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REDVET. Revista electrónica de Veterinaria 1695-7504 2010 Volumen 11 Número 10

Métodos de estudio de la reproducción en hembras de ungulados silvestres http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101010/101009.pdf

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REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet -http://revista.veterinaria.org Vol. 11, Nº 10, Octubre/2010– http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101010.html

Métodos de estudio de la reproducción en hembras de ungulados silvestres - Research methods in female wild ungulates reproduction

Riveros F., José Luis. Dr. Médico Veterinario, PhD. Laboratorio de Biotecnología Animal Instituto de Investigaciones Agropecuarias INIA-Carillanca

Contacto: [email protected]

Resumen

El presente trabajo tiene por objetivo describir el estado actual y proyecciones de las técnicas de estudio de la reproducción en hembras de ungulados silvestres. Inicialmente se caracteriza su estrategia reproductiva y las limitaciones en el conocimiento de su fisiología, dadas por las dificultades en la aplicación de las técnicas utilizadas en especies domésticas. Posteriormente, se describen las técnicas de estudio más utilizadas en ungulados silvestres, comenzando con estudios etológicos, que permiten caracterizar la estación reproductiva mediante la observación de frecuencias de cortejo, monta y partos. A continuación, se presentan las limitaciones de la determinación de hormonas sexuales en sangre, en ungulados silvestres, fundamento para el desarrollo de las técnicas no invasivas. Se caracterizan los fundamentos y aplicaciones, del análisis de esteroides sexuales en orina, fecas, leche, saliva y pelo. Finalmente se caracteriza la técnica ecográfica y sus aplicaciones. Concluyendo con las proyecciones de cada una de las técnicas de estudio, orientadas a facilitar el manejo reproductivo en estas especies.

Palabras clave: Reproducción | ungulados silvestres | hembra | hormonas sexuales | ultrasonido.



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Abstract

The present review is focused on the recent advances and perspectives on female ungulates reproduction research techniques. First the reproductive strategy and the reproduction knowledge limitation given by application difficulties of techniques used in domestic species are characterized. Second the mean methods for studies on reproductive morphology and physiology are described beginning with behavior studies that allow reproductive season characterization by the observation of courtship, mate and birth frequencies. Thereby blood sexual hormone measurement difficulties are described in wild ungulates foundation of noninvasive techniques development. The sexual steroid measurement foundations and applications are characterized in urine, feces, milk, saliva and hair. Then the mean application of ultrasound in reproductive technique is characterized. Finally facilities and limitations of each method are discussed concluding ungulates studies perspectives oriented to give the baselines to reproductive management of wild species to conservation or productive programs.

Keywords: Reproduction | wild ungulates | female | sexual hormones | ultrasound.

INTRODUCCIÓN

Los ungulados son un importante grupo de mamíferos, perteneciente a la subclase Eutheria o placentados. Presentan como característica principal, poseer a lo menos un dedo cubierto por una pezuña como la estructura más distal del esqueleto apendicular. Está compuesta por cuatro órdenes: Artiodactyla, Perissodactyla, Proboscidea e Hiracoidea, 14 familias, 90 géneros y 211 especies (1). Poseen un amplio rango de variación en su masa corporal, desde el pilandoc Indio (T. meminna) con aproximadamente 1,5 kg de peso vivo, al elefante africano (L. africana) con más de 2,5 ton. Estableciéndose que especies de mayor tamaño, presentan gestaciones más largas y menor tasa de crecimiento corporal que las especies de menor masa corporal (Tabla 1). Los ungulados que presentan dimorfismo sexual, viven en grupos separados de machos y hembras durante el año, comportamiento denominado segregación sexual. Conjuntamente, se han descrito marcadas diferencias en el tamaño y número de individuos por camada. Se ha relacionado que, especies territoriales que habitan en ambientes protegidos, paren camadas múltiples de neonatos crípticos y presentan una estrategia de supervivencia



