Métodos de estudio en histología
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MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA
M.C.D. Ma. De Lourdes Urquizo RuvalcabaEsp. Patología y Medicina Bucal
MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA
HISTOLOGÍA Estudia la microanatomía de las células, los tejidos y
los órganos y correlaciona su función.
HISTOTECNOLOGÍA Conjunto de técnicas que se llevan acabo para la
preservación y preparación de los tejidos y células, para su estudio con microscopio de luz y sus variantes
MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA
OBJETIVOS DE LA HISTOTECNOLOGÍA
Preservación optima y funcional de los diferentes materiales tisularesy celulares que llegan al laboratorio.
Conocer los principios de las técnicas rutinarias y especiales, así como sus indicaciones precisas para el estudio de los tejidos
TÉCNICA HISTOLÓGICA
Comprende la preparación de tejidos para su estudio microscópico.
Se logra sometiéndolos a una serie de procesos: Obtención del tejido a estudiar Fijación Deshidratación Aclaramiento Inclusión Corte Montaje Observación (Diagnóstico)
TÉCNICA HISTOLÓGICA
OBTENCIÓN DEL TEJIDO A ESTUDIAR BIOPSIAS
Incisional Excisional
NECROPSIA O AUTOPSIA CITOLOGÍA EXFOLIATIVA FROTIS
TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJACIÓN
Se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias finalidades:
Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc.
Conserva la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo (citoarquitectura y ultraestructura)
Aumenta la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.
Y permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima
TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN FIJADOR
Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan autólisis, desintegración, etc.)
Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas.
Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo
TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN FIJADOR
Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.)
No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales
No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
TÉCNICA HISTOLÓGICA:¿Cómo actúan los fijadores?
Varía con la composición o naturaleza Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas
(alcohol, ácido pícrico, yodo, calor)
Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favorece la coloración ulterior de los tejidos.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
Son los más utilizados Pueden ser: Fijadores simples
constituidos por una sola sustancia química
Fijadores compuestos cuando varias fijadores simples intervienen en su
constitución racionalmente elegidos con el fin de completar la
acción de cada uno de ellos o atenuar sus efectos
TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES SIMPLES Formol al 10%
e s e l m á s us a d o . Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando
enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula.
Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
Alcohol etílico absoluto o de 96% Se usa generalmente en microquímica. Preserva el glucógeno. Causa distorsión del detalle nuclear y comprime el
citoplasma.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES SIMPLES Alcohol metílico.
Se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.)
Ácido ósmico al 1 ó 2% Es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien
estructuras celulares.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES SIMPLES Bicromato de potasio al 3-5%.
Fija el citoplasma y no se precipita. Nunca se usa solo. Después de la fijación loes especímenes deben ser
lavados exhaustivamente para remover el oxido que se forma
TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES COMPUESTOS Líquido de Fleming, m e z c la c ro m o -o s m io -
a c é tic a . Líquido de Zenker, m e z c la bic ro m a to -s ublim a d o -
a c é tic a . Líquido de Helly, m e z c la Ze nke r-fo rm o l. Líquido de Bouin, m e z c la p ic ro -fo rm o s -a c é tic a . Liquido de Duboscq-Brasil, o Bo uina lc o hó lic o
TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES FÍSICOS
Desecación. Calor seco.
Coagulación de las proteínas No es buena ya que las células se destruyen.
Calor húmedo. Frío y Congelación .
Se congela el tejido con dióxido de carbono o N liquido
Es mejor que el calor pero se pueden formar cristales.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
I. FIJACIÓN Fijación en formol al 10% (1 parte
de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.
II. DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y CORTE
Se describe forma, color, textura, superficie, consistencia al corte y se mide.
Se le da el tamaño deseado a la pieza
Enjuaga durante 15 min.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
III. DESHIDRATACIÓN Debido a que una gran parte del tejido está constituida por
agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante.
