Microbiologia Parcial 2

Becerril Román María del Mar J. Gutiérrez Hernández Bernardo Novelo Carmona Milton B.

Microbiología parcial 2.

Citoplasma Bacteriano (protoplasma).

1. Parte de la célula que está dentro de la membrana

citoplasmática.

2. Tiene una consistencia parecida a un gel: compuesto de

agua, enzimas, sustancias nutritivas, desechos, y gases.

3. Contiene estructuras celulares: ribosomas, cromosoma y

plásmidos.

4. La matriz citoplasmática son las sustancias dentro de esta

membrana, excluyendo el material genético.

5. Material genético. En bacterias el 90% es expresable y 10 % es regulatorio (no se expresa); en levaduras el

70% es expresable, mientras que en el ser humano, sólo el 3%.

Cromosoma (ADN) disperso en el citoplasma bacteriano (También es llamado nucleoide). Puede ser

circular o lineal (como en actinomicetos o streptomyces).

El ADN circular se encuentra superenrollado y se organiza en dominios mediante las proteínas like

histonas (por ejemplo H, HU, IHF, H1, HLP1, P), para formar hebras infraenrolladas.

Existen enrollamientos positivos (hélice sobreenrollada, que se protege contra radiaciones) y

negativos (infraenrollada, es más común).

En el proceso de enrollamiento, participan las enzimas topoisomerasas que tuercen la hebra.

Ejemplos de topoisomerasas: ADN-girasa (clase II): Es blanco de algunos antibióticos, está presente

en bacterias y muchas arqueas. Topoisomerasa I: elimina el superenrollamiento y regresa la cadena al

estado relajado

Plásmidos. Son porciones de material genético extracromosómico, en general son circulares pero existen

algunos lineales.

Pueden ser unicopia (una sola replicación por ciclo celular que se coordina con la replicación

genómica) o multicopia (pueden reproducirse varias veces, independientes a la reproducción de la

bacteria).

Algunos de ellos contienen genes que proporcionan características diferentes a las bacterias, como

el plásmido F (plásmido conjugativo) que puede transferirse a otras bacterias mediante la conjugación,

tiene una región denominada región Tra que se excreta por el pili sexual mediante un sistema de secreción

tipo IV, éste sólo es recibido una vez y se vuelve una bacteria F+.

Otros, llamados plásmidos episomales, pueden integrarse al cromosoma y se replican bajo control

de éste. Existen plásmidos que se combinan con el ADN cromosómico llamados transposones. Secuencias

de inserción. Transposasas transposones(elaborada). Normales y Replicativos. Modelo de círculo rodante.

Endonucleasa (enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos).

Griffith: Ciertos péptidos activan señales de la célula.

Transcriptasa reversa: se utiliza en eucariontes para copiar una parte de ADN.

Bacteriófagos: abren canales.


Un transposón o elemento genético transponible es una secuencia de ADN que puede moverse de

manera autosuficiente a diferentes partes del genoma de una célula, un fenómeno conocido

como transposición. En este proceso, se pueden causar mutaciones y cambio en la cantidad de ADN

del genoma. Anteriormente fueron conocidos como "genes saltarines" y son ejemplos de elementos

genéticos móviles.

El transposón modifica el ADN de sus inmediaciones, ya sea arrastrando un gen codificador de

un cromosoma a otro, rompiéndolo por la mitad o haciendo que desaparezca del todo. En algunas

especies, la mayor parte del ADN basura (hasta un 50% del total del genoma) corresponde a

transposones.

A diferencia de los provirus, los transposones se integran en el ADN celular en lugares bien

determinados. Su existencia fue propuesta por Barbara McClintock en el maíz, sin embargo, su

existencia no se demostró hasta mucho más tarde en bacterias. Por ello fue laureada con el Premio

Nobel en 1983.

Los plásmidos son herramientas muy importantes en los estudios de biología molecular, se emplean

como vectores (agentes generalmente orgánicos que sirven como medio de transmisión de un organismo a otro) de genes

para la transformación de células. Los eucariontes no contienen plásmidos, pero pueden insertárseles para que produzcan

una determinada proteína.

Teniendo un plásmido, se puede insertar material genético a través de enzimas de restricción.

ARN. En la célula existen tres tipos principales de ARN (ácido ribonucleico).

•ARNm (mensajero)

•ARNt (de transferencia)

•ARNr (ribosomal). S son unidades de

sedimentación que no son aditivas, sino que se

les aplica una centrifugación y las subunidades

corren diferente que el ribosoma completo.

Los polisomas o polirribosomas son

los ribosomas unidos a una molécula de ARN

mensajero y que se encuentran sintetizando los

péptidos. Son visibles al microscopio electrónico.

http://www2.uah.es/biomodel/model1j/rna-prot/ribosoma.htm

6. A diferencia de los eucariotes, en las bacterias no existen compartimentos, por los que los procesos

de replicación de ADN, transcripción (ADN → ARNm) y traducción (ARNm + ARNt + ARNr →

Proteínas) ocurren en el citoplasma.

7. Inclusiones citoplasmáticas. (presentes en algunos microorganismos)

Gránulos de polisacáridos. Unidades de glucosa que son reserva de carbono y energía que se forma en un

exceso de carbono.

Glucógeno. Almidón(se identifica con lugol: solución yodo-yodurada).

http://es.wikipedia.org/wiki/Secuencia_de_ADN

http://es.wikipedia.org/wiki/Genoma

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

http://es.wikipedia.org/wiki/Mutacion

http://es.wikipedia.org/wiki/Acido_desoxirribonucleico

http://es.wikipedia.org/wiki/Gen

http://es.wikipedia.org/wiki/Cromosoma

http://es.wikipedia.org/wiki/ADN_basura

http://es.wikipedia.org/wiki/Provirus

http://es.wikipedia.org/wiki/Barbara_McClintock

http://es.wikipedia.org/wiki/Ma%C3%ADz

http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria

http://es.wikipedia.org/wiki/Premio_Nobel

http://es.wikipedia.org/wiki/Premio_Nobel

http://es.wikipedia.org/wiki/1983


Inclusiones lipídicas. Aparecen en varias especies de Micobacterium, Bacillus,

Azotobacter (alginatos), Spirillum.

Su nombre genérico es poli-β-hidroxialcanoatos (PHA) que se forman en exceso de

carbono. Pueden observarse al microscopio electrónico de transmisión o con

colorantes solubles en aceites.

Gránulos metacromáticos (volutina). Reserva de fosfato que se ponen en evidencia con una tinción con el

azul de toluidina, al combinarse con el polifosfato da un color violeta rojizo. Este fenómeno se

denomina metacromasia.

Gránulos de azufre. Reserva de fosfato que se ponen en evidencia con una

tinción con el Bacterias quimiolitotrofas y fototróficas que oxidan el H2S a Sº, este

último forma acumulaciones refringentes y visibles al microscopio (brillan en fondo

oscuro). El Sº puede ser oxidado nuevamente para producir SO42- y las inclusiones

desaparecen.

Cianoficinas. Polímero de carbono y nitrógeno que se forma en cianobacterias

(bacterias fotosintéticas). Es el único material de reserva conocido de nitrógeno y no es

sintetizado en los ribosomas. Se tiñen con azul de metileno.

Carboxisomas. Son acumulaciones de la enzima 1,5-di fosfato

carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) empleada por los microorganismos autótrofos

para fijar CO2 mediante el ciclo de Calvin, donde se une a una pentosa y la

molécula de 6C puede ser aprovechada en el metabolismo para formar

finalmente AcCoA.

Magnetosomas. Partículas de magnetita (Fe3O4). Imparten propiedades magnéticas, lo

cual se cree orienta a las bacterias. Rodeados por una membrana.

