina.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• En la
Biopsia de piel de paciente con
mastocitosis teñida con HE.
Células cebadas indetificadas
por la metacromasia de sus
gránulos. Azul de toluidina.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• Para fines prácticos, podemos afirmar que todas las demás tinciones se basan en el empleo de colorantes ortocromáticos.
• En general las tinciones especiales están diseñadas de modo que permitan la identificación de estructuras que no se ven claramente con hematoxilina y eosina.
• Dado que la THO ordinaria emplea dos colorantes, se dice que hematoxilina y eosina es una técnica bicrómica.
• Así, una manera de aumentar el detalle, consiste en aumentar el número de colorantes empleados.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• Las tinciones que emplean más de dos colorantes se pueden llamar policrómicas, de las que la combinación más común es con tres colorantes, por lo que tenemos el grupo de los tricrómicos.
• El histólogo cuenta con un extenso arsenal de tinciones tricrómicas; aquí sólo revisaremos de manera superficial los más comunes:
a) Tricrómico de Masson
b) Tricrómico de Gallego
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Tricrómico de Masson
• Esta técnica tintorial es una de las más frecuentemente usadas en la práctica médica.
• Se debe a uno de los patólogos más famosos y notables que haya existido: el Dr. Pierre Masson.
Dr. Pierre Masson. 1880-
1959
• El azul de anilina que se emplea en esta técnica, tiñe de manera específica a la colágena.
• De esta manera es posible diferenciarla del músculo.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• Con el tricrómico de Masson, la colágena se aprecia en azul, los citoplasmas epiteliales y musculares en rojo escarlata y los núcleos en negro.
Corte de lengua teñido con Masson. En azul se observa la colágena
y en rojo se identifican epitelio y músculo.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• La identificación más o menos específica de la colágena en la práctica médica tiene relevancia en casos de lesión hepática.
• En algunas ocasiones las células del hígado no sobreviven y mueren. Como resultado, el organismo “intenta llenar el hueco” pero desafortunadamente no lo hace con nuevos hepatocitos, sino con tejido conjuntivo rico en colágena.
• A esta fibrosis del hígado asociada con muerte de hepatocitos se le conoce como cirrosis.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• La cirrosis puede ser el resultado de la lesión hepática debida a numerosos factores entre los que sobresalen: por etanol y por virus.
• Si bien la cirrosis es irreversible, en muchos casos el tratamiento antiviral evita la progresión de estos cambios, por lo que el médico debe tener una idea clara de dicha evolución verificando la cantidad de colágena – extensión de la lesión – en el hígado del paciente.
• En estos casos, el tricrómico de Masson resulta particularmente útil.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
• Hígado con intensa fibrosis demostrada con Masson.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Tricrómico de Gallego
• Desarrollada originalmente por don Abelardo Gallego, ilustre histólogo español.
• Los tejidos muestran núcleos en color rojo, la colágena en verde y los citoplasmas, como los del músculo en amarillo.
• El resultado es un predominio de tintes verdes en la imagen.
• La técnica fue posteriormente modificada por el Dr. Alfonso Reyes Mota. Dr. Abelardo Gallego
1879-1930
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Tricrómico de Gallego
• La técnica original de Gallego permite diferenciar las fibras elásticas en un color magenta obscuro.
• El Dr. Alfonso Reyes-Mota cambió el mordente con lo que resultó que ahora las fibras elásticas se identifican en color rojo brillante, mucho más fácil de diferenciar de otras estructuras.
Dr. Alfonso Reyes-Mota
1912-1974
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Tricrómico de Gallego
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Tricrómico de Gallego
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Tricrómico de Gallego
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Tricrómico de Gallego
• La técnica tricrómica de Gallego modificada por Reyes-Mota, además de los contrastes ya mencionados, permite identificar de manera muy clara a las fibras elásticas en un color rojo brillante.
Pared de la aorta Cartílago elástico
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Técnicas de Romanowsky • En 1891, Ernst Malachowsky y Dimitry Leonidovich Romanowsky
desarrollaron técnicas tintoriales con una mezcla de eosina y azul de metileno modificado.
• La mezcla resultante daba un tercer color inesperado de tinte púrpura, con lo que el contraste era tricrómico a pesar de sólo emplear dos colorantes.
