MICROORGANISMOS INDICADORES Y PATÓGENOS
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MICROORGANISMOS INDICADORES Y PATÓGENOS Salvador Camacho Garrido
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MICROORGANISMOS
INDICADORES Y
PATÓGENOS
Salvador Camacho Garrido
El término microorganismos indicadores se puede aplicar a cualquier grupo (taxonómico, fisiológico o ecológico) de microorganismos cuya presencia (o ausencia) proporciona evidencia indirecta de un determinado suceso en la historia de la muestra
Aunque el término se asocia generalmente con microorganismos de origen intestinal, otros grupos pueden actuar como indicadores de otras situaciones
De los microorganismos de origen entérico se puede colegir, la falta de higiene en la muestra y la posible presencia de microorganismos patógenos en la misma
La presencia de cualquier bacteria Gram negativa en muestras alimentarias tratadas con calor, indican un inadecuado tratamiento para la carga inicial de bacterias o su posterior contaminación
MICROORGANISMOS INDICADORES
Grupo coliforme
Grupo coliforme fecal
Escherichia coli
Enterobacteriacea
Estreptococos fecales (Enterococos)
Clostridium sulfito reductores
INDICADORES FECALES
Flora aeróbica mesófila
Flora anaerobia
Flora psicotrófica
Estafilococos
INDICACORES NO FECALES
Ingram y Mossel dentro de los indicadores entéricos distinguen dos tipos:
Microorganismos índice: Aquellos cuya presencia, señala la posible existencia de gérmenes patógenos, como E. coli
Microorganismos indicadores: Aquellos cuya presencia indica deficiencias en la calidad higiénica
La presencia de E. coli, microorganismo de cuyo origen fecal nadie duda, presupone que pueden existir otros microorganismos patógenos de su mismo nicho ecológico, pero no lo afirma
Además, pueden existir dichos patógenos y no aparecer E. coli
En cualquier caso se debe trabajar con el caso más desfavorable
MICROORGANISMOS ÍNDICE
Los indicadores de contaminación fecal, los más utilizados en los
análisis microbiológicos, deben reunir una serie de características:
Especifidad
Sensibilidad
Número suficiente
Resistencia
Facilidad, rapidez y fiabilidad de los ensayos
CARACTERÍSTICAS INDICADORES FECALES
Además del estudio de los microorganismos indicadores e índices,
resulta necesario, sobre todo en microbiología alimentaria, el estudio
de ciertos microorganismos patógenos y toxigénicos, puesto que
pueden ser más resistentes que sus indicadores
Esto ocurre con las enterobacterias Salmonella y Shigella
Otros, tienen nichos ecológicos diferentes, pero por su especial
patogenicidad y toxigenicidad tienen que ser estudiados en
determinados alimentos, lo que ocurre con Pseudomonas
aeruginosa o Bacillus cereus
MICROORGANISMOS A ESTUDIAR
Microorganismos aeróbicos mesófilos
Coliformes
Coliformes fecales
E. coli
Enterobacteriaceae
Enterococos
Clostridium sulfito reductores
Salmonella
Shigella
Staphylococcus aureus
ESTUDIO FRECUENTE
E. coli patógeno
Pseudomonas aeruginosa
Bacillus cereus
Clostridium perfringes
Clostridium botulinum
Vibrio parahaemolityticus
Vibrio cholerae
Yersinia enterocolítica
Campylobacter
Listeria monocytogenes
Enterobacter zakasakii
Mohos y levaduras
ESTUDIO MENOS FRECUENTE
Son un conjunto de microorganismos capacitados para proliferar
en aerobiosis a temperaturas comprendidas entre 25-40 ºC
En general se detectan de forma óptima después de incubación
a 31 ºC durante 72 horas ( o a 37 ºC / 48 h), en un agar nutritivo
o de recuento, formando colonias visibles
El conjunto de esta flora incluye gérmenes patógenos y no
patógenos (de alteración, saprófitos, etc.)
GRUPO AEROBIOS MESÓFILOS
Su valor indicativo ha sido objeto de controversia. Una flora alta indica
un comienzo de alteración, pero sólo si están bien representadas las
bacterias causantes del deterioro
Por otro lado, no existe una relación entre el número total de
microorganismo aerobios mesófilos y la presencia de gérmenes
patógenos
No obstante, algunos microorganismos no patógenos, en elevadas
proporciones, pueden ser agentes etiológicos de enfermedad, como
Pseudomonas, Proteus y Bacillus
Se puede concluir diciendo, que un alimento cuya flora total es
elevada, debe ser considerado impropio para el consumo humano
VALOR INDICATIVO
Técnica de recuento en masa en medio sólido
Técnica de recuento por siembra superficial
Técnica de recuento NMP
Técnica de recuento por filtración en membrana
Técnica de recuento por examen microscópico directo
Utilizan como medio sólido agar nutritivo o agar de recuento en placa
(P.C.A.), y como medio líquido caldo nutritivo (CN)
En el caso de la filtración de membrana (MF), se suelen utilizar
medios especiales de la casa Millipore® u otras tipo MTGE
Estas técnica son aplicables a casi todos los grupos o bacterias
usuales en el análisis microbiológico
En cualquier caso, exceptuando la microscopía directa, el cultivo se
realiza preferentemente durante 72 horas y a 31 ºC
RECUENTO
El grupo de los coliformes, es una forma de clasificación de bacterias en cuanto a su forma de detección y reacciones bioquímicas y no un grupo de una clasificación taxonómica
Son Enterobacteriaceae aeróbicas y anaerobias facultativas, no esporuladas y lactosa positivas
Se caracterizan porque fermentan la lactosa con desprendimiento de gas y producción de ácido, en presencia de sales biliares en el medio de cultivo, dentro de un periodo de 48 horas y a una temperatura entre 30 y 37 ºC
COLIFORMES TOTALES
Los coliformes o coli-aerogenes aunque se pueden encontrar en
el intestino de humanos y animales, también se encuentra en
otros ambientes, por lo que carece de especifidad
No obstante se usan como indicadores fecales por:
Su frecuencia en heces
Fácil detección
Semejanza con algunos de los miembros de la familia de las
Enterobacteriaceae patógenos
VALOR INDICATIVO
Técnica de recuento en medio sólido:
Se utilizan como medios sólidos agares selectivos:
Agar biliado rojo violeta (V.R.B.A.)