Vacuolas de gas. Formadas por dos diferentes proteínas: GvpA (Gas Vacuole

Protein A) y GvpC. Estas vesículas permiten a los

microorganismos flotar en los sistemas acuáticos. Hay

desplazamiento vertical en una columna de agua en

respuesta a cambios ambientales (inflan las bolsitas). Las producen las cianobacterias, las

bacterias fototróficas verdes y púrpura, y algunas aqueobacterias. Parecen

como granitos de arroz.

Preparaciones microbiológicas.

http://microexpfqunam.blogspot.mx/

1. Preparaciones en fresco (microorganismos vivos). Tinciones supravitales, se introducen en el

organismo mientras las células aún se encuentran vivas, colorante muy diluido.

2. Preparaciones fijas y teñidas (microorganismos muertos)

Hongos Condiciones ácidas. Exoenzimas secretadas.

Frotis: capa delgada de muestra extendida

sobre un portaobjetos que permite el paso de la

luz a través de ella.


Impronta. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, es como un sello y se obtienen muestras delgadas.

Gota de cultivo líquido. Se toma una gota y se coloca en portaobjetos.

Cultivo sólido suspendido.

Frotis sanguíneo. Gota en portaobjetos especial. Se usa para buscar protozoarios, cápsulas o diferenciales.

Cinta adhesiva transparente.

Hisopo. Puede ser de alginatos, algodón o un abatelenguas.

Se puede fijar con calor (frotis seco) o con solventes como etanol o metanol.

A los micobacterium puede fijárseles con solución de albúmina.

Tinciones. 1. Positivas. Se observa teñida la célula sobre un fondo claro.

Simples (1 solo colorante: azul de metileno, safranina, cristal violeta, etc.) y compuestas (como

Gimsa, Wright y May Crünwald).

Pueden usarse mordentes (compuestos químicos intensificadores de color aumentando la afinidad

colorante-molécula) y decolorantes.

2. Negativas. El fondo se tiñe de oscuro para observar células o estructuras refringentes, como la

cápsula donde se usa tinta china (tinción negativa de cápsula)

3. Diferenciales. Se pueden diferenciar las distintas especies por su coloración. (ZIehl-Neelsen, Gram).

4. Selectivas. Son utilizadas para dar color y aislar partes específicas de los microorganismos

(Endosporas, Flagelo, Núcleo).

Generalmente, se mezclan los colorantes con glicerina, ya que pueden ser muy agresivos y dañar a la célula.

Colorantes.

Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; están formados por un

grupo cromóforo que es la parte responsable del color, y un grupo auxócromo que al formar sales le

permite disociarse y combinarse. Si se rompen los enlaces conjugados, la molécula deja de tener color. Se

unen a proteínas o ácidos nucleicos.

1. Ácidos El cromóforo es el anión de la molécula (eosina).

2. Básicos. El cromóforo es el catión de la molécula (azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina).

Técnicas de tinción.

3. Tinción simple.

Frotis fijo con calor, seco.

Nos señala la forma, agrupación


4. Tinción de cápsula (Selectiva)

Extendido, no se puede fijar al calor porque se deshidratan las cápsulas,

se seca al aire.

Muestra + tinta china o nigrosina (carbón activado)

Safranina de Gram (es mejor la safranina 0.5, más concentrada) o Cristal Violeta

(1 min)

5. Tinción de endosporas (Selectiva). Sólo se tiñe el exosporio.

Verde de maquila 5% con emisiones de vapor de agua (10 minutos). Situación estresante

para que permita el paso del colorante.

Lavar con agua

Safranina 0.5% (1minuto)

6. Tinción de flagelo. Tampoco se puede fijar el colorante con una tinción simple.

Colorante primario. Pararosa anilina (preparada en el momento).

Mordente. Acido tánico, permite la fijación, principalmente al flagelo. Se deja depositar.

Colorante de contraste. Azul de metileno.

Proteus: Vibrio con flagelo perítrico. Se cultiva en agar inclinado, se gotea

SSI (solución salina) en la parte alta y se separan dos fases (la mitad es medio de

cultivo líquido), se mantiene a 37°C. Frotis: se toma la muestra con mucho

cuidado con una pipeta Pasteur y se coloca en un portaobjetos con un

rectángulo marcado con marcador de cera, se deja secar sin calor y se procede

a la tinción.

7. Tinción de Gram.

Colorante primario. Cristal violeta 1% en sol. de oxalato de amonio al 0.85% (1 min).

Penetra en las células, en G- no pasa a citoplasma.

Mordente. Lugol Iº/KI 1g/2g en 300 mL de agua (1 minuto). Forma complejos.

Decoloración. Etanol-Acetona 70:30 hasta eliminar el exceso de colorante para que no

se mezclen. Las G- pierden cristal violeta ya que se daña su membrana externa. Las G+ deshidratan

su pared y no permiten salir el colorante.

Colorante de contraste Safranina 0.25% (1 minuto).

Los hongos no tienen Gram, porque su pared está hecha de quitina.

8. Tinción de Ziehl-Neelsen.

Serología (anticuerpos)

PCR

Baciloscopía: es la técnica más segura para detectar

tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis).

Se toma la primera expectoración del día.

Neutralizar ácido.

Se deja secar una gota de muestra (frotis) y se

sella con albúmina.

Medio de cultivo 37 °C.

Ácidos micólicos retienen la fucsina básica

(Bacterias AAR: ácido alcohol resistentes)

El azul de metileno de Loeffler, se ha dejado oxidar 6 meses.

También tiñe esporas.


Microscopía.

Tipos de microscopías:

Metabolismo microbiano.

Suma de reacciones bioquímicas requeridas para la generación de energía (catabolismo) y el uso de ella para

sintetizar material celular a partir de moléculas del medio ambiente (anabolismo).

Las reacciones catabólicas producen energía como

ATP, el cual es utilizado en las reacciones anabólicas

para sintetizar el material celular a partir de nutrientes.

1. Enzimas: proteínas con función de catalizadores

biológicos; reducen la

energía de activación

de una reacción

química. Son

específicas para un

sustrato.


Grupo prostético: molécula no proteica que se une a la proteína(enzima) y forma parte de su estructura.

Cofactor (inorgánico) o coenzima (orgánico): se unen a la enzima para

que aumente la afinidad por el sustrato. La enzima cuando no está

unida al cofactor se le llama apoenzima.

Coenzimas de oxido-reducción: NAD+(principal coenzima

de óxido-reduccion; acarreador de electrones), NADP+,

FAD+, FMN+.

Otras coenzimas: CoA, Vitaminas.

La actividad enzimática es la cantidad de producto formado por

unidad de tiempo. Es modificada por factores que afectan a las proteínas, por

ejemplo: la temperatura y el pH. El pH que al influir sobre las cargas eléctricas,

podría alterar la estructura del centro activo y, por lo tanto, también influirá

sobre la actividad enzimática. La temperatura elevada desnaturaliza las

moléculas proteicas por lo que los sitios activos se ven modificados. La enzima

se satura a cierta concentración del sustrato, o sea que aunque aumentemos

la concentración, no aumentará la velocidad de la catálisis puesto que se ha

alcanzado la velocidad máxima de la enzima.

INHIBIDORES ENZIMATICOS.

Un inhibidor competitivo se une a la enzima en el sitio

activo, impidiendo la entrada y unión del sustrato. Un

inhibidor alostérico modifica la afinidad de la enzima

por el sustrato, al unirse en un sitio distinto (sitio

alostérico) al sitio activo.

REGULACIÓN DE LAS VÍAS METABÓLICAS.

Regulación por producto final de la reacción ->

Cuando hay suficiente producto, éste es un inhibidor

de una enzima reguladora, generalmente la primera

para que no se siga efectuando la vía.


REGULACIÓN DE LA EXPRESION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS (nivel genético).

Nivel transcripcional: inducción (mayor transcripción) y represión (menos transcripción)-> operones. Atenuación y

procesamiento del ARNm.

Nivel traduccional: Regulación de la síntesis de las proteínas ribosómicas. Inhibición de la síntesis de proteínas.