• Estas técnicas fueron mejoradas por los doctores James Homer Wrigth y Gustav Giemsa.
Ernst Malachowsky
(1857-1934)
D.L. Romanowsky
(1861-1921)
Dr. J.H. Wright
(1869-1928) Dr. G. Giemsa
(1867-1948)
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Técnicas de Romanowsky
• Las técnicas tintoriales de Wright y de Giemsa se emplean de manera rutinaria para el estudio de extendidos o frotis de sangre y de médula ósea.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Técnicas de Romanowsky
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Técnica de Papanicolaou • En 1928, en una conferencia médica en Battle Creek, Michigan, el Dr.
Georgios Nicholas Papanikolaou, patólogo de origen griego, presentó a la comunidad científica un trabajo en el que se describía un procedimiento sencillo, reproducible y de bajo costo para la detección del cáncer del cérvix uterino.
• Para variar “la comunidad científica” restó importancia a este trabajo y no fue hasta el año de 1943, tras la publicación junto con el Dr. Herbert Traut, del libro Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear, que se le empezó a dar importancia.
Dr. George Papanicolaou
(1883-1962)
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Técnica de Papanicolaou • La técnica de obtención de la muestra por raspado de la superficie de
transición cervical, permite el estudio de las células epiteliales que normalmente se descaman – citología exfoliativa – que después de ser sometidas a un extendido en un portaobjetos, pueden fijarse y teñirse con el colorante de Papanicolaou.
• Con este procedimiento se pueden estudiar las variaciones hormonales del epitelio genital femenino, los microorganismos que le infectan y se pueden identificar tempranamente los cambios precursores de cáncer.
Técnicas histológicas especiales. Tinciones
Técnica de Papanicolaou
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
• Las técnicas de histoquímica se dividen en dos grandes grupos:
a) Histoquímica simple
b) Histoquímica enzimática
• El criterio de división es muy simple, en un caso participan enzimas y en el otro no.
• Las técnicas de histoquímica simple se han dividido de acuerdo con los grupos moleculares que hacen evidentes.
• Así, hay técnicas para lípidos, para carbohidratos y para ácidos nucléicos.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• Posiblemente la técnica más famosa en este grupo es la que se conoce como P.A.S.
• El término corresponde a las siglas para: periodic acid Schiff.
• El corte de parafina se somete a la acción del ácido peryódico que rompe de manera específica un enlace en las unidades de monosacáridos de un carbohidrato, liberando así grupos aldehídos.
• Posteriormente se agrega el reactivo de Schiff o leucofucsina, que originalmente es cristalino y al contacto con grupos aldehído adquiere un tono magenta.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• La técnica de P.A.S. nos permite identificar carbohidratos, pero no nos dice específicamente de qué carbohidrato se trata.
• En esta técnica se emplea hematoxilina, por lo que los núcleos se tiñen de morado.
• Debido a que normalmente el citoplasma celular posee cierta cantidad de carbohidratos, los citoplasmas observados con P.A.S. muestran un ligero tinte rosado, por lo que no sería difícil que el principiante confunda un corte teñido con H y E con un teñido con P.A.S.
• Para evitar este problema debemos fijarnos en dos cosas: la presencia de estructuras con muchos carbohidratos que se aprecian magenta intenso y el tinte de los eritrocitos, que con P.A.S. se ven pálidos y con H y E se ven rojo brillante.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
Corte de intestino delgado teñido con P.A.S. Note las bolitas rojo-magenta que
corresponden a células productoras de moco (carbohidratos complejos) que se
conocen como células caliciformes.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
Corte de intestino delgado teñido con P.A.S. Note las células caliciformes y los
núcleos morados que recuerdan el aspecto del H y E. Observe la presencia de
eritrocitos rosados señalados con la flechas amarillas.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
Observe detenidamente las diferencias y semejanzas entre el aspecto del corte
superior teñido con H y E y el corte inferior, teñido con P.A.S.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• En la práctica médica, la técnica de PA.S. resulta útil en las siguientes circunstancias:
a) Identificación de células mucoproductoras en neoplasias malignas poco diferenciadas.
b) Identificación de alteraciones en membranas basales. Este detalle puede apreciarse en particular en el caso de las biopsias de riñón.
Carcinoma mucosecretor identificado
por la reacción positiva con P.A.S.