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basada en la evasión de la predación. En contraste, los ungulados sociales que habitan espacios abiertos paren crías con un grado de desarrollo tal que son capaces de seguir a su madre a las pocas horas de nacido (2). Por otro lado, el medio ambiente incide directamente, a lo largo del año, sobre la actividad reproductiva. Ésta se encuentra condicionada por factores tales como el fotoperíodo, la latitud, la temperatura, la disponibilidad de alimento, las relaciones sociales y la densidad poblacional. Diferentes estudios en rumiantes silvestres han puesto de manifiesto que esta influencia ha conducido, al desarrollo de estrategias reproductivas, encaminadas a condicionar la época de partos a la estación del año, que presente las condiciones ambientales más favorables para el crecimiento y desarrollo de las crías. De este modo, los periodos de actividad reproductiva y de anestro estacional en las distintas especies de ungulados están relacionados con la duración de la gestación, ajustándose el inicio de la actividad ovulatoria a épocas del año que permitan la parición en primavera. Así, animales con gestaciones largas, como las familias Camelidae, Equidae, Elephantidae, Giraffidae, Rhinocerotidae, Tapiridae, Hippopotamidae comienzan su actividad reproductiva durante los días largos de primavera, mientras aquellos con gestaciones más reducidas, como las familias Cervidae, Suidae, Tragulidae, presentan el inicio de su actividad ovulatoria en los días cortos del otoño (3). Un caso particular, lo representa el corzo (C. capreolus), familia Antilocapridae, cuya característica reproductiva principal radica en su carácter monoéstrico, iniciando su actividad reproductiva en los días largos, siendo el único artiodáctilo que utiliza la implantación retardada (diapausa embrionaria) como estrategia reproductiva (4). El conocimiento y manipulación acabado de la biología reproductiva, en las especies silvestres, dista mucho de los resultados obtenidos durante las últimas décadas en las especies domésticas. Las dificultades inherentes del manejo de las especies silvestres, así como el grado variable de estrés desencadenado por éste, acentuada por el escaso desarrollo de infraestructuras adecuadas, han generado el desarrollo de técnicas de estudio principalmente no invasivas, tales como caracterizaciones etológicas, determinación de hormonas y metabolitos hormonales en excretas y pelo, hasta técnicas más invasivas como la ecografía (5).



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Tabla 1: Estrategia reproductiva según especie: Masa corporal de hembra y camada (kg). Período de gestación (días). Tamaño de camada. Tipo de encaste 1: monógamo 2: polígamo. Grado de precocidad del neonato: 1: subdesarrollado 2: desarrollado capaz de seguir a la madre post parto. Tipo de sociedad 1: solitario 2: gregario. Tipo de dieta 1: pastoreador 2: ramoneador. (Modificado de Saether y Gordon, 1994).

Familia

Género especie

M. corporal hembra

(kg)

M. corporal neonato

(kg)

P. de gestación

(días)

