MICROBIOLOGÍA 2020 TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 Crecimiento ...
36
MICROBIOLOGÍA 2020 TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 Crecimiento bacteriano y efecto de los antibióticos
Transcript of MICROBIOLOGÍA 2020 TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 Crecimiento ...
MICROBIOLOGÍA
2020
TRABAJO PRÁCTICO Nº 3
Crecimiento bacteriano y efecto de los antibióticos
INDICE
CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS .................................................1 1. CRECIMIENTO BACTERIANO .........................................................................................1
1.1. Cinética del crecimiento ........................................................................................1 1.2. Crecimiento balanceado .......................................................................................2 1.3. Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio líquido .............................5
2. EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS .....................................................................................7 2.1. Inhibidores de la biosíntesis de la pared celular bacteriana ...................................8 2.2. Inhibidores de la biosíntesis de proteínas ...........................................................10
CUESTIONARIO .....................................................................................................................16 PROBLEMAS .........................................................................................................................17
1
CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS
1. CRECIMIENTO BACTERIANO
Se define al crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la población.
El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos:
cinética del crecimiento;
factores que afectan al tiempo de generación (g);
factores ambientales que estimulan o limitan el crecimiento.
En este trabajo práctico estudiaremos las características cinéticas de un cultivo bacteriano y los efectos que tienen sobre el mismo el agregado de antibióticos y los cambios en las condiciones de cultivo.
1.1. Cinética del crecimiento
El crecimiento de una población o cultivo bacteriano se puede expresar en función de:
aumento de masa del cultivo
aumento del número de células
La medida de la masa bacteriana puede realizarse por métodos directos como la determinación del peso húmedo o peso seco, o por métodos indirectos, como la turbidimetría.
1.1.1 Métodos directos
a. Determinación del peso húmedo:
1. se tara un tubo de centrífuga; 2. se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; 3. se determina el peso del sedimento.
Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
b. Determinación del peso seco:
El procedimiento es similar al anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105 °C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.
Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastante error en la determinación: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale aproximadamentea unas 5x109 bacterias.
2
1.1.2 Métodos indirectos
a. Métodos turbidimétricos (ópticos):
La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.
Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua. La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional al número de células en suspensión y a la masa del cultivo.
Espectrofotómetro: Este equipo es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. El mismo hace incidir un haz de luz de una determinada longitud de onda (λ) sobre una muestra líquida y mide la cantidad de esta luz que es absorbida y/o dispersada por la muestra. La fracción de luz que es capaz de atravesar la muestra se denomina transmitancia (T). Laabsorbancia (A) o densidad óptica (DO) se define como
DO = A = - log T
Es decir que la DO es una medida de la luz absorbida y/o dispersada por la muestra
Para medir turbidez utilizamos un haz de luz de λ=600 nm, ya que es sabido que los cultivos bacterianos no presentan una absorción significativa a esta longitud de onda. En estas condiciones el valor de DO obtenido se deberá completamente a la luz dispersada por la muestra, y se podrá correlacionar entonces la DO con la turbidez y por ende, con la concentración de células en cultivo
Si uno quisiera determinar la masa bacteriana o el número de células a partir de mediciones ópticas, se debería realizar una curva de calibración previa y determinar el grado de correlación entre ambas variables.
b. Conteo de células viables:
Este método nos permite determinar la concentración de células que se encuentran vivas. En la práctica, una fracción de la muestra es sembrada por esparcimiento en superficie sobre una placa de medio de cultivo sólido. Luego de la incubación, se desarrollarán colonias aisladas a partir de cada una de las células viables sembradas. Si la concentración de las mismas es muy alta, las células crecerán en forma confluente desarrollando un pasto y evitando así su conteo. En estos casos se deben realizar diluciones seriadas del cultivo original y luego sembrar una alícuota de las mismas sobre las placas de medio de cultivo sólido.
Los cálculos necesarios para obtener la concentración de viables a partir de las colonias contadas en cada dilución, se abordarán en la sección de ejercicios prácticos.
1.2. Crecimiento balanceado
Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, no de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso.
Durante este crecimiento, una célula madre es capaz de originar dos células hijas, por lo que el cultivo se comporta como una reacción autocatalítica de primer orden y sigue una cinética exponencial:
velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente}
3
Este tipo de crecimiento se denomina balanceado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera, aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (µ), que es característico para cada cepa bacteriana cultivada enun medio determinado.
En términos matemáticos la velocidad de crecimiento de cualquier componente Z en un tiempo corto puede expresarse como: dZ/dt = µ . Z
Expresión matemática del crecimiento balanceado:
Para deducirla vamos a aprovechar la definición empírica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del número de individuos. En función del aumento de masa celular:
Podemos decir que en condiciones de crecimiento exponencial:
(dM/M)/dt = µ dM/M = µ · dt
Integrando esta última expresión, se puede deducir que:
ln[M/M0] = µ (t-t0)
ln M - ln M0 = µ (t-t0)
Despejando la variable M:
ln M = ln M0 + µ (t-t0)
Forma exponencial:
M= M0 · eµ . (t-t0)
Se puede deducir que en condiciones de crecimiento exponencial existe una relación lineal entre el logaritmo de M y el tiempo.
A partir de las fórmulas anteriores se puede calcular al coeficiente µ como:
µ = ln(M/M0) /(t-t0)
Supongamos que partimos de una célula, tras una división celular, tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc. Esto constituye una serie geométrica: 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n (donde n es número de generaciones transcurridas).
Si en vez de partir de una célula partimos de N0 células iniciales, la expresión se convierte en:
N = N0·2nN/N0 = 2n
Por otro lado, el número de generaciones se puede calcular fácilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generación (g)
n = (t-t0)/g
Sustituyendo esta expresión en la fórmula anterior tenemos:
N/N0 = 2(t-t0)/g
Aplicando logaritmos neperianos obtenemos que:
ln (N/N0)= [(t-t0)/g ]· ln2
4
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemáticas que hemos deducido, basadas en la masa o en número de individuos son equivalentes, por lo tanto:
ln (M/M0) = ln (N/N0)
µ = ln (M/M0) /(t-t0) = [(t-t0)/g ]·ln2 / (t-t0)
Simplificando el término (t-t0) en la expresión anterior:
µ = ln2/g = 0.693/g (expresado en h-1 o min-1)
Esta es la expresión matemática del coeficiente del crecimiento balanceado, en función del tiempo medio de generación (g), en condiciones de crecimiento exponencial.
En un medio ideal, sin limitación de nutrientes, este coeficiente es μ = μmáx, o sea, el máximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio (Crecimiento balanceado no restringido).
En un medio donde la concentración de algún nutriente sea limitante, el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al máximo, y se puede calcular a partir de la fórmula empírica siguiente:
µ = µmáx· [S]/(KS + [S])
donde [S] es la concentración del nutriente limitante; KS es la constante de saturación, correspondiente a la concentración de nutriente en la cual el coeficiente es equivalente a la mitad del μ máx.
Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por µ) es una función hiperbólica de la concentración del sustrato (nutriente) limitante. Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energía, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.
En la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho, entonces se establece un sistema cerrado cuyas características se describen a continuación:
5
1.3. Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio líquido
El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases.
Fase de retardo (fase "lag")
Es el período de tiempo durante el que el inóculo bacteriano se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios factores:
tamaño del inóculo
estado metabólico previo del inóculo:si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros metabolitos celulares son bajos, y las células deben reponerlos en el medio fresco. Si las células están dañadas por algún agente, el tiempo de esta fase será mayor ya que necesitan reparar estos daños para luego iniciar el crecimiento. Si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase logarítmica, el lag será más corto ya que poseen un metabolismo activo y niveles adecuados de los metabolitos intracelulares.
medio del que procede el inóculo: si el medio es similar al medio fresco, el lag será más corto. Si el medio original del inóculo era un medio rico y el medio fresco es nutricionalmente más pobre, la fase de retardo será más larga, ya que las bacterias necesitarán un tiempo adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico. Pero aún cuando la inoculación se hace desde un cultivo previo en fase logarítmica, cuyo medio sea idéntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. Por qué?:
necesidad de neutralizar sustancias tóxicas en el medio fresco.