ATP.

Compuesto de alta energía, (los enlaces fosfato son muy energéticos y por ello son usados por medio de su formación y

rompimiento para almacenar y liberar la energía obtenida de los procesos catabólicos).

Formación de enlaces fosfato:

1. Fosforilación a nivel de sustrato. (se forma el ATP apartir de ADP + Pi, en un sitio alostérico de una enzima que

cataliza una reacción que libera energía, utilizando esa energía para crear el enlace fosfato)

2. Cadena respiratoria. (fosforilación oxidativa, que se da en la membrana plasmática de bacterias y en la

mitocondria en eucariotes, por medio de un gradiente de H+ y en algunos casos Na+, generado por el paso del electrón

disminuyendo gradualmente su potencial a través de distintos complejos proteicos, algunos de los cuales son canales

para H+ que se abren al pasar por ellos el electrón y van generando un gradiente elctroquímico de protones, los cuales

pasan a través de una proteína ATPasa que se encarga de fosforilar ADP)

(Justo debajo de ciclo de Krebs viene la explicación más completa)

3. Fotofosforilación. Los pigmentos captan la energía luminosa proveniente del sol (fotones) y la llevan al

fotosistema uno (P680), donde esta clorofila es excitada a un estado de mayor energía (mayor potencial), por lo que el

electrón va disminuyendo su potencial a medida que pasa por distintos complejos acarreadores de electrones, luego

pasa al fotosistema dos (P700), quien recibe otro fotón, quien pasa a un estado excitado y vuelve a disminuir su potencial

gradualmente, generando un gradiente electroquímico de protones a medida que el electrón pasa por las proteínas

canal con centros redox, el cual es dispersado de manera similar a la cadena respiratoria; por medio de una ATPasa.

Glucólisis

La vía de la glucólisis (EMP), se encuentra en todos los eucariotes y muchas especies de bacterias.

1. En la primera etapa hay gasto de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa

La glucosa siempre que entra a la célula es fosforilada, a manera de que no salga de nuevo por la membrana

y se encuentre en un flujo constante hacia el interior de la célula, además, esta glucosa-6-fosfato se isomeriza a

fructosa-6P y luego se vuelve a fosforilar a fructosa-1,6-bisfosfato que ya es una molécula simétrica; cada fosforilación

requiere de un ATP que done su grupo fosfato, convirtiéndose en ADP.

Fuente de energía

Luz fotótrofas

Fuente de carbono

c. orgánicos fotoheterótrofos

CO2 fotoautótrofos

Redox quimiótrofas

c. orgánicos quimioheterótrofos

Fuente de carbono

c. orgánicos quimioheterótrofos

CO2

c. inorgánicos quimilotótrofos

Fuente de carbono

c. orgánicos mixótrofos

CO2 litoautótrofos


2. En la segunda parte se forman 4 moléculas de ATP por fosforilación a nivel de sustrato (cuando una molécula

fosforilada posee una gran energía de hidrólisis puede ceder su grupo fosfato a un ADP, para formar ATP) y 2 moléculas

de NADH (molécula reducida a la que se conoce como poder reductor que si suponemos que el ATP es el efectivo en

energía, el NADH es como un cheque que se va a canjear en la cadena de transporte de electrones por 3 ATPs por

cada molécula de NADH que cede su electrón).

Esa fructosa1,6bisP, se rompe en dos moléculas de 3 carbonos: gliceraldehído3P y 3dihidroxiacetonafosfato,

que se isomeriza a gliceraldehido3P éste gliceraldehído va sufriendo cambios conformacionales y va pasando

por intermediarios de alta energía que ceden su grupo fosfato a un ADP en 2 ocasiones; como teníamos 2

moléculas de gliceraldehído 3P por gaca molécula de fructosa1,6bisP, se generan en total 4 ATP en esta parte,

además en una de las reacciones, se libera NADH que también se multiplica por 2.

3. La ganancia total son 4 ATP y 2 NADH, y como se invirtieron 2 ATP para fosforilar la glucosa, la ganancia neta es de 2

ATP por molécula de glucosa que se convierte por esta vía en piruvato (molécula de 3 C sin grupo fosfato).

Ciclo de las pentosas fosfato

Es una vía anabólica, ya que produce los precursores de la ribosa (5 carbonos), para formar los ácidos nucleicos y

provee de eritrosa fosfato (4 carbonos) como precursor de aminoácidos aromáticos.

Se produce en está vía NADPH, la mayor fuente de electrones de la biosíntesis (NADH se le llama poder reductor, y

NADPH es un poder reductor biosintético) y varias de sus reacciones las comparte con el ciclo de

Calvín (fase independiente de la luz en la fotosíntesis, donde se utiliza la energía ganada en la fase luminosa para

formar fructosa mediante la fijación de CO2)

Mecanismo:

1. Se tienen 3 moléculas de glucosa6P que se oxidan a a 6-fosfogluconolactona (una lactona es un éster cíclico),

produciéndose 3 NADPH.

2. Las 6-fosfogluconolactonas se rompen para

formar 3 moléculas de 6-fosfogluconato, que

después son oxidadas, reduciendo 3 NADP+ a

NADPH y se descarboxilan, liberando 3

moléculas de CO2 y son transformadas así en

ribulosa5P (Ru5P) que es un azúcar de 5

carbonos (pentosa).

3. Una de esas Ru5P, es isomerizada a ribosa5P

(R5P), y las otras dos se isomerizan a xilulosa5P

(Xu5P). Dos carbonos de la Xu5P son transferidos

por medio de una trancetolasa a una R5P,

formando sedoheptulosa7P y gliceraldehído3P;

obsérvese que de dos moléculas de 5 carbonos,

se formaron una de 3 carbonos y una de 7

carbonos.

4. Se remueven 3C de la sedoheptulosa7P y se

unen al gliceraldehído3P , formando ahora un

azúcar de 4 carbonos (eritrosa4P) y un azúcar de

6 carbonos (fructosa6P)

5. Esa eritrosa recibe 2C de la otra Ru5P, resultando

otra fructosa 6P y un gliceraldehído3P.


Vía Entner-Doudoroff

Muchos tipos de bacterias no poseen la enzima fosfofructocinasa-1 (PFK1 de la glucólisis, donde la

fructosa6P se fosforila mediante un gasto de ATP a ADP a fructosa1,6bisP).

Una vía alterna es Entner-Doudoroff, en la cual la glucosa 6P es convertida a del 6-fosfogluconato que es

deshidratado a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato (KDPG) que ya se rompe en 2 moléculas e 3C (piruvato y

Gliceraldehído-3-fosfato).

Fermentación.

Se realiza en condiciones anaeróbicas.

Utiliza el NADH producido en la

glucólisis que no es canjeado en la cadena

respiratoria, ya que no hay O2 para que

acepte los electrones, por lo que emplea

como aceptor de electrones a una

molécula orgánica: reduce el ácido pirúvico

(piruvato generado) ya sea por glucólisis, vía de

las pentosas o vía de Entner-Doudoroff.

Ácido fórmico, etanol

(saccaromyces) (malta-> cerveza, frutas-> vino,

etc.), ácido láctico (lactobacillus), ácido

propiónico, (etanol-> ácido

acético)(acetobacter aceti), etc…

Madre de vinagre: consorcio

formado por levadura y bacteria; acetobacter y saccaromyces.

Acido láctico

Leche → Yogurt y queso (Lactobacillus,

Streptococcus)

Granos → Pan de centeno (Lactobacillus

bulgaricus)

Col → Chucrut o Sauerkraut (Lactobacillus

plantarum)

Carne → Salchichas (Pediococcus)

Otras fermentaciones

Ácido propiónico y CO2

Leche → Queso suizo (Propionibacterium

freudenreichii)

Acetona y butanol (Clostridium

acetobutylicum)

Glicerol (Saccharomyces cerevisiae)

Ácido cítrico → melazas (Aspergillus niger)

Metano → Ácido acético (Methanosarcina)

Ácido ascórbico → Sorbitol (Acetobacter)

Ciclo de Krebs = Ciclo de los ácidos tricarboxílicos = Ciclo del ácido cítrico

Piruvato Acetil-CoA (enzima: piruvato deshidrogenasa). La acetil-CoA también se forma por la β-oxidación de los

ácidos grasos.


