MICROBIOLOGÍA I

“EQUIPO 7”

OBJETIVO

Predeterminar si se ha liberado enzimaticamente ácido sulfhídrico (H2S) gaseoso a partir de los aminoácidos sulfurados azufrados para producir una reacción coloreada visible, negra en presencia de un sistema indicador de H2S.

BIOQUIMICA

La proteólisis de la proteína produce a.a. individuales; ciertas bacterias heterotróficas pueden liberar enzimáticamente el azufre de los diversos a.a. azufrados, produciendo H2S gaseoso peptona, cisteína, cistina, metionina y tiosulfato son fuentes de azufre, pero las especies utilizan diferentes compuestos o a.a. azufrados para producir H2S. las enzimas responsables de esta actividad son la cisteína, desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa. los a.a. azufrados son:

El catabolismo anaerobio de la cisteina produce H2S, ácido pirúvico y amoniaco.

Existen muchos medios de cultivo como la peptona y hierro para detectar la producción H2S entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Los indicadores de sulfuro varían entre los medios de cultivo: hierro peptonizado, sulfato ferroso, sulfato de amonio ferroso o férrico, citrato férrico, tiosulfato de sodio, sulfito de bismuto o acetato de plomo; pero el principio es el mismo.

En uno de estos medios, el KIA, los indicadores de h2s son una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. ambos indicadores deben estar presentes, puesto que el procedimiento final es en dos pasos.

PASO 1.

El tiosulfato es un intermediario en la reducción de sulfato a H2S por las bacterias reductoras de sulfatos. La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio en una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. debe haber un pH ácido y una fuente de iones H+ en el KIA para que tenga lugar la reducción de tiosulfato. hay dos carbohidratos presentes para proporcionar la acidez y el exceso de iones H+. éste es un proceso de respiración anaerobia, donde el átomo de azufre sirve como

aceptor de electrones para la oxidación de los sustratos orgánicos.

El tiosulfato S2O32- reemplaza al sulfato como aceptor

de electrones y es la fuente de azufre del microorganismo.

4H+ + 4e + 3S2O32- 2SO 3

2- + H2S

El H2S es un gas incoloro; por lo que es necesario un segundo indicador para observar la producción de H2S.

PASO 2. El gas incoloro H2S reacciona con una sal fuerte de

hierro, el citrato de amonio férrico, para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso

metálico. se recomienda el uso de citrato de amonio férrico en lugar de citrato férrico por que es mas soluble. el sulfato ferroso puede sustituir la sal férrica.

La producción de H2S se detecta cuando el gas entra en contacto con ciertos metales, como plomo, hierro o bismuto, y forma sulfuros de estos metales.

SULFURO

DE HIDROGENO + IONES FÉRRICOS SULFURO FERROSO

GASEOSO PP NEGRO

Reacción global Bacteria en medio + tiosulfato de sodio H2S gas Acido H2S + Iones férricos sulfuro ferroso pp negro insoluble

El H2S gaseoso puede ser producido por la reducción de una fuente de azufre inorgánica como le tiosulfato o por la reducción del grupo SH de la cisteina que esta presente en la peptona. Otro indicador de la producción de H2S es el acetato de plomo ya que al entrar en contacto el H2S produce sulfuros de plomo que es un precipitado negro..el acetato de plomo es sumamente sensible por lo que es capaz de detectar cantidades pequeñas de H2S.

Pb(C2H3O2) · 3H2O + H2S PbS + H2O + Ac Ac de plomo sulfuro sulfuro de hidrógeno de plomo acetato

La capacidad de un microorganismo de producir H2S es una característica consistente y un productor de H2S es normalmente produce (CO2 + H2) en los medios de cultivo con hidratos de carbono.

Al determinarla producción de H2S se debe de tomar en cuenta tres factores:

o El tipo y la disponibilidad de la fuente de azufre

o La sensibilidad de la prueba para la detección de H2S

o La presencia del sistema enzimático productor de H2S en el microorganismo a estudiar.

MEDIOS DE CULTIVO

EMPLEADOS

Medios de cultivo detectores de H2S usados con mayor frecuencia

Medio Propósito Fuente(s) de azufre Indicador(es) de H2S

Tiras de acetato de plomo (PbAc)

Bacterias que exhiben pequeñas cantidades de H2S

Tiosulfato de sodio Acetato de plomo

Agar con lisina y hierro (LIA) Ayuda a la identificación de microorganismos entéricos

gramnegativos

Tiosulfato de sodio Citrato de amonio férrico

Agar Salmonella-Shigella (SS) Aislamiento selectivo de Salmonella/Shigella

Tiosulfato de sodio Citrato férrico

Agar con azúcar triple y hierro (TSI)

Ayuda a la identificación de microorganismos entéricos

gramnegativos

Tiosulfato de sodio Sulfato ferroso, sulfato de amonio ferroso

Agar con azúcar triple y hierro (TSI)

Ingredientes. pH 7.4±0.2

Extracto de carne......................3g

Extracto de Levadura................3g

Peptona....................................15g

Peptona Proteosa, Difco...........5g

Dextrosa.....................................1g

Lactosa.....................................10g

Sacarosa...................................10g

Sulfato Ferroso.......................0.2g

Cloruro de Sodio.......................5g

Tiosulfato de Sodio................0.3g

Agar..........................................12g

Rojo de Fenol.....................0.024g

Agua desionizada…..……..1000mL

Agar con lisina y hierro (LIA)

Ingredientes. pH 6.7±0.2

Peptona de gelatina……....………5g

Extracto de levadura………….....3g

Glucosa (dextrosa)………..……….1g

L-Lisina·HCL………………………..10g

Citrato de amonio férrico………0g

Tiosulfato de sodio..............0.04g

Púrpura de bromocresol.....0.02g

Agar…………....……………………….15g

Agua desionizada…..……..1000mL

Agar Salmonella-Shigella (SS)

Ingredientes. pH 7±0.2

Peptona de caseína/carne........5g

Extracto de carne…………….……5g

Lactosa…………....………………….10g

Citrato de sodio..….................8.5g

Mezcla de sales biliares……….8.5g

Tiosulfato de sodio...........…..8.5g

Citrato férico......................…….1g

Rojo neutro………....………...0.025g

Verde brillante………...….0.00033g

Agua desionizada……...….1000mL

Principalmente para la detección de H2S por bacterias que no sean de la familia Enterobacteriaceae; microorganismos pequeños que puedan producir cantidades pequeñas de H2S.

Prueba con tiras de PbAc