El gráfico superior muestra una curva de crecimiento típica para un sistema cerrado en medio líquido. En este caso el crecimiento es monitoreado a través de mediciones de Densidad Óptica (DO). El gráfico inferior resulta de la aplicación de la función logaritmo neperiano para cada punto de la curva de crecimiento anterior. Es en este gráfico donde se observa claramente la extensión de la fase exponencial como el lapso en que el gráfico se ajusta a una recta. La pendiente de esta recta corresponde al valor de μmáx.
6
diferencia en la temperatura de los medios.
dilución de metabolitos intracelulares.
Fase de crecimiento exponencial (fase logarítmica)
Al final de la fase lag las células de la población no se encuentran todas en las mismas condiciones fisiológicas. Por ello, al inicio de la fase de crecimiento las distintas células comienzan a crecer y duplicarse con un cierto desfasaje respecto de sus compañeras. Luego, al cabo de un determinado tiempo, el estado de la población se homogeniza y todas ellas se encuentran duplicándose activamente.
Durante la fase exponencial se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en undeterminado medio de cultivo:
El valor del tiempo de generación (g) depende de:
composición del medio
temperatura
pH
osmolaridad (tonicidad), etc.
Los microorganismos heterótrofoscomúnmente utilizados en el laboratorio suelen crecer más rápidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono.
Fase estacionaria
Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo (µ= 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento se equilibra con la muerte celular, visualizándose como un estancamiento en el crecimiento neto del cultivo.
En este período se agotan determinados nutrientes y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la transición entre las fases exponencial y estacionaria (de aceleración negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (por ejemplo, puede recurrir a metabolizar aminoácidos como fuente de carbono una vez agotados los azúcares).
En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo general de la bacteria es sustancialmente diferente al de la fase logarítmica:
las células son más pequeñas debido a que existe división celular después de que se haya detenido el incremento de masa.
el citoplasma se condensa.
en las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma.
el nucleoide se condensa, por sustitución de ciertas proteínas que se unen a ADN.
la membrana citoplásmica se hace menos fluida.
suelen ser más resistentes a agentes físicos (temperatura, estrés osmótico) y químicos.
7
existe un cambio en el patrón de expresión genética: disminuye la expresión de cientos de genes que habían estado expresándose durante la fase exponencial, mientras que se activan unos 50-100 genes que antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria). Estos genes se transcriben mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada del factor sigma σS característico de esta fase de crecimiento.
existe reciclado de ciertos materiales intracelulares.
baja el contenido en ARN.
Fase de muerte
Se da muerte y lisis masivadel cultivo. Se debe alagotamiento de reservas de energíay la imposibilidad de llevar a cabo las reacciones básicas para el mantenimiento de la célula. Algunas veces las células aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas "fantasmas", "ghost"). Dependiendo de la especie y el cultivo utilizado, la fase de muerte puede presentar una cinética exponencial, caracterizada por un μ de muerte, que en este caso será negativo. La pendiente de esta curva también varía según la especie (por ejemplo, en bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).
2. EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS
Los antibióticos son moléculas complejasusualmente de bajo peso molecular, con regiones hidrofóbicas que facilitan el transporte al interior celular. Muchos poseen estructuras cíclicas, clavesen la interacción de la molécula con su diana macromolecular. Son producto del metabolismo secundario de microorganismos procariotas (Streptomyces, Myxococcus, Bacillus, entre otras) o eucariotas (hongos de los géneros Penicillium, Cephalosporium, etc).
Muchos antimicrobianos que se comercializan actualmente son modificaciones químicas de antibióticos naturales que se producen en el laboratorio (antimicrobianos semisintéticos). Además, hay otros antimicrobianos que se producen completamente de manera sintética.
La mayor parte de los antimicrobianos se emplean para en bajas dosis para tratar enfermedades de etiología bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos presentan actividad antitumoral.
Según su efecto,los antimicrobianos se pueden clasificar en:
Bacteriostáticos: El agente inhibe el crecimiento celular en forma reversible. Esto significa que al removerse el antimicrobiano del medio de cultivo, las células pueden retomar su crecimiento.
Bactericidas: El antimicrobiano inhibe el crecimiento en forma irreversible, causando la muerte de la bacteria e impidiendo que la misma vuelva a crecer, aún si se remueve el agente del medio de cultivo. Si además el compuesto causa la lisis celular, se denomina bactericida lítico. De lo contrario, si la muerte es causada sin necesidad de lisis, el agente se denomina bactericida no lítico o bactericida propiamente dicho.
Para estudiarlos, los antimicrobianossuelen agruparse en función de los blancos sobre los que actúan y con los que interfieren:
A) los que interfieren con la biosíntesis de la pared celular
B) losque actúan sobre la membrana celular
C) los que inhiben la síntesis de proteínas
8
D) los que actúan sobre la síntesis de ácidos nucleicos.
Los antimicrobianos más abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas de la biosíntesis del peptidoglicano de las eubacterias, y los que interfieren con la función del ribosoma.
2.1. Inhibidores de la biosíntesis de la pared celular bacteriana
Fosfomicina (fosfonomicina)
Este antibiótico de estructura muy simple es producido por Streptomyces fradiae. Su acción inhibitoria es ejercida a nivel de la primera reacción de la síntesis del peptidoglicano(PG), a saber, impidiendo la condensación reductora del UDP-NAG con el PEP para dar UDP-NAM. Ello lo logra uniéndose con la enzima transferasa correspondiente, inactivándola.
Aunque tiene baja toxicidad para organismos superiores, apenas ha encontrado aplicación en la clínica.
Cicloserina
Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibiótico muestra cierto parecido estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que actúa como inhibidor competitivo de las dos reacciones secuenciales de la síntesis del PG donde aparece la D-ala:
inhibe la racemasa que cataliza la conversión de L-ala en D-ala;
inhibe la D-alanil-D-alanina sintetasa (que condensa dos D-ala para dar el dipéptido D-ala-D-ala).
La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos enzimas.
Es un antibiótico de amplio espectro, pero apenas se emplea clínicamente, debido a su neurotoxicidad. Se recurre a él sólo para tratar ciertos casos de tuberculosis, en combinación con otros antibióticos.
Vancomicina
Es un glucopéptido complejo producido por Streptomyces orientalis. Se une rápida e irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina del pentapéptido del precursor del PG que se halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana citoplásmica), de modo que inhibe la reacción de transglucosidación.
Es un antibiótico de espectro estrecho, bactericida frente a muchas bacterias Gram-positivas. No actúa sobre Gram-negativas ya que no puede atravesar su membrana externa. Recientemente se está usando frente a infecciones severas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus pneumoniae que sean resistentes a otros antibióticos. Es la droga de elección ante colitis asociadas a antibióticos ocasionadas por Clostridium difficile.
9
Ristocetina
Es un antibiótico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual que la vancomicina inhibe la transglucosidación, siendo activo frente a Gram-positivas.
Bacitracina
Producida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de ahí su nombre), es un antibiótico polipeptídico provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a muchos Gram-positivos así como frente al Gram-negativo Neisseria. Es demasiado tóxico (sobre todo nefrotóxico) como para ser administrado sistémicamente, pero tiene uso tópico (p. ej., en cirugía del colon).
Su mecanismo de acción estriba en que se une al pirofosfato del undecaprenil-P-P, e impide su regeneración hasta undecaprenil-P por la fosfatasa específica; por lo tanto, evita la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo biosintético del PG.
