Métodos y Estrategias de Investigación de Carlson

5/13/2018 M todos y Estrategias de Investigaci n de Carlson

Metodos y estrategiasde investiqacion

~ Ablacion experimentalEvaluaci6n de los efectos

comportamentales del dana cerebralProducci6n de lesiones cerebralesCirugia estereotaxicaMetodos histoloqicosMarcado de conexiones neuralesEstudio del cerebro humano

in v iv oRe sumen int ermed io

I i I I Registro y estimulacionde la actividad neural

Registro de L a actividad neuralRegistro de la actividad metab6lica

y sinaptica del cerebroMedida de las secreciones cerebralesEstimulacion de la actividad neuralEfectos comportamentales de ia

estimulaci6n electrica cerebralResumen int ermed io

ill Metodos neuroquimicosDetecci6n de neuronas que producen

sustancias neuroquimicas especificasLocalizacion de receptores especificosResumen int ermed ioi'I Metodos geneticosEstudios con gemelosEstudios sobre adopci6nMutaciones dirigidasResumen int ermed io


lo 5: Metodos acion

Comose coment6 en el capitulo 4, hace unos veinte afiosvarios j6venes se inyectaron una droga ilicita que estabacontaminada con MPTP,una sustancia que destruyo lasneuronas dopaminerqicas de su sistema nigroestriatal.Consecuentemente presentaron un cuadra grave de Par-kinson. Eltrasplante de neuronas fetales, un metodo neu-rcquirurqico experimental para tratar el Parkinson, haresultado ser prometedor. El fundamento de este proce-dimiento es el siguiente: los sintomas de Parkinson, yasean los de la enfermedad de Parkinson 0 los de los efec-tos t6xicos del MPTP,se deben a la falta de dopamina enlos ganglios basales -especialmente en el niicleo caudadoy el putamen-. Por el momenta no se puede indueir enel encefalo la reqeneracion de las neuronas dopaminerqi-cas del sistema nigroestriatal. Sin embargo, si se puedenimplantar neuronas secretoras de dopamina en el nucleocaudado y el putamen, y si estas sobreviven y seqrsqandopamine. entonces tal vez los sintomas de Parkinson dis- -minuyan. Dado que las neuronas implantadas han de sersaludables y resistentes y no desencadenar la reaccion delsistema inmune del receptor, 10 mas razonable es obte-nerlas de fetos humanosabortados -0 quiza alqun dia,de cultivos de hemocitoblastos (celulas madre) que hansido inducidos a convertirse en neuronas secretoras dedopamina-.

Al menos a uno de los afectados por la intoxicacioncon MPTPse le realize este tipo de trasplante (llamemosleSr. B.). Antes de que tuviera lugar la intervencion, se le

1estudio de la fisiologia de la conducta implica elesfuerzo de cientificos de muchas disciplinas cien-tificas, incluyendo la fisiologia, la neuroanatornia, la

bioquimica, la psicologia, la endocrinologia y la histologic.Llevar a cabo un proyecto de investigacion en Neurocien-. cia comportamental requiere dominar muchas tecnicas expe-rirnentales. Puesto que diferentes procedimientos llevan amenudo a resultados contradictories, los investigadores hande estar farniliarizados con las ventajas y las limitaciones delos rnetodos que ernplean. La investigacion cientilica conllevaun proceso de cuestionarsecual es la naturaleza de los fen6-menos, El metodo que se utiliza enmarca la cuesti6n. Confrecuencia se obtiene una respuesta que extrafia, hasta quemas tarde se cae en la cuenta de que no se estaba planteandola pregunta correcta. Como se vera, las mejores conclusio-nes sobre la fisiologia de la conducta no se extraen de ununico experimento, sino de LID programa de investigacion quepermite comparar los resultados de estudios que abordan elmismo problema con metodos diferentes.

Los investigadores disponen de una enonne -ysorprendente- serie de metodos de investigacion. Si sepresentara aqui tan solo un inventario de ellos, no seriade sorprender que ellector se perdiera -0 simplementeperdiera interes=-. En vez de ello, se presentaran unica-

inyecto L-dopa radiactiva, sustancia precursora de dopa-mina. Luego, una hora mas tarde, se le condujo a unapequefia sala en la que habia un equipo de TEP.Se le pusola cabeza en el interior del aparato y durante varios minu-tos la maquina obtuvo datos de los positrones que se emi-tian. en forma de particulas radioactivas, en su perturbadacabeza.

Unas cuantas semanas despues , el Sr.B. inqr e so en elhospital para su intervencion quiriirgica. Los tecnicosextirparon las n eu ro na s d o pam in erq ic as de la sustancianegra de varios fetos abortados y las prepararon para tras-plantar las al cerebro del Sr. B . E ste estaba anestesiado yel cirujano le hizo unas incisiones en el cuero cabeUudopara dejar al descubierto partes del craneo. Unio el arma-zen de un aparato estereotaxico a su craneo. tom6 algu-nas medidas y lueqo taladro varios orificios. Utilizo elapatato estereotaxico para dirigir la inyecci6n de neuro-nas fetales a l n uc le o caudado yel putamen del Sr. B. Unavez realizada la inyeccion, el cirujano retir6 el armazonestereotaxico e hizo puntos de sutura en las incisiones quehabia hecho en el cuero cabelludo.

La operacion tuvo un exito considerable: el Sr. B.recupero en gran parte el control motor. Poco mas de una fi o d es pu es se le volvio a inyectar L-dopa radioactiva yde nuevo se le puso la cabeza en el aparatp de escaner porrEP. Los resultados del segundo escaner revelaron 10 quesignificaba su recuperacion: las celulas habian sobrevividoy estaban segregando dopamina.:

mente los procedirnientos mas importantes y utilizadocon mayor frecuencia, estructurados en torno a un os cuantos problemas que han estudiado los investigadores. Desta manera, deberia resultar mas facil darse cuenta dtipo de informacion que aportan los diversos metodos dinvestigacion y entender sus ventajas y desventajas. Tambien permitira describir las tacticas de las que se valen linvestigadores cuando siguen exarninando los resultadosde un experimento diseriando y realizando otro.

Ibla,c:i6n experimentalUno de los principales rnetodos de investigacion utilizdos para estudiar las funciones cerebrales requiere destruir unparte del encefalo y evaluar la conducta subsecuente danimal, Este metodo se denomina ablacion experimental

ab la ci6 n ex perim enta l E xtirp acio n 0 destrucc ion de una parte delencefa lo de un anim al de labora torio ; supuestarnente . la s func iones qya no pueden ejecutarse son las que contro laba previa m ente La reqion


Abla ci6 n e xp erim en ta l 145(del termino Iatino ablatus, llevarse). En la mayoria de loscas os, dicha tecnica no implica extraer el tejido cerebral,en vez de ella el investigador destruye algo de tejido y 10deja en 8U sitio. La ablacion experimental es el mas anti-guo de los rnetodos utilizado en Neurociencia, y siguesiendo uno de los mas importantes.

E valuaci6n de los efectoscom portam entales del danacerebralUna lesion es una herida 0un traumatismo, y un inves-

tigadoT que destruye una parte del cerebro por 10 gene-ral describe el dano como una l es io n c er eb ra l. Losexperimentos en los que se dana una parte del encefaloy despues se observa la conducta del animal se Hamanestudios de lesion. Su fundamento teo rico es que el fun-cionamiento de un area cerebral puede deducirse basan-dose en las conductas que el animal ya no puede realizardespues de que se haya destruido dicha area. Por ejem-p10, si despues de que se haya destruido parte del ence-falo un animal ya no puede llevar a cabo tareas querequieren poder ver, se puede concluir que el animal estaciego -y que el area dariada desempeiia alguna funcionen la vision->.

Se ha de ser precavido, al interpretar los efectos delas lesiones cerebrales. Por ejemplo, ~como se puedeestar seguro de que elanimal esta ciego? eChoca contralos objetos, 0 no Iogra recorrer un laberinto en direccioria la luz que indica dondeesta la comida, 0 ya no con-trae las pupilas ante la luz? Un animal puede chocarcontra los objetos debido a una deficiente coordinacionmotora, puede haber perdido el apetito de comer (y portanto su motivacion para recorrer ellaberinto), 0puedever bastante bien pero haber perdido los reflejos visua-les. A menu do los investigadores pueden equivoearse.Race alios pensaban que las ratas albinas eran ciegas. (No10 son). Reflexionemos sobre ella: ~c6mo se comproba-ria si una rata puede ver? Recuerdese que las rat as tie-nen vibrisas (bigotes) que pueden utilizarse para deteetaruna pared antes de chocar con ella 0 con el borde de unamesa antes de caerse de esta, Tambien pueden en con-trar su camino en una habitaci6n guiandose por pistasolfativas.


146 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investigaci6nestructura X tan solo interfiera en el normal funciona-miento de los circuitos neurales de la estructura X:

Veamos un ejernplo concreto para ilustrar este inCOD-veniente. La lesion de una parte del cerebro (el area sep-tal) altera por completo la conducta maternal de unroedor hem bra. EI animal no construye un nido para suscrias ni las agrupa a todas en un lugar y las alimenta.Como consecuencia, estas acaban dispersas por toda Iajaula, y finalmente pueden morir de hambre, a menos queel experimentador las rescate, entregandoselas a unamadre adoptiva. (Cual es la funcion del area septal, queresulta tan vital para la conducta maternal normal? Lo quesucede es que una conexion entre el area septal y la for-macion hipocampal controla la actividad de esta ultima-activa 0desactiva ciertas funciones del hipocampo-.Entre tales funciones figuran algunas de las nec.esariaspara que los animales perciban su localizacion en el espa-cio. Cuando se lesiona el area septal, dichas funcionesquedan permanentemente desactivadas. As! pues, es bas-tante probable que el que no se den las conductas de cons-truccion de nido y de agrupar a las crias se deb a a ladesorganizacion de la percepci6n espacial, de la madre.EI area septal no interviene directamente en la pelTep-cion espacial, pero debido a que controla circuitos neu-rales situados en el hipocampo, su lesion afecta a laconducta maternal.

Lesion por radiofrecuencia. Las flechas sefialan lasminusculas lesiones producidas por el paso de corriente deradiofrecuencia a traves de los extremos de electrodos deacero inoxidable, situados en el nucleo preoptico medialdel encefalo de una rata (Seccion frontal, tinci6n decuerpos celulares.)(De Turkenbu rg, J. L.; Swaab, D . F.; E nd ert, E .; L ou we rs e, A. L. Y va nde P o L L N. E. Brai n Res ea rc h Bu ll eti n, 19 88 , 2 1, 2 15 -2 24 .)

Produccion de lesiones cerebralesi.Como se efectuan las lesiones cerebrales? Destruir

las partes del encefalo que se encuentran justo debajo decraneo es Iacil: se anestesia aI animal, se corta el cuerocabelludo, se extrae una parte del craneo y se corta laduramadre, dejando al descubierto la corteza. Se puedeutilizar entonces un dispositivo de succion para aspirarel tejido cerebral. El tejido cerebral se extirpa situandouna pipeta de vidrio sobre la superficie del encefalo y sue-cionando el tejido mediante una bomba de vacio unidaala pipeta.