Glomérulo renal que muestra el detalle
de la membrana basal con P.A.S.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• Una variante de la técnica de P.A.S se emplea frecuentemente en la práctica médica con el fin de identificar de manera específica a un tipo particular de carbohidrato: el glucógeno.
• El glucógeno es una macromolécula polimérica cuyo monómero es la glucosa.
• La prueba se conoce como P.A.S. con diastasa y se basa en la capacidad que tiene esta enzima, también conocida como alfa-amilasa, para despolimerizar y por lo tanto deshacer el glucógeno.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• Si en un corte histológico sospechamos que se encuentra un agregado de glucógeno, lo primero que hacemos es un corte con P.A.S que dará reacción positiva dado que se trata de un carbohidrato.
• Enseguida tomamos otro corte del mismo bloque de parafina y antes de someterlo a la técnica de P.A.S., lo dejamos expuesto a la acción de la diastasa.
• Si la estructura problema SÍ ES glucógeno, entonces se disolverá por efecto de la diastasa y por lo tanto, no habrá reacción positiva para P.A.S, dejando un hueco que representa el sitio donde estaba la macromolécula.
• Si por otro lado, NO ES glucógeno, entonces no sufrirá el efecto de la diastasa, por lo que SÍ habrá reacción positiva para P.A.S.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
Corte histológico con
estructura P.A.S. positiva
Nuevo corte histológico
del mismo bloque
Aplicación de
diastasa
Realización de la
técnica de P.A.S.
Si la reacción P.A.S.
positiva se mantiene,
entonces NO ES
GLUCÓGENO
Si la reacción P.A.S.
positiva se pierde,
entonces SÍ ES
GLUCÓGENO
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• Un detalle curioso de la técnica de P.A.S. con diastasa reside en el hecho de que la identificación del glucógeno es negativa.
• Esta técnica se emplea de manera rutinaria en el estudio de biopsias de hígado.
Biopsia de hígado contrastada
con el método de P.A.S. con
diastasa. Se identifican células
con citoplasma P.A.S. positivo
resistente a la diastasa, por lo
que su contenido NO ES
GLUCÓGENO. Se trata de los
macrófagos del hígado.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• Existe una técnica especial para la demostración directa y positiva del glucógeno, se trata del carmín de Best.
• Desafortunadamente no es una técnica comúnmente empleada en los hospitales.
Demostración de glucógeno en
hígado de rata por medio de la
técnica de carmín de Best. La
imagen de la izquierda es de
una rata que estaba en ayuno y
la de la derecha, de una rata
bien alimentada. El glucógeno
se aprecia como numerosos
puntos rojos en el citoplasma de
los hepatocitos.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• En algunos casos es importante determinar si los carbohidratos que hacemos evidentes con la técnica de P.A.S. corresponden al grupo de las mucinas.
• Es importante recordar que las mucinas son una familia de glucoproteínas, es decir, moléculas formadas por proteína que contienen grandes cantidades de carbohidratos.
• Las mucinas constituyen elementos secretorios de células epiteliales glandulares.
• Una de las técnicas de histoquímica que permite identificar claramente mucinas es la conocida como mucicarmín de Mayer.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
Glándula salival teñida con mucicarmín de Mayer. En amarillo se aprecian los
conductos glandulares, las células serosas en color pardo y en rosa, las
mucoproductoras.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para carbohidratos.
• En el caso de que sea importante diferenciar entre mucinas neutras y mucinas ácidas, podemos emplear la técnica de azul alciano en pH ácido.
En este corte teñido con azul
alciano, el moco alcalino de las
células normales del estómago
se aprecia rosa pálido, mientras
que la mucina ácida de las
células caliciformes que
normalmente se encuentran en
el intestino, se aprecia azul.
Este hallazgo permite confirmar
el diagnóstico de esófago de
Barrett.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para ácidos nucléicos.
• La técnica de Feulgen permite la identificación específica del ADN.
• El principio histoquímico de esta técnica es el mismo que el descrito en la técnica de P.A.S. con la diferencia de que en vez de emplear ácido peryódico para liberar aldehídos de los carbohidratos, se emplea ácido clorhídrico.
• El HCl libera aldehídos exclusivamente a partir de un azúcar específico que resulta ser la desoxirribosa.
