DETERMINACIÓN DEL NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES (NMP) Y COLIFORMES FECALES, EN BEBIDAS DE VENTA CALLEJERA DE LA CIUDAD DE ARMENIA,

DEPARTAMENTO DEL QUINDÍO. 2009.

CINDY DAYANA SOLER TIQUEMARGARITA MARIA ROBLEDOJORGE MARIO TORRES MARIN

CESAR AUGUSTO ROJAS DRADAALVARO DULCE VILLARREAL

UNIVERSIDAD DEL QUINDIOFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE MEDICINA ARMENIA, QUINDIO

2009

DETERMINACIÓN DEL NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES (NMP) Y COLIFORMES FECALES, EN BEBIDAS DE VENTA CALLEJERA DE LA CIUDAD DE ARMENIA,

DEPARTAMENTO DEL QUINDÍO. 2009.

Dra. MARTHA LUCIA GALLEGO HERNANDEZDocente

Dr. LUIS NEBIO JARAMILLO MASIASAsesor

Elaborado Por

CINDY DAYANA SOLER TIQUEMARGARITA MARIA ROBLEDOJORGE MARIO TORRES MARIN

CESAR AUGUSTO ROJAS DRADAALVARO DULCE VILLARREAL

UNIVERSIDAD DEL QUINDIOFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE MEDICINA ARMENIA, QUINDIO

2009

INTRODUCCION

Se estima que la ocurrencia de las enfermedades transmitidas por alimentos ETA, está en incremento a escala mundial, en función de factores como cambios ambientales que conducen a la resistencia antimicrobiana, el aumento de la población, la aparición de grupos poblacionales vulnerables, el acelerado incremento del comercio internacional de alimentos, los avances tecnológicos en la producción, el aumento del uso de aditivos, el incremento del consumo de productos industrializados, el recorrido de largos trayectos para su comercialización, la preferenciade alimentos de rápida preparación y el consumo de éstos en la vía pública.

En Latinoamérica, al igual que en Colombia, existen otros factores que contribuyen a la prevalencia de enfermedades transmitidas por alimentos, tales como la falta de legislación actualizada y la poca aplicación de la existente, la infraestructura inadecuada para el almacenamiento y distribución, las deficiencias en el saneamiento y la urbanización con formación de viviendas sin servicios básicos de agua potable y alcantarillado, el deterioro del nivel socioeconómico de amplios segmentos de la población con un creciente número de vendedores ambulantes de alimentos que no someten sus productos a ningún tipo de control, los factores culturales que influyen en la preparación de los mismos y la falta de información adecuada en la población general sobre medidas para disminuir el riesgo para adquirir una ETA.

Según el último informe sobre condiciones de salud en las Américas publicado por la Organización Panamericana de la Salud OPS, entre 1960 y 1990 ocurrieron cinco millones de defunciones de niños menores de cinco años por diarrea; esto significa que hasta tres millones y medio de niños murieron por diarrea debido al consumo de alimentos contaminados (especialistas mundiales en este evento consideran que hasta 70% de estas muertes son ocasionadas por alimentos contaminados).

En Estados Unidos, la Foods and Drugs Administration - FDA, calcula que pueden ocurrir anualmente hasta 81 millones de casos de ETA, que causan nueve mil muertes.

En Colombia durante el año 1997, se notificaron un total de 39 brotes de ETA; el departamento de Antioquia aportó 33,3% de los brotes, seguido por Bogotá y Nariño, con 17,9% y 15,4%, respectivamente. Del total de brotes reportados, sólo en cuatro de ellos (10,8%) se informó el alimento implicado. El número de individuos afectados, registrados en cada evento, varió entre dos y 280 personas; estos datos no incluyeron la información de todos los departamentos debido a que esta variable no fue reportada.