Lo mas frecuente es que la region que se quiere des-truir este oculta en el interior del encefalo. Las Iesionescerebrales de regiones subcorticales -regiones locali-zadas debajo de Ia corteza- se realizan por 10 generalhaciendo pasar una corriente electrica a traves de un elec-trodo de acero irioxidable que, salvo en la punta, estacubierto de un barniz aislante electrico. Se gufa el elec-trodo sih'lliendo un metodo estereotaxico, de modo quesu extremo llegue allugar adecuado. (La cirugia estere-otaxica se describe en el proximo subapartado). Luego,se conecta el aparato de prorlucir lesiones, que produceuna corriente de radiofrecuencias (RF) -corrientealterna de Irecuencia mlly elevada-. EI paso de lacorriente a traves del tejido cerebral produce una altatemperatura, que destruye lascelulas cercanas a la regionque rodea la punta del electrodo (vease la figura 5.7).

Las lesiones producidas con este metodo destruyentodo 10 que se encuentra en la vecindad de la punta delelectrodo, incluyendo los somas neuronales y los axonesde las neuronas que atraviesan la region. Un metoda masselectivo de producir lesiones cerebrales es emplear unaminoacido excitatorio como el dc ido ca in ico , que destruyelas neuron as estimulandolas hastaque mueren. (Como sevia en el capitulo 4, el acido cainico estimula los recep-tores glutamatergicos). A este tipo de lesiones se les llamalesiones excitotoxicas. Cuando se inyecta a traves de unacanula un aminoacido excitatorio en una region cerebral]a sustand~ destruye los somas celulares vecinos pero res~peta a los axones de las diferentes neuronas que pasan porlos alrededores (vease lafigura 5.2). Esta selectividad lepermite al investigador determinar si los efectos compor-tamentales de la destruccion de una estructura cerebralconcreta se deb en a la muerte de las neuronas que alii seIocalizan 0 a la lesion de los axones de paso. Por ejemplo,unos investigadores descubrieron que las lesiones por RFde una region determinada del tronco del encefalo abo-Han el suefio REM, por 10 tanto creyeron que esa region

L es io n e xc ito t6 x:ic a L es io n ce re bra L p ro du cid a p or in ye cc i6 n in tra ce re -braL d e un arnin oacid o ex citato rio , taL co mo el acid o cainico .


Ablac i6n expe rimen ta l 147

(a)

(b )

L esi6n ex cito t6 xica. (a) S ecci6 n a traves d el hipo cam podel encefalo de una rata normaL (b) Lesion producida porla infusi6n de un am inoacirio excitatorio en una regi6ndel hipocam po. Las puntas de flecha sefialan los lim itesde la regi6n en la que se han destruido las neuronas.(C ortesia de S enn o R oo zen daal, llniversid ad d e C alifo rn ia, Irvin e.)

participaba en la generacion de dicha fase del sueno. (EIsuefio REM es 111.ase del suefio en la que tienen lugar losensuerios). Pero estudios posteriores demostraron quecuando se utiliza acido cainico para destruir las neuronasque contiene esa region, eJ sueno de los anirnales noresulta afectado. De modo que las Iesiones por RF debie-ron alterar el sueno al destruir los axones que atraviesan1 e. area.

Se dispone de rnetodos para producir lesiones toda-via mas especificos. Por ejernplo, la 6-hidroxidopamina(6-HD) es similar a las catecolarninas noradrenalina y cdopamina. Debido a esta semejanza, la 6-HD es captadapor los transportadores de moleculas de los axones y losbotones terrninales de las neuronas doparninergicas ynoradrenergicas. Una vez dentro, 111.'ustancia intoxicay destruye las neuronas. Asi, 111.-HD puede inyectarsedirectamente.en regiones deterrninadas del encefalo para

eliminar poblaciones especificas de neuronas doparnergicas y noradrenergicas.

Reparese en que cuando se producen lesiones scorticales mediante corriente de RF a traves de un etrodo 0par infusion de una sustancia quimica a travesuna canula, siempre se causan danos adicionales enencefalo. Cuando se introduce un electro do 0una canen el encefalo para alcanzar el objetivo que se pretendinevitablernente se produce un cierto gTado de lesincluso antes de activar el dispositive de lesion 0deciar 111.nfusion. Por ]0 tanto, uno no se puede limitacomparar 111.onducta de los animales lesionados conde animales de referenda no operados; el dafio asociaproducido en las regiones cerebrales situadas por encide 111.esion puede, de heche, ser 10 que causa algunolos deficits comportamentales que se observan. Lo quehace es operar a un grupo de animales y producirles lesnes falsas (sham). Para ello, se anestesia a cada animse Ie coloca en el aparato estereotaxico (descrito mas a[ante}, se Ie abre el cuero cabelludo, se le trepana elneo y se inserta el electrodo 0 la canula, haciendapenetren hasta 111.rofundidad adecuada, En otras pbras, se hace 1 0 mismo que se haria para producir 111.esiexcepto activarel dispositive de lesion 0 iniciar 111.nsion, Este gTUpOde animales sirve de gTUpOde refercia; si 111.onducta de los animales can una lesion cerebes diferente de 111.e los animales de referencia conlesion falsa, se puede conduir que las lesiones son respsables de los deficits comportamentales. (Como se pueadvertir, una lesion falsa cumple el mismo cometidoun tratamiento placebo en los estudios farmacologicosLa mayoria de las veces, los investigadores producIesiones cerebrales permanentes, pero en algunas ocasnes resulta provechoso irnpedir temporalmente 111.ctdad de una determinada region del encefalo. La forma msencilla de hacerlo es inyectar un anestesico local 0unmaca llarnado muscimol en ellugar adecuado del encefaEl anestesico bloquea los potenciales de accion enaxones que entran 0 salen de esa region, y es eficaz pproducir una lesion temporal (Hamada corrientementlesion cerebral reversible). EI muscimol, un farmacc quemula los receptores GABA, inactiva una region delcefalo inhibiendo a las neur onas alli Iocalizadas.recordara que el GAEA es eI principal neurotransmisoinhibitorio en el encefalo). Las lesiones reversibles tabien pueden conseguirse enfriando el tejido nervioso

6 hidroxidopamina (6 -H D) Sustancia que es captadaselectivam en te por lo s ax on es y los ho tones terminales de lasne urona s no rad re netqi c as 0 dopaminerqicas y actua com o una to:idariandolas 0 destruyendolas.les io n fa ls a P ro ced im ie nto placebo: que reproduce todos los pade realizaci6n de una lesi6 n cerebral salvo el que realm ente la ca


148 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investiqacion

C rio do . instrum ento que pro duce lesio nes tem po rale s en lac or te za c ere bra l. E l i ns trume nto s e impla nta q uirC trg ic am en teentre e l craneo y e l ence fa lo , y la le si6 n temp oraL p ue dep ro du cir se m ie ntr as e l a nim aL e sta d es pie rto y alerta. S e h acecircular un liquido frio a traves de lo s tubos de aceroinoxidable. El c riodo que se ve en la fotoqrafia se coloco enuna reg i6 n d e L aco rte za visual d e aso ciaci6 n d el h em isferioizquierdo del encefalo d e un m ono.(C ortesia de Jam es H orel, S UN Y U ps ta te M ed ic al C en te r.

suficiente para suprirnir la actividad neural, La Figura 5.3muestra un instrumento Ilamado criodo, el cual puede uti-lizarse para producir lesiones temporales en una regionde la cortez a cerebral del encefalo del mono. EI utensilioconsiste en una serie de tubos de acero inoxidable a tra-yes de los cuales puede hacerse circular un Iiquidoenfriado. Se implanta entre el craneo y la superficie delencefalo (vease lafigura 5.3).

Cirugia estereotaxicaeComo puede situar Lapunta de un electrodo 0una

canula en un lugar precise del interior del encefalo de unanimal? La respuesta es mediante cirugia estereotaxica.Stereotaxis significa literalmente disposicion solida; enconcreto, se refiere ala capacidad de localizar objetos enel espacio. Un aparato estereotdxico consta de un soporte, queinmoviliza la cabeza del animal en una posicion estable-cida, y un brazo que desplaza el electrode 0 fa canula en

ciruqia estereot . ixica Ciruqia ce rebral que utiliza un aparato estere-otaxico para situar un electrodo .o una canula en un lugar especificod e l e n ce fa lo .bregma C on fluen cia d e las suturas sag ital y c oro na l d el cra ne o:sue le utilizarse co mo pun ta d e re fe re ncia e n ciruqia e ste re otax icacerebral.

los tres ejes espaciales a 10 largo de distancias cuantifibles. No obstante, para realizar una intervencion estertaxica primero se ha de consultar un atlasestereotdxic

El atlas estereot6xicoNo existen dos encefalos de animales de una determ

nada especie que sean completamente identicos, perosernejanza entre los individuos es suficiente para predeIa localizacion de una estructura cerebral concreta respea las caracteristicas extemas de la cabeza. Por ejemplo,micleo subcortical de la rata puede estar a tantos rnilimtros en los planos ventral, anterior y lateral de un puntomado por la confluencia de varios huesos del craneo.figura 5.4 muestra dos vistas del craneo de una rata:dibujo de Ia superficie dorsal y, debajo, una vista sagmedial (vease lafigura 5.4). EI craneo se compone de vahuesos que crecen juntos y forman sl1turas(puntos de unioEn la cabeza de los nifios recien nacidos hay un publando en donde se unen las suturas sagital y coronal,made [onianela. Cuando esta abertura se cierra, la uniondenomina bregma, de la palabra griega que significa paanterior de la cabeza. Tarnbien se observa bregma ecraneo de una rata, ysirve como un titil punto de refercia. Si el craneo del animal esta orientado tal como se repsenta en la ilustracion, una deterrninada region del encefsiempre se encuentra en una posicion bastante constaen el espacio, tomando bregma como referenda.

BregmaSe perfora un agujeropor encimadei objetivodela lesi6n

R elaci6 n entre las suturas del craneo y el encefalo de unrata, y lo calizaci6 n d el o bjetivo d ond e situar e l ele ctro deArriba: Vi st a do rs al , Abajo: V ista s ag ital m ed iaL


Objetivo de la lesion

Ab la ci 6n e xp er im en ta l 149

Ejem plo de paqina de un atlas estereotaxico del encefalode rata. El o bjetivo (fornix) se ha resaltado en rajo. S e hansuprim id o lo s rotulo s id entificativo s para m ayo r clarid ad.(A daptado de Swanson, L. W . Brain M aps: Structure of the Rat Brain.Nue va Y o rk : E ls ev ie r, 1992.)