Agar lactosado rojo bilis violeta (V.R.B.L.)
Generalmente se recurre a la técnica de la doble capa
Se incuba a 37 ºC durante 24 horas
La lectura positiva son la formación de colonias (no puntiformes) rojo púrpura con halo de precipitación violeta por precipitación de las sales biliares
RECUENTO
Técnica de recuento en filtración en membrana:
Se utilizan como medios selectivos:
MF-ENDO
CHAPMANN TTC – TERGITOL 7
Se incuba a 37 ºC durante 24 horas
La lectura positiva son la formación de colonias (no puntiformes) rojo púrpura con halo de precipitación violeta en el medio MF-ENDO y de color amarillo o anaranjado en el medio CHAPMANN TTC – TERGITOL 7
RECUENTO
Técnica de recuento en medio líquido:
Se utiliza la técnica del NMP
Como caldos se pueden utilizar:
Caldo lactosado de púrpura de bromocresol
Caldo lactosado biliado verde brillante (B.G.B.L.)
Siempre con campana de Durham (detectar gas)
Se incuba a 37 ºC durante 24 horas
La lectura es positiva si la formación de gas es al menos un 10 % del volumen de la campana
RECUENTO
Características generales:
Características de coli-aerogenes
Además, la aptitud de poder proliferar entre 43-45 ºC
Su origen es estrictamente fecal y debe considerarse como presunto E. coli
Valor indicativo:
Su origen fecal es indudable por lo que posee la especifidad requerida y una buena sensibilidad
COLIFORMES FECALES
Detección: Todos los métodos para coliformes totales
Se utiliza el medio líquido caldo B.G.B.L., subcultivando las placas o los tubos positivos de los coliformes totales con campana Durham
Los tubos se incuban a 44,5 ºC durante 24-48 horas (baño de agua)
Positivos si aparece al menos un 10 % de gas en las campanas
Recuento: Todos los métodos para coliformes totales
Se realiza en medio líquido (NMP) utilizando caldo B.G.B.L., a partir de los tubos positivos de los coliformes totales
Se incuban a 44,5 ºC durante 24 horas en baño María considerándose positivo cualquier tubo con gas superior a un 10 %
COLIFORMES FECALES
ESCHERICHIA COLI
Características generales:
Enterobacteria que muestra todas las características de los
coliformes fecales y algunas particulares, como:
Movilidad general
Indol positivo
Rojo de metilo positivo
Acetilmetilcarbinol negativo
Citrato negativo
Ureasa negativos
ESCHERICHIA COLI
Valor indicativo:
Testigo más específico de contaminación fecal
No tiene relación con la de las Enterobacteriaceae patógenas pero
representa un riesgo potencial
Su sensibilidad es buena pero se le acusa de poca resistencia
comparada con patógenos, sobre todo Salmonella, por lo que ésta
debe ser investigada siempre
Basta una pasteurización o la congelación para destruirla
Su presencia, atestigua contaminación fecal reciente
ESCHERICHIA COLI
Detección:
Agotamiento en estrías sobre agar Levine eosina azul de metileno
(E.M.B.)
Incubar a 37 ºC durante 24 horas
Positivas las colonias que presentan un centro azul-negro y,
generalmente pero no siempre, brillo metálico verdoso
RECUENTO
Técnica de recuento en medio sólido: El recuento se realiza mediante siembra en masa (a veces
superficie) en agar V.R.L.B. o V.R.B.A
Se incuba a 44,5 ºC durante 24 horas, para contar las colonias rojo-
púrpura rodeadas de una zona violeta (debida a la precipitación de
sales biliares)
Técnica de recuente en medio líquido: Se efectúa según la técnica de NMP utilizando como caldo de cultivo
B.G.B.L y campana Durham
Se incuba al baño María a 44,5 ºC durante 24 horas
Positivos los tubos con gas en al menos un 10 %
Uso de medios cromogénicos: Mug-plus
Crome-Id
Cromagar ECC
TBX
CONFIRMACIÓN
Las colonias típicas obtenidas pueden confirmarse por subcultivo en:
B.G.B.L. y Agua de triptona (T.W.) al 5 %.
Durante 24-48 horas a 44,5 ºC
Positivas: Formación de gas en B.G.B.L. e Indol positivo en T.W. al 5
%
I.M.V.iC.
Indol: positivo
Rojo de metilo: positivo
Voges-Proskauer: negativo
Citrato: negativo
Características generales:
Bacilos, Gram-negativos, aeróbicos y anaeróbicos facultativos, no
esporulados, móviles o inmóviles, que fermentan la glucosa, reducen
los nitratos a nitritos, son citocromooxidasa-negativos y crecen en
medios que contienen sales biliares
Valor indicativo:
Mossel propuso la sustitución de las Enterobacteriaceae por los
coliformes como índice de contaminación fecal por los siguientes
motivos:
Definición taxonómica imperfecta de los coliformes
Los coliformes solo evidencian las Enterobacteriaceae lactosa positivas,
cuando las especies patógenas, como Salmonella, son lactosa negativas
La sensibilidad reducida de los coliformes, ya que su número es pequeño
respecto de las Enterobacteriaceae
ENTEROBACTERIACEAE
Uso
Se recomienda el uso de Enterobacteriaceae totales cuando se ha
alterado el equilibrio de la flora en un alimento por diferentes
causas:
Bajo pH y/o baja actividad de agua
Conservación de alimentos por frío
Tratamiento térmico suave del alimento
ENTEROBACTERIACEAE
Preenriquecimiento:
Se utiliza el caldo de triptona y soja (T.S.B.)