Antibióticos β-lactámicos
Todos los antibióticos de este grupo contienen un anillo característico: el anillo β-lactámico. La importancia de las penicilinas radica en que fueron los primeros compuestos antibióticos naturales en descubrirse. Con el paso del tiempo se fueron descubriendo otros compuestos que presentan el mismo anillo β-lactámico, pero que presentan variantes estructurales y por lo tanto se agrupan en familias diferentes a la penicilina:
El poder de estos antibióticos reside fundamentalmente en su anillo β-lactámico, por lo que el mecanismo de acción de todos ellos es el mismo:
Inhiben el sistema enzimático implicado en la reacción de transpeptidación del peptidoglicano naciente, impidiendo los entrecruzamientos entre cadenas de PG.
Esta inhibición de la reacción de transpeptidación causa:
acumulación de precursores del PG, sin ensamblar;
activación de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que hidrilozan el PG maduro de la bacteria.
En Gram-positivas, además, se produce desorganización de los ácidos teicoicos y lipoteicoicos. (En este tipo de bacterias son estos ácidos los que regularían la activación de las autolisinas).
10
Por ello todas las penicilinas son bactericidas líticos sobre bacterias en crecimiento activo y en medios hipotónicos respecto al interior celular.
En caso de que la bacteria se encuentre creciendo en un medio de cultivo isotónico, se generará una célula sin pared denominada protoplasto, pero éste no se lisará.
Si la bacteria no se encuentra en crecimiento, no habrá síntesis de pared celular ni renovación ("turnover") de la misma. En estas condiciones el antibiótico β-lactámico no tendrá una "diana" sobre la que actuary por lo tanto, la bacteria sobrevivirá. Esta es la causa general de las "recaídas" de muchas infecciones, una vez que se ha dado por terminado prematuramente el tratamiento de un paciente con este tipo de antibiótico.
2.2. Inhibidores de labiosíntesis de proteínas
Los antimicrobianos que interfieren en la síntesis de proteínas son numerosos y muy variados. La mayoría de ellos funcionan interactuando con el ribosoma, sobre todo los que se unen a proteínas ribosómicas y/o a alguno de los ARN ribosómicos. Los más útiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los ribosomas 70S procarióticos, pero no sobre los 80S eucarióticos. En este trabajo práctico pondremos especial atención en aquellos antibióticos que afectan a la elongación de la cadena naciente del polipéptido. Siguiendo el orden natural del funcionamiento de la elongación de la cadena polipeptídica, podemos agruparlos según la fase concreta del proceso que inhiben:
inhibición del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del ribosoma;
introducción de errores en la lectura de los ARNm;
inhibición de la reacción de formación del enlace peptídico;
inhibición de la traslocación del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.
bloqueo de los factores de elongación.
2.2.1 Inhibidores que provocan la introducción de errores en la lectura de los ARNm
Kanamicina
La kanamicina es un antibiótico de la familia de los aminoglucósidosproducido por la bacteria Streptomyces kanamyceticus. El mismoes un bactericida de amplio espectro, activo frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Debido a su toxicidad, en el área clínica el uso de kanamicina se ha limitado últimamente al uso oral y tópico.
Mecanismo de acción: La kanamicina interactúa irreversiblemente con la subunidad 30S del ribosoma, interfiriendo la formación del complejo de iniciación y provocando una gran cantidad de errores en la lectura de los ARNm. Esto ocasiona polipéptidos con una secuencia aminoacídica errónea y/o truncos, que resultan no funcionales y cuya acumulación es tóxica para la célula.
Estreptomicina
La estreptomicina es el primer antibiótico descubierto de la familia de los aminoglucósidos, producido por la bacteria Streptomyces griseus. El mismo es un bactericida de espectro reducido, que
11
inhibe la síntesis proteica bacteriana a nivel de la subunidad 30S ribosomal. Es utilizado preferentemente frente a Mycobacterium tuberculosis y algunos microorganismos gram negativos sensibles.
2.2.2 Inhibidores de la fase inicial de la elongación (del reconocimiento y entrada del aa-ARNt al sitio "A" del ribosoma)
Tetraciclinas
Son antibióticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas, Gram-negativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas), producidos por distintas especies de Streptomyces. Actúan como bacteriostáticos, siempre y cuando las bacterias estén en crecimiento activo. Como se puede ver por su espectro, son útiles incluso contra bacterias que viven como parásitos intracelulares (como las Rickettsias), debido a que su carácter hidrofóbico permite su difusión a través de membranas.
Mecanismo de acción: Provocan que la unión del aa-ARNt al sitio A del ribosoma sea inestable y esté distorsionada, con lo cual se evita la elongación de la cadena. In vitro actúan tanto frente a ribosomas 70S como frente a los 80S. Entonces, ¿por qué in vivo sólo inhiben a las bacterias? La explicación está en el hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma "suicida", cosa que no ocurre en eucariotas. Al llegar la tetraciclina a la subunidad 30S, se une a las proteínas S4 y S18 del ribosoma 70S intacto, ejerciendo el efecto que hemos descrito en el párrafo anterior.
Efectos secundarios:
Las tetraciclinas naturales se absorben mal por el intestino, y pueden destruir la flora autóctona, favoreciendo infecciones secundarias. Las semisintéticas evitan este problema.
Se depositan en tejidos calcificados, ocasionando daños a huesos y dientes, y tiñendo los dientes de amarillo en los niños.
2.2.3 Inhibidores de la formación del enlace peptídico
Se trata de un grupo variado y heterogéneo de agentes antibacterianos que interfieren con el centro peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma.
Cloranfenicol(antes llamado cloromicetina)
Antiguamente la industria lo obtenía a partir de Streptomyces venezuelae, pero actualmente es más barato fabricarlo por síntesis química. Es un bacteriostático de amplio espectro. Se absorbe bien vía oral y penetra bien en todos los tejidos, incluyendo cerebro y líquido cerebroespinal, por lo que se puede usar frente a meningitis ocasionadas por Haemophilus influenzae, así como tratamiento de fiebres tifoideas y anaerobios Gram-negativos.
12
Mecanismo de acción: Se une a varios sitios de la subunidad 50S, entre los cuales el más importante es la proteína L16, que forma parte del centro peptidil-transferasa, cerca del sitio del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del ARNt, en el sitio A.
El cloranfenicol ha sido muy útil en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza los polisomas rápidamente.
13
TRABAJO EXPERIMENTAL I. MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
A. Método de dilución en tubo
La actividad antimicrobiana se mide determinando la concentración más pequeña del agente que
se necesita para inhibir el crecimiento de un organismo control, valor que se conoce como
concentración inhibitoria mínima (CIM). A partir de este dato puede determinarse si es posible tratar
una infección causada por ese microorganismo con ese antimicrobiano, o no. Si la CIM es menor que la
concentración de antimicrobiano que se alcanza en los tejidos de cuerpo humano, el tratamiento
puede tener éxito, y el microorganismo se considera sensible; en caso contrario fracasará, y el
microorganismo se considera resistente.
a) Preparar un tubo de hemólisis con 2 ml de LB líquido, con una concentración de cloranfenicol
de 200 μg/ml. A partir del mismo preparar 5 diluciones seriadas al medio. En el último tubo, se debe
descartar 1 ml, para que todos los tubos tengan el mismo volumen final (1 ml).
Inocular todos los tubos de la serie con la cepa de Bacillus subtilis MC530.
b) Repetir la preparación de las
diluciones partiendo de una
concentración inicial de cloranfenicol de
25μg/ml.
Inocular todos los tubos de la serie
con la cepa de Bacillus subtilis JH642.