Según el Instituto Nacional de Salud, en el año 2008 se presentaron a nivel nacional 146 caso de muertes por EDA, los cuales fueron reportados por los departamentos de Bolívar (25 casos), Bogotá (24 casos), Cesar (11 casos), Boyacá (7 casos), entro otros, los cual refleja la grave problemática del país en cuanto al manejo de alimentos de alto riesgo epidemiológico.

Tomando como base la panorámica nacional relacionada con las enfermedades transmitidas por alimentos, se desarrolló la presente investigación, con el fin de determinar el grado de contaminación

de las bebidas de venta callejera en la ciudad de Armenia, a través de la identificación del número más probable de coliformes totales y fecales (NMP).

JUSTIFICACIÓN

Existen muchas enfermedades en el ser humano causadas por bacterias, algunas de estas son comensales del tracto gastrointestinal, pero se pueden encontrar aumentadas y producir una serie de patologías. Entre las bacterias causantes de enfermedades gastrointestinales esta la Escherichia Coli la cual está implicada en cuadros de síndromes diarreicos y enfermedades graves como la colitis hemorrágica; además puede causar daños en el tracto urinario.

La Escherichia Coli es una enterobacteria gram negativa anaerobia facultativa, hace parte de la flora gastrointestinal normal, ayudando a su adecuado funcionamiento en la absorción de nutrientes y producción de vitaminas B y K. todo este proceso se lleva a cabo cuando el número total de Escherichia Coli no sobrepasa la potencia de 106.

Los alimentos al igual que el agua son indispensables para la vida de cualquier ser vivo. Sin embargo si no se toman ciertas precauciones pueden ser causales de un sin número de enfermedades. Por tal motivo en este proyecto buscamos hacer un diagnostico por medio de un muestreo en los diferentes puestos ambulantes que se encuentran a las afueras de la Universidad del Quindío en la ciudad de Armenia, donde cualquier persona de la comunidad los consigue fácilmente, habiendo una constante interacción entre las personas que preparan los alimentos y los consumidores convirtiéndose en un ciclo de riesgo a contaminación y a contraer una enfermedad producida por alimentos; las cuales pueden ser toxicas, invasivas o alérgicas dependiendo del microorganismo que se ingiera y en especial en nuestro caso el de la Escherichia Coli. Las cuales pueden manifestarse con diarrea, náuseas, vómito y fiebre, siendo los jóvenes, mujeres embarazadas más susceptibles por lo que en ellos sus efectos podrían ser más serios.

Por este motivo es importante intervenir en la adecuada manipulación, limpieza y desinfección de las materias primas para obtener alimentos inocuos; ya que estos giran en torno a un factor predisponente de contaminación “el medio”.

IMPACTO ESPERADO

Nuestro grupo espera encontrar la presencia de coliformes totales y fecales en las muestras tomadas en los puestos ambulantes a las afueras de la Universidad del Quindío, para confirmar así la hipótesis establecida, de que en estos lugares no se aplican buenas prácticas de manipulación en todo lo relacionado con el almacenamiento y elaboración de las diferentes bebidas ofrecidas a la comunidad.

Lo que queremos lograr con esto, es que luego de una debida identificación de estos microorganismos, es lograr que las personas que preparan estas bebidas sean capacitadas por el SENA, sobre como es la adecuada manipulación de los alimentos y ofrecerles herramientas que ellos puedan usar fácilmente para disminuir la incidencia de enfermedades transmitidas por alimentos.

OBJETIVOS

Objetivo General

Identificación del Número más probable (NMP) de coliformes totales y fecales en bebidas de venta callejera de puestos ambulantes a las afueras de la Universidad del Quindío en la ciudad de Armenia – Quindío en el año 2009.

Objetivos específicos

Establecer la presencia de coliformes totales y fecales en las muestras estudiadas mediante aislamiento en medios selectivos.

Analizar los resultados obtenidos

Diseñar campañas de promoción y prevención tanto con los vendedores ambulantes como con las demás personas de la comunidad.