Durante 2 horas a temperatura ambiente y agitando de cuando en
cuando
Se revivifican los gérmenes lesionados por el tratamiento
Enriquecimiento:
Sobre la muestra pre-enriquecida , se añade caldo E.E. de Mossel de
doble fuerza
Se incuba a 31 ºC durante 18-24 horas
Estas etapas de pre-enriquecimiento y enriquecimiento sólo son
necesarias en aquellas muestras de alimentos que hayan sufrido
distintos tratamientos de preservación en su elaboración
DETECCIÓN
Detección:
La muestra una vez enriquecida, si es necesario, se siembra por
agotamiento en estrías sobre agar biliado rojo violeta glucosa
(V.R.B.G.)
Se incuba a 31 ó 37 ºC durante 24 horas
Presuntas las colonias teñidas de rojo violeta con halo de
precipitación del mismo color debido a la precipitación de sales
biliares
DETECCIÓN
Técnica en medio sólido en masa:
Se utiliza la técnica de cultivo en masa y en doble capa con agar V.R.B.G.
Se incuba a 37 ºC durante 24 horas, contándose aquellas colonias del aspecto descrito en su detección
Técnica en medio sólido en superficie:
Se emplean el mismo medio de cultivo y la misma incubación
La siembra superficial del inóculo mediante asa de Driglaski es 0,1 mL
Técnica de recuento en medio líquido:
Utiliza la técnica de NMP
Las diluciones decimales caldo triptona soja (T.S.B.)
Caldo de cultivo caldo de Enterobacterias (E.E.B.) simple
Incubar a 37 ºC durante 24 horas
RECUENTO
Previamente se purifican las colonias sobre agar P.C.A. con incubación a 37 ºC y siempre a 24 horas
Prueba de la citocromo-oxidasa: La citrocromo-oxidasa en un enzima ferroporfirínico que oxida el citrocromo C reducido inactivándolo. Con reactivo diclorhidrato de N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiamina, Enterobacteriaceae son oxidasa negativas
Fermentación del agar glucosa sal: Picadura en tubo de agar glucosa sal, para cubrir con parafina estéril e incubar a 37 ºC durante 24 horas. Si el color del medio vira a amarillo, lo que da Enterobacteriaceae es positivo
Prueba de fermentación sobre agar Klinger (K.I.A.): Esta prueba, además de confirmativa, nos ayuda a identificar el microorganismo sembrado. El medio incorpora dos azúcares, la glucosa y la lactosa, además de sulfato(o citrato) ferroso como indicador del ácido sulfhídrico
CONFIRMACIÓN
Fondo amarillo = fermenta glucosa
Fondo rojo = no fermenta glucosa
Superficie amarilla = fermenta lactosa
Superficie roja = no fermenta lactosa
Gas = presencia de burbujas en el
medio, entre el medio y el tubo, o rotura
del medio
Producción de SH2 = Ennegrecimiento
de la interfase entre la pendiente y el
fondo. A veces se ennegrece toda la
parte inferior del tubo
LECTURA K.I.A.
TABLA ASIGNACIÓN K.I.A. FONDO ZONA INCLINADA SH2 MICROORGANISMOS
AG A - En. aerogenes
AG A - Enterobacter cloacae
AG A - Escherichia coli
AG SC + Proteus vulgaris
A o AG SC - Proteus morganii
A SC - Shigella sonnei
A SC o ALC + Salmonella typhi
AG SC o ALC + S.Typhimorium
AG SC o ALC + Salmonella enteriditis
•AG = formación de ácido y gas (amarillo y burbujas)
•A = formación de ácido (amarillo)
•SC = sin cambios
•ALC = alcalino (rojo)
•+ = producción de SH2 (negro)
•- = no produción de SH2 (no ennegrece)
El género Streptococcus se encuentra dentro de los cocos Gram
positivos
Antiguamentemente, nos referiamos a ellos como Streptococcus del
grupo D de Lancefield
Además de comprender los enterococos del tubo digestivo humano,
comprende especies cuyo hábitat es el intestino de animales y aves
Se caracterizan por:
Forma cocóide
Generalmente agrupados en cadenas
Ser inmóviles
No esporulados, microaerófilos o anaerobios facultativos
Catalasa negativos
ENTEROCOCOS
Se utilizan como índice de contaminación fecal en el análisis
bacteriológico del agua
En alimentos su valor es más discutido
La especifidad es medianamente satisfactoria
También se le achaca el no poder determinar si la contaminación
fecal es animal o humana
En algunos alimentos, sobre todos fermentados, deben considerarse
como parte de la flora normal
En cuanto a su resistencia, muy elevada, es defendida por algunos
autores, y puesta en duda por otros
En cualquier caso su presencia en un número elevado puede
evidenciar falta de higiene en la elaboración de ciertos alimentos o
condiciones de conservación defectuosas
Su detección se utiliza con éxito para comprobar las condiciones
higiénicas de plantas industriales
VALOR INDICATIVO
Detección:
Prueba presuntiva:
Se utiliza el caldo Kanamicina-Aesculina-Azida (K.A.A.)
Incubación a 37 ºC durante 24 horas
Positivo si el medio se ennegrece
Prueba confirmativa:
De los tubos positivos de K.A.A., se siembran en superficie sobre
agar K.A.A.