En ambos se agregarán 2 tubos de
hemólisis con 1 ml de LB cada uno: Uno
se inoculará con la cepa de B. subtilis
correspondiente (Control positivo) y uno
se dejará sin inocular (Control negativo).
Después de la incubación a 37ºC con agitación durante una noche, observar en qué tubos no ha habido
crecimiento (indicado por turbidez visible) e informar la CIM de cada una de las cepas.
14
B. Método de la difusión en agar (Antibiograma)
Un antibiograma es un estudio de la sensibilidad de un
microorganismo ante distintos compuestos antimicrobianos.
Las distintas especies y variantes microbianas presentan
distintos grados de sensibilidad a los diversos agentes, de ahí
que sea necesario hacer una evaluación para poder seleccionar
el compuesto más apropiado para el tratamiento de una
infección bacteriana.
a) Preparar el inóculo: suspensión del microorganismo
al cual se le determinará la sensibilidad al antimicrobiano (B. subtilisJH642 o MC530).
b) Sembrar 100 µL del inóculo de la cepa bacteriana a ensayar con espátula de Drigalsky en una
placa de LBA.
c) Aplicar un set de discos con antimicrobianos sobre la placa (agregar a cada disco 5 µL de
distintas concentraciones de Cloranfenicol 40 mg/mL, 5 mg/mL y 2.5 mg/mL, y de Kanamicina 10
mg/mL, antes de aplicar sobre la placa.
d) Incubar 16 horas a 37°C y observar el desarrollo de crecimiento.
Durante la incubación el agente difunde desde el papel de filtro al agar: cuanto más se aleja del papel
menor es la concentración del agente. A una cierta distancia del disco se alcanza la concentración
Inhibitoria mínima (CIM). Pasado ese punto, el microorganismo puede crecer ya que la concentración
del agente antimicrobiano no es suficiente para inhibirlo. Se crea por lo tanto una zona de inhibición, y
el diámetro de esta zona es proporcional a la cantidad de agente antimicrobiano añadida al disco y a
la efectividad del agente.
Este método se utiliza rutinariamente para ensayos de sensibilidad a los antimicrobianos de los
microorganismos patógenos.
II. CINÉTICA DE CRECIMIENTO
a) Inocular un erlenmeyer con 80 ml de medio LB líquido con un cultivo saturado de E. coli, de manera de lograr una DO inicial de 0.1. Incubar a 37 °C con agitación.
b) Cuando el cultivo haya alcanzado una DO aproximada de 0.3 dividir en 4 alícuotas de 15 ml cada una:
cultivo control: Sin agregados
Cultivo Ap200: se le agregará ampicilina en cantidad suficiente para alcanzar una concentración final de 200 µg/ml.
Cultivo Cm40: se le agregará cloranfenicol en cantidad suficiente para alcanzar una concentración final de 40 µg/ml.
Cultivo Tc100: se le agregará tetraciclina en cantidad suficiente para alcanzar una concentración final de 100 µg/ml.
15
c) Continuar la incubación y tomar alícuotas de 1 ml cada 30 minutos. Sobre estas alícuotas se medirá la DO.
d) Graficar DO en función del tiempo para cada uno de los cultivos.
e) Graficar ln DO en función del tiempo para cada uno de los cultivos.
f) Discutir los efectos de cada uno de los antimicrobianos sobre el crecimiento del cultivo.
g) Calcular los parámetros μmáx y g para el cultivo sin agregado de antimicrobianos.
III. RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES
a) Realizar diluciones seriadas hasta un orden de 10-7 a partir de un cultivo de E. coli a DO 0.3-0.5
b) Sembrar las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7 en placas de LBA utilizando espátula de Drigalsky.
c) Incubar una noche a 37°C y hacer el recuento de colonias en la placa que corresponda.
16
CUESTIONARIO
1. ¿Qué técnicas pueden utilizarse para medir el crecimiento bacteriano? ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de cada una de ellas?
2. ¿A qué se denomina metabolito secundario? ¿Puede utilizarse su producción para evaluar el crecimiento de un cultivo?
3. ¿Qué fenómenos ocurren durante la fase lag de crecimiento? ¿Qué factores afectan la duración del período lag?
4. ¿Qué factores influyen sobre la velocidad de crecimiento?
5. ¿Cómo se calcula la velocidad máxima de crecimiento en un cultivo cerrado? ¿y el tiempo de generación?
6. ¿Cómo se puede mantener un microorganismo en fase exponencial de crecimiento por un período continuado de tiempo?
7. Si luego de 2 días de cultivo no se obtiene desarrollo de un dado microorganismo ni a 10°C ni a 45°C, ¿puede concluir que ese microorganismo no crece a esas temperaturas? Justifique.
8. ¿Por qué deben realizarse diluciones para realizar el recuento de células viables?
9. Explique qué es lo que se cuenta y qué es lo que se asume cuando se realiza un recuento de células viables.
10. ¿Cómo diferencia un agente bactericida de un bacteriostático? ¿Y un bactericida lítico de un bactericida no lítico?
11. ¿Cuál es el blanco de los antibióticos β-lactámicos? ¿Cuál es su mecanismo de acción?
12. ¿Para qué realizaría un antibiograma en un diagnóstico clínico?
13. ¿Cómo se podría determinar si los microorganismos contenidos dentro una zona de inhibición del crecimiento están muertos o solo inhibidos?
14. Explique la importancia de incluir controles positivos y negativos en un ensayo de CIM.
17
PROBLEMAS
1. Se desea conocer el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL), de un cultivo de Escherichia coli LE392. A partir de dicho cultivo se realizaron tres diluciones 1:100, y una dilución 1:10. Se sembraron con espátula de Drigalski 0,1 mL de la tercera y cuarta dilución, por triplicado. En la tercera dilución se contaron 50, 55 y 48 colonias, mientras que en la cuarta el recuento arrojó 1, 3 y 3 colonias.
a) ¿Qué significado tiene el término UFC/mL?
b) ¿Cuál de las dos diluciones se usa para calcular el número de UFC/mL? Justifique.
c) Calcule en número de UFC/mL del cultivo original.
d) Este método de cuantificación de microorganismos determina:
I. número total de microorganismos. II. número de microorganismos viables.
III. número de microorganismos muertos. 2. Se necesita cuantificar la carga bacteriana de un polvo medicinal coloreado hidrosoluble. Para ello
disuelve 5 g de polvo en 5 mL agua estéril, logrando disolución completa. A partir de la mezcla inicial realiza una primera dilución 1/20 y a partir de ella, 4 diluciones seriadas al décimo (1/10) más. Luego inocula, por triplicado, 0,2 mL de cada una de las diluciones al décimo sobre placas conteniendo medio de cultivo.
a) De las siguientes opciones seleccione qué medio de cultivo utilizaría en las placas. Justifique su elección.
i. sintético, sólido y diferencial ii. complejo, sólido y selectivo
iii. complejo y semisólido iv. complejo, sólidoy diferencial v. selectivo y diferencial
vi. complejo y sólido vii. sintético y sólido
viii. sintético y semisólido Luego de la incubación, los resultados obtenidos fueron:
Número de colonias
Seriada 1 520 480 530
Seriada 2 60 54 62
Seriada 3 3 6 4
Seriada 4 0 1 0
b) Calcule el número de UFC/mL en la disolución inicial del polvo ¿Qué esperaría observar si siembra la primera dilución, 1:20? Justifique
18
3. En un laboratorio de Microbiología se les propuso a los alumnos evaluar el efecto de los diferentes antibióticos sobre el crecimiento de E. coli en un cultivo líquido cerrado. Para lo cual, se les proporcionó un frasco con 60 mL de medio LB y un cultivo saturado de E. coli. A continuación, los alumnos procedieron según el siguiente protocolo:
1) Inocularon el medio de cultivo fresco con el saturado de manera tal de lograr una DO
inicial de 0.1. Incubaron el cultivo en agitación a 37°C.