Presentar los resultados obtenidos mediante conferencia dirigida a docente y estudiantes de Microbiología de segundo semestres de medicina de la Universidad del Quindío.

MARCO TEORICO

Método para la determinación de bacterias coliformes, Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (Número más Probable o NMP)

Según el manual de Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos, de la Facultad de Química, de la UNAM1. Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra.

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli.

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores devirulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente.

Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. colienterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC).

Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los niños.

Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos.

La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja.

Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica.

Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plásmido, ambas proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción de las microvellosidades intestinales.

Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar).

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal.

A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas características importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos.

La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.

Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una

variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.

La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne. En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de Escherichia coli antes descritas.

PROPIEDADES Y SÍNTOMAS CAUSADOS POR ALGUNAS CEPAS DE ESCHERICHIA COLI

PATÓGENAS

ETEC EPEC EHEC EIEC

Toxina Lábil/estable - Shiga o vero -

Invasiva - - - +

Intiminas - - + -

Enterohemolisina - - + -

Fiebre baja + - +

Intestino involucrado

Delgado Delgado Colon Colon y partebaja deldelgado

Dosis infectiva Alta Alta baja Alta

Serotipos varios O26, O111 y otros

0157:H/,026, 0111 y otros

varios

FUNDAMENTO

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales iliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la

muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h.La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1. Para análisis de agua

Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1.

5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado concentración doble o triple con campana de Durhama.

5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb.

5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC MUG con campana de Durham .

2 cajas Petri con agar para métodos estándar 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional) 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons

(opcional)

2. Para análisis de alimentos

1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatosa

2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatosa

15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración sencilla o caldo lactosado concentración sencilla con campana de Durhama

15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb.

15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb. 2 cajas Petri con agar para métodos estándard 2 cajas Petri con agar MacConkey 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VP 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1 Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2 COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAM

MATERIAL Y EQUIPO

Mechero Propipetaa. Gradillaa Balanza granatariaa. Stomachera Bolsas para stomacher . Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm) Lentes de seguridadc Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna. Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna. Pipetas Pasteur estériles Asa bacteriológicab Portaobjetos Microscopio óptico Termómetro calibradob Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C. Incubadora a 35° ± 2,0ºC Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°C Autoclave

NOTAS

A. Material necesario al inicio de la práctica.B. Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.C. Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.D. Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.E. Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.

8

2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo

37°C

24 - 48 h

37°C

24 – 48 h

44.5°C

24 – 48 h

Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfatode sodio (CLSS) triple concentración (3X) CLSS + 20.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriológica de los tubospositivos (producción de gas) en caldo lactosaverde brillante bilis 2% y caldo EC

Tubos con 10.0 mL deCaldo Lactosa verdebrillante bilis 2%

Lectura de tubos positivos entablas. NMP de coliformestotales /100 ml de muestra

Tubos con 10.0 mL deCaldo EC o EC-MUG

Lectura de tubos positivos entablas. NMP de coliformesfecales /100 ml de muestra.

Siembra de tubos positivos enplacas de Agar EMB para labúsqueda de Escherichiacoli

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

Pesar 10.0 g de muestra Homogenizar la muestra Realizar 2 diluciones decimales más enen condiciones de asepsia con 90.0 mL de solución diluyente tubos con 9.0 mL de solución diluyente

10-1 10-2 10-3

1 0-1 10-2 10-3 10 -1 10-2 10-3

1 0-1 10-2 10-1 1 0-2 10-1 10 -2 10-1 10-2

1.0 mL 1.0 mL

35°C

24 - 48 h

35°C

24 - 48 h

44.5°C

24 - 48 h

Sembrar por triplicadocada dilución en tubosde caldo lauril sulfato desodio (1X)