Incubando las placas a 37 ºC durante 24 horas
Positivas aquellas colonias rodeadas de halos negros
DETECCIÓN
Recuento:
Recuento en medio sólido en superficie: Agar K.A.A. en
superficie a 37 ºC durante 24 horas, positivos halos negros
Recuento en filtración en membrana: medio Slanetz-Bartley,
positivos colonia color rojo ladrillo
Recuento en medio líquido:
Utiliza la técnica de NMP
Caldo K.A.A. o caldo azida de Rothe. Este caldo se considera
positivo por enturbiamiento y viraje del púrpura de bromocresol
Para confirmar los tubos se utiliza o bien el agar K.A.A. o el caldo etil
violeta azida (E.V.A.) también conocido como caldo de Litsky
Positivos son color o sedimento color violeta
RECUENTO
Tinción de Gram: cocos agrupados en cadenas cortas Gram-positivos
Prueba de la catalasa: La catalasa es un enzima ferroprotéico capaz de
catalizar la ruptura del peróxido de hidrógeno con liberación de
oxígeno. En caso positivo, como no ocurre en los enterococos, existe
desprendimiento de burbujas
Crecimiento en agar esculina bilis: Todos los Streptococcus del grupo D
de Lancefield crecen en agar esculina bilis
Crecimiento en presencia de cloruro sódico: Los Streptococcus del
grupo D de Lancefield crecen en caldo B.H.I. que contenga un 6,5 %
de cloruro de sodio previa incubación a 37 ºC durante 72 horas
(excepto St. equinus y St. bovis)
Crecimiento a 45 ºC: Todo el grupo crece a 45 ºC en caldo B.H.I.
CONFIRMACIÓN
Son gérmenes del género Clostridium, que tienen en común el reducir
el sulfito a sulfuro
Su capacidad para esporular les confiere una gran resistencia
Valor indicativo:
Sus esporas les hacen resistentes, por lo que se pueden utilizar como
indicadores fecales contaminación no reciente
No obstante también pueden tener un origen telúrico
Su investigación debe efectuarse, porque algunos de sus miembros
como, Clostridium perfringens o Cl. botulinum son patógenos
CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES
Detección:
Crecimiento de medios que contienen sulfito de sodio y hierro. La reducción del sulfito a sulfuro origina coloración negra
Incubación en condiciones anaerobias:
Regenerar los medios.
Emplear jarras de anaerobios
Sembrar en profundidad y sellar con parafina
Como medio, se suele emplear el agar sulfito-polimixina-sulfadiazina (S.P.S.), el agar de Wilson-Blair o agar triptosa-sulfito-cicloserina (T.S.C.)
DETECCIÓN
.
Su recuento se puede realizar mediante la numeración de formas vegetativas y esporuladas conjuntamente, o sólo de las formas esporuladas
Recuento de formas vegetativas y esporuladas:
Se efectúa mediante siembra en masa en tubo en profundidad con agar S.P.S. regenerado
En anaerobiosis
Incubando a 46 ºC durante 48 horas
Las colonias a contar se distinguen por su color negro
La sulfadiazina es selectiva y solo inhibe los Gram-negativos
Recuento de formas esporuladas:
Aprovechamos su termo-resistencia calentando a 80 ºC durante unos 10 minutos para eliminar las formas vegetativas:
La disolución madre
La serie de diluciones decimales
Proceder como en el recuento total
RECUENTO
NH3
Especie perteneciente a la familia de las Pseudomonaceae:
Forma bacilar
No esporulados ni capsulados
Extraordinariamente móviles mediante cilios polares
Son aerobios estrictos
Valor indicativo: Se utiliza para determinar la contaminación en la
manipulación de las aguas, fundamentalmente la envasada para
consumo humano
Enriquecimiento: Caldo de enriquecimiento caldo selenito cistina por
incubación a 42 ºC durante 24 horas.
Detección y recuento:
Siembra superficial en agar Cetrimide
Incubación a 42 ºC durante 24 horas
Positivas aquellas colonias que adquieren un color verde
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Tinción de Gram: Gram-negativa
Prueba de la Oxidasa: Citocromooxidasa-positiva
Investigación de pigmentos:
Se realiza mediante siembra en estrías de dos medios
King A, para la investigación de la piocianina, pigmento amarillo-verdoso
fluorescente y soluble en agua y cloroformo
King B, para la investigación del pigmento pioverdina, de color azul soluble
en agua y no en cloroformo
Ps. aeruginosa, da siempre positiva la presencia de piocianina y a veces la
de pioverdina. Además presenta fluorescencia en agar cetrimida.
CONFIRMACIÓN
Género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae
Forma bacilar
No esporulados
Habitualmente móviles mediante flagelos perítricos
Gram negativos
Aerobios y anaerobios facultativos
Capaces de reducir los nitratos a nitritos
Fermenta la glucosa con producción de ácido y gas
SALMONELLA
Su reservorio primario es el tracto intestinal
Su transmisión es, sobre todo, por contaminación fecal de productos
alimentarios
Su patogenicidad provoca enfermedades tifoideas y otros cuadros
clínicos conocidos como salmonelosis
Dosis infectivas están entre los 105 y 109 gérmenes/g de alimento
Su peligro es tal que la legislación rara vez utiliza los recuentos, sino
el término presencia / ausencia (P/A), generalmente en 25 g
(actualmente 10 g), para desechar una partida alimentaria
SALMONELLA
Revivificar, recuperar y aumentar la vitalidad de la bacteria
Cuando el alimento en estudio ha sufrido procedimientos de
conservación
Se usan medios de cultivo líquidos no selectivos:
Caldo glucosado o caldo lactosado
Agua de peptona tamponada (B.W.P.)
