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MICRO ARNs INVOLUCRADOS EN LA RESPUESTA A XANTHOMONAS SPP. EN CITRUS LIMON María Amalia Chiesa 1 ; Roxana A. Roeschlin 1 ; Laura Campos 2 ; María Paula Fillipone 3 ; Atilio P. Castagnaro 3 ; Adrián A. Vojnov 4 ; Frederick G. Gmitter Jr. 5 ; José Gadea Vacas 2 ; María Rosa Marano 1 . [email protected] 1 Instituto de Biologia Molecular de Rosario-CONICET (IBR), Argentina; 2 Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP), Universidad Politécnica de Valencia-CSIC, España; 3 Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino (ITA-NOA), Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC)- CONICET, Tucumán, Argentina; 4 Fundación Pablo Cassará-BsAs, Argentina y 5 University of Florida (IFAS), Citrus Research and Education Center, Lake Alfred, U.S.A. √ INTRODUCCIÓN Las plantas responden a la infección por patógenos a través de un sistema inmune innato basado en el reconocimiento de moléculas asociadas al patógeno o PAMPs. Esta respuesta se denomina inmunidad inducida por PAMPs o PTI (por, P AMP-t riggered i mmunity). Algunos PAMPs inducen la expresión de determinados micro ARNs (miR), los cuales regulan la transducción de señales hormonales y la expresión de genes de defensa, inhibiendo la colonización del patógeno. Sin embargo, los patógenos exitosos han desarrollando estrategias altamente especializadas para suprimir PTI, conduciendo de este modo a la enfermedad. Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) es la bacteria causal del cancro cítrico. Todos los cultivares de cítricos son susceptibles a X. citri. Interacción Compatible C. limon- X. citri Formación in planta de Biofilm bacteriano (5 dpi) Interacción No-hospedador C. limon- X. campestris Vis UV Población bacteriana Log (UFC/cm2) 2 4 6 8 Tiempo (dpi) 0 2 4 6 8 Ausencia de Biofilm bacteriano in planta (5 dpi) 100x Ausencia de síntomas típicos de Cancrosis y de HR (8 dpi) Interacción Incompatible C. limon- X. aurantifolii -tipo C Población bacteriana Log (UFC/cm 2 ) 2 4 6 8 Tiempo (dpi) 0 2 4 6 8 Vis UV 100x Ausencia de Biofilm bacteriano in planta (5 dpi) Reacción de Hipersensibilidad (HR) (8 dpi) Vis UV Síntomas típicos de Cancrosis (16 dpi) (Aspersión de suspensión bacteriana 10 7 ufc/mL) Población bacteriana Log (UFC/cm 2 ) Tiempo (dpi) 0 2 4 6 8 2 4 6 8 100x √ OBJETIVO: A fin de estudiar la participación de miARNs en la respuesta inducida por PTI en C. limon (limonero), se analizó la expresión diferencial de los miRs involucrados en señalización hormonal (miR159), estrés oxidativo (miR398) y metabolismo secundario (miR393) en respuesta a X. citri (enfermedad) y a otras Xanthomonas no patogénicas de limonero (X. campestris y X. aurantifolii tipo C) (resistencia). La función de estos miARNs en cada una de las interacciones fue analizada a través de estudios fisiológicos, bioquímicos y moleculares. 50 μm X. citri Mock X. aurantifolii C X. campestris ABA 1 hpi 4 hpi Análisis del movimiento estomático (Aspersión de 10 7 ufc/mL) 3 0 0.5 2.5 1.5 1 2 1 hpi 4 hpi Apertura estomática (μm) a a a b ab ab ab cd c d VIS 8x UV 3 hpi 24 hpi O 2 - 3 hpi 24 hpi H 2 O 2 X. campestris X aurantifolii C X. citri Infiltración de 10 7 ufc/mL (16 dpi) X. campestris X aurantifolii C X. citri 3 hpi 24 hpi Expresión relativa cis- [Cu/Zn] CSD 1 10 0.1 3 hpi 24 hpi Expresión relativa (cis-miR398) 10 100 1 10 1 0.1 Expresión relativa NCED3 3 hpi 24 hpi 3 hpi 24 hpi Expresión relativa MYB101 10 1 0.1 100 Expresión relativa cis-miR159 10 1 3 hpi 24 hpi 10 1 0.1 14 hpi 24 hpi Expresión relativa PAL1 14 hpi 24 hpi 10 1 0.1 Expresión relativa WRKY70 Expresión relativa PR-1 14 hpi 24 hpi 1000 10 100 1 3 hpi 24 hpi Expresión relativa (cis-miR393) 10 100 1 Análisis de respuesta de defensa- estallido oxidativo Análisis de genes de la vía del Ácido Abscísico (ABA) Análisis de genes de la vía del