Éste piruvato es oxidado a CO2 en el CK (ciclo de Krebs).

Mecanismo:

1. El oxalacetato u ácido oxalacético es una molécula de 4C, que se une al grupo acetil (2C) para formar ácido

cítrico.

2. Éste ácido cítrico es isomerizado y oxidado, liberando NADH y CO2, por lo que nos queda una molécula de 5C,

llamada ácido-α-cetoglutárico, que es oxidado a su vez, liberando NADH, ATP y CO2 a ácido succínico (4

carbonos).

3. Éste es oxidado a ácido fumárico, liberando FADH2 (que es otro poder reductor, acarreador de electrones),

que pasa a su vez, liberando otro NADPH a oxalacetato.

Por Acetil-CoA se forman 2 moléculas de NADH, una de NADPH y una de FADH2, además de un ATP por FNS

(fosforilación a nivel de sustrato).

Fosforilación oxidativa.

Las coenzimas reducidas (como el NADH), transfieren los electrones a un aceptor Menor potencial redox

final oxidado, no directamente (como en la fermentación), sino a través de una cadena

transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exógeno oxidado, que se

reduce.

Respiración aerobia: el aceptor final es el O2

Respiración anaerobia: el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.)

La transferencia de electrones se da en la dirección de mayor potencial redox, con

la liberación de energía libre que se va a traducir en un potencial electroquímico de

protones, cuya disipación a través de ATPasas de membrana origina ATP, conociéndose

este proceso como fosforilación oxidativa. Mayor potencial redox

Éste proceso se da en la membrana citoplasmática en procariontes, o la membrana interna en cloroplastos y

mitocondrias. La membrana interna es pues, muy selectiva y rica en proteínas que llevan a cabo el proceso de

transporte de electrones:

NADH deshidrogenasa. (complejo proteico 1) Transfiere los e- y los H+ del

NADH; es una proteína tipo canal que al pasar el electrón por ella, se abre

y hace pasar H+ contra gradiente (es un tipo de transporte activo).

Flavoproteínas. Transfieren los e- y los H+.

Proteínas de hierro y azufre. Acarreador de electrones.

Citocromos. Acarreador de electrones.

No proteínas

Quinonas. (coenzimas Q; moléculas orgánicas no proteicas, embebidas en

la membrana que también transfieren los e- y los H+).

En la fosforilación aerobia:

Los electrones pasan primero al complejo 1 (si provienen del acarreador NADH) o

al complejo 2 (si provienen de FADH2); ambos complejos donan su electrón a las quinonas, quienes lo transfieren al

complejo 3; éste lo transfiere al citocromo C (citocromo es una proteína periférica pequeña que posee un centro

redox); del citocromo C, el electrón pasa al complejo 4, que finalmente, dona el electrón al oxígeno (O2 O22-), quien

se une a dos protones H+ (que ya pasaron a través de la ATPasa hacia el citoplasma) para formar H2O. Los complejos

1,3 y 4 son canales de protones, mientras que el complejo 2 es simplemente un acarreador.

El donador es el NADH o el FADH2; el aceptor es el O2 y el producto final es H2O.


El gradiente de protones generado, es utilizado para la síntesis de ATP mediante una proteína ATPsintasa

(ATPasa); quien posee dos complejos:

Complejo F0 responsable de la transferencia de protones a través de la membrana. Embebido en la membrana

citoplasmática.

Complejo catalítico F1 responsable de la interconversión de ADP+ Pi y ATP. Se encuentra en el lado citoplasmático.

http://www.youtube.com/watch?v=WggF8DGEmEs

La ATPasa es reversible; puede funcionar como bomba de protones contra gradiente, mediante la hidrólisis de

ATP.

En la respiración anaerobia, los compuestos que se reducen en lugar del O2 pueden ser:

Oxidación del Hidrógeno.

Las bacterias captan H2 y poseen la enzima hidrogenasa (que tiene un

cofactor de Ni 2+ en su estructura), ésta rompe la molécula en dos

átomos de H y puede estar en la membrana y generar un gradiente de

protones, así como transferir los electrones a una cadena de transporte, o

bien, estar en el citoplasma y utilizar esos hidrógenos para generar

NADPH, que junto con el CO2 entran a ciclo de Calvin para generar

carbohidratos.

http://www.youtube.com/watch?v=WggF8DGEmEs


Oxidación del azufre

La vía de la sulfito oxidasa es la más común en la oxidación de compuestos de sulfito.

La adenosina fosfosulfato reductasa (APS) la emplean pocos microorganismos que oxidan el sulfito.

Los electrones liberados entran a nivel del citocromo C, para formar ATP.

El NADH es producido por un flujo reverso de electrones para producir NADH necesario para la fijación del CO2

en el ciclo de Calvin.

Oxidación del azufre

1. Nitrificación paso 1: Oxidan el amonio a nitritos.

NH4+ + 1½O2 → NO2 - + 2 H+ + H2O

Proteínas de membrana citoplasmática que llevan a cabo éstas funciones:

Amonia Monooxigenasa (AMO). Proteína transmembranal; Oxida el

NH4+ a hidroxilamina (NH2OH).

Hidroxilamina oxidoreductasa (HAO). Proteína periplásmica; Oxida

la hidroxilamina a NO2- (nitrito).

2. Nitrificación paso 2:

Nitrito Oxidoreductasa (NOR). Proteína transmembranal.

NO2- + ½O2 → NO3-

3. Las bacterias nitrificantes fijan CO2 por el ciclo de Calvin. Las que

oxidan nitrito pueden ser heterótrofas con glucosa y otros

compuestos orgánicos.

Oxidación del hierro

Fe2+ + H+ + 1¼O2 → Fe3+ + ½H2O

Rusticianina. Proteína periplásmica que contiene Cobre.

Los electrones liberados entran a nivel del citocromo C, para formar ATP.

La bacteria vive en pH bajos, para obtener su gradiente de protones.

El NADH es producido por un flujo reverso de electrones para producir NADH

necesario para la fijación del CO2 en el ciclo de Calvin (Ver página 14).

Organismos Autótrofos

Organismos que utilizan el CO2 como fuente de carbono y lo pueden incorporar por diversas vías:

Ciclo de Krebs reverso. Bacterias verdes del azufre (Chlorobium)

Vía del Hidroxipropionato. Bacterias verdes (Chloroflexus)

Vía Acetil CoA reductiva. Bacterias acetogénicas (Clostridiumthermoaceticum, Acetobacterium

woodii), metanogénicas (Methanobacterium thermoautotrophicum) y autótrofas sulfato

reductoras (Defulfobacterium autotrophicum)

Ciclo de Calvin. Bacterias púrpura, cianobacterias, algas, plantas verdes, muchas bacterias

quimiolitótrofas y algunas arqueobacterias halófilas e hipertermófilas.


La fijación es realizada por la enzima Ribulosa bifosfato carboxilasa (RubisCO) que forma cúmulos llamados

carboxisomas.

Fotosíntesis.

Consta de 2 fases:

1. Fase Luminosa: fotofosforilación

(catabólica), la energía solar es

transformada en energía

química (ver en la página 8).

2. Fase independiente de la luz:

ciclo de Calvin-Benson

(anabólica), involucra la fijación

de CO2 como fuente de

carbono para el crecimiento

celular.