Incubación a 37 ºC durante 16-20 h
PRE- ENRIQUECIMIENTO
Facilitar la multiplicación de Salmonella inhibiendo el crecimiento de gérmenes competitivos
Deben ser lo suficientemente selectivos, pero a su vez ser capaces de recuperar todos los serotipos
Ningún medio de cultivo lo cumple, generalmente se usan dos diferentes en paralelo
Se suelen utilizar caldos:
Con base tetrationato: caldos de tetrationato bilis verde brillante, de Muller-Kaufmann y el caldo tetrationato novobiocina
Con caldos a base de selenito: caldo selenito cistina, el caldo selenito verde brillante sulfamida y el caldo de Rappaport-Vassiliadis
En cuanto a la incubación, parece aconsejable incubar un caldo a 37 ºC (base tetrationato) y otro a 42 ºC (base selenito) durante 24-48 h
ENRIQUECIMIENTO
Son muchos los medios sólidos selectivos. Agar base al que se le
adiciona colorantes, sales biliares, antibióticos y otros inhibidores y
un sistema indicador, basado en la producción de SH2 y la
fermentación de carbohidratos como lactosa, sacarosa o xilosa
Medios:
Poco selectivos: como el agar McConkey
Moderadamente selectivos y diferenciales:
Agar citrato desoxicolato
Agar Salmonella-Shigella (S.S.)
Agar de Hektoen
Agar xilosa lisina descarboxilasa (X.L.D)
Medios altamente selectivos y diferenciales:
Agar verde brillante (B.G.A.)
Agar bismuto sulfito
DETECCIÓN
Prueba de la oxidasa: como Enterobacteriaceae es oxidasa-negativa
Siembra en agar Klinger: Se caracteriza por fermentar la glucosa con producción de gas, no fermentar la lactosa y producir generalmente sulfuro de hidrógeno
Siembra en agar urea: Salmonella es ureasa negativa
Siembra en caldo lisina descarboxilasa: caldo que se recubre de parafina estéril y se incuba a 37 ºC durante 4 días se observa diariamente. La reacción es positiva si aparece un color rojo o violeta, como ocurre con Salmonella
Pruebas I.M.V. i C.:
I (-)
M (+)
V (-) ?
C (+) ?
CONFIRMACIÓN
Género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae
Forma bacilar
No esporulados
Inmóviles (pero con oscilación “in situ”)
Son Gram negativos
Aerobios y anaerobios facultativos
Citocromo oxidasa negativos
Capaces de fermentar la glucosa sin producción de gas ni SH2
Con poca actividad bioquímica
SHIGELLA
Su reservorio primario es el tracto intestinal de humanos y primates enfermos
Los alimentos sólo son vectores inespecíficos a partir del hombre
Provoca disenterías bacilares por toxiinfección (presencia de endotoxinas) alimentaria, una serie de patologías conocidas con el nombre de sigelosis (antiguas disenterias bacilares)
Aunque su presencia es inferior a Salmonella se aconseja su estudio en los mismos términos de P/A
SHIGELLA
Enriquecimiento:
Caldos Gram-negativo (G.N.)
Caldo de Mossel
Incubación se realiza a 37 ºC durante 16-18 h
Aislamiento:
De menor a mayor selectividad se utilizan:
Agar McConkey
Agar X.L.D.
Agar entérico de Hektoen (en el que a veces aparecen falsos positivos)
Incubar a 37 ºC 24-48 horas
ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO
Prueba de la oxidasa: Como integrante de la familia
Enterobacteriaceae es oxidasa-negativa
Siembra en agar Klinger: Se caracteriza por fermentar la glucosa sin
producción de gas, no fermentar la lactosa y no producir,
generalmente, sulfuro de hidrógeno
Siembra en agar urea: Shigella es ureasa negativa
Pruebas I.M.V. i C.:
I (d)
M (+)
V (-)
C (-)
Prueba de la catalasa: Shigella es catalasa-positiva, excepto Sh.
Dysenteriae tipo1
Prueba de la potasa: Shigella se comporta como Gram-negativa, y,
por tanto, es potasa-positiva
CONFIRMACIÓN
Especie bacteriana perteneciente a la familia Micrococcaceae:
Gram-positivos en masas irregulares
Aerobios y anaerobios facultativos
Fermentadores de glucosa sin formación de gas
Capaces de crecer en medios altamente salinos (hasta un 15 % de
NaCl) y en medios que contiene telurito y bilis
Son oxidasa-negativos y catalasa-positivos
Es un germen ubicuitario
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Su poder patógeno se basa en supuraciones, septicemias,
gastroenteritis e intoxicaciones alimentarias
Capaz de producir:
Enzimas:
Coagulasa
Desoxirribonucleasa (DNsa)
Fosfatasa
Penicilasa
Lipasa, etc.
Toxinas:
Hemolisinas (a, b, d,)
Leucocidina
Enterotoxinas (de las que se conocen 8)
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Enriquecimiento:
No son necesarios
Apropiado cuando se supone un número de gérmenes escaso
Caldo de tripticasa soja con un 10 % de NaCl ( T.S.B.S.)
Caldo de carne cocida con un 6-10 % de NaCl (C.M.M.)
Caldo de Giolitti-Cantoni
Incuba en anaerobiosis utilizando parafina a 37 ºC durante 18-24 horas
Aislamiento–identificación:
Se utiliza el sistema de resiembra superficial de los tubos de enriquecimientos positivos
El medio más utilizado es el agar de Baird-Parker (B-P)
Además de selectivo es diferencial
Contiene telurito potásico y yema de huevo
Las colonias típicas son pequeñas, convexas, negras (por formación de teluro a partir del telurito), con borde blanco muy fino y rodeadas de zonas claras (halo debido a la actuación de la lipasa sobre la yema de huevo)
La incubación se realiza a 37 ºC
Se observa a las 24 y a las 48 horas definitivamente
IDENTIFICACIÓN
Método del NMP:
Con caldo Giolitti-Cantoni
Siembra en superficie:
A partir de la serie de diluciones decimales
Con agar Baird-Parker
Otros agares:
Agar manitol sal
Agar Vogel-Johnson
Medios cromogénicos (chromID S. aureus )
RECUENTO
Prueba de la coagulasa:
Las colonias típicas se resiembran en caldo B.H.I.
