MICRO ARNs INVOLUCRADOS EN LA RESPUESTA A XANTHOMONAS

SPP. EN CITRUS LIMON María Amalia Chiesa1; Roxana A. Roeschlin1; Laura Campos2; María Paula Fillipone3; Atilio P. Castagnaro3; Adrián A. Vojnov4;

Frederick G. Gmitter Jr.5; José Gadea Vacas2; María Rosa Marano1. mchiesa@unr.edu.ar 1Instituto de Biologia Molecular de Rosario-CONICET (IBR), Argentina; 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP), Universidad Politécnica de

Valencia-CSIC, España; 3Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino (ITA-NOA), Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC)-

CONICET, Tucumán, Argentina; 4Fundación Pablo Cassará-BsAs, Argentina y 5University of Florida (IFAS), Citrus Research and Education Center, Lake Alfred, U.S.A.

√ INTRODUCCIÓN Las plantas responden a la infección por patógenos a través de un sistema inmune innato basado en el reconocimiento de

moléculas asociadas al patógeno o PAMPs. Esta respuesta se denomina inmunidad inducida por PAMPs o PTI (por, PAMP-triggered immunity).

Algunos PAMPs inducen la expresión de determinados micro ARNs (miR), los cuales regulan la transducción de señales hormonales y la

expresión de genes de defensa, inhibiendo la colonización del patógeno. Sin embargo, los patógenos exitosos han desarrollando estrategias

altamente especializadas para suprimir PTI, conduciendo de este modo a la enfermedad. Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) es la bacteria

causal del cancro cítrico. Todos los cultivares de cítricos son susceptibles a X. citri.

Interacción Compatible

C. limon- X. citri

Formación in planta

de Biofilm

bacteriano (5 dpi)

Interacción No-hospedador

C. limon- X. campestris

Vis

U

V

Po

bla

ció

n b

ac

teri

an

a

Lo

g (

UF

C/c

m2

)

2

4

6

8

Tiempo (dpi)

0 2 4 6 8 Ausencia de

Biofilm bacteriano

in planta (5 dpi)

100x

Ausencia de

síntomas típicos

de Cancrosis y

de HR (8 dpi)

Interacción Incompatible

C. limon- X. aurantifolii -tipo C

Po

bla

ció

n b

ac

teri

an

a

Lo

g (

UF

C/c

m2)

2

4

6

8

Tiempo (dpi)

0 2 4 6 8

Vis

U

V

100x

Ausencia de

Biofilm bacteriano

in planta (5 dpi)

Reacción de

Hipersensibilidad

(HR) (8 dpi)

Vis

U

V

Síntomas típicos de

Cancrosis (16 dpi)

(Aspersión de

suspensión bacteriana

107 ufc/mL)

Po

bla

ció

n b

ac

teri

an

a

Lo

g (

UF

C/c

m2)

Tiempo (dpi)

0 2 4 6 8

2

4

6

8

100x

√ OBJETIVO: A fin de estudiar la participación de miARNs en la respuesta inducida por PTI en C. limon (limonero), se analizó la expresión

diferencial de los miRs involucrados en señalización hormonal (miR159), estrés oxidativo (miR398) y metabolismo secundario (miR393) en

respuesta a X. citri (enfermedad) y a otras Xanthomonas no patogénicas de limonero (X. campestris y X. aurantifolii tipo C) (resistencia). La

función de estos miARNs en cada una de las interacciones fue analizada a través de estudios fisiológicos, bioquímicos y moleculares.

50 µm

X. c

itri

M

oc

k

X. a

ura

nti

folii C

X

. c

am

pe

str

is

AB

A

1 hpi 4 hpi

Análisis del movimiento estomático

(Aspersión de 107 ufc/mL)

3

0

0.5

2.5

1.5

1

2

1 hpi

4 hpi

Ap

ert

ura

esto

máti

ca (

µm

)

a a

a

b ab ab ab

cd c

d

VIS 8x

UV

3 h

pi

24

hp

i

O2-

3 h

pi

24

hp

i

H2O2

X. campestris X aurantifolii C X. citri

Infiltración de 107 ufc/mL (16 dpi)

X. campestris X aurantifolii C X. citri

3 hpi

24 hpi

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

cis

- [C

u/Z

n]

CS

D

1

10

0.1

3 hpi

24 hpi

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

(cis

-miR

39

8)

10

100

1

10

1

0.1

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

NC

ED

3

3 hpi

24 hpi

3 hpi

24 hpi

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

MY

B1

01

10

1

0.1

100

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

cis

-miR

15

9

10

1

3 hpi

24 hpi

10

1

0.1

14 hpi

24 hpi

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

PA

L1

14 hpi

24 hpi

10

1

0.1

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

WR

KY

70

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

PR

-1

14 hpi

24 hpi

1000

10

100

1

3 hpi

24 hpi

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

(cis

-miR

39

3)

10

100

1

Análisis de respuesta de defensa-

estallido oxidativo

Análisis de genes de la vía del Ácido

Abscísico (ABA)

Análisis de genes de la vía del Ácido

Salicílico (SA)

Análisis de la vía de los

Glucosinolatos (GSL)

14 hpi

24 hpi

10

100

1

1000

0.1

Ex

pre

sió

n r

ela

tiva

CY

P8

3B

1

√ Se analizó la sintomatología por

infiltración.

√ Se analizó el estallido oxidativo a

través del análisis bioquímico de la

acumulación de O2- y H2O2. Además,

se midieron por qRT-PCR los niveles

de expresión de la Cu/ZnSOD y del

cis-miR398 de limonero. Como gen

de referencia de utilizó la Histona H4

√ Las 3 cepas inducen el cierre estomático

a 1 hpi. A 4 hpi X. citri abre los estomas

mientras que X. campestris y X. aurantifolii

C mantienen los estomas cerrados

√ Se observó que X. campestris induce la acumulación de H2O2 pero

no de O2-, mostrando diferencias importantes con respecto al

estallido oxidativo indicido por X. aurantifolii-C, que induce una HR

típica. Esta acumulación se correlaciona con la inducción de la

Cu/ZnSOD. A 3 hpi se observan niveles antagónicos del mARN de la

Cu/ZnSOD y del miR-398, sugiriendo una posible regulación por parte

del mismo a tiempos tempranos en C. limon, como en Arabidopsis.

Deposición de calosa (24 hpi)

X. campestris X. aurantifolii C X. citri

√ Se analizó la expresión de genes

involucrados en la síntesis (NCED3) y la vía de

señalización (MYB101) de ABA y la posible

regulación de éste por el miR159.

√ Se observaron niveles antagónicos de

MYB101 y del miR-159 en las interacciones de

resistencia, sugiriendo una posible regulación

por parte del mismo a tiempos tempranos en

C. limon.

√ Se observó la inducción de genes de la vía

del SA en las interacciones no hospedador

e incompatible (resistancia).

√ Se observó la inducción de la vía de los GSL,

metabolitos secundarios antibacterianos. El

aumento sostenido de los niveles del miR393,

disminuye los niveles de ARF8 y 9 (targets)

reguladores negativos de la síntesis de GSL,

aumentando la resistancia.

√ Los resultados indican que el miR393

podría ser utilizado como estrategia

biotecnológica para manipular la

respuesta a X. citri.

Agradecimientos:

CONICET

ANPCyT PICT 2011- 1833

Citrus Research and Education Center, University of Florida (Contrato UF1150 y

UF13089)

Los mayores niveles del

miR393 se observaron en

las interacciones de

resistencia, sugiriendo una

posible regulación por

parte del mismo a tiempos

tempranos en C. limon.