Mecanismo del ciclo de Calvin:

La enzima RUBISCO fija el CO2 a

la ribulosabisfosfato (5 carbonos) y divide

la molécula en 2 moléculas de 3-

fosfoglicerato (cada una de 3C), la cual

es fosforilada y reducida a

gliceraldehido3P, que como sabemos,

es precursor de la fructosa.

Después se da la regeneración de Ribulosa bifosfato, que es el sustrato para la fijación de nuevas moléculas de CO2.

Los organismos fotótrofos convierten la energía luminosa en energía química para formar ATP.

Fotosíntesis oxigénica. Cianobacterias, algas y plantas

1

2


Fotofosforilación acíclica

Ocurre en la fotosíntesis oxigénica. El donador de electrones es el agua y el aceptor final es una

coenzima oxidada. Hay producción de oxígeno.

Fotosíntesis anoxigénica. Bacterias púrpura, verdes y heliobacterias.

Fotofosforilación acíclica

Ocurre en la fotosíntesis anoxigénica. Los donadores de electrones son principalmente: H2S, Sº, S2O32-.

Los electrones son devueltos a la bacterioclorofila por medio de transportadores (cadena reversa).

Fotofosforilación no fotosíntetica (mediada por el pigmento

bacteriorodopsina). Halobacterium sp (arquea halofílica). Crecen en

agua de mar (salmuera) en las salinas de evaporación.


La bacteriorrodopsina tiene siete hélices alfa que comprenden toda la sección de

la membrana. El cromóforo retinal todo-trans (púrpura) esta unido covalentemente

mediante una base de Schiff al grupo ε-amino de una Lys. Una serie de residuos Asp

y Glu, y moléculas de agua asociadas aportan la vía transmembranal para los

protones (flechas rojas).

En cianobacterias, la ficoeritrobilina y la ficocianobilina como pigmentos capturadores de la luz. Las ficobilinas están

unidas covalentemente a proteínas de unión específicas, formando las ficobiliproteínas, que se asocian en complejos

ordenados llamados ficobilisomas. Estas son las principales estructuras de captación de luz en los microorganismos. (Son

como antenas)

En estos ensamblajes los pigmentos de ficobilina se unen a proteínas específicas que forman pigmentos llamados

ficoeritrina (PE), ficocianina (PC) y aloficocianina (AP). La energía de los fotones absorbidos por PE o PC es transmitida por AP

a la clorofila a del centro de reacción mediante un proceso conocido como transferencia de excitones.

Medios de cultivo 1. Macronutrientes en los medios de cultivo


2. Micronutrientes en los medios de cultivo

3. Factores de crecimiento


4. Clasificación.

Composición

Naturales o complejos. No tienen una composición definida. Sangre, suelo, frutas, etc. o medios que contengan

ingredientes cuya composición no esté completamente definida como el extracto de levadura, peptonas o el agua

de la llave.

Sintéticos. Composición completamente conocida, componentes son extrapuros, como en los medios empleados

para investigación.

Estado

Medios líquidos. Generalmente tienen componentes completamente solubles. Son útiles en la propagación de

microorganismos pero tienen la desventaja de que no se pueden detectar contaminaciones.

Medios fluidos. Contienen agar aprox. 0.1%, consistencia líquida pero la presencia de agar disminuye la velocidad de

disolución de O2 ambiental. Se emplea generalmente en el cultivo de microorganismos anaerobios y

microaerofílicos.

Semisólidos. 0.2 a 0.8% de agar, son suaves y permiten observar la movilidad de los microorganismos. Esta

consistencia es utilizada en los medios de transporte, las pruebas de movilidad, pruebas biquímicas y pruebas

genéticas.

Sólidos. 1.5 a 2.0% de agar, consistencia dura y forman un soporte para el crecimiento microbiano. Se emplean para

cultivo, aislamiento, diferenciación, cuantificación, pruebas de sensibilidad y en algunos casos para conservación

(inclinados).

Uso

Enriquecidos. Contienen componentes ricos nutritivamente y permite el crecimiento de microorganismos no

exigentes.

Ejemplos:

•Agar cuenta estándar (cuenta en placa)

•Infusión cerebro y corazón (BHI)

•Agar Soya Tripticaseína (TSA)

•Agar nutritivo (AN)

•Agar sangre (AS)

De enriquecimiento. Contiene componentes y condiciones que permiten el desarrollo de un tipo microbiano y

disminuyen la velocidad de crecimiento de la flora acompañante.

Ejemplos:

•Agua peptonada pH 9: Detección de V. cholerae

•Caldo tetrationato: Pre-enriquecimiento para Salmonella

Caldo selenito: Detección de Salmonella, Enterobacter sakazakii y Yersinia enterocolitica

Selectivos. Contiene componentes que permiten el desarrollo de un tipo microbiano e inhiben el crecimiento de los

demás microorganismos.

Ejemplos:

•Agar cetrimida

•Caldo bilis verde brillante

•Agar Bacillus cereus

•Agar Sabouraud cicloheximida

Diferenciales. Contiene componentes que permiten diferenciar las actividades metabólicas de los microorganismos

inoculados. La presencia de indicadores o el uso de reveladores después de la incubación ponen de manifiesto la

actividad.

Ejemplos:

•Agar DNAsa

•Agar almidón

•Agar cromogénico para Candida

Diferenciales y selectivos.

Agar sal y manitol

•Agar eosina azul de metileno (EMB)


•Agar XLD

•Agar Endo

•Agar Mc Conkey

De conservación. Algunos medios de cultivo son empleados para la conservación temporal de microorganismos,

como son:

•Medio sólido en caja a 4ºC (hasta 1 semana).

•Medio de agar inclinado 4ºC (hasta 2 semanas) con sello de glicerol estéril a 4ºC (varios meses dependiendo del

microorganismo).

•Medio fluido de tioglicolato con carne molida con sello de aceite mineral estéril a temperatura ambiente (varios

meses

dependiendo del microorganismo).En la liofilización también se emplea la leche descremada (años).

De transporte. Son medios que se emplean para el transporte de muestras sin alterar la viabilidad y la proporción de

microorganismos. Tienen consistencia semisólida, con amortiguador de pH y reducidos en nutrientes para preservar la

proliferación de microorganismos por varias horas. Las muestras se recolectan con asas o con hisopos de alginatos

que no inhiben a los microorganismos.

•Medio Amies

•Medio de Stuart

De transporte. Son medios de cultivo que tienen los nutrientes para poner en evidencia la actividad metabólica de

un microorganismo puro. Pueden emplear reveladores y/o indicadores.

Pruebas bioquimicas

Determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificación y

clasificación de bacterias y hongos.

Partes.

Sustrato (contenido en el medio de cultivo)

Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del microorganismo)

Producto

Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)

1. Hidrólisis del almidón. Polímero de glucosa compuesto de amilosa (poco

ramificada) y amilopectina (más ramificada).

Agar almidón. Sustrato: Almidón Enzima: Amilasa (exoenzima). Producto:

Glucosa. Revelador: Lugol que forma un complejo color café-púrpura que

desaparece cuando el almidón ha sido degradado.

2. Degradación de la caseína. Las proteasas son excretadas al medio para la

degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere

el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el color blanco

alrededor del crecimiento microbiano.

Agar Leche Descremada. Sustrato: Caseína Enzima: Caseinasa

(Proteasa, exoenzima). Producto: Aminoácidos. Revelador: No requiere.

3. Hidrólisis de la lecitina y reducción del telurito. Las colonias productoras de lecitinasa

forman una zona opaca a su alrededor. El medio de Baird Parker es empleado para

el aislamiento y cuantificación de estafilococos coagulasa positivos, al que se

adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias típicas de S. aureus son

oscuras por la reducción del telurito (TeO32-) a Teo, además presentan el halo de

hidrólisis de la lecitina.

Agar yema de huevo/Agar Baird Parker. Sustrato: Lecitina. Enzima: Lecitinasa

hidroliza la lecitina (fosfolípido). Producto: Fosforilcolina. Revelador: No requiere.