Un atlas estereotaxico incluye fotografias 0 esque-mas que correspond en a secciones frontales, tomadas adiferentes distancias rostrales y caudales a bregma. Porejemplo, en la pigina representada en la figura 5.5 hay unesquema de una secci6n del encefalo en la que se hallauna estructura cerebral (que se ve en rojo) que le interesaal investigador Si este quisiera colocar la punta de unelectrodo en dicha estructura (el fornix), tendria que per-forar el craneo justa por encirna de ella (vease lafigu-ra 5.5). Cada pigina del atlas estereotaxico estaidentificada conforme ala distancia de la seccion anterioro posterior respecto a bregma. La cuadricula de cadapagina indica las coordenadas de las estructuras cerebra-Ies en el plano ventral a la parte superior del craneo y late-ra] a la linea media. Para situar la punta de un electrodoen el fornix habria que hacer un agujero por encirna delobjetivo y luego bajar el electrode por el orificio hasta quesu punta este en la profundidad correcta, en relacion alaaltitud del craneo en bregma (veanse lasfiguras 5.4 y 5.5).Asi, localizando una estructura neural (que no se puedever en el animal de experirnentacionlen una de las pagi-nas de un atlas estereotaxico, se puede determinar su Ioca-Iizacion respecto a bregma (que S 1 se puede verl. Hay que

.atlas estereo taxico R ecopitacion de esquem as de secciones delencefalo de un determ inado anim al con m edidas que proporcionanlas cco rcenad as para realizar la cirug ia estereo tax ica.aparato estereotaxico D ispositivo que perm ite al cirujano situaru n e le ct ro d o 0 una canula en un lugar especifico del encefalo .m _ . _ _

tener en cuenta que, debido a variaciones en la cepa y edadde los animales, la localizacion que proporcionan los atlases s610' aproximada, Siempre hay que pro bar con unanueva serie de coordenadas, seccionar y tefiir el encefalodel animal, com pro bar la localizacion exacta de la lesion,corregir los valores y volver a intentarlo. (Los metodos desecci6n y tincion cerebral se describiran mas adelante.)

E l aparato estereotiixicoUn aparato estereotaxico funciona segiin principiossencillos. El dispositive incluye un soporte para la cabeza,que mantiene el craneo del animal en la ubicacion ade-cuada, un soporte para el electrodo y un mecanismo degraduaci6n pOl' el se mueve este ultimo soporte en dis-tancias ponderadas a 1 0 largo de los tres ejes espaciales:anterior-posterior, dorsal-ventral y lateral-medial. En lafigura 5.6 se presenta un aparato estereotaxico disenadopara animales pequefios; se pueden utilizar varios tipos desoportes de cabeza con el fin de adaptar este instrumento.adiferentes especies, como ratas, ratones, hamsteres, palo-mas y tortugas (vease lafigura 5.6).Una vez que se han obtenido las coordenadas este-reotaxicas a partir de un atlas estereotaxico, se anestesiaal animal, se le coloca en el aparato y se le hace una inci-sion en el cuero cabelludo. Se localiza bregma, se marcanlos mirneros apropiados en el aparato de estercotaxia, setaladra el craneo y se introduce el dispositive en eJ ence-falo basta las coordenadas correctas. Ahora la punta de la .

Tuercasde ste

Electradoen el encetalo

Apa ra to e ste re ota xic o pa ra re aliza r c iru gia c ere bra le n r ata s.


1 S O Capitulft 5: MHodos y esbategias de investigaciimcanula 0del electrodo estci donde se queria que esmviesey se puede pradicar Ia lesiOn.

Evidentemente" la cirugia estereotaxica pnede ulili-zarse para otros fines distintoo que prodncir lesiones, Loselectrodes situados en el en.cefulo pneden emplearse tantopara estimular neuronas como para destruidas, Y se pue-den inyectar tannacos que estimulen neuronas 0Ioqneenreeeptores especificos, Se pneden implantar canulas .0electrodes permanentes, siguiend.o un procedimiento quese desc:r ihir . i luego en este cap:t1:ulo.En cualquier easo , unavez f:inalizada la inteJvenci6n quirfugica" se cose laherida, se renra aI animal del aparato estereotibcico y se deja quese recupere de Ia anestesia

A propOsito" tmnbien hay aparatos estereotaxicospara seres humanos, A veees, los neurocirujanos efectii.anIesiones subcorncales -por ejemplo, para reducir los sin-tomas de la enfermedad de Paiklnson-. Par 1 . 0 general>se vaten de mUltiples puntos de referencia y venfican lalocal:izaci6n del electrode t o de otro dispositiV.o) insertadoen. el encefulo tomando iIm\"uenes de RM antes de producirla lesion cerebral (vease IafipN 5.1).

Metodos h is to lOg icosDespues de haber producido una lesiOn cerebral. 'I

observado sus efectos en Ia conducta del animal, hay queseceionar y teD.ir el tejido cerebral de modo que se puedamspeeeionar con el microscopic y localizat el logarde lalesiOn. A menudo, las Iesioues cerebrales yerran su obje-tivo, pOl'10 que hay que verific.ar la localizaci6n encta deldano cerebral despues deexammar el eomportamientodel animal Para ello se necesita fijar. seccionar, tei:iir 'Iexammar el eneefalo, Tornados en conjunto, estos pro-cedimientos se denominan milodes Imtoliigicos.. (Elprefijo histrr hace alusi6n al tejido corporal],

Rjodon y obtend6n de secrionesSi se pretende esmdiar el tqido tal como era en el

memento de la muerte del .organismo" se han de destruirlas enzimas autohncas (mrt6lim~unifica


Abl at ion exper imen tA l l 151

MicrotortlO.

induye un accesorio que congela el encefalo, endure-ciendolo 10 suficiente para poder cortarlo en finas sec-ciones. En la figura 5.8 se muestra un rnicrotomo. EIsoporte de la cuchilla se desliza hacia delante sobre un rielengrasado y asi se obtiene una seccion de la parte supe-rior del tejido fijado a la plataforma. Esta sube automati-camente a una altura predeterrninada cuando la cuchilla)' el soporte son empujados de nuevo hacia atras, demanera que el siguiente movimiento hacia delante de lacuchilla corta otra seccion (vease laftgura 5.8).

Tras haber cortado el tejido, las secciones se montansobre portaobjetos de vidrio. Estas pueden entoncestefiirse sumergiendo el portaobjetos en diversas solucio-nes quimicas. Par ultimo, las secciones tefiidas se cubrencan una pequefia cantidad de liquido transparente, cono-cido como medic d ep re p ar ac io n, ) ' se coloca una lamina decristal mu)' fina (cubreobjetos) sobre ellas, El medio de pre-paracion mantiene fijo el cubreobjetos.

IincionSi se observa al microscopio una secci6n de tejido

cerebral sin tefiir, se podran ver los contomos de algu-nas masas celulares grandes )' los fasciculos de fibras masdestacados. Sin embargo, no se dejaran ver los detallesmas finos. Par esta razon, el estudio de la neuroanatorniamicrosc6pica requiere tinciones histol6gicas especificas.Los investigadores han desarrollado muchas tincioriesdiferentes para identificar sustancias espedficas en el inte-rior 0el exterior de las celulas. Para verificar la localiza-cion de una lesi6n cerebral se utilizara una de las massimples: la tinci6n de los somas celulares,

A finales del siglo pasado, Franz Nissl, un neurologoaleman, descubri6 que un tinte, llamado azul de metileno,podia tefiir los somas celulares del tejido cerebra1. EImaterial que capta el tinte, conocido como sustancia deNissl, esta formado por ARN, ADN Yplptefnas asocia-

das locahzadas en el nucleo y disperses, en forma de gra-nulos, po T el citoplasma. Ademas del azul de metileno sepueden utilizar muchos tintes para tew los somas ceIu-lares, peru el que mas se emplea es el violeta de cresilo,P oT cierto, los tmtes no se desarrollaron expresamente confines histOlogicos sino que, en un principio, Sf! f.ilirit:.lU'6Dpara teillr telas.

EI descubrimiento de las tinciones de somas celula-res hizo posable identificar masas nucleares eli el encet..do.En l a c figura 5.9 se representa una. sec:ci6n frontal de unen cefalo de gato tenida OOD violeta de cresilo, Repcireseen que se pueden distinguir los fusticulos de fibras por-que tienen un aspecto mas claro: no absorben el tinte[vease la.fi!:rua 5.9), Latincion no tiiie selectivsmente lossomas celulares neuronales; todas las celulas" ya seanneuronas 0neurogliocitos, quedan teiiidas por igual_ Lecorresponde al investigador determiner emil es cual-enfuncion de su tamaiio, forma y localizacion-.

Microscopia electr6nicaEl microscopic 6ptico bene una escasa capacidad deresolucron espacial para apreciar pequenos detalles,Debido a Ia naturaleza de Ia luz en simisma, una ampli-ficacion de mas de unas 1,500 veces no aiiade ningUn deta-lIe. Para poder vel' estructuras anatomicas tan pequenascomo las vesiculas sinapticas y detalles de los organuloscelulares, los investigadores han de utilizar un microsco-pio electronico. Con el sepasa un haz de electrones deun lado a otro del tejido a examinar, Una sombra delmismo se proyecta entonces sobre una placa fotognifi.ca"la cual queda revelada pOl' los electrones, Las micro

S ecci6n frontal del encefalo de un gato, tefiido con viole tade cresilo , una ti nci6n del som a celular. Las puntas defle ch a se fia la n lo s n uc le os 0 g rup os d e somas c elulare s.(M ate ria l h is ta l6 gic o p ar (arte sia d e M ary C arlso n.)


152 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investiqacionNeurona Botones terminales que

sinaplan con una neuronafotografias electronicas asi producidas pueden aportarinformacion sobre los detalles estructurales del orden deunas pocas decenas de nan6metros (vease lafigura 5.10).

Un microscopio electr6nico de barrido propor-ciona un grado de amplificacion (capacidad de aumento)menor que un microscopic electronico de transmisi6ncorriente, el cual transmite el haz de electrones a travesdel tejido. En cambio, muestra los objetos en tres di-mensiones, E1 microscopioexamina (


AbLac i6 n e x pe rimen ta l 153

. " . 1 . 8 , _ ' - _Una vez que se Sa be que una determi nada region delencefalo interviene en el control de una determ inadafuncion, cabe preguntarse cuales son las estructurasque le aportan inform acio n y cuales La reciben de ella.

activado par las ilonTIonas sexuales adecuadas.e Cual es lafunci6n exacta del HVM en este complejo sistema?

Antes de pretender contestar a esta pregunta hay quesaber mas acerca de las conexiones del HVM can el restodel encefalo, (Que estructuras envian sus ax ones al HVMy a que estructuras los envia este a su vez? Una vez sabidocuales son las conexiones, se podra investigar la funci6nde estas estructuras y el caracter de sus interacciones(vease lafigura 5.12).

lComo se pueden investigar las conexiones delHVM? Esta cuestion no se puede resolver mediante pro-cedimientos histologicos que tinen todas las neuron as,como hace la tin cion de los somas celulares. Si se observadetenidamente un encefalo que ha side preparado cantales rnetodos, unicamente se vera una masa enmarafiadade neuronas. Pero en los tiltimos afios los investigadoreshan desarrollado metodos de gran precision que hacenresaltar a neuronas especificas de entre todas las dernas.

Marcado de axon es ejerentesEn ultima instancia, el HVM tiene que afectar ala con-

ducta, Es decir, las neuronas de este micleo tienen queenviar axones a zonas del encefalo en las que haya neu-ronas que medien los movimientos musculares. Proba-blemente la via no sea directa; 10 mas seguro es que lasneuronas del HVM afecten a neuronas localizadas enotras estructuras, las cuales a su vez influyan en las de otrasestructuras, hasta que, finalmente, las neuronas motorasapropiadas sean estirnuladas. Para poner de manifiestoeste sistema se han de identificar las rutas que siguen losaxones que salen del HVM. En otras palabras, se pre-tende ahora marcarlos axones eftrentes de dicha estructura.