2) Una vez alcanzada la DO de 0.3-0.4, dividieron el cultivo en 4 alícuotas iguales:
Cultivo control: sin agregados
Cultivo Ap200: agregaron el antibiótico ampicilina en cantidad suficiente para alcanzar una concentración final de 200 µg/mL.
Cultivo Cm40: agregar el antibiótico cloranfenicol en cantidad suficiente para alcanzar una concentración final de 40 µg/mL.
Cultivo Tc100: agregar el antibiótico tetraciclina en cantidad suficiente para alcanzar una concentración final de 100 µg/mL.
3) Continuaron la incubación y tomaron alícuotas de 1 mL de cada uno de los cultivos cada 30
minutos. Sobre estas alícuotas midieron la DO. Al final del práctico, armaron una tabla con los datos obtenidos, la cual se muestra a continuación:
Tiempo (min) DO Control DO Amp DO Cm DO Tc
0 0.153 0.153 0.153 0.153
30 0.228 0.228 0.228 0.228
60 0.412 0.412 0.412 0.412
90 0.7 0.163 0.519 0.5
120 1.029 0.103 0.539 0.513
150 1.604 0.097 0.549 0.525
a) Calcule el ln DO para cada punto y grafique ln DO vs tiempo para el cultivo control y cada uno de
los cultivos tratados con antibiótico b) ¿Cuál es el efecto de los distintos antibióticos sobre el crecimiento de E. coli?
4. Por accidente, en el laboratorio se borraron los rótulos de dos frascos de antibióticos (ATB A y B). Se sabe que uno de ellos es Ampicilina (un antibiótico que inhibe la síntesis de la pared bacteriana) y el otro Tetraciclina (un antibiótico que inhibe la síntesis de proteínas). Para identificarlos, se decidió realizar una curva de crecimiento. Para ello, se inoculó un cultivo bacteriano en medio LB a partir de un saturado de E. coli y se lo incubó a 37ºC en agitación. Cuando éste alcanzó una DO de 0.3, se lo dividió en 3 alícuotas:
- A la primera se la dejó crecer sin ningún agregado, para utilizarla como control.
- A la segunda se le agregó el antibiótico A.
- A la tercera se le agregó el antibiótico B.
La densidad óptica (DO) de cada cultivo fue monitoreada a lo largo del tiempo (se tomó 1mL de cultivo cada 30 minutos), y los resultados obtenidos fueron los siguientes:
19
A. Teniendo en cuenta las características de los antibióticos y los gráficos observados, indicar de qué antibiótico se trataba en cada caso.
B. ¿En qué fase del crecimiento bacteriano se agregaron los antibióticos? ¿Por qué?
C. En el primer intento de realizar este experimento, al agregar el antibiótico A no se observó ningún efecto en el crecimiento bacteriano en comparación con el control. Este problema fue resuelto aumentando la concentración de antibiótico agregado.
Utilizando el concepto de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), explicar lo sucedido.
5. Para analizar el efecto de diferentes concentraciones de un antibiótico sobre el crecimiento de
una cepa de Streptococcus se determinó tanto la DO del cultivo, como el recuento de células viables a diferentes tiempos. Los datos indicados en la columna 1 (cultivo 1) fueron obtenidos en ausencia del antibiótico. Los cultivos 2 y 3 muestran el crecimiento de cultivos a los cuales se les
adicionó a los 150 minutos el antibiótico en estudio a una concentración final de 1 y 100 g/mL respectivamente.
Cultivo 1: ausencia de antibiótico
Cultivo 2: a los 150 minutos se agregó el antibiótico a una concentración final de 1 g/mL y se continuó midiendo la DO del cultivo.
Cultivo 3: se realizó el mismo procedimiento que para el cultivo 2 excepto que el antibiótico se
agregó a una concentración final de 100 g/mL.
Tabla 1. Medida de DO
Tiempo (min)
Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3
D.O. ln D.O. D.O. ln D.O. D.O. ln D.O.
0 148 5 148 5 148 5
60 149 5 149 5 149 5
90 181 5.2 181 5.2 181 5.2
120 330 5.8 330 5.8 330 5.8
150 600 6.4 600 6.4 600 6.4
180 1097 7 600 6.4 600 6.4
210 2000 7.6 600 6.4 600 6.4
240 3640 8.2 600 6.4 600 6.4
300 5400 8.6 600 6.4 600 6.4
ln ln ln
20
360 5430 8.6 600 6.4 600 6.4
Tabla 2. Recuento de células viables x 108 (Nv).
Tiempo (min) Cultivo 2 Cultivo 3
Nv ln Nv Nv ln Nv
0 2.7 19.4 2.7
60 2.7 19.4 2.7
90 3.3 19.6 3.3
120 6.0 20.2 6.0
150 11 20.8 6.0
180 11 20.8 5.8
210 11 20.8 3.2
240 11 20.8 2.5
300 11 20.8 2.0
360 11 20.8 1.8
a) Calcule μmáx y g e indique durante que lapso el cultivo se encontraba en la fase exponencial.
b) Fundamente cual es el efecto del antibiótico para cada concentración (bacteriostático, bactericida o bacteriolítico).
6. Con el fin de analizar el efecto de los antibióticos X e Y sobre el crecimiento de E. coli se
determinó el número de células viables por mililitro (Nv/mL) a diferentes tiempos, en ausencia (Tabla 1) y en presencia de dichos antibióticos (Tabla 2: antibiótico X; Tabla 3: antibiótico Y). Se indican las diluciones realizadas a cada tiempo para el contaje de células viables, el volumen sembrado para cada dilución y el número de unidades formadoras de colonias (UFC) contadas en cada dilución.
Tabla 1. Valores obtenidos en ausencia de antibióticos.
Tiempo (hs) Dilución Vol. de siembra (mL) UFC
0 10-2 0.1 30
10-3 0.1 1
1 10-2 0.2 61
10-3 0.2 3
2 10-2 0.1 60
10-3 0.1 8
4 10-3 0.1 410
10-4 0.1 38
6 10-6 0.2 49
10-7 0.2 4
7 10-5 0.1 922
10-6 0.1 145
8 10-6 0.1 290
10-7 0.1 25
9 10-7 0.2 58
10-8 0.2 1
21
Tabla 2. El antibiótico X fue agregado a T = 4 hs.
Tiempo (hs) Dilución Vol. de siembra (mL) UFC
5 10-4 0.1 54
10-5 0.1 5
7 10-3 0.1 630
10-4 0.1 55
9 10-3 0.2 1200
10-4 0.2 108
Tabla 3. El antibiótico Y fue agregado a T=4 hs.
Tiempo (hs) Dilución Vol. de siembra (mL) UFC
5 10-4 0.2 108
10-5 0.2 9
7 10-3 0.1 120
10-4 0.1 24
9 10-3 0.2 54
10-4 0.2 2
a) Calcule UFC/mL del cultivo para cada tiempo, en ausencia y presencia de los antibióticos X e Y.
b) Grafique ln Nv/mL vs tiempo en ausencia y presencia de los antibióticos.
c) Calcule μmáx y g.
d) ¿Puede, en base a los datos de Nv, indicar el efecto de los antibióticos X e y sobre E. coli? (bacteriostático, bactericida o bacteriolítico). En caso negativo, indique qué otros datos necesitaría para determinarlo.