4. Licuefacción de la gelatina. La gelatina es una proteína que cuando es hidrolizada por la

gelatinasa en los aminoácidos que la componen, pierde su característica de gelificar. Si al

refrigerar el medio en donde se incubó por 7 días el microorganismo la gelatina cuaja, el

microorganismo creció pero no la degradó. Otra opción es con carbón activado, si éste se

esparce por todo el medio, quiere decir que hubo degradación.

Gelatina Nutritiva (base nutritiva en caldo y después se agrega el gelificante)

Sustrato: Gelatina (proteína). Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima). Producto:

Aminoácidos. Revelador: No requiere o puede emplearse el carbón activado en polvo.

5. Fermentación. Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser

incorporados, algunos requieren de ser degradados en monómeros y transportados a la

célula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la vía

fermentativa. La fermentación (degradación) de un compuesto orgánico se observa por la

acidez en el medio de cultivo y la formación de gas capturado en la campana de

fermentación. Prueba positiva (ácido y gas), si únicamente vira el indicador se trata de

prueba posistiva (ácido).

Medio base caldo rojo de fenol (indicador pH), con campana de fermentación

(Durham). Sustrato: Carbohidrato o polialcohol. Vía: Fermentativa. Producto: Ácidos orgánicos. Indicador: Rojo de

fenol (bugambilia, rojo, amarillo), púrpura de bromocresol (púrpura, violeta, amarillo) o cualquier indicador de pH.

6. Oxidación/fermentación. Las bacterias obtienen energía a partir de

hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos;

fermentativo u oxidativo. Prueba para determinar si el

microorganismo oxida, fermenta o es facultativo. Se inoculan dos

tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina

para impedir la entrada de oxígeno.

Hugh and Leifson. Sustrato: Carbohidratos. Vías: Fermentativa

y/u Oxidativa. Producto: Acido pirúvico. Indicador: Azul de

bromotimol u otro indicador ácido/base.

7. Fermentación ácida o neutra.

Fermentación ácido mixta: Los productos son ácidos orgánicos que provocan un descenso del pH inicial (indicador:

amarillo pH por encima de 5,1 y rojo pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de ácido pirúvico

(piruvato) formadas, se reducen dos a ácido láctico y dos las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del

acético pasa a etanol y parte del fórmico a CO2 y H2 .

Fermentación butilenglicólica: en ésta, parte del piruvato se metaboliza

produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético, la mayor parte del

piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol,

productos que son neutros.

Para determinar la presencia de los productos neutros (acetoína) (prueba de Voges-

Proskauer): Se agrega un poco de a-naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto

lechoso), luego se le añade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita

fuertemente. La acetoína reacciona con el a-naftol, y produce un cromóforo rojo en

presencia de oxígeno. (Prueba positiva color rosado - violáceo en la parte superior del tubo;

Prueba negativa no tiene coloración).


Rojo de Metilo/Voges Proskauer (Caldo RM/VP) Sustrato: Glucosa. Vías: Fermentación ácida o neutra.

Producto: Ácidos orgánicos o acetoína. Reveladores: Solución de Rojo de Metilo, Alfa

Naftol y KOH 40%.

8. Utilización del citrato. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única

fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de

nitrógeno. La extracción de nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se

alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.

Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Vía: Varias dependientes

del pH del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Acetoína en condiciones

ácidas. Indicador: Azul de bromotimol.

9. Agar Hierro de Kligler (KIA). Identificación de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas. En presencia de

tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman

H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en

condiciones ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro

ferroso metálico.

Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan el medio.

Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan aeróbicamente la glucosa y debido a la

baja concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio (el pico de

flauta).

Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la

lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa del medio.

Alcalino: rojo/bugambilia, Ácido: amarillo.

Agar hierro de Kligler Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína. Vía: Fermentativa

Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa Productos: Ácidos mixtos y H2S. Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+.

10. Medio SIM (Sulfhídrico Indol Movilidad). Derivación del de Kligler. (medio semisólido) Sustratos: Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína y triptófano. Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y

tiptofanasa. Producto: H2S e Indol. Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA).

Resultados: 1. Reducción del azufre (precipitado negro). 2. Formación de indol a partir de triptófano (se forma un

cromóforo rojo en la superficie) y 3. Movilidad (si se esparce por el tubo de ensaye o si sólo se presenta en la parte

donde se inoculó).

1. 2. 3.


5. Ureasa. La hidrólisis de la urea por la ureasa libera dos moléculas de amoniaco

que alcaliniza el medio. Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea. Enzima: Ureasa.

Producto: Amoníaco. Indicador: Rojo de fenol.

6. Reducción de nitratos. Anaerobios y asimiladores de nitrógeno.

Reducción asimilativa: los nitratos pasan a -NH2

Reducción desasimilativa: se reduce hasta formar N2

Nitrato reductasa (NAR). (la que se quiere medir)

Nitrito reductasa (NIR).

NO reductasa (NOR).

N2 reductasa (N2OR).

Caldo nitratos Sustrato: Nitrato de sodio. Enzima: Nitrato reductasa. Producto: Nitritos. Revelador: Reactivos de Griess (a

y b) (ácido sulfanílico y dimetil-a-naftilamina (a-naftilamina) que forman un cromóforo rojo, después de 24 horas de la

incubación, en presencia del nitrito.

Cuando la prueba resulta negativa para

nitritos se utiliza la campana de fermentación o la prueba del

zinc, ya que es posible que la bacteria haya logrado reducir

aún más el nitrito hasta N2 (donde se observaría la presencia

de un gas). El zinc, reduce nitrato a nitrito, y si sale positiva,

quiere decir que la bacteria no logró reducir el nitrato.

7. Descarboxilasa. Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas (prueba

positiva)lo que incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las

descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias. Medio base de descarboxilasas (caldo con aa. Y fuente de carbono) u otros medios como LIA

(lisina.hierro.agar) o MIO (algo con quitina..) Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o arginina). Enzimas: Lis.

Producto: Amoníaco y diaminas. Indicador: Púrpura de bromocresol.

8. Coagulasa. Exoenzima producida por S. aureus, (factor de virulencia) esta enzima

actúa sobre los factores de la coagulación presentes en el plasma y forma un coagulo

visible con las proteínas del hospedero para evadir a sistema inmune.

Plasma de conejo. Sustrato: Factores de la coagulación. Enzima: Coagulasa

(estafilocoagulasa). Producto: Coagulo. Revelador: No requiere.

9. Oxidasa. Se debe a un sistema de citocromo oxidasa (complejo IV, ver fosforilación

oxidativa). La prueba positiva se observa por la oxidación del reactivo de Kovacs (incoloro,

reducido) formándose un producto colorido. amarillo es negativo, fucsia y azul marino es prueba

positiva.

Cultivo de medio nutritivo Sustrato: Compuesto reducido. Enzima: Oxidasa. Producto: Compuesto

oxidado. Revelador: Reactivo de Kovacs: diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) al 1%.

Crecimiento Bacteriano

Crecimiento: incremento en el # de células

Bipartición (fisión binaria): una célula se divide para formar dos iguales.

Generación: intervalo que transcurre en la formación de dos células.


Fisión binaria: cada célula hija recibe una copia del cromosoma, ribosomas, complejos macromoleculares, así como

monómeros y iones inorgánicos para existir como una célula independiente. El ADN se ancla a la membrana y así, cada

célula hija se queda con una copia.

Se forma un septo que dará lugar a cada una de las células, las envolturas

rodean a cada copia del ADN y finalmente se da la separación de las células.

Proteinas Fts (filamentous temperature sensitive): forman el aparato de división (divisoma)

o FtsZ polimeriza y forma un anillo en el centro de la célula.

o FtsA es una enzima ATP hidrolasa que provee la energía para ensamblar proteínas

en el divisoma.

o ZipA ancla a FtsZ a la membrana citoplasmática.

o FtsI es una proteína involucrada en la síntesis de peptidoglucano, también

llamada proteína de unión a penicilina (su actividad es bloqueada).