Para marcar dichos axones se utilizara un metodo demarcado anterograde. (Anterogrado significa que semueve hacia delante). Estos metodos emplean sustanciasque son captadas por las dendritas 0 los somas celularesy transportadas a 10 largo del axon hasta los botonesterminales.

A 10 largo de los anos, los neurocientifrcos 'han desrrollado diferentes metodos paramarcar las vias que siguelos axones eferentes. Un metodo ideado recientementeesta desplazando a los anteriores, por 1 0 que en este casse utilizara este, Los biologos celulares 'han descubierto quuna familia de proternas producidas por plantas se unenmoleculas complejas especificas que existen en las celuladel sistema inrnunitario. Se ha encontrado que estas pro. teinas, llamadas lecitinas, tambien pueden emplearse parhazar las vias neurales. Una lecitina determinada,PHA-L (phaseolus vu lga r is l eukoagg lu ti ni n, si es que le intresa allector saberlo), producida poria judfa, es la queemplea para identificar los axones eferentes.

Para descubrir el destine de los axones eferentes de lneuronas localizadas en el HVM, se inyecta en el una minucula cantidad de PHA-L. (Para hacerlo se utilizara, obviamente, un aparato estereotaxioo], Las moleculas de PHA-Lson captadas por las dendritas y transportadas a traves dsarna al axon, par donde viaian mediante transporte axplasmico rapido hasta los botones terminales, En pocos dilas celulas estan lienas de moleculas de PHA-L en su totaldad: las dendritas, el soma, e1axon y todas sus ramificaciones, y los botones terrninales. Entonces, se sacrifica al animase secciona el .encefalo y se acoplan las secciones sobre potaobjetos. Para poder ver las moleculas de PHA-L se aplicun metoda inmunocitoquimico especial, y las preparacionesexaminan al microscopic (vease Jafigura 5.13).

Los metodos inmunocitoquimicos sacan provechode las reacciones inmunitarias. El sistema inmunitario dorganismo tiene la capacidad de producir anticuerpos erespuesta a los antigenos. Los antigenosson proteinas (0peptides), como las que se encuentran en la superficie de lbacterias 0 los virus. Los anticuerpos, que tambien son proteinas, son producidos los leucocitos de la sangre para detruir a los rnicrorganisrnos invasores. Los anticuerpos 0bieson segregados pOl' los leucocitos a bien se sinian sobresuperficie, al igual que los receptores de los neurotrans-misores se localizan sobre la membrana de las neuronaCuando los antigenos presentes en la superficie del microrzanismo invasor entran en contacto con los anticuerpos quolos reconocen, estes desencadenan el ataque de los leu ccites sobre el invasor,

rnetodo de marcado anteroqrado M etodo histoL6gico que m arca loaxones y los botones terminates de neuronas cuyos som as celuLaresse localizan en una reg ion determ inada .PHA- l Ph as ee lu s v uiq o n: l eu ko a g g lu tin in ; prote ina derivada de lasjudi as, que se utiliza como marcador anter6grado; es captada por

'. las dendrita s y Los s om as ceLulares y transportada hasta Los e xtrem osd e los ax ones .metodo inmunodtoquimico M etoda histo l6g ico que em pleaanticuerpos rad ioac tivos a anticuerpos ligados a una m olecule tefiidpara indicar La p resencia de determ inadas pro teinas de peptidcs.


154 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investigaci6nLa PHA-L se inyecta en unaregion del encefalo yes captadapar lasdentritas v los cuerpos celularesundamento del uso de

P HA -L para m arcar losa xone s e fe re nt es .

Los biologos celulares han desarrollado metodos deproduccion de anticuerpos para cualquier peptide 0 prote-ina. Las molecules de los anticuerpos estan unidas a distin-tos tipos de moleculas de colorantes. Algunos de estescolorantes reaccionan con otras sustancias y tirien el tejidode color marron, Otros son fluorescentes: brillan cuando sonexpuestos a una luz de una deterrninada longilud de onda.Para determinar en que parte del encefalo se localiza el pep-lido 0la protema (el antigeno), los investigadores sumergensecciones frescas de tejido cerebral en una solucion quecontiene las moleculas de anticuerpo/colorante. Los anti-cuerpos se unen a su antigeno. Cuando el investigador exa-mina las secciones con un microscopio (bajo una luz de una

. (a)

La PHA-L es transportadapor el flujo axoplasmico

Los axones y los botonesterminales pueden versecan el microscopiodeterrninada longitud de onda, en el caso de tintes fluocentes) puede ver cuales son las partes del encefalo -incIuque neuronas individuales- contienen el antigeno.

La figura5.14 rnuestra c6mo se puede utilizarPHA- L para identificar las eferencias de una regi6n deminada del encefalo. Se inyectaron moleculas de estatancia en el HVM. Dos dias despues, wando la PHAhahia sido absorbida pOl' las neuronas de esa regi6ntransportada a los extremes de sus axones, se sacrificeanimal. Las secciones del encefalo se trataron con un acuerpo de la PHA-L, unido a un tinte que tine el tejidocolor marron rojizo. La figura 5.14(a) muestra el Iugarla inyeccion; como se puede ver, la led tina llena los som

(b)

M etodo de marcado anteroqrado . Se iyecto PH A-L e n el nucleo ventromedial delhipotalarno (H VM ), donde fue captado por las dendritas y transportado a traves de losaxones de las celulas hasta los botones term inales. (a) Lugar de la inyeccion. ( b )Axones y botones term inales de la sustancia gris periacueductal (S PG ) m arcados.(C ortesia d e K irsten N ielsen R icciard i y Jeffrey B laustein, U nivJrsid ad d e M assach ussets.)


Ab la ci or e xp erim en ta l 155celulares y las dendritas cercanas (vease lafigura 5.14a).La figura 5.H(b) presenta una microfotograHa de la sus-tancia gris periacueductal (SGP). Esta region contiene algu-nos axones y botones terrninales marcados (en dorado), 1 0cual dernuestra que algunos axones eferentes del HVM ter-minan en la SGP (vease lafigura 5.14h).

Para seguir con el estudio de la funcion del HVM enla conducta sexual de las hernbras habria que averiguarcuales son las estructuras que reciben informacion de lasneuronas del HVM (entre elias, la SGP) y vel' que sucedecuando se lesiona cada una de elIas. Supongase que eIdafio de algunas de estas estructuras altera tambien la COD-. ducta sexual femenina. Se inyectara PHA-L en dichasestructuras y se observara hacia don de se dirigen sus axo-nes. Finalmente, se descubrira Ia via principal que va desdeel HVM hasta las neuron as motoras cuya actividad esnecesaria para copular. (De hecho, los investigadores ya 10han hecho y algunos de los resultados obtenidos se expon-dran en el capitulo 10).

Marcado de axones ajerentesTrazar los axones eferentes del HVM solo explicara

parte de la historia sobre los circuitos neurales implicadosen la conducta sexual femenina: la parte que ocurre entreel I-IVM y las neuronas motoras, lQue hay en cuanto a loscircuitos que se situan antes del HVM? dnterviene de algiinmodo el HVM en el analisis de la informacion sensorial(como Ia vision, el olor 0el toque del macho)? 0 tal vez losefectos activadores de las horrnonas sexuales de la hembrasobre su eondueta acnian a traves del HVM, 0de neuronascuyos axones establecen sinapsis alli, Para descubrir cualesson las regiones del encefalo que estan involucradas en loscomponentes de la corriente superior de los eircuitos neu-rales, se ha de determinar cuales son las aferencias querecibe el HVM -sus conexiones aferentes-. Para hacerlo,S8 ernpleara un metodo de marcado retrograde.

Retrogrado significa que se mueve hacia atras. Losrnetodos de marcado retrograde emplean sustancias que soncaptadas por los botones terminales y transportadas devuelta a 10 largo de los axones hacia los somas celulares. EImetoda para identificar las aferencias que recibe una deter-minada region del enoefalo es similar al utilizado para iden-.tificar sus eferencias, En primer lugar, se invecta en el HVMuna pequefia eantidad de una sustancia denominada orofluorado. La sustancia es absorbida pm los botones tenni-nales y transportada de vuelta a los somas celulares mediante

'< ; trans porte axoplasrnico retrograde. Pecos dias despues sesacrifica al animal, se secciona 3U encefalo, y se examina eltejido bajo una luz de la longitud de onda adecuada, Lasmoleculas de oro fluorado emiten fluorescencia bajo esta luz.Se encontrara que la arnigdala medial es una de las regio-nes que aportan aferencias al HVM(ve.ase laftgUra 5.15}.

Los metodos de rnarcado anter6grado y retrogradeque se han descrito identifican un solo eslabon de unacadena de neuronas -neuronas cuyot axones entran 0

M etodo de marcado retroqrado. 5e inyect6 oro fluoradoel HVM , donde fue captado por los botones termina lesy transportado de vuelta a traves de los axones hastasus somas celulares. La fotografia m uestra estos somasce lu lare s, L ocaL izad os e n L a am ig daL a med ial.(C urte sia d e Y vo n D elv ille , Med ica l S choo l, Mass achus et ts Un iv er si ty

salen de una region cerebral determinada-. Los mdos de marcado transneuronal identifican una serie detres 0mas neuronas que forman conexiones sinapticasserie una con otra. E1 metodo de marcado transneuromas eficaz emplea un virus de la seudorrabia -uforma debilitada del virus herpes del cerdo que origimente se concibio como vacuna-. EI virus se invdirectamente en una region cerebral, es captado poneuronas dellugar y las infecta, E1virus se extiende aves de las neuronas infectadas y finalmente es liberacontagiando la infeccion a las neuron as con las queblece conexiones sinapticas. Algunas neuron as sontruidas por el virus; otras sobreviven a la infeccion.metodo puede utilizarse para marcar los circuitos, yaen direccion anterograda 0 retrograda.

Cuanto m a s espera eI investigador tras inyectar el vmayor es la cantidad de neuronas que llegan a infectaDespues de que el animal haya sido sacrificado y su efalo seccionado, se aplican metodos inmunocitoquimico":

~ ~ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -etodo de marcado retrriqrado M etodo h istol6gico que marr a lsomas celulares a los que pertenecen los botones terminates de laxones que establecen sinapsis can las cclulas de una determ inadaregion.oro fLuorado Tincior que sirve como marcador retroqrado: lo captlos botones terminales y lo transportan de vuelta a los somascelulares.virus de La seudorrabia Forma debilitada de un virus herpes delcerda; se usa como marcador transneuronaL el cual rnarca una serde neuronas que estan conectadas entre S 1 m ed ia nte s in ap sis ,


156 Capitulo 5 : MHodos y estrategias de investigaci6npara localizar una proteina producida por el virus, Porejernplo, Daniels, Miselis y Flanagan-Cato (1999) invecta-ron el virus de la seudorrabia en los musculos que contro-Ian la postura de apareamiento de las ratas hembra, Trasunos cuantos mas, se sacrifice a las ratas y se buscaron ensu encefalo signos de infeccion virica, EI estudio indicaque el virus encontro su camino a 1 0 largo de los nerviosmotores hasta las neuronas motoras de la rnedula espinal,de ahi a la formaci6n reticular del bulbo, luego ala sustanciagris periacueductal y por ultimo al HVM. Estos resultadosconfirman los de los rnetodos de marcado anterograde yretrogrado que se acaban de describir. (Tambien se encon-traron neuronas infectadas en otras estructuras, pero estono es relevante en esta exposicion).

