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5/26/2018 metodos de siembra.ppt

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METODOS DE SIEMBRA


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INTRODUCCION

Para poder estudiar debidamente los microorganismos, senecesita comorequisito previo poder cultivarlos en condicionesde laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados. Paraello, se dispone previamente de muestras, que muchas vecessuelen presentar los siguientes problemas:


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*Que no exista la cantidad suficiente del microorganismo que sebusca.

* Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos,

parte ( los cuales son contaminantes, hacindose necesario suaislamiento inicialpara obtener cultivos puros.Generalmente los procesos infecciosos estn creados por unagente causal sin embargo, es fcil que puedan proliferar enesas condiciones otros microorganismos oportunistas o incluso

contaminantes. De ah que una forma de evitar estos erroressea aislarlos inicialmente y posteriormente identificarlos


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MATERIAL DE SIEMBRA O

INOCULACIONExisten los siguientes materiales: Asas de siembra Hilos de platino Asas de Digrasky Hisopos Pipetas


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MATERIAL DE SIEMBRA OINOCULACION

1. ASAS DE SIEMBRA El asa de siembra es utilizada para la inoculacin o siembra por estra en

medios slidos, por picadura en medios slidos semislidos y para la siembrade medios lquidos. Estas asas se llaman tambin de platino porque con estematerial se fabricaron por primera vez, aunque en la actualidad no se suelen

utilizar. stas han sido sustituidas por asas de acero inoxidable o cromo-nquel. Presentan un arco bastante cerrado en su extremo, cuyo dimetro esms o menos especfico es decir, muchas de las asas son calibradascorrespondiendo a un volmen determinado de siembra. Las ms utilizadasson las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.


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MATERIAL DE SIEMBRA O

INOCULACION2. HILOS DE PLATINO Son similares a las asas con la diferencia de no

presentar arco en su extremo, nicamente es un hilo.Se utiliza para la siembra por picadura en mediossemislidos o slidos.


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3. ASAS DE DIGRASKY Son asas de vidrio con forma

de tringulo ms menosabierto.

Se utilizan para extender elinoculo lquido previamenteadicionado en la placa, porejemplo, a travs de pipetaPasteur.

Se esterilizan en estufa, en

autoclave, aunquegeneralmente se puede hacermetindola en alcohol yprendiendo la llama hastaagotar el alcohol del asa.


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4. HISOPOS Se utilizan para la toma de muestras e incluso en muchos casos

llevan un medio de transporte incorporado que permitetransportar muestra sin que sta sufra ninguna desecacin,deterioro o contaminacin.

Sirve para extender la muestra a travs del hisopo en el mediocultivo. Se suele comercializar ya estril, listo para utilizar ydesechables.


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5. PIPETAS

Pueden ser de vidrio, reutilizables poresterilizacin o de plstico, generalmentedesechables.

*Pueden ser graduadas (contienen volmenesespecficos), en cuyo caso su aspiracin serealizar con aspiradores para pipetas tipo pera oprepipeta.*Pipetas Pasteur (no contienen volmenesgraduados), muy utilizadas en bacteriologa y

cuya aspiracin se realiza con chupetes de gomaque no tienen porqu ser necesariamenteestriles, aunque s la pipeta.*Micropipetas utilizadas para la siembra demililitros y microlitros en un determinado mediode cultivo.


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PREPARACIN DE INCULOS Un inoculo corresponde a una cantidad suficiente y

representativa de microorganismo problema. Se debe partir de un cultivo puro y De una concentracin adecuada de microorganismo problema.

Si la muestra no es pura se aplicarn distintos mtodos parael aislamiento mediante tcnicas especficas: Siembra por estra en placa o por agotamiento, Emplear la tcnica de la placa invertida, que en general va a

permitir el crecimiento ms o menos separado de losmicroorganismos.

Utilizar medios de cultivo enriquecidos especficos ydiferenciales que permiten el crecimiento del tipo demicroorganismo concreto que buscamos. De esta forma, unamuestra natural que en principio no es pura puede ser aislada ydesarrollada como cultivo puro.


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PREPARACIN DE INCULOS Si el problema est en la

cantidad demicroorganismo, que noes suficiente, ser

necesario preparar uninoculo con el fin deobtener una cantidadmicrobiana suficiente yrepresentativa paraobtener resultadosfiables.


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MTODOS DE PREPARACIN DE

INCULOS Si la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de

siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipeta

Pasteur estril en cantidad suficiente y, en ambos casos, sehomogeneizar posteriormente en el medio especfico de cultivo. Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un

medio lquido se homogeneizar y se dejar crecer a la temperaturaadecuada, que generalmente para microorganismos patgenos

coincidir con la temperatura corporal, dejndolos creceraproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesario la utilizacin de un

rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo elmedio lquido, aunque esto va a depender de su aplicacin posterior

y de la cantidad de inoculo que se requiera.