Lectura de tubos positivos entablas. NMP de coliformestotales /g Ode muestra

Lectura de tubos positivos entablas. NMP de coliformesfecales /g de muestra.Siembra de tubos positivos enagar Mac Conkey parabúsqueda de Escherichia coli

Tubos con 10.0 mL de CLSS concentraciónsencilla (1X) + 1 .0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriológica de los tubospositivos (producción de gas) en caldo lactosaverde brillante bilis 2% y caldo EC

Tubos con 10.0 mL deCaldo Lactosa verdebrillante bilis 2%

Tubos con 10.0 mL deCaldo EC o EC-MUG

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO

1.1 Prueba presuntiva• Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno delos tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar lostubos para homogeneizar la muestra.

CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio

INOCULO (ML) CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (ML)

VOLUMEN MEDIO MAS INOCULO

CALDO LAUTIL TRIPTOSA REQUERIDO G/L

CONCENTRACIÓN

1 10 o mas 11 o mas 35,6 1x

10 10 20 71,2 2x

10 20 30 53,4 1.5x

20 10 30 106,8 3x

100 50 150 106,8 3x

100 35 135 137,1 3.5x

100 20 120 213,6 4x

• Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de gas, incubar 24 h. más.

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.

Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h.. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.. Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes totales/100 mL.

Control de calidad

1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.

1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli

Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología

típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.

Incubar las placas a 35°C por 18-24 h. Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

a. Producción de indol (I)

Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h. Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs. La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera una prueba positiva.

b. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)

Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h. Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.

c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h. Adicionar 0.6 mL de solución VP1 y 0.2 mL de solución VP2 y agitar. Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilización del citrato (C)

Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo ligero para evitar turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons) Incubar a 35°C por 96 h.

El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una prueba positiva.

NOTAS

Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta. Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo. Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono, también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica pruebapositiva

1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG(4 metil-umbeliferil-b-D-glucuronido)FUNDAMENTO

Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli.

a. Prueba confirmativa

A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de gas , tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación EC-MUG.

Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más. Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura. Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.

Control de calidad

Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.pneumoniae como control negativo.

2. Alimentos

2.1 Preparación de la muestra.

Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estériles y mezclar. Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3 minutos. Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2° y 5 ° C.

2.1.1 Prueba presuntiva.

Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio. Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo lauril sulfato de sodio. Incubar a 35-37°C durante 24-48 h.

Los tubos después de la incubación, se registrarán como positivos si presentan crecimiento y producción de gas.

2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.

Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas, después de un período de incubación de 24 a 48 h. Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el número más probable de organismos coliformes totales por mL.

2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.

Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h. Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el número más probable de organismos coliformes fecales por mL.

Control de calidad

• Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.

2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli.

Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares. Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las bacterias. Seleccionar 1 o más colonias aisladas para realizar pruebas IMViC. Todos los cultivos que: Fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C. Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli. Calcular el NMP de E. coli basándose en la proporción de los tubos positivos de caldo EC.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al procedimiento señalado en la tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para el análisis de agua), para estimar la población de bacterias coliformes totales, Escherichia coli de acuerdo con las diluciones empleadas.

Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar las siguientes tablas:

TABLA 1. Índice de NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 ml de muestra de agua o hielo

No. DE TUBOS POSITIVOS

NMP/100 ML 95% DEL LIMITE DE CONFIANZA (APROXIMADO)INFERIOR SUPERIOR

0 <1,1 0 3,0

1 1,1 0,05 6,3

2 2,6 0,3 9,6

3 4,6 0,8 14,7

4 8,0 1,7 26,4

5 >8,0 4 Infinito

TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 ml de muestra de agua o hielo