Cornbinandolos, los metodos de marcado anterogradey retrograde -incluyendo los rnetodos transneuronales-permiten descubrir circuitos de neuronas interconectadas.ASI, estos metodos contribuyen a obtener un diagrarna delcableado neural del encefalo (vease lafigura 5.16) . Provis-Losde otros metodos de invesrigacion (incluidos algunos delos que se describiran mas adelante en este capitulo), sepuede tratar de descubrir las funciones de cada uno de loscomponentes de dicho circuito.

E stud io d eL c ere bro humano in vivoHay muy buenas razones para investigar las funcio-

nes del encefalo de otros animales aparte de los seres'IIMarcado anter6grado:

se inyecta PHA-L en el HVMIIntonces pueden verselos axones y terminalesen la SGP

IIIMarcado retroqrado:se inyecta oro fluoradoen el HVMIIntonces puede verse los cuerpos

celulares an'la amfgdala medial

U na de las aferencias al H VMy una d e las eferencias ,puestas de manifiesto par los metcdos de marcadoantercqrado y retroqrado.

humanos .. Una de ellas es que se pueden compararresultados de estudios realizaclos con diferentes esppara sacar algunas conclusiones sobre la evoluci6n de vsistemas neurales. Aunque nuestro principal foco deres sean las funciones del en cefalo humano, obviamentese puede pedir a las personas que se sometan a cicerebral con el fin de investigarlo. Pero, a veces, las emedades y los accidentes dafian el encefalo humane,se sabe donde se ha producido la lesion se puede estula conducta de esas personas e intentar hacer el mismode inferencias que se hicieron respecto a las lesionesbrales praducidas intencionadamente en los animalesIaboratorio. E1 problemaes (donde se localiza la les

En el pasado, un investigador podia estudiar la condde una persona con dario cerebral y no saber nuncaexactitud su localizacion, La unica manera de asegurarseconseguir el cerebra del paciente cuando moria y examinal microscopic. Pero solia ser imposible. En ocasionespaciente sobrevivia al investigaelor. Habia casos en qupaciente cambiaba de residencia. Algunas veces '(qdernasiadas], la familia no concedia la autorizacion paautopsia. Debido a estos problemas practices, el estudiolos efectos comportamentales del dafio en regiones esficas del encefalo humano progresa mas bien lentarne

Los recientes avances en las tecnicas de rayos XIa tecnologia de los ordenadores han llevado a concvarios rnetodos para estudiar la anatornia del cerebrovivo. Dichos avances permiten a los investigadoresminar la localizaci6n y extension de la lesion ceremientras el paciente esta aiin vivo. El primer metodase ideo recibio el nornbre de tomograffa axial comtarizada (TAC) (de los terrninos griegos tomes, cortgmphe in , escribir). Este procedimiento, al que frecutemente se le llama im ag en d e T AC , funciona como sise coloca la cabeza del paciente en un amplio cilindroforma oval ada ..El cilindro contiene un aparato de rX y, justo enfrente ele el (al otro lado de la cabezapaciente), hay un detector de rayos X : El hazde rayopasa a traves de la cabeza del paciente y el detector mla cantidad de radioactividad que se transrnite. Esteexplora la cabeza desde todos los angulos, y un ordedor convierte los valores que recibe del detector engenes del craneo y su contenido (vease lafigura 5.1En la figura 5,18 se presenta una serie de estasgenes de TAC obtenidas de la cabeza de una pacientehabia sufrido una apoplejia. Este accidents cerebrovcular daiio una parte del encefalo implicada en la cciencia del propio cuerpo y en la percepcion delespac

tomografia axial computarizada (TA C) Instrument'o que empleo rdenador para analizar los datos obten idos par un haz de rayoscual efectua un barrido para presen tar una radio grafia bidim ensionde una seccion a traves del cuerpo.


158 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investiqacion

R M sagital medial de un encefalo humano.(Foto por cortesia de Ph i/ip s M e dic al S y stem s) .funciones. ELmetoda de lesion es el mas antiguo de los quese em plean en este tipo de investiqacion y sigue siendo unode los mas utiles.U na lesion subcortical se efectua can laayuda de un aparato estereotaxico. S e obtienen las coorde-nadas en un atlas estereotaxico, y luego se situa la puntad e l eLec tr odo 0de La canula en la sede del objetivo . Se rea-liza una lesion haciendo pasar corriente de RF a traves delelectrodo 0 infund ie ndo un arn in oacido e xcitatorio a travesd e ta can ula, prod ucie ndo as] un a lesion ex cito to xica. L a v en -taja de estas lesiones es que solo destruyen Los somas ceLu-lares de las neuronas; los axones que atraviesan La regionno resultan danad os.

S e ha de determinar la localizacion de la lesion trashaber observado la conducta del animal. El animal se sacri-fica de form a hurnanitaria. se perfusiona el encefalo con unasolution salina, seextrae del craneo y se conserva en unfijad or co mo L aform alin a. 5e utiL iza un m icrotom o -para sec-cionar el tejido, el cual generalmente se ha congelado conel fin de endurecerlo suficienternente para poder cortarloen finas secciones. Estas se rnontan en portaobjetos, teni-das con un coLorante de somas celulares, y se examinan almicroscopio.

E Lm icrosco pio optico pe rm ite ver las celulas y sus o rqa-nulos m as grandes, pero para ver los pequerios porm enores,tales como cada una de las mitocondrias 0 la s v es icul assin apticas, se necesita un m icro sco pio e le ctro nico. E l m icros-copio electronico de barrido proporciona una vista trid i-mensional del tejido , pero can amplificacion menor que elm icro sco pio e le ctro nico d e tra nsrn is io n co nve ncio na l.

El siguiente paso en un programa de i nvestiqacion amenudo requiere que el investigador descubra las conexio-nes aferentes y eferentes de La region que se esta cstudiandocon el resto del encefalo. Las conexiones eferentes (las que

transmiten informacion de La region en cuestion a otras par-tes del encefalo) son puestas de manifiesto con rnetcdosde marcado antercqrado, como el que utiliza PHA -L. Lasconexiones aferentes (aquellas que lLevan informacion a Lregion en cuestion desde otras partes del encefalo) se evi-dencian can metodos de marcado retroqrado, como el queusa oro fluorado. Las cadenas de neuronas que estable-cen conexiones sinapticas pueden verse con metodos demarcado transneuronal, los cuales em plean el vi rus de laseudorrabia.

A unque no se realizan lesiones deLiberadas en el ence-falo de los seres humanos confines de investiqacion. lasenfermedades y los accidentes pueden causar una lesioncerebral y, si se sabe donde se localiza dicha lesi6 n, se puedeestudiar La conducta de Los sujetos y sacar conclusionesacerca de la localization de los circuitos neurales que llevana cabo funciones importantes. 5i el paciente muere y puededisponerse de su encefalo para exarninarlo, se pueden apli-car los rnetodos h isto loqicos habituates. En otro caso, sepuede exam inar el cerebra in v iv o u ti liz ando expl or ac io nescan TA C0 con RM .

En La tabla 5.1 se resumen los metndos de investiga-cion descritos en este apartado.

~!1~~~'~';::'11~"l.tfc'k'.""i.~~If~~~i~l~~._La primera parte de este capitulo se ocup6 de la ana-tornia del encefalo y los efeetos de las lesiones en deter-

minadas regiones cerebrales, Esta seccion aborda unaaproximacion diferente: el estudio del encefalo medianteel registro 0 la estirnulacion de la actividad de regionesespecificas. Las funciones cerebrales implican la actividadele eireuitos neuronales; asi, las diferentes percepciones yrespuestas comportamentales implican diferentes patro-nes de actividad cerebral. Los investigadores han elabo-rado rnetodos para registrar estes patrones 0 paraproducirlos de forma artificial.

R egistro de L aactividad neuralLos axones producen potenciales de acci6n, y los

botones terrninales provocan potenciales postsinapticosen la membrana de las celulas con las que establecensinapsis, Estos fenomenos electricos pueden registrarse(como se via en el capitulo 2), y los cambios en la acti-vidad electrica de una region concreta, se pueden utili-zar para determinar si dicha region participa en el controlde diversas conductas. Por ejemplo, pueden hacerseregistros durante la presentacion de un estimulo, el pro-ceso de tom a de decisiones 0a ejecucion de una activi-dad motora.


Ab la ci6 n e xp er im e nt al 157

(1)

(4)

(2)

(5)

(3)

La paciente perdio la percepcion cansciente de Ia parteizquierda de su cuerpa y de los estimulos localizados a suizquierda. Se puede ver el dano como una mancha blancaen el lado inferior Izquierdo de la imagen 5 (vease lafigura 5.78).

Una radiografia incluso mas detallada de 10 que hayen el interior de la cabeza de una persona la proporcionauna tecnica que se denomina resonancia magnetica(RM). EI equipo de RM se parece al del TAG, pero nouti1iza rayos X. En lugar de ella, hace pasar un campo mag-netico extrernadamente intenso a traves de la cabeza del

T orn oq ra fia a xial c ompu ta riz ad a (TA e).(La rry Mulv ih i ll /Ra inbow.)

(6)

Serie de T1I(s de un paciente con una lesi6en el area o ccipito -parietal derech a(imagen 5), La lesion se ve en blancodebido a la hem orragia: la sangre absorbem as radiaci6 n que el tejido cerebraleircundante. La zona rostral se situa arribala caudal abajo; los lados izquierdo yderecho estan invertidos La im agen 1muestra una seeei6n a nivel de los ojosy la base d el encefalo .(C ortesia de J. M eA , J ones,Good S ama ri ta n H os pita l, P ort la nd , O re go n.)

paciente. Cuando se coloca el cuerpo de un sujeto enintenso campo magnetico, los micleos de algunos atomode moleculas del organismo rotan siguiendo una deteminada alineacion. Si entonces se hace pasar una ondaradiofrecuencia a traves del cuerpo, dichos nucleos emten ondas de radio. Las diferentes rnoleculas erniten enegia a diferentes frecuencias. El equipo de RM se ajusta padetectar la radiaci6n procedente de los atomos de hidrgena. Ya que la concentracion de estos atomos en los dtintos tejidos es diferente, el equipo puede utilizarinformacion para elaborar imageries de secciones dencefalo. A diferencia de las imagenes de TAG, que p10 general estan limitadas a un plano horizontal, las de Rpueden obtenerse tarnbien en un plano sagital a uno frotal (vease lafigura 5.19).

in te rille d i0Ablaci6n experimental ~.El objetivo de la investiqacion en N euroeiencia com porta

mental es entender que funciones cerebrales se requierepara llevar a c:abo una co nd ucta d eterrninad a y lue go s abd6nde se localizan los circuitos neurales que ejecutan es

resonancia magnH ica Tecn.ca por Ia cual puede obtenerse una:im agen precisa del interior del organism o; im pliea la interacciorentre ondas de radio y un fue rte cam po m ag netico .