• Dado que la desoxirribosa solamente se encuentra en el ADN, la aplicación posterior del reactivo de Schiff demuestra la presencia de este tipo de ácido nucléico.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para ácidos nucléicos.
• La técnica de Feulgen nos permite apreciar el detalle de los cromosomas en las distintas etapas de la división celular.
• Debe quedar claro que se trata en este caso sólo de un aspecto académico y no diagnóstico, ya que las figuras de mitosis se pueden apreciar con H y E.
Cortes de raíz de lirio contrastados con la técnica de Feulgen. Note el detalle de
los cromosomas en metafase y en anafase.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para ácidos nucléicos.
• En la práctica médica, también es posible identificar de manera específica a los cromosomas con técnica de procesamiento especial.
• Una vez identificados, se pueden ordenar formando lo que conocemos como cariotipo.
Cromosomas humanos obtenidos a partir de linfocitos y extendidos en una
laminilla que se identifican específicamente con la técnica de Feulgen.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para ácidos nucléicos.
• Uno de los criterios de evaluación de la agresividad de las neoplasias es la cantidad de figuras de mitosis apreciables con H y E.
• Se supone que en la medida en que más figuras de mitosis encontremos, el tumor se reproduce más y por lo tanto el pronóstico del paciente es más reservado, por lo que deberemos contemplar la posibilidad de un tratamiento más agresivo.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para ácidos nucléicos.
• Desafortunadamente ocurre en en muchos casos, el tumor muestra un alto nivel de reproducción, pero los cortes histológicos no muestran figuras de mitosis.
• Debemos saber que normalmente, las células, cuando van a iniciar el proceso de división celular, lo primero que hacen es duplicar su ADN.
• Por lo tanto, si pudiéramos saber cuántas células en el tumor tienen el doble de material genético – han pasado la llamada etapa S del ciclo celular – entonces tendríamos una estimación más exacta que el conteo de mitosis, sobre las células que están reproduciéndose.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para ácidos nucléicos.
• De este modo, se obtiene un corte histológico del tumor problema en estudio y se contrasta con la técnica de Feulgen.
• La laminilla se pasa a un sistema de análisis por computadora que tiene la capacidad de medir exactamente la cantidad de ADN por núcleo celular.
• El resultado se expresa en gráficos de fácil interpretación.
• Este sistema conocido como citometría estática permite además obtener un estimado de la ploidía de las células del tumor, de modo que podemos saber exactamente cuántas son diploides, poliploides o en su caso aneuploides.
• La citometría estática tiene aplicaciones fundamentalmente en el estudio de neoplasias malignas.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para ácidos nucléicos.
Equipo de citometría estática con el
microscopio, el sistema de captura de imágenes
y las computadoras encargadas del análisis.
Gráfico de contenido de ADN que nos da un
estimado de la cantidad de células que se
encuentran en las distintas etapas del ciclo
celular
Corte de un tumor teñido con Feulgen que
resulta ser la base de este estudio.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para lípidos.
• Estas técnicas ya casi no se usan con fines diagnósticos, debido a que han sido superadas por las técnicas de inmunohistoquímica.
• Cuando queremos estudiar el contenido de grasas de un tejido, es importante recordar que el procesamiento histológico suele eliminar el contenido lipídico del corte, por lo que cuando vemos una sección de tejido adiposo con H y E, observamos huecos donde estaba la grasa.
• ¡¡¡NO SE TRATA DE QUE LA GRASA SE TIÑE DE BLANCO!!!
• Para mantener la grasa en el tejido será necesario obtener cortes por congelación, los que ahora se pueden contrastar con técnicas que colorean específicamente a los lípidos.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica simple para lípidos.
Tejido adiposo con técnica
histológica ordinaria. Se ha
perdido la grasa y sólo se
aprecian los huecos claros.
Tejido adiposo en cortes
congelados con técnicas para
grasa.
En negro, la tinción fue con osmio
y en rojo se empleó la tinción de
rojo oleoso.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica enzimática.
• Este es otro grupo de técnicas que va siendo cada vez menos utilizado en el diagnóstico médico.
• Las enzimas son catalizadores biológicos, esto es, que pueden acelerar reacciones.
• Como regla, las enzimas actúan de manera específica sobre moléculas que conocemos como sustrato.
• La interacción enzima – sustrato, tiene como resultado la generación de un producto específico.