Ácido Salicílico (SA) Análisis de la vía de los Glucosinolatos (GSL) 14 hpi 24 hpi 10 100 1 1000 0.1 Expresión relativa CYP83B1 √ Se analizó la sintomatología por infiltración. √ Se analizó el estallido oxidativo a través del análisis bioquímico de la acumulación de O 2 - y H 2 O 2 . Además, se midieron por qRT-PCR los niveles de expresión de la Cu/ZnSOD y del cis-miR398 de limonero. Como gen de referencia de utilizó la Histona H4 √ Las 3 cepas inducen el cierre estomático a 1 hpi. A 4 hpi X. citri abre los estomas mientras que X. campestris y X. aurantifolii C mantienen los estomas cerrados √ Se observó que X. campestris induce la acumulación de H 2 O 2 pero no de O 2 - , mostrando diferencias importantes con respecto al estallido oxidativo indicido por X. aurantifolii-C, que induce una HR típica. Esta acumulación se correlaciona con la inducción de la Cu/ZnSOD. A 3 hpi se observan niveles antagónicos del mARN de la Cu/ZnSOD y del miR-398, sugiriendo una posible regulación por parte del mismo a tiempos tempranos en C. limon, como en Arabidopsis. Deposición de calosa (24 hpi) X. campestris X. aurantifolii C X. citri √ Se analizó la expresión de genes involucrados en la síntesis (NCED3) y la vía de señalización (MYB101) de ABA y la posible regulación de éste por el miR159. √ Se observaron niveles antagónicos de MYB101 y del miR-159 en las interacciones de resistencia, sugiriendo una posible regulación por parte del mismo a tiempos tempranos en C. limon. √ Se observó la inducción de genes de la vía del SA en las interacciones no hospedador e incompatible (resistancia). √ Se observó la inducción de la vía de los GSL, metabolitos secundarios antibacterianos. El aumento sostenido de los niveles del miR393, disminuye los niveles de ARF8 y 9 (targets) reguladores negativos de la síntesis de GSL, aumentando la resistancia. √ Los resultados indican que el miR393 podría ser utilizado como estrategia biotecnológica para manipular la respuesta a X. citri. Agradecimientos: CONICET ANPCyT PICT 2011- 1833 Citrus Research and Education Center, University of Florida (Contrato UF1150 y UF13089) Los mayores niveles del miR393 se observaron en las interacciones de resistencia, sugiriendo una posible regulación por parte del mismo a tiempos tempranos en C. limon.
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MICRO ARNs INVOLUCRADOS EN LA RESPUESTA A XANTHOMONAS
SPP. EN CITRUS LIMON María Amalia Chiesa1; Roxana A. Roeschlin1; Laura Campos2; María Paula Fillipone3; Atilio P. Castagnaro3; Adrián A. Vojnov4;
Frederick G. Gmitter Jr.5; José Gadea Vacas2; María Rosa Marano1. [email protected] 1Instituto de Biologia Molecular de Rosario-CONICET (IBR), Argentina; 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP), Universidad Politécnica de
Valencia-CSIC, España; 3Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino (ITA-NOA), Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC)-
CONICET, Tucumán, Argentina; 4Fundación Pablo Cassará-BsAs, Argentina y 5University of Florida (IFAS), Citrus Research and Education Center, Lake Alfred, U.S.A.
√ INTRODUCCIÓN Las plantas responden a la infección por patógenos a través de un sistema inmune innato basado en el reconocimiento de
moléculas asociadas al patógeno o PAMPs. Esta respuesta se denomina inmunidad inducida por PAMPs o PTI (por, PAMP-triggered immunity).
Algunos PAMPs inducen la expresión de determinados micro ARNs (miR), los cuales regulan la transducción de señales hormonales y la
expresión de genes de defensa, inhibiendo la colonización del patógeno. Sin embargo, los patógenos exitosos han desarrollando estrategias
altamente especializadas para suprimir PTI, conduciendo de este modo a la enfermedad. Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) es la bacteria
causal del cancro cítrico. Todos los cultivares de cítricos son susceptibles a X. citri.