Registro y estirnulacion de la actividad neural 159

Metodos de investigaci6n: Parte I

Destruye todo el te jido cerebral proximo a la puntad el e le ctr od o

Lesiones excito toxicas: utiliaaam inoa- O estruye solo los somas celulares proximos a l extremac idos exc itatorios como el ac ido cainico de la canula; no afecta a los axones que atraviesan La

regionLesion con 6 -HD Destruye las neuronas ca tecolarninerqicas pr6ximas aL

extremo de la canulaInfusi6n de un anestesico Local; crioda Inactiva temporalmente regiones cerebraLes especffi-

cas; el animal puede servir como su propia testigo

D estruir a inactivar reg ionesc er eb ra le s e sp ec if ic as

L es i6 n p ar ra dio fre cu en cia

ldentificar la loca lizaci6n de lalesi6n en el encefa lo humano vivo

Tom ograffa computarizada (TA C)Resonancia rnaqnetica (RM )

M uestra secc iones del encefalo : utiliza rayos XM uestra secc iones del encefalo ; m ejor resolucionespacial que la TAC; utiliza un campa maqnetico yondas de ra d io

Los registros pueden realizarse cronicamente, durante unlargo periodo de liempo despues de que el animal se hayarecuperado de la intervencion quirurgica; 0de forma a g u d a . ,durante un periodo de tiempo relativamente corto duranteel cual el animal perrnanece anestesiado. Los registros agu-dos, efectuados bajo anestesia, pOl' 10 general se limitan a!estuclio de las vias sensoriales, Dichos registros rara vez seacornpanan de observaciones cornportamentales, ya quela capacidad cornportamental de un animal anestesiado es,cuando men os, limitada.

Registro con microelectrodosLos agentes quimicos que afectan a las neuronas 5ero-

toninergicas y noradrenergicas tambien afectan al suerioREM. Sup6ngase que, sabiendo esto, uno se plantea S I [aactividad cle las neuronas serotoninergicas y noradre-nergicas variaria durante las diferentes fases del suefio.Para averiguarlo, se registraria la actividad de dichas neu-ronas con microelectrodos. Los microelectrodos tienen

una punta muy [ina, 10 suficientemente pequefia paraporler registrar [a actividad electrica de neuronas indivi-duales. Esta tecnica se denomina generalmente registrode neuronas individuales (0 de unidades).

Los microelectrodos se pueden fabricar con tubos devidrio muy fines. Como se via en el capitulo 2, estos electrodos pueden utilizarse para registrar los potenciales deaccion en el axon gigante del calamar. Los electrodosde vidrio tienen una propiedad interesante. Si se calientanhasta ablandarlos y se estiran sus extremos hasta que sseparan, el vidrio reblandecido se alarga y se consigue unfilamento mlly fino. Sin embargo, independientemente de

microelectrodo ELectrodo muy fino, generalmente se utiliza pararegistrar L a a ctivid ad d e neu rona s ind ividu ales.registro de neuronas individuales Registro de la actividadelectrica de una sola neurona.


160 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investiqaciori

Bobinaterrnica

los extremos

M icroelectrodo s fabricados calentando la parte central de untuba capilar alargad o d e vidrio y e stira nd o lo s e xtremo s.

10 fino que Begue a ser, sigue teniendo un orificio que 10recorre de un extremo al otro. Para construir un micro-electrode de vidrio, se calienta la zona media de un tubocapilar (vidrio de un diametro externo de aproximada-mente 1mm) y luego se estiran con fuerza'sus extremos.El tubo de vidrio se va hacienda cada vez mas delgado,hasta que se quiebra, EI resultado son dos micrcelectro-dos, que se representan en lafigura 5.tO. (Estos se obtie-nen generalmente con la ayuda de un aparato especial,llamado ti radorde microe le c trodos) . EI vidrio no conducecorriente electrica, por 10 que el microelectrodo se rellenade un Iiquido conductor, como una solucion de clorurode potasio.

Puesto que se quiere registrar la actividad de neu-ronas individuales durante un largo periodo de tiempoen animales no anestesiados, se elegiran electrodos queduren mas. Se puede conseguir un juego de cables muyfinos, unidos en un manojo. Los cablesse aislan conun barniz especial de modo que solo sus puntas quedensin recubrir. Los cables son 10 suficientemente flexiblespara poder seguir los movimientos del tejido cerebralcausados por los rnovimientos de la cabeza del animal.En consecuencia, se reduce la probabilidad de danara las neuronas cuya serial se esta registrando. Porotra parte, se puede registrar Ja actividad de variasneurcrias individuales de una region concreta delericefalo.

Los electrodos se irnplantan en el encefalo de los ani-males mediante cirugia estereotaxica, Luego se conec-tan a unos zocalos de conexi on electrica en rniniatura yestes se fijan al craneo del animal con una pasta que enun principio se ideo para uso de los dentistas [cemento

dental). Luego, cuando el animal se ha recuperado decirugia, ya se Ie puede conectar al sistema de registroLos animales de laboratorio no prestan atenci6nlos zocalos de coriexion electrica que tienen sobrecabeza y se comportan con bastante normalidad (veaslafigura 5.21).

En muchas ocasiones, los investigadoresfijan dispsitivos bastante complejos al craneodel animal cuandimplantan microelectrodos, Estos dispositivos incluyemecanismos de tomillos que permiten al experimentadordesplazar el electro do -0 el conjunto de electrodos-al interior del encefalo, de forma que pueda registradiferentes partes del encefalo mientras realiza sus obsevaciones.

Las seriales electricas que detectan los microelectrodos son bastante debiles y tienen que amplificarse. Lamplificadores utilizados con tal fin funcionan de la mismmanera que los de un equipo estereo, convirtiendo ldebiles sen ales registradas en el encefalo en otras mas fuetes. Estas senales pueden verse en un osciloscopio y almcenarse en la memoria de un ordenador para analizarlamas tarde.t Cuales son los resultados de este registro de neuronas serotoninergicas y adrenergicas? Como se estudiaren el capitulo 9, si se registra la actividad de neuronas sertoninergicas y noradrenergicas durante diferentes fases dsuefio se encontrara que la frecuencia de descargaestas neuronas decae casi hasta cero durante el suefREM. Esta observacion sugiere que dichas neuronas tinen un efecto inhibitorio sabre este tipo de suefio, Es deciel suerio RKM no puecle ocurrir hasta que estas neuronas dejan de descargar.

Z6calo de conexi6nCementa dental

G rupa de electrodos unidos permanentemente al craneomedia nte una base de cemento .


162 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investigaci6nestaba obstruyendo parte de su arteria car6tida izquierda,con 1 0 que aumentaria el aporte sanguineo al lado Izquierdodel encefalo.

El procedimiento se denomina endoarteriectomfa car6-tida. Yoestaba conversando con el neurocirujano de la Sra.F. despues de una conferencia y casualmente coment6 queiba a realizar la operaci6n mas tarde esa manana. Le pre-qunte si podia asistir y dio su consentimiento. Cuandoentre en Lasala de operaciones, con vestimentas esterili-zadas,. encontre a la Sra. F. ya anestesiada, y la enfermerahabia preparado ellado izquierdo de su cuello para Lainci-sion. Ademas, se le habian colocado varios electrodos de EEGen el cuero cabelludo y vi al Dr. 1., un neuroloqo especia-lizado en NeurofisioLogia clinica, sentado ante su aparatode EEG.

El cirujano hizo una incision en el cuello de LaSra. F.y dejo al descubierto su car-itida interna en el punta dondela car6tida comun, que procede del coraz6n, se divide enla carotida interna y Laexterna. Coloco una cinta de plas-tieo alrededor de la arteria carotida comun, pinzandola ydeteniendo el flujo de sangre. ~Que aspecto tiene, Ken?Ie pregunt6 al Dr. 1. No rnuy buena; yeo cierta lentifica-cion. Deberias hacer una derivacion,

El cirujano quito rapidamente la banda compresora yle pidio a Laenfermera una sonda de derivaci6n, un cortotuba de plastico un poco mas fino que la arteria. Hizo dospequenas incisiones en la arteria bastante por encima y pardebajo de Laregion en donde estaba la placa. e inserto Lasanda. Ahora ya podia trabajar en Ia arteria sin detener elflujo de sangre al cerebro. Hizo un corte longitudinal enla arteria, que dejo ver una masa amariUenta que seccionoy extirpo. Cerro la incision, extrajo la sonda y sutur6 lospequeiios cortes que habia hecho para colocarla. ~Vatodobien? prequnto al Dr. 1. Si, su EEGesta bien.

La mayoria de los neurocirujanos prefieren hacer unaendoarteriectomia pinzando temporalmente la arteriaocluida mientras trabajan en ella. Eltrabajo es mas rapido,y las complicaciones son menos probables. Dado que hayuna conexi6n del aporte sanguineo a cad a uno de loshemisferios del encefalo (mediante arterias comunicantesespeciales), a menudo es posible sellar una de las arteriascar6tidasdurante unos minutes sin provocar ninqun dana.Sin embargo, a veces el flujo sanguineo de un lado del ence-falo at otro no es suficiente para mantener a uno de LosLadas abastecido de sangre y oxigeno. El unico modo quetiene el cirujano de saberlo es poder disponer del EEGdel paciente. Si el cerebro no esta recibiendo el aporte

m agne toencefalografia Proced im ie~ to que detecta La actividad degrupos de neuronas que descargan sincronizadam ente, gracias alcam po maqnetico inducido por activ idad electrica de estas: em pleaun co njun to d e d ispo sitiv os su pe rco nd ucto re s d e inte rfe re nciascuanticas 0 SQUIDs .

sanguineo necesario, en el EEGse veran las caracteristicaondas lentas. Esto es 1 0 que sucedio al pinzar la arterde la Sra. F y es por 10 que el cirujano tuvo que usar unsonda de derivacion. Sin ella, Laintervenciori podria habcausado una apoplejia en Lugar de prevenirla.

Por cierto, la Sra. F. se recupero bien de la intervencion.Magnetoence/alogra/faComo si duda ellector ya sabe, cuando una corrienteelectrica fluye a traves de un conductor, induce un camp

magnetico. Esto significa que cuando los potenciales daccion se transmiten a ]0 largo de los axones 0 los potendales postsinapticos se transmiten por las dendritas 0propagan de un lado a otro de la membrana sornatica duna neurona, tambien se producen campos magneticosEstos campos son sumamente pequefios, pera los ingenieras han elaborado detectores superconductores (Ilmados SQUIDs, 0 dispositivos superconductores dinterferencias cuanticas) capaces de detectar campornagneticos que son de aproximadarnente una mil millonesima parte del tamafio del campo magnetico de la tiITa. La magnetoencefalograffa se realiza medianteneuromagnet6metros, instrumentos que contienen una matride varios SQUIDs, dispuestos de rnanera que un ordenador pueda examinar su ernision y calcular el origen dseriales determinadas en el encefalo. El neuromagneto-metro que se muestra en la Figura 5.23 contiene 27SQUIDs. Estos aparatos pueden utilizarse en la practicaclinica, por ejemplo, para localizar el foco de cris

Magnetoelectroencefalografia. El neuromagnet6metro semuestra a Laizquierda del monitor. En la parte derechade la pantalla pueden verse las regiones con elevadaactividad electrica, superpuestas a una imagen delencefalo obtenida con RM.(Cortesia de CTF S ystem s I nc .)