• Frecuentemente las enzimas rompen a su sustrato dejando como producto los fragmentos del mencionado sustrato.
ENZIMA SUSTRATO PRODUCTOS
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica enzimática.
• Una vez ocurrida la reacción enzimática se agrega una sustancia que al combinarse con el producto de la reacción adquiere color.
• A esta sustancia se le conoce como cromógeno.
ENZIMA SUSTRATO PRODUCTOS
SIN CONTRASTE POR LO TANTO
INVISIBLES
+ PRODUCTO CROMÓGENO
COMPLEJO
CON COLOR
CLARAMENTE
IDENTIFICABLE
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica enzimática.
• Con este procedimiento, los histólogos identificaron la presencia de numerosas enzimas en numerosas regiones tisulares.
• Sin embargo, la técnica tiene numerosos inconvenientes prácticos, por lo que fue muy difícil aplicarla en los hospitales con fines diagnósticos.
• En la actualidad tiene aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades primarias del músculo esquelético.
• Dado que la actividad enzimática se pierde en gran medida por el procesamiento rutinario, estas muestras requieren de la realización de cortes congelados.
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica enzimática.
Biopsia de músculo esquelético en corte por congelación que se procesó con la técnica
de histoquímica enzimática para la detección de la enzima ATPasa. Se pueden
distinguir al menos 3 tipos de fibras: las obscuras, las claras y las intermedias. Las
alteraciones en este patrón normal de distribución enzimática permiten realizar
diagnósticos en patología muscular
Técnicas histológicas especiales. Histoquímica
Histoquímica enzimática.
• La histoquímica enzimática para ATPasa, permite además la identificación – con fines de investigación y de enseñanza – de otras estructuras importantes como es el caso de las células de Langerhans y los canalículos biliares del hígado.
Células de Langerhans con ATPasa. Canalículos biliares con ATPasa
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• Los tejidos a estudiar se someten al efecto de sales metálicas, que frecuentemente son de oro y/o de plata.
• Las partículas metálicas quedan adheridas a la superficie de las células y/o estructuras tisulares inertes de la muestra en estudio.
• De modo que impregnación, es algo así como “cubrir por fuera”.
• Las impregnaciones clásicas que fueron las primeras en emplearse requieren de muchos y estrictos cuidados para su elaboración, por lo que no suelen usarse en los hospitales.
• Estas técnicas tienen un importante valor histórico y afectivo, en particular para los mexicanos, ya que se considera que provienen de la escuela cajaliana.
Impregnaciones metálicas.
• El más grande histólogo que pueda jamás imaginarse, fue un médico de pueblito llamado Santiago Ramón y Cajal.
• Sus estudios sobre la textura (tejidos) del sistema nervioso le valieron el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en el año de 1906.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• En la actualidad, las impregnaciones metálicas clásicas tienen nula aplicación en el diagnóstico médico y escasa en el campo de la investigación científica.
Las impregnaciones metálicas clásicas jugaron un papel determinante en la demostración de la
existencia celular de las neuronas. Aquí vemos una técnica que permite identificar el perfil de las
neuronas piramidales de la corteza cerebral humana. La secuencia: Cajal —- del Río Hortega —-
Costero, resultó fundamental en el desarrollo de la anatomía patológica y la histología mexicanas.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• En la actualidad, las impregnaciones metálicas clásicas tienen nula aplicación en el diagnóstico médico y escasa en el campo de la investigación científica.
Célula de Purkinje en el cerebelo. Astrocito fibroso con prolongaciones
en contacto con vasos sanguíneos.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• En la actualidad, las impregnaciones metálicas clásicas tienen nula aplicación en el diagnóstico médico y escasa en el campo de la investigación científica.
Numerosos astrocitos fibrososo asociados
con vasos sanguíneos.
Fibras reticulares en hígado
demostradas con la técnica de doble
impregnación de Pío del Río
Hortega.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• A partir de los conocimientos obtenidos por el desarrollo de las técnicas de impregnación metálica clásicas, los histotecnólogos han llegado a desarrollar técnicas más sencillas y fácilmente aplicables a cortes de parafina, por lo que su utilidad diagnóstica se ha mantenido hasta la fecha.
• A estas técnicas las conocemos como impregnaciones metálicas modernas.