NO DE TUBOS POSITIVOS

NMP/100ML 95% DEL LIMITE DE CONFIANZA (APROXIMADO)INFERIOR SUPERIOR

0 <1,1 0,0 3,0

1 1,1 0,03 5,9

2 2,2 0,26 8,1

3 3,6 0,69 10,6

4 5,1 1,3 13,4

5 6,9 2,1 16,8

6 9,2 3,1 21,1

7 12,0 4,3 27,1

8 16,1 5,9 36,8

9 23,0 8,1 59,5

10 >23,0 13,5 infinito

METODOLOGIA

Tipo de estudio: descriptivo

Muestras: Se analizaron cuatro muestras de bebidas callejeras, tomadas en puestos de venta ubicados en las afueras de la Universidad del Quindío. Las muestras analizadas fueron:

- Jugo de tomate- Jugo de naranja- Salpicón- Raspado

Dichas muestras se transportaron hasta el laboratorio de bacteriología de la Facultad de Ciencias de la Salud, refrigeradas y con las más estrictas medidas de asepsia y se ubicaron en la nevera de dicho laboratorio.

Media hora antes, se extrajeron para colocarlos a temperatura ambiente.

Procedimiento

Inicialmente se prepararon 500 ml de agua pectonada para realizar la disolución de las muestras conforme lo indica el protocolo establecido por el Instituto Nacional de Vigilancia de Alimentos - INVIMA. Igualmente se preparo el medio de cultivo MB – PR, para la siembra de las diferentes muestras, en diluciones de 10 -1, 10 -2 y 10-3. La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales iliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo utilizado es el MB - PR el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se empleó el mismo medio, debido a que los laboratorios de la Universidad no contaban con el caldo verde bilis brillante, que es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h.

Siembra de las Muestras:

1 tubo de cultivo con 10.0 mL de caldo MB PR, con campana de Durhama. En cada uno de de los tubos se agrega un centímetro de la muestra diluida en agua pectonada, con las diferentes diluciones 10 -1, 10 -2 y 10-3. La muestras son incubadas a 35 ºC, durante 24 horas.

El proceso de dilución y la siembra de las muestras se muestra a continuación.

Pesar 10.0 g de muestra Homogenizar la muestra Realizar 2 diluciones decimales más enen condiciones de asepsia con 90.0 mL de solución diluyente (agua pectonada) tubos con 9.0 mL de solución diluyente

10-1 10-2 10-3

1 0-1 10-2 10-3 10 -1 10-2 10-3

1 0-1 10-2 10-1 1 0-2 10-1 10 -2 10-1 10-2

1.0 mL 1.0 mL

35°C

24 - 48 h

35°C

24 - 48 h

44.5°C

24 - 48 h

Sembrar por triplicadocada dilución en tubosde caldo MR BP)

Lectura de tubos positivos entablas. NMP de coliformestotales /g de muestra

Lectura de tubos positivos entablas. NMP de coliformesfecales /g de muestra.

Tubos con 10.0 mL de MR BP Siembra con pipeta de los tubospositivos (producción de gas)

Tubos con 10.0 mL deCaldo MRBP

TUBOS POSITIVOS RESIEMBRA POR 24 h A 45 ªC

RESULTADOSHOJA DE RESULTADOS

Los resultados obtenidos se resumen en la siguiente tabla:

MUESTRA No 1 MUESTRA No 2 MUESTRA No 3 MUESTRA No 4Jugo de Tomate Jugo de Naranja Raspado Salpicón

Hora de Siembra: Hora de Siembra Hora de Siembra Hora de SiembraHora de Lectura: Hora de Lectura Hora de Lectura Hora de Lectura

RESULTADOS10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3

† † † † † † † † † † † †† † † † † † † † † † † -† - - † † - † † † † - - 3 2 2 3 3 2 3 3 3 3 2 1

RESULTADOS RESIEMBRA Determinación de Coliformes fecales

Jugo de Tomate Jugo de Naranja Raspado SalpicónHora de Siembra Hora de Siembra Hora de Siembra Hora de SiembraHora de Lectura Hora de Lectura Hora de Lectura Hora de Lectura

10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3

† † † † † † † † † † † †† - † † † - † - † † †- - † † † † †2 1 2 3 2 1 3 2 3 3 2 1

ANALISIS DE RESULTADOS

Después de obtener los resultados procedemos a efectuar el comparativo con la tabla del número más probable de colonias (NMP), la cual se adjunta como anexo.