Registro y estimulaci6n de la actividad neural 163

A uto rrad io grafia co n 2 -D G d el encefalo d e una rata(seccion frontal, la zona dorsal se situa arriba), en la quese yen reg iones con una actividad m arcadam ente elevadaen el par de nucleus h ipotalarnicos. en La base delencefalo.(D e S ch wartz, W . J. YG a in er. H . Science, 1 97 7. J 97 . 1 08 9-1 09 1.)

epilepticas y as! poder extirparlas quirurgicamente, Tam-bien pueden usarse en experimentos para rnedir la acti-vidad cerebral regional asociada a 1a percepci6n dediversos estimulos 0 la ejecuci6n de varias conductas 0tare as cognitivas (vease lafzgura 5;23).

Regis tr o d e Laac tiv id admetab6Lica y sinaptica d el ce re broLas senales electricas no son los unicos signos de acti-

vidad neural. Si la actividad neural de una region concretadelencefalo aumenta, el indice metabolico tambien 1 0hace, en gran medida como consecuencia del mayor fun-cionamiento de las bombas ionicas de la membrana delas celulas, Este aumento del indice rnetabolico puedemedirse. El investigador inyecta2-desoxiglucosa (2-DG)radiactiva en el torrente circulatorio del animal. Dadoque esta sustancia es similar a la glucosa (la principalfuente de energia del encefalo}, es transportadaal interiorde las celulas, Asi, las celulas mas activas, que son las queconsumen mas gIucosa, llegan a ser las que alcanzan lamayor ~oncentraci6n de 2-DG radioactiva. Pero, a dife-rencia de la glucosa normal, la 2-DG no puede ser meta-bolizada, de modo que queda dentro de la celula, Luego,el investigador sacrifica al animal, extrae su encefalo, 10secciona y 10 prepara para la autorradiografia.

Autorradiografia podriatraducirse aproximada-mente como escribir con la propia radiacion, Sobre unportaobjetos se menta una seccion del encefalo. Se nevaentonces a una habitacion oscura, donde se cubre con unaemulsion fotogr.ilica (la sustancia que tienen las pelicu-

las fotograficas). Varias semanas despues, la secci6n, consu capa de emulsion, se revel a exactamente igual queuna pelicula fotografica. Las moleculas de 2-DG radioac-tiva se ponen de rnanifiesto como puntos de gr-anulosplate ados en la emulsion revelada, ya que la radioac-tividad revela Ia emulsion, tal como 1 0 harian los rayos Xo la luz.

Las zonas mas activas del encefalo contienen el mayorgrado de radioactividad; esta se manifiesta en la emulsionrevelada como puntos oscuros. En la figura 5.24 se mues-tra una autorradiografia de una secci6n del encefalode rata; los puntos oscuros en la parte inferior (sefialadoscon la flecha) son micleos del hipotalamo que tienen unindice metabolico especialmente elevado. En el capitulo9 se describen dichos nucleos y sus funciones (vease lafigura5.24). r

Otro metodo para identificar las regiones activas de Iencefalo sac a provecho de que cuando las neuronas soestimuladas (por ejemplo, por los botones terminales questablecen sinapsis con ellas), determinados genes denucleo, a los que se les llama genes de expr es i6n t ernpranason activadosy se producen proteinas especificas. Estaproteinas se unen entonces a los cromosomas del nucleoLa presencia de estas proteinas nucleates indica que laineuronas acaban de ser activadas.

Una de estas proteinas nucleares producida durantla activaci6n neural recibe el nombre de Fos. Como srecordara, antes se estaba explicando una supuesta inves-tigaci6n acerca de los circuitos neurales implicados en laconducta sexual de la rata hem bra. Supongase que sequiere utilizar el metodo Fos en Ese proyecto de investi-gacion para ver que neuron as se activan durante la acti-vidad sexual de una rata hem bra. Se instalan ratas hembracon machos y se les permite aparearse. Luego se extraeel en cefalo de las ratas, se secciona y se sigue un proce-dimiento para tefiir la proteina Fos. En la figura 5.25 sepresentan los resultados: en las neuronas de la amigdalamedial de una rata hembra que acaba de aparearse pue-den observarse puntos oscuros, 10 que indica la presen-cia de proteina Fos. As!, parece ser que estas neuronassehan activado debido a la copula ~quiza por la estimula-cion fisica de los genitales que han tenido las ratas-.Como se recordari, cuando se inyecto un marcador retro-grade' (oro fluorado) en el HVM, se encontro que esta

~ ~2-desoxiglucosa (2-D) Azucar que penetra en l as c el ul as junto conL a g L uc os a p er o que no se rnetaboliza.a uto rra dio gra fia P roc ed im ie nto q ue lo caliza su sta nc ia s rad io activ asen una secci6n de te jido ; La rad .acion revela una ernclsiorfotografica 0 un fragm ento de pelicula q ue re cu bre e l te jido .Fos Pro te ina producida en el nucleo de una neurona en respuesta ala e stim ula ci6 n s in ap tic a.


164 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investigaci6n~--~

Loc aL iz ac i6 n d e L a p ro te ln a FGs. La m ic ro fo to gra fia mue st rauna secci6n frontaL deL encefalo de una rata hembra,obtenida en un plano transversal de La amigdaLa medial.Los puntos oscuros indican Lapresencia de proteins Fos,localizada m ediante inm unocitoquim ica. L a sintesis deproteina Fos se estimul6 permitiendo al animal tener unac on du cta d e ap are am ie nto .(C ortesia d e M arc T ete l, S kidmor e C oUe ge .)

region recibe aferencias de la amigdala medial {vease Iafigura 5.25}.La actividad rnetabolica de regiones cerebrales espe-

cificas puede asirnisrno medirse en el encefalo humanoutilizando un rnetodo conocido como tomograffa poremision de positrones (TEP). En primer lugar, alpaciente se le invecta 2-DC radioactiva. (Finalmente,lasustancia se degrada y sale de las celulas, La dosis que seadministra a los pacientes hurnanos es inocua). La cabezadel sujeto se coloca en un aparato similar al de un TAC.Cuando las moleculas radiactivas de 2-DC se descom-ponen, erniten particulas subatomicas llamadas positro-nes, que son detectadas porel equipo de TEP. Elordenadordetermina cuales son las regiones del encefaloque han absorbido la sustancia radioactiva y crea una ima-gen de una seccion delencefalo, mostrando el nivel deadividad de las diferentes regiones de dicha secci6n(vease lafigura 5.26).

tomografia por em isi6n de positrones (TEP) Aplicaci6n de un ins-trumento que deja ver la localizacion de un marcador radioac tivo enun encefalo vivo.resonancia maqnetica funcional ( RMf ) I nnovac io n de lprocedimiento de la RM , que permite medir el metabolismo regionale n e l e nc efa lo .

Uno de los inconvenientes de la TEP es su coste de fun-cionarniento. POl'motivos de seguridad, las sustancias radio-activas que se adrninistran tienen una vida media muycorta; es decir, se descomponen y pierden su radioactivi-dad muy rapidamente. Por ejemplo, la vida media de 1a2-DC radioactiva es de 110minutos; la del agua radioactiva(que tambien se utiliza para obtener imageries de TEPl esde solo 2 minutos. Teniendo en cuenta que estas sustanciasse descomponen tan deprisa, tienen que ser producidas ene11ugar donde se van a utilizar, mediante un acelerador departiculas atornicas denominado ciclotron. POI'10 tanto, acoste de la TEP hay que afiadirle el del cidotron y los sala-rios del personal que trabaian en enos.

E1desarrollo m a s reciente en neuroimagen cerebral esla resonancia magnetica funcional (RMf). Los ingenie-ros 'han disefiado modificaciones de la RM ya existente que

Im agenes de T EP de un encefalo h urnano (seccioneshorizoritales). La fila superior m uestra tres irnaqenes de unapersona en estado de reposo. La fila inferior muestra tresirn aqene s @ e L amism a pe rson a m ien tras abria y cerraba elpurio derecho. En las irnaqenes se observaun aumento de Lacaptacion de 2-desoxiglucosa radioactiva en las regiones delcerebra encargadas del contro l del m ovim iento, lo queindica un aumento delindice m etab6lico en dichas areas.Los diferentes colores que genera elordenador indicandiferen te s ind ices d e captation d e 2 -DG , c on fo rm ere presen ta la e scaL a en la parte in fe rio r.(C ortesia del B roo kh ave n N atio nal L ab ora to ry y la S tate U nive rs ity deN uev a Y ork, S to ny B rook .)


Registro y estimulaci6n de la actividad neural 165----------------------------------------------------------~~--~------~------------~----~"~=~r__consiguen imagenes con gran rapidez y permiten medir elmetabolisrno regional, detectando losniveles de oxigeno enlos vasos sanguineos del encefalo, Las imageries de RM fun-cional tienen mayor resolucion que las de TEP y puedenobtenerse mucho mas rapidarnente. Por 1 0 tanto, dejanver una informaci6n mas detallada sobre la actividad deregiones cerebrales especificas (vease lafigura 5.27).

Medida d e Las se cre done s c ere braLesA veces se esta interesado, no en la actividad meta-

b6lica general de deterrninadas regiones del encefalo,sino en la secrecion de neurotransmisores 0 neuromodu-ladores especificos en esas regiones. Por ejemplo, supon-gase que se sabe que las neuronas colinergicas del troneodel encefalo participan en el control del suefio REM. (Losexperimentos que aportaron este dato se describen en laseeci6n siguiente de este capitulo). Una de las caracteris-ticas del suerio REM es la atonia muscular, la cual impideque nos levantemos de la cama y representemos nuestrosensuenos. Se decide medir la seereci6n de acetilcolina enuna regi6n del bulbo, en la que.se sabe que hay neuronassecretoras de glieina que inhiben a las matoneuronas dela rnedula espinal, Para hacer esto se utiliza un procedi-miento denominado microdiallsis.

La didlisis es un proceso mediante el cual se separansustancias utilizando' una membrana artificial permeablea algunas moleculas, pero no a otras, Una sonda de micro-dialisis consiste en un pequefio tubo de. metal que intro-duce una so1uci6n en una seccion de un tubo de dialisis--un trozo de membrana artificial moldeada en forma decilindro, sellada en el extreme inferior-- ..Otro pequeriotubo de metal extrae la so1uci6n despues de que esta haya

RM funcional de urr encefalo humano. Se observa unaumento localizado de la actividad neural en varones(izquierda) y mujeres (derecha) mientras juzgaban quepares de palabras escritas rim aban.(De Shaywitz, B, A. Y cols., Nature, 1995,373, 607-609.Reproduddo can permiso).

Se bombea el fluido a travesde una canula interna

Cementodental

Las sustancias del fluidoextracelu lar se dlfunde na travcs del tuba de dla.isls

M icrodialisis. S e adm inistra lentam ente una solucion saldiluida en el tuba de micrcdialisis, do nde capta rnoleculadel liquido extracelular que se difunden en el. Luego seanaliza el contenido del tubo.(M odificado de H erna idez. L; S tanley; B , G . Y Hoebel, B. G . LifeSciences, 1986, 39, 2629-2637). .

circulado por el tubo de dialisis. En lafigura 5.28 se mutra un esquema de este tipo de sonda.