7. Una investigadora desea caracterizar el crecimiento de una cepa nueva del género Streptomyces sp., que en medios de cultivo líquidos crece formado grumos debido a su desarrollo a través de micelios. Para ello, procede a realizar una curva de crecimiento determinando la masa celular como peso seco. Inicia la curva inoculando un cultivo líquido y, a los tiempos que se indican en la tabla, toma alícuotas de 5 ml por duplicado y las coloca en tubos falcon. Luego de centrifugar los tubos a 4ºC para detener el crecimiento, elimina con cuidado el sobrenadante, reservando los pellets celulares recogidos. Para finalizar el proceso, coloca los tubos abiertos en la estufa de 37ºC por 24 hs o más con el objeto de lograr peso estable en cada tubo. Los valores de peso seco (mg) registrados a cada tiempo se muestran en la tabla y en las figuras que siguen:
Horas Peso Seco (mg) Ln (Prom. Peso Seco)
0 0,00 0,00
5 0,12 0,10 -2,21
10 0,16 0,14 -1,90
15 1,00 0,95 -0,03
18 1,45 1,40 0,35
21 2,90 2,88 1,06
24 4,30 4,28 1,46
40 66,70 65,00 4,19
22
47 103,75 101,00 4,63
62 96,75 95,00 4,56
71 91,75 90,00 4,51
a) Explique: ¿Por qué la investigadora realizó mediciones de peso seco en lugar de determinaciones de DO para estudiar el crecimiento de este microorganismo? ¿La información que obtiene de estos métodos de estudio de crecimiento es equivalente? ¿Qué beneficios y qué desventajas tiene esta técnica con respecto a DO, en general y en este caso en particular?
b) En la gráfica del Ln (peso seco) vs. Horas, indique las fases de crecimiento, y el lapso de tiempo durante el cual el cultivo se encontraba en la fase exponencial. Calcule μmáx y g a partir de los datos de la tabla.
c) Streptomyces sp. es el género productor, por excelencia, de metabolitos secundarios (antibióticos, antifúngicos, exoenzimas, pigmentos, entre otros). Indique en qué fase del crecimiento el microorganismo produce estos compuestos. Esquematice en la gráfica de Peso seco vs. horas cómo sería la curva esperada de producción del compuesto. ¿Podría utilizarse la síntesis de metabolitos secundarios para calcular los parámetros de crecimiento?
8. Se quiere determinar el sitio de acción de un antibiótico, para lo cual se utiliza la bacteria Gram (+) Bacillus subtilis. Alícuotas de esta bacteria son incubadas con el agregado de precursores radioactivos en presencia o en ausencia del antibiótico. Luego se van tomando muestras a distintos tiempos y se determina la incorporación de radioactividad en cada caso, obteniéndose los siguientes gráficos:
I. Incubación realizada en presencia de UDP (14C) Glc-Nac
21 3
Tiempo (Hs.)
% de radioactividaden la pared celular
Sin antibióticoCon antibiótico
23
II. Incubación realizada en presencia de (14C) D-alanina.
III. Incubación realizada en presencia de (14C) D-alanina.
a) Indique los posibles sitios de acción de este antibiótico.Justifique su respuesta.
b) Grafique DO en función del tiempo para un cultivo al que se le agrega este antibiótico.
9. Se estudió el mecanismo y lugar de acción de un antibiótico activo contra bacterias Gram (+), para ello se realizaron los siguientes ensayos:
I. Ensayos de biosíntesis de macromoléculas: se cultivó la bacteria Staphylococcus aureus en presencia de distintos precursores de macromoléculas marcadas radioactivamente, en presencia de distintos antibióticos conocidos y del nuevo antibiótico X. Luego se prepararon los extractos celulares según la macromolécula que se quería estudiar y se determinó la cantidad de radioactividad de cada una según la siguiente tabla:
21 3
Tiempo (Hs.)
% de radioactividaden la pared celular
Sin antibióticoCon antibiótico
4
21 3
Tiempo (Hs.)
% de radioactividaden la fracción demembrana
Sin antibióticoCon antibiótico
4
24
% de inhibición sobre la biosíntesis
Proteína DNA RNA Mureína
X 2 1 1 92
Cloranfenicol 85 0 2 2
Actinomicina 1 91 15 0
Rifampicina 0 1 92 1
Vancomicina 1 0 0 84
II. Incorporaciónde radiactividadproveniente de precursores unidos a UDP en presencia de distintos antibióticos. Posteriormente se separa el péptidoglicano ácido insoluble y se determina su radiactividad para cada condición de cultivo según se ve en la siguiente tabla:
Precursor radioactivo Antibiótico (µ/mL)
Radiactividad
(incorporada en
mureína)
% Inhibición
UDP-GlcNac
Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina
20000
200
250
400
-
99
98.5
98
UDP-MurNac-pentapéptido
Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina
5000
4500
4250
500
-
5
7.5
90
En base a los datos suministrados:
a) Interpretar cada uno de los resultados presentados.
b) Indicar los posibles lugares de acción del antibiótico.
10. Las tetraciclinas representan una familia de antibióticos introducidos a fines de la década del 40, a partir de su aislamiento de diferentes cepas de Streptomyces.
Cuando una de estas cepas es cultivada en un medio de cultivo adecuado se obtienen los resultados observados en la siguiente tabla:
TIEMPO (hs) PESO SECO (g/l) ln PESO SECO
1 4.5 1.50
3 5.0 1.61
6 6.3 1.84
10 12.5 2.53
25
14 25.0 3.22
18 40 3.70
Por encima de las 20 hs. no se observa aumento apreciable del peso seco.
Paralelamente se determina la concentración de tetraciclina (Tc) producida por esta especie bacteriana en el sobrenadante del medio de cultivo (Fig. 1).
FIGURA 1
a. Calcular la velocidad de crecimiento específica máxima y el tiempo de generación.
b. Se podrían utilizar los datos numéricos de producción de Tc (en caso de contar con ellos) para calcular la velocidad pedida? Justificar.
11. Grafique cómo se comportará un cultivo de la bacteria Gram (-) E. coli K12, ante el agregado de los siguientes antibióticos, por separado, en los momentos indicados por las flechas en las figuras, ya sea en un medio hipotónico (caldo peptonado) o isotónico (caldo peptonado + sacarosa).
1- Ampicilina 2- Tetraciclina 3- Polimixina B 4- Vancomicina
105 15Tiempo (hs)
Cc de Tcproducida
20 25 30
Tiempo
D.O. D.O.
1, 2, 3
1, 3, 4
3, 2
3, 4
Tiempo
MEDIO ISOTÓNICO MEDIO HIPOTÓNICO
1, 2, 3
1, 2, 3
26
12. En el curso de la búsqueda de nuevos antibióticos producidos por microorganismos se detectó que una cepa de Bacillus subtilis produce un novedoso antibiótico macrocíclico llamado Dificidina. A los efectos de caracterizar este compuesto se realizaron los siguientes experimentos:
I. Una cepa de E. coli fue cultivada en medio sintético hasta D.O. 0,1. En ese momento se fraccionó el cultivo en 4 partes, y a los 60 minutos a cada fracción se le adicionó un compuesto diferente (Fig. 1).
FIGURA 1
II. Células de E. coli fueron cultivadas en medio M9 hasta fase logarítmica y en ese momento se adicionó Dificidina. Se tomaron alícuotas del cultivo desde el agregado del antibiótico, con el objeto de detectar la viabilidad celular (Fig. 2).
FIGURA 2
10050 150 200
0,4
0,8
0,2
0,6
Abs (590nm)
Control sin droga
Cloranfenicol
Dificidina
Penicilina
Tiempo (min)
Agregadode droga
1, 2, 3, 4
10050 150 200
10
20
5
15
ln N° Células
Control sin droga
100µg Dificidina
200µg Dificidina
Tiempo (min)
Agregadode droga
1, 2, 3, 4
27
a) En base a estos dos experimentos, ¿Qué conclusiones extrae sobre el efecto de Dificidina
sobre el crecimiento de E. coli? Fundamente su respuesta.