De la misma manera se realiza el comparativo de los valores obtenidos, con los parámetros establecidos por el INVIMA mediante la Resolución 7991 de 1991, especifica para jugos, la cual se muestra a continuación:

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

MUESTRA No 1. JUGO DE TOMATE

El número más probable de Colonias de Coliformes totales arrojo como resultado la combinación 3-2-2, lo que corresponde a un NMP de 21/100 ml

El número más probable de Colonias de Coliformes fecales arrojo como resultado la combinación 2-1-1, lo que corresponde a un NMP de 2/100 ml.

Interpretación: Muestra no apta para consumo humano. Los resultados indican que hubo errores en la manipulación de alimentos, proceso en el cual se contamino la muestra con coliformes totales y fecales.

MUESTRA No 2. JUGO DE NARANJA

El número más probable de Colonias de Coliformes totales arrojo como resultado la combinación 3-3-2, lo que corresponde a un NMP de 110/100 mlEl número más probable de Colonias de Coliformes fecales arrojo como resultado la combinación 3-2-1, lo que corresponde a un NMP de 15/100 ml.

Interpretación: Muestra no apta para consumo humano. Los resultados indican que hubo errores en la manipulación de alimentos, proceso en el cual se contamino la muestra con coliformes totales y fecales.

MUESTRA No 3. RASPADO

El número más probable de Colonias de Coliformes totales arrojo como resultado la combinación 3-3-3, lo que corresponde a un NMP de > 110/100 ml.

El número más probable de Colonias de Coliformes fecales arrojo como resultado la combinación 3-2-3, lo que corresponde a un NMP de 29/100 ml. .

Interpretación: Muestra no apta para consumo humano. Los resultados indican que hubo errores en la manipulación de alimentos, proceso en el cual se contamino la muestra con coliformes totales y fecales.

MUESTRA No 4. SALPICON

El número más probable de Colonias de Coliformes totales arrojo como resultado la combinación 3-2-1, lo que corresponde a un NMP de 15/100 ml

El número más probable de Colonias de Coliformes fecales arrojo como resultado la combinación 3-2-1, lo que corresponde a un NMP de 15/100 ml.

Interpretación: Muestra no apta para consumo humano. Los resultados indican que hubo errores en la manipulación de alimentos, proceso en el cual se contamino la muestra con coliformes totales y fecales.

DISCUSIÓN

El “análisis sobre el grado de contaminación o inocuidad de los alimentos de consumo popular” que se venden en la ciudad de Barranquilla, fue realizado por Osvaldo del Castillo, ingeniero químico que preside Aciqca y es vicepresidente de la Asociación a nivel nacional, y un equipo de trabajo conformado por María Bernarda Alvarado Bawab, Alfredo Navarro y Ralph Polo . En estos estudios se analizaron muestras de seis alimentos diferentes, para un total de 30 pruebas.

Los alimentos analizados fueron perro caliente, chorizo, ensalada, pollo, jugo y frutas, las cuales fueron procesadas en el laboratorio microbiológico de la secretaria de salud de Barranquilla, donde se efectuó un examen denominado fermentación en tubos múltiples para establecer la presencia de microorganismos.

Los resultados obtenidos indican que el 64% de todas las muestras presentó valores superiores a 1.200 coliformes por gramo. Baste decir que, de acuerdo con la orientación del INVIMA en la norma ISO 22000 para seguridad alimentaria, ninguna comida que se expenda en el país debe tener más de tres coliformes por gramo.

Más grave aún es que el 54% de los alimentos mostraron resultados de E. coli (materia fecal), cuando las normas internacionales exigen que ese valor sea de cero.