Para implantar un tubo de microdialisis en el enfalo de la rata se utiliza cirugia estereotaxica de formala punta de la sonda se situe en la region en la cual seinteresado. Se bombea una pequeria cantidad de una scion similar alliquido extracelular hacia el tubo de dsis a traves de uno de los pequenos tubos de metaLHquido circula pOI el tubo de dialisis y pasa al seguntubo de metal, de donde se recoge para analizarlo. AJ pael liquido por el tubo de dialisis, arrastra moleculaslfquido extracelular del encefalo, las cuales son ernpudas a traves de la membrana por Ia fuerza de difusi

EI contenido del hquido que ha pasado al tubo deIisis se exarnina mediante un metoda analitico extremdarnente sensible. Este metodo es tan sensible que puedetsctar neurotransmisores (y sus produdos de degradci6n) que han side liberados par los botones terminalesse han dispersado desde el espacio sinaptico al restoliquido extracelular. De hecho, se observa que la cantid

microdialisis Procedimiento para analizar sustancias existentes ee lliq uid o in te rs tic ia l par medio de un paqusno fragmento de tubahecho de una m em brana sem iperm eable, que se im planta en elencefalo, .


166 Capitulo 5: Metodos y estrategias de investiqarion

(a) (b)

Imaqenes de TEP que muestran Ia recaptacion de L-doparadioactiva en los ganglios basales de pacientes consl n tom as de Parkinson i nducidos por una susta n cia to xic aantes y despues de que se le hiciera un trasplante deneuronas doparninerqicas fetales. (a) Imagen antes de laoperacion. (b) Im ag en o btenid a 13 meses despues de Laintervencion, El a umento de captacion d e L -d opa ind icaque el trasplante fetal estaba segregando dopam ina.(M odificad o de W idner, H ., T etrud. J., R ehncrona, 5., S now , 8., Brun-din, P., Gus ta vii, B ., B jo rk lu nd , A., Lindvall, O. y Langston, J. W. NewE ng la nd J ou rn al o f M e dic in e, 1992,327, 1556-1563. Irnaqeries repro-d ucid as co n pe rm iso ).

de acetilcolina presente en el liquido extracelular denucleos del bulbo aurnenta durante el suefio REM.

En unos cuantos casos especiales (por ejemplo,alinspeccionar las sustancias quirnicas que hay en el ence-falo de personas que han sufrido hernorragias endocra-neales 0 traumatismo craneal), se ha aplicado elprocedimiento de rnicrodialisis para estudiar el encefalohumane; pero razones eticas impiden hacerlo con finesde investigacion. Afortunadarnente, existe un modo noinvasive de medir sustancias neuroquimicas en el cerebrohumano. Pese a que la TEP es un instrumento muy caro,:tambien es muy versatil. Puede utilizarse para localizarcualquier sustancia radioactiva que emita positrones.

La figura 5.29 muestra imagenes de TEP del encefalodel Sr. B., cuyo caso se describio al principio de este capi-tulo. Se utilize un aparato estereotaxico para hacerle uninjerto de neuronas fetales secretoras de doparnina en losganglios basales. Como se vio, se obtuvo una imagen deTEP de su encefalo antes de la cirugia y poco mas de unafio despues. Se Ie inyecto L-dopa radioactiva una horaantes de cada una de las exploraciones. Como se esrudioen el capitulo 4, la L-dopa escaptada pOl'los terminales delas neuronas doparninergicas, donde se convierte en dopa-rnina; asi, la radioactividad observada en las imageriesindica la existencia de terminales que segregan dopaminaen los ganglios basales. Las imageries muestran la cantidadde radioactividad antes (parte a) y despues (parte b) de que

se le realizara el trasplante. Como puede verse, Ia cantidadde dopamina en los ganglios basales era sustancialmentemas alta despues de la cirugia (vease lafigura 5.29).

Estimulacion de La actividad neuraLBasta aqui, esta secci6n se ha dedicado a los metod o

de investigacion que miden la actividad de regiones especificas del encefalo. Pero a veces se quiere cambiar artificialmente la actividad de dichas regiones para observar quefectos tienen estos cambios en la conducta del animal. Poejemplo, las ratas hernbra copularan con machos s610sciertas hormonas sexuales femeninas estan presentes. Si sextirpan los ovaries de la rata, la perdida de esas hormonassuprimira su conducta sexual. En anteriores estuclios, eautor hallo que las lesiones del BVM alteran esta conductaTal vez si se actina el HVM se cornpensara la falta de hormonas sexuales femeninas y la rata volvera a copular,

~Como se pueden activar las neuronas? Se puedehacer mediante estimulaci6n electrica 0 quimica, La estimulaciori electrica implica simplernente pasar unacorriente electrica a traves de un cable insertado en eencefalo, como se via eri la figura 5.21.La estimulaci6n quimica por 10 general se efecnia inyectando un aminoacidoexcitatorio,como el acido cainico 0 el acido glutamico,en el encefalo. Conforme a 10 que se explico en el capitulo 4, el acido glutamico (glutal11ato) es el principal neurotransmisor excitatorio en el encefalo, y ambas sustanciasestimulan los receptores glutamatergicos, activando aSIlarieuronas en donde se localizan estos receptores.

La inyeccion de sustancias en el encefalo puedehacerse, mediante un aparato permanentemente unido acraneo, de modo que la conducta del animal pueda observarse en repetidas ocasiones. Se coloca una canula dmetal (la canula guia) en el encefalo del animal, y se fijcon cementa 8U extreme superior al craneo. Mas tardese coloca una canula mas fina de una longitud determi-nada dentro de Ia canula guia, y luego se inyecta una sustancia en el encefalo. Como el animal tiene libertad dmovimientos en su entorno, se pueden observar los efectos de la inyeccion en su conducta (vease lafigura 5.30)El principal inconveniente de la estimulacion quimicaes que es algo mas compleja que la electrica; se requierencanulas, tubos, bombas 0jeringas especiales, y solucionesesterilizadas de aminoacidos excitatorios. No obstante, tienuna clara ventaja sobre la electrica: activa los somas celulares, pero no los axones. Puesto que s610los somas celulares (y por supuesto sus dendritas] contienen receptoresglutamatergicos, se puede estar segl.lrode que la inyeccionde un aminoacido excitatorio en una determinada regiondel cerebra excira las celulas alii localizadas, pero no los axones de otras neuronas que Uegan a pasar por la region. Aspues, los efectos de la estimulacion quimica son mas circunscritos que los de la estimulaci6n electrica,


Registro y estimulaci6n de la actividad neural 161

" . _ ~ _ " E _ I p _ a _ p _ 8 _ I _ S _ 8 _ d _ 8 _ S ,P la z a. _

Registro obtenido mediante un oscil6grafo de ti nta(p oliq ra fo ).

Regis tr o c on macroe le ctr odosA veces se quiere registrar la actividad de una regi6n

global del encefalo, no la actividad de las neuronas indi-viduales que se localizan en ella. Para hacerlo se utiliza-rian macroelectrodos. Los macroelectrodos no detectanla actividad de neuronas individuales; antes bien, los regis-tros que se obtienen mediante tales dispositivos repre~sentan los potenciales postsinapticos de muchos miles -0millones- de celulas del area en que se sinia el electrode,Estos electrodos pueden consistir en alambres no afiladosinsertados en el encefalo, tomillos fijados sobre el craneoo incluso discos de metal pegados sobre el cuero cabelludode sujetos humanos can una pasta especial que conducela electricidad. Los registros, en particular los tornados delcuero cabelludo, representan la actividad de una gTancantidad de neuron as, cuyas sefiales electricas atraviesanlas meninges, .el craneo y el cuero cabelludo antes dealcanzar los electrodos.

En algunas ocasiones, los neurocirujanos implantanmacroelectrodos directamente en el interior del encefalohumano. La razon de hacerlo es detectar el origen de unaactividad electrica an6mala que origina frecuentes con-vulsiones. Una vez detectada la fuente, el cirujano puedeabrir el craneo y ex traer el foco de las convulsiones-habitualmente, tejido cicatricial producido par un dafiocerebral ocurrido afios antes->. Mas frecuentemente,la actividad electrica del encefalo humano se registramediante electrodos pegados al qlero cabelludo, y sepuede observar en un o sc i/ og r af o d e tin ta , corminmentedenominado poligrafo.

Unpolfgrafo contiene un mecanisme que hace azar una larga tira de papel sabre la que escriben una sde plumillas. Estas basicamente SODmanecillas de gdes voltimetros, que se mueven bacia arriba y abajorespuesta a la sefial electrica que les envian los ampcadores biologicos. En la figura 5.22 se representaregistro de la actividad electrica obtenido mediante maelectrodes situados en varios lugares del cuero cabellude un individuo (vease lafigura 5.22). Dichos registroHaman electroencefalogramas (EEGs), a escritos delectricidad de la cabeza. Pueden utilizarse para e1dn6stico de la epilepsia 0 de tum ores cerebrales, 0para ediar las fases de suefio y vigilia, las cualesse asociapatrones de actividad electrica caracteristicos.

Otra aplicaci6n del EEG es supervisar el estadoencefalo durante intervenciones gue, en principio, puedafiarlo. El autor presenci6 una de estas intervencionhace varios anos.

La Sra. F. sufrio un ataque cardiaco moderado ypruebas posteriores indicaron que padecia una considble ateroesclerosis, generalmente denominada endurmiento de las arteries. Muchas de sus arterias se haestrechado debido a placas ateroescler6ticas ricas en cterol. Un tromba, farmado en una parte especialmeestrecha de una de sus arterias coronarias. fue 10

' , 1 : , ' provoc6 el ataque. Tras su primer ataque, su medicprescribi6 un farrnaco que reducia Ia tendencia detrambocitos (plaquetas sanguineas) a farmar ccaqulos

Sabienda que la ateroesclerosis no se limita a las aIrias del corazon. el medico utilizo el fonendoscopio'''-, auscultarie las arterias car6tidas y, can bastante clari'J . escuch6 -especialrnente en ellado izquierdo- los caIteristicos ruidos (el terminc procede de la palabra franII bruits) que se producian cuanda la sangre pasaba porI'~strechos y endurecidos vasos sanguineos. Meses despde su ataque al corazon. la Sra. F.tuvo varios ataques is.~~.micas transitorios, breves episodios de sintomas neurI: gicos que parecen deberse a trornbos que se forman y luIse disuelven en los vases sanguineos cerebrales. E~ caso, le provocaron entumecimiento en el brazo derec

: . : 11..ificultades para hablar. Su medico la refiri6 a un ne

.. logo, quien le rnand6 hacerse un angiograma. Este reque su arteria car6tida izquierda estaba casi totalme

.. I i . . . . obstruida. It neuroloqo recomend6 a la Sra. F. quesultara al neurocirujano, y este la urgi6 a someterse a

intervenci6n quirurqica en la que se extraerfa la placa~.'macroelectrodo Electrodo que se usa para registrar La actividadtrica de una gran cantidad de neuronas en una region cleterm inadadel encefalo: m ucho m as grande que un m icioelectrodo .electroencefalogram a (EEG ) P otencial electrico cer

Métodos y Estrategias de Investigación de Carlson

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