Replicación del ADN

Previo a la formación del anillo FtsZ que se forma en el espacio entre los cromosmas duplicados.

o MinC: inhibidor de la división celular y previene que FtsZ ensamble el anillo hasta que el centro se encuentre formado.

o MinE: inhibe la actividad de MinC y se ancla al centro de la división.

o FstK participa en la elongación.

o FstZ: tiene actividad de GTP hidrolasa, libera energía para la polimerización y despolimerización, así como para el

ensamblaje y desensamblaje del anillo.

Proteína MreB y la forma de las bacterias.

La presencia de esta proteína se ha relacionado con las bacterias no cocoides.

o FtsZ tubulina bacteriana.

o MreB actina bacteriana.

Autolisinas: realizan pequeñas aberturas, presentes en el complejo divisoma.

La síntesis del nuevo peptidoglocano deja en las células Gram positivas una cicatriz. (de

donde empieza a sintetizar la célula hija su propio péptidoglucano)

La abertura y síntesis deben ser coordinadas para evitar la autolisis de la célula.

Bactoprenol y transpeptidacion.

El bactoprenol (proteína en el periplasma de gran negativas) acarrea los precursores de la pared celular, en el

periplasma interactúa con la enzima que inserta los precursores de pared celular y cataliza la formación del enlace

glucosídico.

La transpeptidasa forma el enlace peptídico entre las cadenas de aminoácidos de las unidades de mureína.

Crecimiento bacteriano: duplicación de un cultivo de manera regular durante un intervalo de tiempo.

o Grafica logarítmica: muestra el crecimiento exponencial; puede calcularse el tiempo de generación.

Tiempo de generación (G): tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique.

G = t/n

n= numero de generación

t=tiempo

No= número inicial de microorganismos

N = No2n

lg N = lg No + n lg 2

El crecimiento se produce en progresión geométrica:

1 generación -------------> 2 células

2 generaciones -------------> 4 células

3 generaciones -------------> 8 células

Bacteria que se duplica más rápido: E. coli Más lenta: Treponema pallidum

Curva de crecimiento: A (Fase Lag). Latencia/adaptación: no aumento significativo d densidad celular, crecimiento asincrónico.

B (Fase Log). Crecimiento exponencial, sincrónico y se alcanza la máxima velocidad de crecimiento.

C (Fase pre-estacionaria). Retardo, desaparece crecimiento exponencial, microorganismos en estrés.

D (Fase estacionaria). Estacionario: equilibrio entre los microorganismos vivos y muertos.

E (Fase de muerte). El equilibro desaparece y predominan los microorganismos muertos. No hay nutrientes para el

recambio y las condiciones del medio de cultivo son adversas para el crecimiento.

Tipos de cultivo.

Cultivo en lote. Varios matraces, muestrear de cada uno en el tiempo, se construye una curva, método analítico

analítico a pequeña escala.


Cultivo en lote alimentado. Cambiar condiciones, inducir algún sistema.

Cultivo en continuo. Fermentador (bioreactor) para cultivo. La cepa se inocula en fase log, cuando entra en fase

preestacionaria, debe depurarse y utilizar más medio de cultivo a modo de evitar que entren en fase estacionaria y su

producción sea eficiente.

Temperatura (1). Gelificación de la membrana; los procesos de transporte se llevan a cabo

lentamente y no hay crecimiento.

(2). Las reacciones enzimáticas aumentan su velocidad.

(3). Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo a su máxima velocidad. (no

todas, cada enzima tiene su temperatura óptima).

(4). Desnaturalización de proteínas y membrana citoplasmática. Lisis térmica.

pH Microorganismos patógenos.

Acidofilos 1-6

Neutrofilos 7-10

Alcalofilos 11-14

Oxigeno.


Cultivo de anaerobios. Se lleva a cabo en jarra de anaerobiosis.

NaHCO3 + NaBH4 + O2 → CO2 + H2O + H2

Radicales generados en respiración aerobia.

O2 + e- → O2- Superoxido

O2- + e- + 2H+ → H2O2 Peróxido de hidrógeno

H2O2 + e- + H+ → H2O + OH- Radical hidroxilo

Superoxido dismutasa (SOD) Enzima detoxificante que se hace cargo del superóxido.

O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2

Catalasa. Enzima detoxificante que se hace cargo del peróxido.

H2O2 + H2O2 → 2H2O + O2

Peroxidasa.

H2O2 + NADH + H+ → 2H2O + NAD+

Concentración de solutos.

Actividad del agua (aw ): disponibilidad del agua para los microorganismos.Osmófilos y xerófilos pueden vivir en bajas aw

Solutos compatibles: Los forman los microorganismos para compensar la

concentración de solutos exterior. (para poder vivir en medios hipertónicos)

Aminoácidos: Glicina-betaína y ectoina

Carbohidratos: Sacarosa y trehalosa

Poli alcoholes: Manitol y glicerol

Otros: KCl y propionato dimetilsulfonico (PDS)

TABLA DE EXTREMOFILOS


Medición del crecimiento microbiano.

1 Viables. Presencia de microorganismos vivos. Al menos 24 horas incubación e interpretación de resultados.

Se emplean medios de cultivo generales, enriquecidos selectivos y diferenciales dependiendo de los

microorganismos a cuantificar.

Cuenta en placa. Principalmente cuantificación de bacterias y hongos. UFC (Unidades Formadoras de Colonias).

Se emplean diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia

formada provenga de un solo microorganismo (Criterio: 25 a 250 UFC por

placa).

Se reporta como: #UFC/unidad de volumen o peso.

http://people.rit.edu/~gtfsbi/IntroMicro/20081MicrobialGrowthCh6.htm

TECNICAS DE CUENTA EN PLACA:

Vaciado (se vacia la muestra y después se pone el agar), extendido (se

extiende la muestra sobre el agar ya preparado)

Miles y Misra. Las placas son divididas en sectores. Preparación de diluciones

seriadas de una suspensión bacteriana. Se toman en cuenta los sectores

donde hay menos de 20 UFC. El número de bacterias viables se obtiene

calculando la media de cada dilución en las repeticiones realizadas.

Asa calibrada. Tomar volúmenes pequeños, inoculados en la superficie del

agar mediante la técnica de siembra masiva. Las colonias son contadas y se

multiplican por el factor de dilución del asa empleada. Se determinan las

UFC/g o mL de muestra.

Filtración. La membrana de celulosa retiene a los microorganismos en su

malla con poros de 0.25-0.45µm. Esta membrana se transfiere a un medio de

cultivo para el desarrollo de colonias.

Número más probable. También llamada técnica de dilución en tubo: estimación

estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de

obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de

muestra inoculado.

Microorganismos COLIFORMES.

Coliformes totales: bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la

lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h a 35°C.

Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente:

Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales: bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a

las 48 h de incubación a 44 °C. Este grupo no incluye una especie determinada; la más prominente es Escherichia coli.

http://people.rit.edu/~gtfsbi/IntroMicro/20081MicrobialGrowthCh6.htm


2 Totales. Microorganismos vivos y muertos no se pueden distinguir. Son rápidos pero se requiere contar en algunos casos

con curvas de calibración.

Recuento microscópico.

1. Cámaras de Petroff-Hausser y de Neubauer.

Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de muestras.

No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean

observadas al microscopio.

No distinguen células vivas de muertas.

2. Cuenta de Breed.

Se usa: muestra a evaluar (directa o diluida), objetivo micrométrico, asa

calibrada o micropipeta

Área de la muestra = bxh y convertir a µm2

Determinar el área del campo: A= πxr2(µm2)

Observar 10 campos, contar las bacterias de cada uno de ellos y obtener el promedio X

Factor= Am/Ac

Calcular el número de bacterias por mL x Factor x 100 = bacterias_____ /mL

100 es la dilución inicial al tomar 0.01mL


Nefelometría (Turbidimetría). La turbidez producida por el crecimiento microbiano e determina por la

densidad óptica (DO) que puede ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o Unidades Klett (UK).