Por Otra parte, según el Laboratorio de Salud Pública de la Secretaría de Salud departamental del Tolima, en el año 2008 se efectuó en ese departamento un trabajo minucioso y serio para vigilar las ventas ambulantes de alimentos con el fin de prevenir las intoxicaciones.

Como resultado de este trabajo, el Laboratorio puedo asegurar que el 60 por ciento de las muestras analizadas, donde se incluyen las bebidas de venta callejera, presentan un alto grado de contaminación por microorganismos como la Salmonella, Estafilococos y E. coli, todos ellos causantes de diarreas e intoxicaciones alimentarías.

En estudios desarrollados en la ciudad de Bogotá por la Secretaria Distrital de Salud como parte de las acciones de Inspección, Vigilancia y Control, para el caso de las bebidas consideradas como alimentos de menor riesgo, el Laboratorio de Salud Pública analizó 210 muestras de jugos, en el año 2003. De ellas, el 71,4% (150) fueron no aceptables. En 2004, la no aceptabilidad fue del 63%, de un total de 87 muestras tomadas.

Los mohos y las levaduras fueron durante los años 2003 y 2004 las principales causas de no aceptabilidad, con una participación del 82% y 73%, respectivamente. Estos resultados reflejan el uso de materias primas sobremaduras para la preparación de jugos, insuficientes procedimientos de higiene y desinfección y conservación del producto a temperatura ambiente, favorece la multiplicación microbiana.

Tomando como base los resultados obtenidos en los estudios anteriores, podemos inferir que los obtenidos en el nuestro concuerdan con lo que se ha encontrado en investigaciones similares a nivel nacional.

Con mucha seguridad podemos afirmar que la contaminación de las bebidas de venta callejera se debe a inadecuadas prácticas de manufactura, esto como resultado del bajo grado de conocimiento de los expendedores sobre procesos que permitan la inocuidad de estos alimentos.

Por otra parte podemos afirmar que existe un alto grado de permisividad por parte de las autoridades de Inspección, Vigilancia y Control de la Secretaria de Salud de Armenia, puesto que según el Decreto 3075 de 1998, en el Articulo 30, literal f, “los alimentos y bebidas expuestos para la venta deben mantenerse en vitrinas, campanas plásticas, mallas metálicas o plásticas o

cualquier sistema apropiado que los proteja del ambiente exterior”, medida que incumplen todos los puestos donde se tomaron las muestras analizadas.

De la misma manera, dentro de las acciones de Inspección, Vigilancia y Control, que le corresponde a la Secretaria según lo contemplado en la Ley 715 de 2001, se deberían tomar muestras periódicas para garantizar que las bebidas de venta callejera cumplan con los parámetros de inocuidad establecidos en la normatividad vigente y no representen un riesgo para la salud humana.

CONCLUSIONES

En el 100% de las muestras analizadas se determino la presencia de coliformes totales y fecales mediante la técnica de diluciones en tubo múltiple (Número más Probable o NMP).

La muestra más contaminada fue el Raspado, seguida del jugo de naranja, jugo de tomate y por último el salpicón. Cabe destacar que según los parámetros del INVIMA las cuatro bebidas (100%) no son aptas para el consumo humano. A pesar de esto, se suministran a la población de esta localidad.

Los resultados obtenidos en el presente estudio concuerdan con los determinados por las autoridades de salud en ciudades como Bogotá, Barranquilla e Ibagué, utilizando el mismo procedimiento empleado en este trabajo.

Según el Instituto Nacional de Salud, entidad encargada de la vigilancia en Salud Publica en el país, las Enfermedades Transmitidas por alimentos, continúan siendo un evento importante, puesto que durante el año 2008 se reportaron 146 casos de muertes por EDA., dentro de los cuales se incluyen ETAs.