• Una de las más empleadas se basa en los principios de la técnica de P.A.S. ya que se emplea ácido peryódico para liberar grupos aldehídos de moléculas de tipo carbohidrato.
• Esta técnica conocida como plata metenamina, con las variantes de Gomori o de Jones, se usa rutinariamente en el estudio de biopsias renales.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
Biopsia renal contrastada con la técnica de metenamina de plata de Gomori. Se
aprecian en negro las lineas que corresponden a las membranas basales, tanto de
túbulos renales como de los glomérulos. Las alteraciones en estos arreglos
normales, permiten realizar diagnósticos en la práctica médica.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
La técnica de Wilder, conocida comúnmente como “retículo”, se emplea
rutinariamente en el estudio de las biopsias de hígado con fines diagnósticos.
Permite identificar en cortes de parafina, el arreglo de las fibras reticulares.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• Dos conceptos importantes referidos a las impregnaciones metálicas modernas son:
a) ARGENTAFINIDAD
B) ARGIROFILIA
• Argentafinidad es un propiedad histoquímica por la que algunas sustancias tienen la capacidad de capturar la plata y reducirla de manera espontánea.
• Argirofilia es una propiedad histoquímica por la que algunas sustancias tienen la capacidad de capturar la plata, pero no la reducen espontáneamente. Es necesaria la aplicación de un agente reductor.
• La plata reducida se ve negra.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• En el humano existen varias sustancias argentafines y es necesario recordarlas.
SUSTANCIAS ARGENTAFINES
a) Melanina
b) Aminas biogénicas:
b.1. Serotonina
b.2. Catecolaminas (epinefrina y norepinefrina)
• Las técnicas de impregnación metálica modernas del tipo argentafín permiten la identificación de estas sustancias.
• La técnica argentafín más comúnmente empleada en el diagnóstico médico es la de Fontana-Masson.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
• Las sustancias argirófilas, son menos e incluyen a:
SUSTANCIAS ARGIRÓFILAS.
a) Fibras reticulares
b) Neuropéptidos. Con este término nos referimos a una familia amplia de glucoproteínas que se comportan como hormonas y que se encuentran en tejido nervioso y en epitelios neuroendocrinos.
• La técnica argirófila más frecuentemente empleada en la práctica médica es la de Grimelius.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
Piel humana contrastada con la técnica
de Fontana-Masson. Se identifican
claramente en negro los gránulos de
melanina en la epidermis.
Intestino delgado contrastado con la
técnica de Fontana-Masson. Se
identifican los gránulos negros de
aminas biogénicas (en este caso
corresponden a serotonina) en la base
de las células neuroendocrinas.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Impregnaciones metálicas.
Corte de apéndice cecal humano contrastado con la técnica de Grimelius. Se
aprecia el detalle de los gránulos citoplásmicos negros argirófilos de una
célula neuroendocrina.
Técnicas histológicas especiales. Impregnaciones
Técnicas histológicas especiales.
Conclusiones:
• Hasta aquí hemos revisado de manera superficial algunas de las técnicas histológicas especiales de primer orden.
• Conviene ahora al educando, revisar el material de nueva cuenta con un poco más de detenimiento.
• Es importante que sepamos de cada una de las técnicas revisadas:
a) Que existen
b) Para qué sirven
c) Cómo se identifican
• Recuerde que la mayoría de las técnicas aquí revisadas se emplean frecuentemente en la práctica médica con fines diagnósticos.
Técnicas histológicas especiales.
Resumen de las técnicas histológicas especiales de primer orden:
• Tinciones
a) Metacromáticas. Azul de toluidina
b) Ortocromáticas.
b.1. Tricrómicos: Masson, Gallego
b.2. Romanowsky: Wright, Giemsa
b.3. Papanicolaou
• Histoquímica
a) Simple
a.1. Para carbohidratos: P.A.S., P.A.S. con diastasa, carmín de Best, azul alciano
a.2. Para lípidos: Osmio, rojo oleoso
a.3. Para ácidos nucléicos: Feulgen
b) Enzimática
• Impregnaciones metálicas
a) Clásicas
b) Modernas: Metenamina de plata, Wilder, Fontana-Masson, Grimelius
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
• Las técnicas inmunológicas se basan en la especificidad que tienen los anticuerpos para unirse a diversos tipos de moléculas.