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INCULOS

Si la muestra se toma con asa desiembra estril y se adiciona en unmedio de cultivo slido se utilizarndiferentes tcnicas de siembra yposteriormente se verificar elcultivo; por ejemplo, siembra por

agotamiento.


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INCULOS Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y se

adiciona a un medio de cultivo lquido, se homogenizar la mezclainicial por agitacin y se dejar crecer a una temperatura adecuada

(unos 37 C) en un tiempo aproximado de 24 horas. Es importante que los inoculos sean siempre jvenes y en ocasiones

excepcionales, sobre todo, si se necesita de mucha cantidad deinoculo, se podra utilizar rotavapor.


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INCULOS

Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y sta

se aade al medio slido, posteriormente se extender con el asa deDigrasky, previamente estril a travs de toda la placa incubndose ala temperatura adecuada durante aproximadamente unas 24 horas.Se requerirn tambin cultivos jvenes.

Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina

estril o, incluso, caldo de cultivo base.


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MTODOS DE PREPARACIN DEINCULOS

A veces es necesario partir de un inoculo con unnmero aproximado de microorganismos problema.

En estos casos, los inoculos se establecen en medios

lquidos y el nmero de microorganismos se recuentade forma aproximada, por comparacin de medioslquidos con diferentes gradientes de turbidez.

ste es el caso de la escala de Mc-Farland formada poruna batera de tubos cada uno de los cuales tiene

distinta turbidez segn la concentracin de sulfatobrico. Cada tubo corresponder a una determinada

concentracin de microorganismos


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MTODOS DE INOCULACIN O SIEMBRA

(MTODOS DE AISLAMIENTO) El paso de una muestra microbiana a un medio de

cultivo, ya sea lquido o slido, se denomina siembrao inoculacin.

El paso de una muestra microbiana de un medio decultivo a otro se denomina resiembra. Toda siembra, inoculacin, o incluso resiembra, se

puede realizar de diferentes formas segn lascaractersticas de la muestra, del medio en el que sevan a sembrar o resembrar, del tipo de material quese utilice, etc. A continuacin, se explican losmtodos ms importantes de siembra o inoculacin.


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SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO LQUIDO

Si se realiza con asa de siembra, sta se carga con la muestra problemaslida o a veces lquida en condiciones de esterilidad y se adiciona al mediolquido agitndola.

Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y sevierte al medio de cultivo lquido agitndose hasta su homogenezacin.

Si se realiza con escobilln o hisopo el mtodo es igual que con el asa desiembra.


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SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO

SOLIDOEstas siembras pueden darse en placa o en tubo.

1. Siembra del inoculo en placaEstas siembras pueden darse en placa o en tubo.

A.Tcnica de BarryB. Asa de DigraskyC. Agotamiento por estraD. Tcnica de los cuatro cuadrantesE. Tcnica de los tres giros


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Tcnica de Barry

Siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello en el medio decultivo previamente fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a unatemperatura de 45 a 50 C) en tubo, se adicionar la cantidad de inculoque oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogeniza la muestra en el tubomediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en laplaca Petri estril y se dejar solidificar. La mezcla tambin se podrarealizar en la misma placa Petri, aunque la homogenizacin en este casoes ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para ladeterminacin del CMI (concentracin mnima inhibitoria) de unantibitico frente a determinados microorganismos.


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Asa de Digrasky

Siembra de muestra lquida en placa con asa de Digrasky Consiste en adicionar al medio slido un inoculo que puede

oscilar entre 0,2 y 1 mililitro segn los casos con pipetagraduada estril, y posteriormente se extiende con el asa deDigrasky tambin estril. Esta tcnica se suele utilizar para el

recuento de viables, antibiogramas, etc.


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Siembra por agotamiento oaislamiento en estra

Se tomar con el asa de siembra

(previamente esterilizado porflameado) una cantidad adecuada

de muestra problema depositando elinoculo en uno de los extremossuperiores de la placa; a partir deaqu se realizarn movimientos enzig-zag de un extremo a otro de la

placa no tomndose en ningnmomento nuevo inoculo y nolevantndose el asa hasta concluirla siembra de toda la placa.