Los puestos de ventas callejeras en esta localidad no cumplen con los requisitos establecidos en el Decreto 3075 de 1998, lo cual hace que los productos distribuidos representen un grave riesgo para la salud humana por no cumplir con los parámetros de inocuidad establecidos por la normatividad vigente.

RECOMENDACIONES

Se deben desarrollar estudios a mayor escala, lo cual permita determinar las características reales de los productos de venta callejera que se expenden en la ciudad de Armenia.

Es urgente la intensificación de acciones de Inspección, Vigilancia y Control por parte de las autoridades de Salud de la ciudad de Armenia, debido a que a simple vista se puede determinar que los puestos de venta callejera no reúnen condiciones de asepsia para el expendio de alimentos.

Se debería desarrollar procesos de educación continuada a los manipuladores de alimentos, con el fin de garantizar que se mejoren las practicas de manipulación de alimentos y de esta manera se minimicen los riesgos para la contaminación de alimentos de venta callejera.

Adelantar acciones de información, educación y comunicación, dirigidas a la población en general, para alertar sobre la situación crítica actual relacionada con el expendio de alimentos de venta callejera y de esta manera evitar que se presenten intoxicaciones alimentarias.

El programa de medicina debería establecer convenios de cooperación con facultades como la de Ingeniería de alimentos, lo cual permita realizar estudios de esta naturaleza en un laboratorio que reúna las condiciones de bioseguridad necesarias y evitar contratiempos como los que se presentaron durante el desarrollo del presente estudio.

BIBLIOGRAFIA

DECRETO 3075 de 1998, INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS. Bogotá. 1998.

MANUAL DE TECNICAS DE ANALISIS PARA CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLOGICA DED ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO. Instituto Nacional de Vigilancia de Alimentos. Bogotá. 1998.

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. 1.999

CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número mas probable, detección de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia coli por el número mas probable”

Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9 th ed. Arlington, VA: AOAC.

Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed. 2006, pp 935-936

Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de Jawetz. Manual Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275

Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005). “Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed.

SITIOS WEB VISITADOS

Cesar Augusto Rojas, (fecha de acceso 9 de noviembre de 2009); http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis134.pdf

Cesar Augusto Rojas, (fecha de acceso 9 de noviembre de 2009); http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-Ecoli-NMP_6529.pdf

Margarita María Robledo, (fecha de acceso 22 de noviembre de 2009); http://www.cepis.ops-oms.org/bvsacd/scan/013761/013761-03.pdf

Margarita María Robledo, (fecha de acceso 22 de noviembre de 2009); http://www.EL HERALDO.COM.CO Barranquilla

Alvaro Dulce, (fecha de acceso 7 de noviembre de 2009); http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

Alvaro Dulce, (fecha de acceso 7 de noviembre de 2009); http://www.saludtolima.gov.co/portal/website/noticias/noticia.php?id=462

Jorge Mario Torres (fecha de acceso 12 de noviembre de 2009); http://www.saludcapital.gov.co/Cartillas/Cartilla11.pdf

Cindy Dayana Soler, (fecha de acceso 20 de noviembre de 2009); http://www.saludcapital.gov.co/ListasVsp/Protocolos/Protocolos%20Salud%20Ambiental/sisvea.pdf

ANEXOS

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCION

JUSTIFICACION

IMPACTO ESPERADO

OBJETIVOSGeneralesEspecificos

MARCO TEORICO

Método para la determinación de bacterias coliformes, Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (Número más Probable o NMP).

FUNDAMENTO

Medio de Cultivo y DiluyentesSoluciones Reactivos e indicadoresMaterial y equipo

PROCEDIMIENTOPrueba presuntiva y confirmativaControl de CalidadPrueba confirmativa para E ColiIdentificación Bioquímica de E Coli.

C Cálculo y expresión de Resultados

METODOLOGIATipo de estudioMuestraProcedimientoResultadosAnálisis de resultadosDiscusión

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFIA

Anexos

Tabla de número más probable NMP