Se incuban a 43 ºC hasta enturbiamiento, que si no sucede en 24 horas se desecha
En caso positivo, en un microtubo, se añade 0,3 mL de plasma de conejo con ácido etilendiamino tetraacetato disódico (EDTA) y 0,1 mL de caldo de cultivo B.H.I.
Se incuba a 37 ºC durante 6 horas y se observa si se ha producido la coagulación del plasma
Prueba de la DNsa:
Se resiembra mediante estría única o botón en agar DNsa
Se incuba a 37 ºC durante 18-24 horas
Como agentes reveladores se utilizan:
Ácido HCl 1N, con lo que aparecerá una zona transparente alrededor de la estría
Solución de azul de toluidina, en cuyo caso, aparecerá un halo rosa alrededor de la estría, cuando el ensayo sea positivo
CONFIRMACIÓN
Existen cepas de E. coli causantes de enfermedad y cuyo estudio,
menos usual, más costoso y difícil es necesario
Las cepas más comunes corresponden a diferentes grupos:
Enteropatogénica (ECEP)
Enterotoxigénica (ECET)
Enteroinvasiva (ECEI)
Enterohemorrágica (ECEH)
Enteroagregativa (ECEA)
Adherencia difusa (ECAD)
Tres son las cepas patógenas más estudiadas:
E. coli enterotoxigénico, capaz de producir dos enterotoxinas
denominadas termolábil y termoestable respectivamente
E. coli enteropatógeno, de patogénesis oscura
E. coli enteroinvasivo.
Aunque varía en función de la cepa y del estado general de la
persona afectada, se considera que la dosis infectiva está en 105 /g.
E. COLI PATÓGENO
La epidemia de ‘E.coli’ que ya mató a 21 personas en Alemania podría tener su origen en una planta de brotes de soja (frejolitos chinos) ubicada en Baja Sajonia, noroeste del país, señalaron hoy las autoridades locales.
Los procedimientos analíticos van encaminados a facilitar la
recuperación de cepas atípicas porque se apartan de las
características peculiares de la especie:
No fermentan lactosa
No producen gas en la fermentación de la lactosa
Sensible a elevadas temperaturas de incubación
Inhibición de su crecimiento en medios selectivos adecuados
Imposibilidad de crecimiento en presencia de otras
Enterobacteriaceae
No producen indol, etc.
CARACTERES PECULIARES
CONSERVACIÓN DE MUESTRAS
En el caso de tener que conservar las muestras, debe evitarse la congelación,
puesto que, las cepas atípicas empiezan a declinar e incluso a destruirse a partir de
los 6-7 ºC.
PREENRIQUECIMIENTO
Se utiliza el caldo de triptona soja (T.S.B.), manteniendo a 37 ºC durante 6 horas
ENRIQUECIMIENTO
Caldo lauril sulfato triptosa (L.S.T.)
Se incuba a 44 ºC durante 18 horas
Fermentando la lactosa rápidamente
Caldo EE de Mossel.
Se incuba a 41,5 ºC durante 18 horas
Fermentando la lactosa lentamente
AISLAMIENTO
Se utiliza agar selectivo:
Levine para las cepas que fermentan rápidamente la lactosa
Mc Conkey, para las que lo fermentan lentamente
Se incuban a 37 ºC durante 24 horas
E. COLI PATÓGENO
Comprobar que sean E. coli:
Siembra sobre agar tres azúcares hierro (T.S.I.)
Siembra en caldo púrpura de bromocresol arabinosa
Siembra en caldo urea
Siembra en caldo triptona (T.W.)
Comportamientos atípicos:
Siembra sobre caldo KCN
Siembra sobre caldo glucosa tamponado
Siembra sobre caldo lisina descarboxilasa
Siembra sobre caldo púrpura de bromocresol adonitol
Nitratos
Tinción de Gram
Citocromo oxidasa
CONFIRMACIÓN SEROLÓGICA
Se realiza por aglutinación en porta utilizando antisuero polivalente inicialmente, para
posteriormente utilizar todos los monovalentes que lo constituyen. Las especies
enteropatógenos tienen unos serotipo definidos y dan la aglutinación tardía, en cuyo caso
será también autoaglutinante en solución salina.