• Las sustancias a las que se unen los anticuerpos reciben el nombre genérico de antígenos.
• Podemos hacer antigénica a cualquier sustancia si la pasamos a un animal de otra especie.
• Por ejemplo, si aislamos insulina humana, que en una hormona protéica reguladora de la glucemia, y la inyectamos a un ratón; este animal reconoce como extraña a la insulina humana y produce anticuerpos de ratón anti-insulina humana.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
• Ahora aislamos estos anticuerpos y les agregamos una marca para poder identificarlos en un tejido.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
• Podemos pegarles una sustancia fluorescente (fluorocromo) o una enzima cuya actividad podemos revelar empleando histoquímica enzimática.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
• Cuando empleamos un fluorocromo para marcar el anticuerpo estamos haciendo una técnica de inmunofluorescencia.
• El fluorocromo más comúnmente empleado es el isotiocianato de fluoresceína que brilla en color verde.
Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-
actina en un fibroblasto en cultivo. Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-
IgG en una biopsia renal.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
• La inmunofluorescencia tiene aplicaciones en el diagnóstico médico en casos de glomerulopatías y en algunas lesiones de piel en que participa el sistema inmune.
• Se requiere de un microscopio de fluorescencia y de cortes por congelación.
Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-
IgG en piel de paciente con lupus
eritematoso sistémico.
Inmunofluorescencia con anticuerpos anti-
IgA con depósitos en vasos sanguíneos en
paciente con vasculitis.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
• Cuando empleamos una enzima para marcar el anticuerpo y revelamos su presencia por medio de una técnica de histoquímica enzimática, estamos haciendo una inmunohistoquímica enzimática.
• La enzima más frecuentemente empleada para marcar anticuerpos tiene el curioso nombre de peroxidasa del rábano fuerte, pero se conoce comúnmente como peroxidasa.
• Se pueden usar al menos dos reveladores para la peroxidasa, el carbazol, que produce un color rojo y la más común que es la diaminobencidina, que produce un color pardo.
• No se requiere de un microscopio de fluorescencia y las laminillas pueden revisarse años después.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-insulina en islotes
pancreáticos.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-glucagon en
islotes pancreáticos.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-proteína ácida
fibrilar glial, que es un filamento intermedio
que se encuentra en astrocitos fibrosos.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-actina específica
de músculo liso en un corte de piel. Se
identifican las paredes de vasos sanguíneos
de la dermis.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-proteína ácida
fibrilar glial, que es un filamento intermedio
que se encuentra en astrocitos fibrosos.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-CD3 en un corte
de piel. Se identifican los linfocitos T en un
linfoma (neoplasia maligna de linfocitos).
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-proteína S100 en
piel humana. Se hacen evidentes las células
dendríticas de Langerhans.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-proteína S100. A
grandes aumentos, el detalle de la célula de
Langerhans y su relación con los
queratinocitos resulta muy claro.
Técnicas histológicas especiales. Inmunológicas
Técnicas inmunológicas.
• En la actualidad las aplicaciones de la inmunohistoquímica enzimática en la práctica médica son muy extensas.
• No sólo nos permite resolver importantes problemas de diagnóstico histológico, pero también sus resultados se pueden traducir en el establecimiento del pronóstico y tratamiento de los pacientes con los que trabajamos.
Inmunohistoquímica enzimática con
anticuerpos primarios anti-HER2 en un
cáncer de mama. Las pacientes que
muestran abundante expresión
inmunohistoquímica de esta molécula de
tipo factor de crecimiento, pueden ser
tratadas con anticuerpos monoclonales anti-
HER2, y su pronóstico es mucho mejor que
el de aquéllas que no lo expresan.
Técnicas histológicas especiales.
Conclusión final.
• Aquí hemos presentado una muy breve revisión de algunas de las técnicas histológicas que tienen relevancia en el diagnóstico, pronostico y tratamiento de nuestros pacientes.
• Faltan muchas otras que muy probablemente se irán revisando a lo largo del curso.
• Es importante que no olvides que todo esto se usa diariamente en la práctica como médico general y especialista, ante pacientes reales.
• Sobre las técnicas histológicas especiales de segundo orden que nos faltaron – microscopía electrónica y biología molecular – haremos posteriormente otra presentación específica.
• GRACIAS.
Introducción al estudio de la Medicina Humana