Interacción Compatible
C. limon- X. citri
Formación in planta
de Biofilm
bacteriano (5 dpi)
Interacción No-hospedador
C. limon- X. campestris
Vis
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UF
C/c
m2
)
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Tiempo (dpi)
0 2 4 6 8 Ausencia de
Biofilm bacteriano
in planta (5 dpi)
100x
Ausencia de
síntomas típicos
de Cancrosis y
de HR (8 dpi)
Interacción Incompatible
C. limon- X. aurantifolii -tipo C
Po
bla
ció
n b
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Lo
g (
UF
C/c
m2)
2
4
6
8
Tiempo (dpi)
0 2 4 6 8
Vis
U
V
100x
Ausencia de
Biofilm bacteriano
in planta (5 dpi)
Reacción de
Hipersensibilidad
(HR) (8 dpi)
Vis
U
V
Síntomas típicos de
Cancrosis (16 dpi)
(Aspersión de
suspensión bacteriana
107 ufc/mL)
Po
bla
ció
n b
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a
Lo
g (
UF
C/c
m2)
Tiempo (dpi)
0 2 4 6 8
2
4
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100x
√ OBJETIVO: A fin de estudiar la participación de miARNs en la respuesta inducida por PTI en C. limon (limonero), se analizó la expresión
diferencial de los miRs involucrados en señalización hormonal (miR159), estrés oxidativo (miR398) y metabolismo secundario (miR393) en
respuesta a X. citri (enfermedad) y a otras Xanthomonas no patogénicas de limonero (X. campestris y X. aurantifolii tipo C) (resistencia). La
función de estos miARNs en cada una de las interacciones fue analizada a través de estudios fisiológicos, bioquímicos y moleculares.
50 µm
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(Aspersión de 107 ufc/mL)
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Infiltración de 107 ufc/mL (16 dpi)
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Análisis de respuesta de defensa-
estallido oxidativo
Análisis de genes de la vía del Ácido
Abscísico (ABA)
Análisis de genes de la vía del Ácido
Salicílico (SA)
Análisis de la vía de los
Glucosinolatos (GSL)
14 hpi
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√ Se analizó la sintomatología por
infiltración.
√ Se analizó el estallido oxidativo a
través del análisis bioquímico de la
acumulación de O2- y H2O2. Además,
se midieron por qRT-PCR los niveles
de expresión de la Cu/ZnSOD y del
cis-miR398 de limonero. Como gen
de referencia de utilizó la Histona H4
√ Las 3 cepas inducen el cierre estomático
a 1 hpi. A 4 hpi X. citri abre los estomas
mientras que X. campestris y X. aurantifolii
C mantienen los estomas cerrados
√ Se observó que X. campestris induce la acumulación de H2O2 pero
no de O2-, mostrando diferencias importantes con respecto al
estallido oxidativo indicido por X. aurantifolii-C, que induce una HR
típica. Esta acumulación se correlaciona con la inducción de la
Cu/ZnSOD. A 3 hpi se observan niveles antagónicos del mARN de la
Cu/ZnSOD y del miR-398, sugiriendo una posible regulación por parte
del mismo a tiempos tempranos en C. limon, como en Arabidopsis.
Deposición de calosa (24 hpi)
X. campestris X. aurantifolii C X. citri
√ Se analizó la expresión de genes
involucrados en la síntesis (NCED3) y la vía de
señalización (MYB101) de ABA y la posible
regulación de éste por el miR159.
√ Se observaron niveles antagónicos de
MYB101 y del miR-159 en las interacciones de
resistencia, sugiriendo una posible regulación
por parte del mismo a tiempos tempranos en
C. limon.
√ Se observó la inducción de genes de la vía
del SA en las interacciones no hospedador
e incompatible (resistancia).
√ Se observó la inducción de la vía de los GSL,
metabolitos secundarios antibacterianos. El
aumento sostenido de los niveles del miR393,
disminuye los niveles de ARF8 y 9 (targets)
reguladores negativos de la síntesis de GSL,
aumentando la resistancia.
√ Los resultados indican que el miR393
podría ser utilizado como estrategia
biotecnológica para manipular la
respuesta a X. citri.
Agradecimientos:
CONICET
ANPCyT PICT 2011- 1833
Citrus Research and Education Center, University of Florida (Contrato UF1150 y
UF13089)
Los mayores niveles del
miR393 se observaron en
las interacciones de
resistencia, sugiriendo una
posible regulación por
parte del mismo a tiempos
tempranos en C. limon.