CONFIRMACIÓN
Bacteria Gram-positiva aunque al envejecer pueden convertirse en
Gram-negativa
Bacilos cortos de extremos redondeados o agudos
No esporulados ni capsulados
Generalmente móviles (1 ó 2 flagelos polares)
Psicotróficos, microaerófilos y anaerobios facultativos
Patógenos intracelulares causante en el organismo de listeriosis
Con producción de la toxina hemolítica b
Temperatura de crecimiento óptimo entre 30 °C - 37 ° C, pero se
reproduce 3 ° C - 45 ° C, y también pueden crecer a temperaturas entre 1
° C - 4 ° C
Es la capacidad de adaptación para la supervivencia y el crecimiento en
los alimentos procesados, y mantenidos en refrigeración lo que la hace
especial
Además de su transmisión por los alimentos puede transmitirse por vía
transgenital y transplacentaria
LISTERIA MONOCYTOGENES
Pre-enriquecimiento:
Enriquecimiento primario en caldo Frazer a media concentración
Incubar a 24 horas a 30 ºC
Enriquecimiento:
Inoculando 0,1 mL de pre-enriquecimiento, en 10 mL de Caldo Frazer
Incubar a 37 ºC durante 48 horas
Aislamiento:
Siembra superficial en:
Agar PALCAM
Agar Oxford
Incubación aeróbica o microaerofílica a 37 º C durante 24 horas
Las colonias típicas en agar PALCAM son grises o verdes con halo
de marrón a negro. En agar Oxford dan colonias incoloras halo
oscuro
Actualmente se usan medio cromogénicos específicos:
Agar Aloa que da colonias azul-verdosas con halo
Agar Cromocytogenes
Investigación en términos de Presencia / Ausencia
AISLAMIENTO
Las colonias presuntivas, se purifican en agar TYSEA o en caldo
TYSEB
Pruebas bioquímicas confirmar género:
Catalasa
Tinción de Gram y motilidad
Pruebas bioquímicas para confirmar la especie:
Hemólisis sangre
Fermentación de ramnosa y xilosa: negativo
Voges-Proskauer: positivo
Test de Camp: positivo
Los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) producen una proteína difusible
y termoestable (factor CAMP) que aumenta la beta-hemólisis de otros
microorganismos como Staphylococcus aureus. Listeria monocytogenes
genera el mismo factor CAMP
CONFIRMACIÓN
BACILLUS CEREUS
Características generales:
Especie bacteriana perteneciente a la familia de las Bacillaceae
Bacilos voluminosos de extremos rectos
Generalmente móviles (flagelos perítricos)
Son Gram positivos y V-P positivos
Hábitat:
Germen ubicuitario
Considerado como saprófito
Presente en alimentos crudos, secos y elaborados
Enfermedades:
Bronconeumonía
Meningitis
Septicemias
Infecciones oculares
Síndromes diarreicos y eméticos
Transmisión: Por intoxicación debida a varias enterotoxinas:
Enterotoxina lábil diarreica
Enterotoxina emética
Toxina necrótica
Toxina de permeabilidad vascular
Toxina hemolítica
Dosis infectiva: 106/g aunque en algunos casos la cifra ha sido inferior
Presencia alimentaria: En alimentos muy variados como salsas, cremas, infusiones, vegetales, carnes crudas y preparadas, pastas, arroces, etc.
PATOGENICIDAD
Características generales:
Perteneciente a la familia de las Bacillaceae
Bacilos rectos, gruesos, aislados o agrupados en cadenas
cortas
Esporulados
Anaerobios estrictos
Gram positivos
Hábitat: Es una de las bacterias más ampliamente distribuidas en
la naturaleza, incluidas las heces de animales y humanos.
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
PATOGENICIDAD
Enfermedades:
Tres tipos de cepas A, B y C
Elaboran toxinas, la primera y última con importancia alimentaria
La toxina más peligrosa es la a de A, hemolítica y letal, productora de
eritemas.
Transmisión: Por alimentos y moscas
Dosis infectiva: 106/g alimento
Presencia alimentaria: En carnes y pescados crudos, platos
preparados, frutas y verduras, hortalizas, pastas, queso, aceitunas,
etc.
Características generales:
Especie bacteriana perteneciente a la familia de las Bacillaceae
Bacilos de extremos redondeados, solos o agrupados en parejas
o en cadenas cortas
Generalmente móviles (cilios perítricos)
Son gram positivos
Anaerobios estrictos (en presencia de oxígeno pueden fabricar
toxinas)
Hábitat: Es un germen habitualmente telúrico y saprófíto fecal
CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Enfermedades:
Intoxicación alimentaria por toxinas botulínicas
Especies A-G
Inhiben la liberación de acetilcolina, y, por tanto, la contracción muscular y la parálisis respiratoria hasta la muerte
Transmisión: Ingestión de alimentos en los que previamente se ha multiplicado el germen
Dosis infectiva: 0,1- 1 mg de toxina es letal en el hombre
Presencia alimentaria: En salazones, semiconservas, queso, conservas y alimentos ácidos como los encurtidos y fermentados
PATOGENICIDAD
Características generales:
Perteneciente a la familia de las Vibrionaceae Bacilos pleomorfos Generalmente móviles (flagelos polares o perítricos en cultivos sólidos) Gram-negativos Anaerobios facultativos Halófilos hasta el extremo de que se destruyen con agua destilada Son catalasa positivo Oxidasa positivo V-P negativo Indol positivo No forma SH2
Hábitat: Agua de mar y pescados y mariscos crudos aunque
también cocidos por contaminación cruzada
VIBRIO PARAHEMOLYTICUS
Enfermedades: Enfermedades asociadas a la exposición del agua marina
Transmisión: Por alimentos de origen marino
Dosis infectiva: 106-107/g lo que se consigue fácilmente debido a su elevada velocidad de reproducción. G = 10-15 minutos
Presencia alimentaria: En pescados y mariscos frescos, productos del mar cocinados y otros alimentos
PATOGENICIDAD
Características generales: Perteneciente a la familia de las Vibrionaceae
Bacilos pequeños, incurvados y con tendencia al pleomorfismo
Móviles (flagelos perítricos)
No esporulados ni encapsulados
Son Gram-negativos
Aerobios y anaerobios facultativos
Indol positivo
Nitrorreductores
Citrato positivo
Oxidasa positivo
Catalasa positivo