III. A continuación es realizada una serie de experimentos para determinar el proceso metabólico primario inhibido por Dificidina (ejemplo: síntesis de mureína, de proteínas, de ARN, de ADN). En todos los casos E. coli se cultivó en medio M9 en presencia de algún precursor radioactivo como se indica en cada caso, y se determinó la radioactividad (cpm) incorporada por las células (Figuras 3-6).
1- sin agregado 5- Tetraciclina 2- Dificidina 6- Rifampicina 3- Ac. Nalidíxico 7- Cloranfenicol 4- Cicloserina
FIGURA 3 FIGURA 4
FIGURA 5 FIGURA 6
b) ¿Qué conclusión extrae de estos últimos experimentos acerca del o de los posibles blancos de acción de la Dificidina? Explique su respuesta.
CPM
Tiempo
Incorporación de [ H] Uracilo
3
6
1
72
CPM
Tiempo
Incorporación de [ H] Aminoácidos
3
2 y 5
1
4
CPM
Tiempo
Incorporación de [ H] Timidina
3
3
2
6
1 CPM
Tiempo
Incorporación de [ H] DAP
3
4
2
31
5
28
13. Esquematice las curvas de crecimiento esperadas al medir DO en cultivos cerrados de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis, a los que se les agregan los siguientes antibióticos en fase exponencial: Vancomicina y fosfomicina. El medio de cultivo utilizado es LB.
14. Un integrante de su laboratorio preparó soluciones de vancomicina, ampicilina y tetraciclina, pero se olvidó de colocarles el rótulo. Usted tiene que identificar y rotular cada tubo en forma correcta. Para ello dispone de las cepas Escherichia coli y Bacillus subtilis, espectrofotómetro, medio de cultivo LB líquido.
a) ¿Cuál es el sitio de acción de estos antibióticos, y qué efectos ejercen sobre el crecimiento bacteriano?
b) Detalle cómo procedería a identificar cada uno, teniendo en cuenta los materiales con los que dispone.
15. Se quiere caracterizar un nuevo antibiótico llamado BQ14. Para ello se realizan los siguientes experimentos utilizando una cepa sensible al mismo:
I. Se cultiva la cepa sensible en medio de cultivo LB hasta DO= 0.3. En este momento el cultivo se divide en 2: A la mitad se le adiciona BQ14 100 μg/mL y a la otra se la deja sin tratamiento (Control). Se obtienen el siguiente resultado:
II. En los tiempos T1 y T2 se realiza el recuento de viables en el cultivo al cual se le agregó BQ14, obteniéndose los siguientes resultados:
Muestra Dilución Volumen sembrado
Colonias
T1
10-4 0.1 1000
10-5 0.2 230
10-6 0.2 18
T2
10-3 0.2 150
10-4 0.1 6
10-5 0.1 0
III. Se evalúa la incorporación de distintos sustratos marcados radiactivamente por parte de la cepa sensible, en presencia y ausencia del antibiótico BQ14
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 2 4 6 8 10 12 14
Ab
s 60
0nm
Tiempo (hs)
Control
BQ14T1 T2
29
[35S] metionina [3H] timidina [3H] uracilo [14C] DAP
+ BQ14 14900 1100 15900 110000
Sin antibiótico 15000 17000 16500 120000
Teniendo en cuenta los resultados anteriores:
a) Calcule el tiempo de generación, si el μmax para el cultivo sin antibiótico fue de 0.5 h-1
b) Describa brevemente los pasos a seguir para hacer un recuento de células viables.
c) Calcule UFC/mL en los tiempos T1 y T2 para el cultivo tratado con BQ14.
d) Clasifique a BQ14 según su actividad sobre la cepa estudiada. Justifique
e) ¿Qué procesos metabólicos se ven afectados en presencia de BQ14? Justifique
16. Para estudiar el efecto y mecanismo de acción de un antibiótico se llevaron a cabo los siguientes experimentos:
I. Recuento del número de células viables: El ensayo del antibiótico (ATB) se realizó sobre una cepa de Bacillus subtilis sensible (S) y una resistente (R); el antibiótico fue agregado en una concentración de 100 µg/mL, 150 minutos después de iniciado el cultivo. Los valores informados en la tabla son unidades formadoras de colonias por mililitro de cultivo.
TIEMPO (minutos)
Cepa S sin ATB
Cepa S con ATB
Cepa R con ATB
Cepa S sin ATB
Cepa S con ATB
0 1.0 x 103 1.0 x 103 1.0 x 103 1.1 x 103 1.1 x 103
30 1.0 x 103 1.0 x 103 1.0 x 103 1.2 x 103 1.2 x 103
60 1.5 x 103 1.5 x 103 1.5 x 103 1.3 x 103 1.2 x 103
90 4.0 x 104 4.0 x 104 4.0 x 104 4.2 x 104 4.1 x 104
120 4.0 x 105 4.0 x 105 4.0 x 105 4.1 x 105 4.0 x 105
150 4.0 x 106 4.0 x 106 4.0 x 106 3.9 x 106 3.8 x 106
180 4.2 x 107 4.2 x 107 4.2 x 107 4.1 x 107 4.0 x 106
210 3.7 x 108 3.7 x 108 3.7 x 108 3.6 x 108 9.0 x 105
240 4.3 x 108 4.3 x 108 4.3 x 108 4.2 x 108 2.0 x 105
270 5.0 x 108 5.0 x 108 5.0 x 108 4.9 x 108 8.0 x 104
300 5.1 x 108 5.1 x 108 5.1 x 108 5.0 x 108 4.0 x 104
330 5.2 x 108 5.2 x 108 5.2 x 108 5.1 x 108 2.1 x 104
360 5.2 x 108 5.2 x 108 5.2 x 108 5.2 x 108 1.0 x 104
390 5.2 x 108 5.2 x 108 5.2 x 108 5.2 x 108 5.0 x 103
Osmolaridad del medio
ISOSMOTICO ISOSMOTICO ISOSMOTICO HIPOSMOTICO HIPOSMÓTICO
II. Seensayó también el efecto del agregado de distintas concentraciones del antibiótico sobre el crecimiento de la cepa sensible. Para ello, se cultivó la cepa S en el medio hiposmótico hasta alcanzar una DO=0,6, se separó el cultivo en cinco alícuotas iguales a las que se le agregó el antibiótico en las concentraciones finales que se indican en la tabla. Se proceso además el
30
control sin agregado del antibiótico. Luego de 1 hora, se midió la DO final alcanzada en cada condición.
ALICUOTA CONCENTRACIÓN (µg/mL) DO final alcanzada
1 sin ATB 1.3
2 10 1.2
3 50 0.9
4 100 0.2
5 200 0.2
III. Para individualizar el metabolismo afectado por el antibiótico en estudio, se ensayó su efecto sobre una cepa sensible cultivada en presencia de precursores marcados radiactivamente, determinando la incorporación de la marca radioactiva a distintas biomoléculas. Como controles se ensayaron en paralelo otros antibióticos cuyo mecanismo de acción es conocido. Los valores informados (en cuentas por minuto totales) fueron:
ANTIBIOTICO [35S] metionina [3H] timidina [3H] uracilo [14C] UDP NAcGluc
ATB 14900 14000 14900 17000
Cloranfenicol 3100 16300 16100 111000
Actinomicina 14000 2500 15500 120000
Rifampicina 13900 16000 170 115000
Vancomicina 14800 16500 16000 20000
Sin antibiótico 15000 17000 16500 120000
IV. Con el fin de avanzar en la identificación del sitio de acción del antibiótico se realizó un experimento en el cual se utilizaron precursores radioactivos de la síntesis de mureína, midiéndose la incorporación de los mismos a la pared celular en un medio isosmótico, luego de 2 horas de cultivo, en presencia de 200 µg/mL del antibiótico.