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Siembra poragotamiento

Aislamiento en estra mltiple. Se tomar muestraproblema con asa de siembra previamente estrily dicho inoculo se depositar en el extremosuperior de la placa, extendindose de un

extremo a otro de sta, slo en la parte superior.Flameamos el asa de platino y giramosligeramente dicha placa repitiendo el procesoanterior que nos permitir arrastrar la muestradesde uno de los bordes donde qued la muestrahasta el otro extremo superior de la placa. Sevuelve de nuevo a flamear el asa de platino sin

coger muestra como en el caso anterior ysiguiendo la misma direccin se repite laoperacin hasta un total de 4 o 5 veces, que sonlas que tienen cavida aproximadamente en unaplaca, teniendo en cuenta que el ltimo tramo seefectuar hacia el interior de la misma.


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Siembra por agotamiento

Aislamiento en estra mltiple. El resultado son colonias cada vez msseparadas como consecuencia de que cada vez se va arrastrando yseparando ms la muestra. Es importante que para separar estascolonias se realice en cada estra un flameado previo del asa desiembra.


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Tcnica de los cuatrocuadrantes

Con un rotulador, por ejemplo, para vidrio, en la base de la placa(reverso) se dibujan dos lneas perpendiculares que debern cruzarse enel centro de la placa de tal forma que sta quede dividida en 4cuadrantes iguales. Se tomar con el asa de siembra estril una cantidad

de inoculo y se adicionar en el extremo superior de uno de loscuadrantes extendindose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag.Realizaremos la misma operacin sin flamear en todos los demscuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando elmicroorganismo problema, observndose en el ltimo cuadrante las

colonias ms aisladas o separadas.


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Tcnica de siembra por dilucin

Se dispondr de una batera de tubo con medio de cultivo especfico o agua estril segn los casos. Se adicionar una cantidad de muestra slida o lquida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o

inoculo que se aade en el tubo inicial. Se agitar hasta homogeneizacin. Con pipeta estril se tomar una cantidad especfica o exacta y se adicionar al segundo tubo, que se

homogeneiza. Repetimos la operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener ladilucin deseada.


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Tcnica de siembra pordilucin

Con la dilucin esperada, por ejemplo! 103 y 104, inocular en placas de cultivo una cantidadde inoculo exacto y extender con asa de Digrasky previamente estril.Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente recontar.Existen muchas variaciones de este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con

agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilucin deseada;posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.


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Siembra del inoculo en tubo

1.Siembra por estra en tubos con medio slidoinclinado.

Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameadouna cantidad de muestra adecuada. Se aade al tubo desde el fondode la superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo esutilizado para conservar cepas durante largos periodos, as como parala realizacin de ciertas pruebas bioqumicas, como, por ejemplo, laprueba de la ureasa.


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2.Siembra por picadura. Se suelen tomar con hilo de

siembra aunque en algunasocasiones tambin puede hacersecon asa de siembra. Consiste enintroducir el asa en el medio decultivo que se encuentra en el tubohasta el fondo de ste y en posicincentral. Esta tcnica se utiliza parala siembra de medios de cultivosemislidos como por ejemplo, elmedio de oxidacin fermentacinde Hugh-Leiffson.


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.Siembra por picadura Se suelen tomar con hilo de

siembra aunque en algunasocasiones tambin puede

hacerse con asa de siembra.Consiste en introducir el asa enel medio de cultivo que seencuentra en el tubo hasta elfondo de ste y en posicincentral. Esta tcnica se utilizapara la siembra de medios decultivo semislidos como porejemplo, el medio de oxidacinfermentacin de Hugh-Leiffson.


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Consiste en la utilizacin de las dos tcnicasanteriormente descritas. Este mtodo se lleva acabo cuando el medio es slido y est inclinado.Primero se realiza la siembra por picadura yposteriormente la siembra por estra; sonejemplos de este tipo de siembra la prueba enmedio KIA y la prueba en medio citrato,entreotras.

3. Siembra por picadura y estra.


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CULTIVO DE CEPAS Aunque todo lo referente a cultivos se ha estudiado

en el tema correspondiente a cultivos, sealaremosaqu que tras la preparacin de un inculo y posterior

inoculacin en el adecuado medio de cultivo serequerirn una serie de condiciones para que lasiembra pueda desarrollarse y realizar posteriormentelos oportunos estudios cualitativos y cuantitativos delmicroorganismo problema. As pues, de acuerdo con

lo dicho, todo cultivo de cepas para poder crecercomo tal, requerir de una serie de condicionesadecuadas, que sern las siguientes:


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METODO DE SIEMBRA EN PLACA POR

ESTRIA CULTIVOS PUROS Se esteriliza el asa y luego se

extrae con ella un inculo del tubo. Se hace estrias en la placa

extendiendo los microorganismos. El asa se vuelve a esterilizar entre

distintas operaciones.

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