Se debe deshidratar el tejido, ya que la parafina nos es hidrosoluble
Alcohol 70º, 1h30'. Alcohol 96º, 1h30'. Alcohol 100º (l), 1h30'. Alcohol 100º (ll), 1h30'. Toluol O Xilol , entre 1h30' y 3hs. (Aclaramiento)
NOTA: si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
ACLARAMIENTO Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una
sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión (PARAFINA) a utilizar.
Se sustituye el alcohol por un líquido intermediario normalmente el hidrocarburo bencénico (xilol, benceno, toluol).
Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción.
Nota: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
IV. INCLUSIÓN A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos
para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. gelatina y parafina.
El objeto de la inclusión es: Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la
matriz extracelular. Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y
corte. La parafina penetra en los vasos, en los espacios
intercelulares y en el interior de las células embebiendo el tejido y haciendo más fácil la obtención de cortes en el microtomo.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
IV. INCLUSIÓN Infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en
estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido.
1.Secado de la muestra con gasa.
2) Parafina 56º (l), 1h30'.
3) Parafina 56º (ll), 1h30'.
4) Formación de la barra.
5) 30' de frezzer.
6) Fractura del taco
NOTA: Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios anteriormente ocupados por el son ahora ocupados por la parafina
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
V. CORTE El taco ahora se puede cortar en secciones lo
suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz.
La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros (5μ)
MICROTOMO.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIÓN Y MONTAJE Los cortes todavía no son aptos para su examen con el
microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña cantidad de Albúmina, la cual actúa como adhesivo.
La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% y agua.
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIÓN Y MONTAJE Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y
la EOSINA. Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera
que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar).
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
VI. COLORACIÓN Y MONTAJE 1.Xilol o toluol(I), 15' en estufa. 2. Xilol o toluol(II), 2'. 3. Alcohol 100º, 30". 4. Alcohol 96º, 30". 5. Alcohol 70º, 30". 6. Alcohol 50º, 30". 7.Agua destilada, 30". 8. Hematoxilina, 1´30". 9. Agua corriente, 2´. 10. Alcohol 50º, 15". 11. Eosina, 30". 12. Alcohol 96º, 10". 13. Alcohol 100º, 10". 14. Xilol, 1´ por lo menos. 15. Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.
VI. COLORACIÓN Y MONTAJE
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases: Colorantes que diferencian los componentes
ácidos y básicos de la célula. Colorantes especializados que distinguen los
componentes fibrosos de la matriz extracelular.
Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos
HEMATOXILINA Y EOSINA
Tinción PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff)
Es uno de los métodos químicos más empleados en histología. Tiñe carbohidratos y macromoléculas ricas en carbohidratos. Se usa para detectar :
glucógeno en las células Moco en diversos tipos celulares Membrana basal subyacente a los epitelios Fibras reticulares del tejido conectivo
Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos adyacentes, cada uno con un grupo hidroxilo
El ac, peryódico rompe la unión entre estos átomos de carbono adyacentes y forma grupos aldehído.
Estos aldehídos reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color púrpura intenso (rojo luminoso)
Tinción PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff)
Tinción PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff)
Tricromico de Masson
Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. Se observan tres colores distintos:
Núcleos: Negro Músculo, citoplasma y queratina: rojo Colágeno: azul o verde
COLORACION DE WRIGHT
TEJIDO CONECTIVO LÍQUIDO: SANGRE
NEGRO SUDÁN
Los colorantes Sudán tiñen fuertemente los TRIGLICÉRIDOS, como por ejemplo:
Rojo de sudán o sudán III, en la coloración de células adiposas.
El negro de sudán o sudán IV, se emplea en la coloración de las vainas mielínicas de las fibras nerviosas compuestas por lipoproteínas.
TINCION ARGÉNTICA
TÉCNICA HISTOLÓGICA: INMUNICITOQUÍMICA
INMUNICITOQUÍMICA DIRECTA
INMUNICITOQUÍMICA INDIRECTA
AUTORRADIOGRAFIA
CRIOFRACTURA
CRIOFRACTURA
TÉCNICA HISTOLÓGICAVII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)
TÉCNICA HISTOLÓGICAVII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)
TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL
VII. OBSERVACIÓN (DIAGNÓSTICO) MICROSCOPIO