PRECURSOR Cepa S sin ATB Cepa S con ATB Cepa R con ATB
N-AcGlucosamina 20000 1500 18000
D-Alanina 23000 1300 17900
UDP NAcMur pentapéptido 19000 1600 19000
V. Para estudiar el mecanismo de resistencia de la cepa R se realizó el siguiente experimento: Se cultivó la cepa R en presencia del antibiótico hasta una DO de 1 y se separaron las células por centrifugación. Luego, se adicionó el sobrenadante libre de células obtenido a medio fresco (en las proporciones que se indican en la tabla), y se utilizaron estas mezclas para cultivar la cepa sensible S (en todos los casos la DO al inicio del cultivo fue de 0.5). Los resultados se informan como DO final alcanzada luego de 3 horas de cultivo.
31
Relación SOBRENADANTE/MEDIO FRESCO DO FINAL ALCANZADA
Control de Medio fresco 0.80
1/9 0.81
2/8 0.72
5/5 0.74
8/2 0.71
Medio fresco + 100 µg/mL de ATB 0.07
a) Grafique ln(Nv) versus tiempo para las cepas en estudio.
b) Esquematice los resultados esperados en el caso de medir DO en lugar de Nv.
c) Calcule la μmáx. para la cepa control sin antibiótico en medio isosmótico.
d) Indique el posible sitio de acción del antibiótico y el o los posibles mecanismo(s) de resistencia para la cepa R.
17. Usted dispone de una muestra que contiene dos especies bacterianas (X: colonias pequeñas, circulares, de borde regular, e Y: colonias grandes, de borde aserrado).
a) Dado los siguientes medios de cultivo, ¿cuál elegiría para obtener cultivos puros de cada cepa a partir de esta muestra?Justifique y describa brevemente cómo procedería.
Medio 1 Medio 2 Medio 3
0.2 % Glucosa
1 % Peptona
0.5 % Extr.de levadura
Violeta Cristal
1.5 % Agar
1 % Peptona
0.5 % Extr. de levadura
1 % NaCl
1.5 % Agar
1 % Peptona
0.5 % Extr. de levadura
1 % NaCl
A continuación, se propone evaluar la sensibilidad de las cepas X e Y frente al antibiótico tetraciclina (Tc). Para ello realiza un ensayo de concentración inhibitoria mínima (CIM) para cada cepa, con Tc = 200 µg/mL como concentración inicial (tubo 1) y 5 diluciones al medio del mismo en medio de cultivo adecuado. Luego inocula cada uno de estos tubos con cultivos puros de cada cepa, incuba a 37ºC con agitación por una noche y luego evalúa el crecimiento en cada uno. Adicionalmente se incuba también un tubo que contiene sólo medio de cultivo (C).
Tubo 1 2 3 4 5 6 Sin Tc C
Cepa X - - - - + + + -
Cepa Y - - + + + + + -
[Tc] (µg/mL)
(+) Crecimiento (-) No crecimiento
b) Indique la CIM para las cepas X e Y. ¿Para qué se realizan los tubos Sin Tc y C?
32
c) ¿Qué cepa es más resistente a la Tc? ¿Cuál podría ser el o los mecanismos que confiere esta resistencia?
d) Explique la importancia de incluir controles positivos y negativos en un ensayo de CIM.
18. Se realizaron investigaciones acerca del mecanismo de resistencia a Tetraciclina, desarrollado por una cepa mutante de Staphyloccus faecalis. Se emplearon para este fin tres cepas de este microorganismo: una sensible al antibiótico (A), una cepa resistente ya conocida (B), y la mutante en estudio (C). Para detectar el origen de la resistencia adquirida por esta cepa, se realizaron los siguientes ensayos:
I. Efecto de la tetraciclina sobre el crecimiento de las cepas (A), (B) y (C) (Fig. 1). La flecha indica el momento de agregado del antibiótico (100 µg/mL).
FIGURA 1
II. Actividad biológica de la Tetraciclina recuperada del sobrenadante (esterilizado por filtración) donde se desarrollaron las cepas (B) y (C) (Fig. 2).El sobrenadante de un cultivo de S. faecalis (B) y (C), al que se cultivó ON en presencia de Tetraciclina (100 µg/mL), fue recuperado y utilizado para ensayar su capacidad inhibitoria remanente a distintas concentraciones, sobre una suspensión de bacterias (A).El crecimiento fue observado y medido a las 15 hs de la adición del sobrenadante. El control se realizó incorporando en un tubo cantidades variables de Tetraciclina fresca.
FIGURA 2
42 6
Tiempo (Hs.)
Log DO (590 nm)
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
(A)
(B)
(C)
8
42 6 Tetraciclina (µg/ml)
Log DO (590 nm)
Cepa (A) + distintas diluciones del sobrenadante de (B)
Cepa (A) + distintas diluciones del sobrenadante de (C)
Cepa (A) + cantidades variables de Tetraciclina
8
Diluciones del sobrenadante
1/8
1/16
1/4
1/2 1
33
III. Efecto de la Tetraciclina en la síntesis in vitro de proteína, medida como porcentaje de Actividad (incorporación de 14C aminoácidos). Los extractos de las cepas (A), (B) y (C) fueron preparados y se enfrentaron con distintas concentraciones de Tetraciclina (Figura 3).
FIGURA 3
Establezca qué tipos de mecanismos podrían ser responsables de que las cepas B y C no sean afectadas por la Tetraciclina.Justifique.
19. Hasta el presente se han descripto distintos mecanismos de resistencia bacteriana a tetraciclinas. Para estudiar uno de estos mecanismos de resistencia mediado por la proteína Tet (0) en una cepa de E. coli denominada JM107 productora de esta proteína, se realizaron los siguientes ensayos:
I. Captación de 3H-tetraciclina: se cultivaron las cepas JM107 y HB101 (cepa de E. coli resistente a tetraciclina mediante un proceso de expulsión activo de la droga) hasta la fase exponencial de crecimiento, se lavaron y resuspendieron en medio de cultivo fresco con el agregado de 3H-tetraciclina. A distintos tiempos se tomaron alícuotas y se determinó la radioactividad presente en las bacterias.
3015 45Tiempo (min)
Captaciónde ( H)-Tc
3
60 75 90
2
4
6
8
HB101
JM107
105 15 Tetraciclina (µg/ml)
% actividadsíntesis proteica
20
50
100
25
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
(A)
(B)
(C)
34
II. Efecto de Tet(0) sobre la actividad de la tetraciclina: se utilizó un sistema de traducción in vitro a partir de ARNm sintético (poliU) cuya traducción da polifenilalanina. Dicho sistema de traducción utiliza fracciones ribosomales provenientes de E. coli HB101 o JM107 TcR en presencia de 14C-fenilalanina y distintas concentraciones de tetraciclina en un medio por lo demás completo. A los 60 minutos se precipita la polifenilalanina con ácido tricloroacético al 10% y se mide la radioactividad incorporada en el precipitado. En la figura 2 se grafica el porcentaje de inhibición alcanzado.
III. Por último se midió la unión de 3H-tetraciclina a una fracción de ribosomas provenientes de la cepa HB101 o de la cepa JM107. Para ello se incubó una alícuota conteniendo ribosomas en un buffer adecuado en presencia de distintas concentraciones de 3H-tetraciclina durante 15 minutos a 37°C. Posteriormente se colectaron los ribosomas, se lavaron, y se determinó la radioactividad unida en cada caso. Se obtuvieron los siguientes resultados:
En base a los datos mostrados, indique el posible mecanismo de resistencia de la cepa JM107. Justifique su respuesta analizando en cada caso los datos mostrados.
5025 75[Tc] µM
% deInhibición
100 125 150
20
40
60
80
JM107
HB101100
4020 60 [Tc] µM
( H)-Tcunida
3
80 100 125
0.5
1.0
1.5
2.0
JM107
HB101
150