Ureasa negativo
Hábitat: Agua de lagos, ríos y estuarios, sobretodo salobres, y en
verano
VIBRIO CHOLERAE
PATOGENICIDAD Enfermedades:
Enteritis con nauseas, vómitos, diarrea, dolores abdominales y pérdidas de electrolitos en heces que pueden provocar la muerte
Poseen una enterotoxina que activa la adenilato ciclasa que incrementa la secreción de la mucosa intestinal
Transmisión: Aguas contaminadas con heces o las verduras regadas con las mismas. También las moscas
Dosis infectiva: Los enfermos expulsan de 106-108/g en heces aunque se desarrollan a elevada velocidad
Presencia alimentaria: Frutas y verduras crudas y otros alimentos por contaminación cruzada
Características generales:
Perteneciente a la familia de las Enterobacteriaceae Bacilos ovoides con pleomorfismo en cultivos viejos, siendo cocoides en
cultivos jóvenes Generalmente inmóviles a alta temperatura y móviles (flagelos
perítricos) a baja temperatura Son no capsulados Catalasa positivo Oxidasa negativo Ureasa positivo Psicotróficos (a temperatura de refrigeración)
Hábitat: Es un germen ubicuitario presente en agua y alimentos, así
como en heces de animales domésticos, salvajes o de ganadería
YERSINIA ENTEROCOLÍTICA
Enfermedades:
Yersiniosis, o gastroenteritis agudas
La patogenicidad está en función de la temperatura de incubación
Transmisión: Por alimentos y aguas
Dosis infectiva: Elaboración suficiente de toxina termoestable
Presencia alimentaria: En alimentos muy variados como leches
crudas y pasteurizadas, helados, quesos, carnes envasadas,
ovoproductos, alimentos marinos, vegetales, frutas y agua
PATOGENICIDAD
Características generales:
Perteneciente a la familia de las Spirillaceae
Gérmenes de morfología curvada o espiral
Muy móviles (1 ó 2 flagelos polares)
Microaerófilos (capaces de proliferar en atmósferas con menos del 6
% del oxígeno y más del 5 % de dióxido de carbono)
Gram negativos
Oxidasa positivos
Catalasa positivo (con excepciones)
Hábitat: Flora intestinal de animales y aves domésticas o
salvajes, así como en aguas y alimentos sólidos y líquidos
CAMPYLOBACTER
Enfermedades:
Gastroenteritis humanas o campilobacteriosis
Debida a C. jejuni y C. coli (con capacidad de crecimiento a 42 ºC e inhibición a 25 ºC)
Transmisión:
Por contacto
Contaminación cruzada de alimentos
Ingestión de alimentos infectados mal cocinados y/o refrigerados
Dosis infectiva: 2 ó 3 /g.
Presencia alimentaria: En alimentos muy variados como agua, leche,
carnes, etc.
PATOGENICIDAD
Características generales:
Enterobacter sakazakii, ahora reclasificado como un nuevo género
llamado Cronobacter
Está relacionada con infecciones neonatales
Bacteria bacilar
Móvil
Anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae
Hábitat:
Microorganismo ubicuo que se conecta a las superficies, formando
biopelículas que son resistentes a la limpieza y los agentes
desinfectantes
Una fuente natural probable para Cronobacter es material de origen
vegetal, ya que se ha aislado a partir de cereales como trigo, maíz, soja,
arroz, otras hierbas y especias, verduras y ensaladas
CHRONOBACTER spp
DETECCIÓN Y RECUENTO
Para los análisis microbiológicos clásicos, se utiliza una etapa de pre-
enriquecimiento para recuperar las células estresadas, seguido por
una etapa de enriquecimiento selectivo.
El métodos ISO / TS 22964:2006 recomiendan:
Agua de peptona tamponada (BPW) como medio de pre-
enriquecimiento a 37 ºC
Caldo lauril sulfato modificado (mLST) a 44 ° C durante la etapa de
enriquecimiento selectivo secundaria
El siguiente paso es entonces una agar cromogénico como HiCrome
Cronobacter spp. para el aislamiento y la identificación
PATOGENICIDAD
Enfermedades: El organismo puede causar infecciones neonatales graves:
enterocolitis necrotizante, septicemia y meningitis. La tasa de mortalidad tras
meningitis y otras infecciones es de 50%, con supervivientes neurológicamente
dañados de por vida. Afortunadamente, las infecciones son raras en los bebés,
pero pueden ocurrir en todos los grupos de edad, aunque con resultados
clínicos menos severos. Cronobacter spp. se ha demostrado para invadir las
células intestinales humanas, replicar en macrófagos, e invadir la barrera
hematoencefálica
Transmisión: Consumo de productos previamente infectados. El organismo es
muy tolerante a etapas de secado y puede sobrevivir dos años desecados en la
fórmula infantil y crecer rápidamente en la reconstitución.
Dosis infectiva: No evaluado. Cronobacter posee tiempos de generación
promedio de cerca de cinco horas a 10 ° C, pero de sólo 40 minutos a 23 ° C.
Presencia alimentaria: Prácticamente en todos los alimentos. También puede
estar presente como contaminación ambiental.
Características generales:
No corresponde a un grupo taxonónomico como tal
Se estudia por sus características de cultivo comunes
Poseen un gran poder alterante de los alimentos
Pueden ser peligrosos por sus micotoxinas
Hábitat: Es un germen ubicuitario y bastante resistente en cualquier medio
MOHOS Y LEVADURAS
Tanto para la detección o aislamiento como para el recuento se
utilizan medios sólidos
Tanto generales como específicos (uso de antibióticos)
Se utiliza también el cultivo en porta de Johnson
Para la identificación de las micotoxinas se suele utiliza la
cromatografía en capa fina (TLC)
Se usan aún para la identificación las técnicas microscópicas
DETECCIÓN Y RECUENTO
PATOGENICIDAD
Enfermedades:
Hepatotoxicidad
Necrosis
Hemorragias
Ergotismo
Dermatitis y edemas
Estrogénico
Transmisión: Consumo de productos infectados
Dosis infectiva: Depende de la toxina
Presencia alimentaria: Prácticamente en todos los alimentos
También puede estar como contaminación ambiental
OTRAS BACTERIAS
Chlorella
Agar Algas
Legionella
pneumophila
Agar BCYE
Micrococcus luteus PCA