Longitud de onda (λ)

•Bacterias 540nm

•Protozoarios 580nm

•Levaduras 600nm

Actividad metabólica (producción de CO2).

CO2 + 2NaOH → Na2CO3 + H2O

Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2NaCl

NaOH (residual) + HCl → NaCl + H2O

Peso seco y determinación de proteína. Más proteína, más células.

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas se obtiene por el secado de un volumen en un horno a

105°C hasta peso constante. Útil para grandes volúmenes. Desventaja: componentes volátiles pueden perderse y puede

existir degradación. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado.


Factores que afectan la sobrevivencia de los microorganismos. Esterilización: destrucción de toda forma de vida microbiana.

Esterilización comercial: destruye esporas de Clostridium botulinum.

Desgerminación: eliminación de microorganismos en un área limitada.

Sanitización: eliminación de microorganismos patógenos.

Desinfección: destrucción de formas vegetativas en superficies inertes.

Antisépsis: tratamiento químico en tejidos vivos.

Asepsis: ausencia de contaminación significativa.

Técnicas asépticas: minimizan la contaminación en áreas y equipos.

Biocida: mata a los microorganismos

Bio-estático: detiene el crecimiento de los microorganismos.

Biolítico: tiene acción sobre membrana o pared celular.

Sepsis: indica contaminación por bacterias. En medicina describe una

infección en el torrente sanguíneo.

1. Agentes químicos.

•Mecanismo de acción

•Concentración

•Tiempo de exposición

•Factores ambientales

•Susceptibilidad de los microorganismos

•Edad de los microorganismos

•Presencia de materia orgánica

Fenoles y sus derivados. Destrucción de la membrana citoplasmática y desnaturalización de enzimas.

Biguanidas. Destrucción de la membrana citoplasmática.

Clorhexidina. Bactericida no tóxico. Se emplea en infecciones bucales, en la prevención de infecciones

tras cirugía bucal, combate y reduce la formación de la placa dental, lavado quirúrgico y lavado antiséptico.

Halógenos.

CLORO.

Agente oxidante.

Usado como desinfectante de superficies, agua y equipos.

SOLUCIONES DE IODO.

Se une a residuos de tirosina y desnaturaliza proteínas.

Antiséptico y desinfectante.

Alcoholes. Solubiliza lípidos y desnaturaliza proteínas.

Etanol e isopropanol. Bactericida y funguicida. Antiséptico no afecta esporas y virus envueltos.


Metales pesados.

Colorantes. Cristal violeta, verde brillante, eosina.

Combinación específica con ácidos nucleicos principalmente.

Biostáticos. Antifúngicos, antisépticos locales, inhibidores en los medios de cultivo selectivos.

Surfactantes.

1. Jabones aniónicos ácidos. Remoción mecánica de microorganismos. Germicida de piel. Algunos

contienen otros antimicrobianos.

2. Detergentes aniónicos ácidos. Interacción con la membrana citoplasmática cargada, probable

inactivación o destrucción de enzimas. Sanitizante. No tóxico, no corrosivo, actúa rápidamente y es de amplio

espectro. Equipo de procesamiento de alimentos.

3. Detergentes catiónicos. Desnaturalización de proteínas, inhibición de enzimas y destrucción de la

membrana citoplasmática. Bactericidas, bacteriostático, funguicida y virucida, destruye virus envueltos.

Antiséptico de piel, instrumentos, utensilios y gomas. Cloruro de Benzalconio.

Ácidos orgánicos. Conservadores (ácido sórbico, ácido benzoico, ácido ortofosfórico, ácido cítrico,

ácido ascórbico) Inhibición metabólica. Antifúngicos en alimentos y cosméticos.

Aldehídos. Inactivan proteínas por la formación de enlaces covalentes con grupos funcionales (-NH2, -

OH, -COOH y –SH)

Formaldehído. Biocida. Eliminación de bacterias y virus en vacunas. Conservación de especímenes biológicos.

Glutaraldehído. Esterilizante. Biocida de bacterias incluyendo a M. tuberculosis, esporas y virus.

Peroxigénos. Su mecanismo de acción es la oxidación de moléculas.

Ozono. Desinfectante en agua. Costoso.

Peróxido de hidrógeno H2O2. Antiséptico y desinfectante. Esporocida. Usado en heridas y superficies.

Peróxido de benzoilo. Antiséptico contra bacterias anaerobias en el tratamiento del acné.


Ácido peracético. Esterilizante. Biocida para hongos y bacterias, endoesporas y virus. No tóxico. Desinfectante

de equipo médico y de procesamiento de alimentos.

Esterilizantes gaseosos. Esterilizantes de plásticos y materiales termosensibles. Desnaturalizan proteínas.

Análogos. Moléculas similares a material celular.

Antibióticos.


Antibiograma.

Resistencia.

Natural

Adquirida

Una cruzada

Una asociada

Factores Físicos.

Calor húmedo

Ebullición. Desnaturaliza los componentes celulares.

•Punto térmico mortal. Temperatura variable y tiempo constante. La temperatura que destruye a los

microorganismos en un tiempo determinado.

•Periodo térmico mortal. Tiempo variable y temperatura constante. El tiempo que tardar en destruir a los

micoorganismos en una muestra a una temperatura determinada.

Tindalización. Proceso de destrucción de formas vegetativas

por medio de vapor de agua y una incubación para favorecer la

germinación de endosporas, para posteriormente repetir el proceso.

Pasteurización lenta. Calentar la leche entre 62 y 64ºC y mantener durante 30 minutos. Luego enfriar entre

4 y 10ºC .

Pasteurización rápida. Llamada también pasteurización continua o bien HTST (High Temperature Short

Time), consiste en aplicar a la leche una temperatura de 72 - 73ºC en un tiempo de 15 a 20 segundos.

Una leche ultrapasteurizada: 110ºC y 115ºC por 4 segundos, mientras que la leche esterilizada : 140-150ºC en 2 s;

inyección de vapor purificado, con la cual se eleva la temperatura; la leche pasa inmediatamente a una

cámara de vacío, en donde ocurre una expansión del líquido con la siguiente separación del vapor.

Todo tratamiento térmico a temperaturas inferiores al 100°C son considerados métodos de pasteurización.

Autoclave. Esterilización 121ºC, 15lb, 20 minutos. Esterilización comercial 70ºC.


Calor seco

Produce desecación de la célula, es esto tóxico por los niveles elevados de electrolitos y fusión de membranas.

Transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.

La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está

seco o la actividad de agua del medio es baja.

Ventajas:

No es corrosivo para metales e instrumentos.

Desventajas:

Requiere mayor tiempo de esterilización respecto al calor húmedo.

Materiales que se pueden esterilizar: materiales no alterables por el calor, no hace falta que sean porosos pero sí

que resistan altas temperaturas, durante prolongados periodos de tiempo.

Estufas de esterilización (horno). Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia circula por la

cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras. Se mantiene una temperatura estable mediante

termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito eléctrico.

Para el control del proceso existen:

•Métodos físicos. Uso del termómetro interno vs externo.

•Métodos químicos. Cinta testigo y tiras reactivas.

•Métodos biológicos. Bioindicadores de B. subtilis.

Temperaturas bajas. Disminuye la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Provoca la formación de

cristales*. Conservación de alimentos, reactivos y muestras biológicas.

•Refrigeración 4ºC.

•Congelación -20ºC*

•Ultracongelación -96ºC*

Tiempo de reducción decimal D. Es el tiempo que una población se reduce en 10 ordenes a una

temperatura determinada. Es característico de cada microorganismo.

Microbiologia Parcial 2

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