T. de

camada

T. de

encaste

G. de

precocidad

Tipo de

sociedad

Tipo de

dieta Antilocapridae A. americana 41,0 2,8 235,0 2,0 2 1 2 2 Bovidae A. Lervia 74,0 3,2 158,0 1,6 2 2 2 1 Bovidae A. marsupialis 26,0 4,0 170,0 1,0 2 1 1 1 Bovidae A. melampus 38,0 4,8 197,0 1,0 2 1 1 2 Bovidae C. bies 53,0 2,4 154,0 1,8 2 1 2 1 Bovidae C. taurinus 164,0 16,8 247,0 1,0 2 2 2 1 Bovidae C.hircus 60,0 2,2 156,0 2,0 2 1 2 2 Bovidae D. dorcas 67,0 6,9 229,0 1,0 2 2 1 1 Bovidae K. defassa 177,0 13,8 270,0 1,0 2 1 1 1 Bovidae K. ellipsiprymnus 178,0 13,0 264,0 1,0 2 1 1 1 Bovidae M. kirki 5,0 0,68 171,0 1,0 1 1 1 2 Bovidae O. aries 50,0 3,0 146,0 2,0 2 2 2 1 Bovidae O. canadensis 71,0 4,1 178,0 1,4 2 1 2 1 Bovidae O. dalli 65,0 3,48 - 1,1 2 - 2 1 Bovidae O. moschatus 258,0 10,1 245,0 1,0 2 2 2 1 Bovidae R. fulvorufula 31,0 2,7 236,0 1,0 2 1 1 1 Bovidae S. caffer 517,0 40,8 332,0 1,0 2 2 2 1 Bovidae S. grimmia 19,0 1,66 176,0 1,1 1 1 1 2 Bovidae S. tatarica 29,0 3,2 149,0 1,8 2 - 2 2 Bovidae T. imberbes 49,0 6,5 222,0 1,0 2 1 2 2 Bovidae T. oryx 525,0 30,4 265,0 1,0 2 1 2 2 Bovidae T. scriptum 29,0 3,8 183,0 1,0 2 1 1 2 Camelidae L. guanicoe 95,0 12,0 350,0 1,0 2 2 2 1 Camelidae V. vicugna 43,0 5,6 315,0 1,0 2 - 1 1 Cervidae A. alces 330,0 13,1 239,0 1,4 2 1 2 2 Cervidae A. axis 55,0 4,0 221,0 1,0 2 1 2 1 Cervidae C. canadensis 230,0 16,4 255,0 1,0 2 1 2 1 Cervidae C. capreolus 22,0 1,45 292,0 2,0 2 1 1 2 Cervidae C. duvauceli 143,0 - 248,0 1,0 2 - - 1 Cervidae C. elaphus 102,0 6,2 233,0 1,0 2 1 2 1 Cervidae C. eldi 73,0 4,9 231,0 1,0 - - - 1 Cervidae C. nipón 53,0 2,25 222,0 1,0 2 1 2 1 Cervidae C. unicolor 171,0 9,4 243,0 1,0 - - - 1 Cervidae D. dama 39,0 4,6 234,0 1,0 2 1 1 1 Cervidae E. davidianus 149,0 11,5 264,0 1,0 2 1 2 1 Cervidae H. inermes 14,0 - 182,0 3,4 2 - - 1 Cervidae M. americana 23,0 0,55 224,0 1,0 - - - 2 Cervidae M. gouazoubira 17,0 1,3 206,0 1,0 - - - 2 Cervidae M. moschiferus 13,0 - 165,0 1,5 2 1 1 2 Cervidae M. muntjak 14,0 1,26 206,0 1,0 2 1 1 2 Cervidae M. revéis 12,0 1,00 214,0 1,0 2 1 1 2 Cervidae O. hemionus 54,0 3,4 204,0 2,0 2 1 2 2 Cervidae O. virginianus 57,0 3,2 203,0 2,0 2 1 2 2 Cervidae P. pudu 8,0 0,5 210,0 1,1 - - - 2 Cervidae R. tarandus 96,0 4,95 224,0 1,0 2 2 2 1 Cervidae T. javanicus 3,3 0,37 142,0 1,5 - 1 1 2 Giraffidae G. camelopardis 850,0 93,0 - 1,0 2 2 2 2 Hipoppotamidae H. amphibius 1415,0 42,5 236,0 1,0 2 2 1 1 Paquidermae L. africana 2770,0 115,0 656,0 1,0 2 2 2 1 Rhinocerontediae C. simum 1600 40 507,0 1,0 1 2 1 1 Rhinocerontediae D. bicornis 1100,0 40,0 455,0 1,0 1 2 1 1 Suidae P. aethiopicus 59,0 0,77 172,0 4,0 1 2 2 1 Suidae P. porcus 37,0 0,76 125,0 5,0 2 2 2 2 Suidae S. scrofa 147,0 2,3 117,0 4,4 2 - 2 2 Tragulidae T. meminna 1,5 - 120,0 2,0 - 1 1 2 Tragulidae T. Napu 5,9 9,36 158,0 1,0 - - - -



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ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA Estudios etológicos.

Los ungulados silvestres se caracterizan, en general, por una marcada disgregación sexual durante el periodo de anestro estacional, siendo la formación de grupos mixtos la principal característica conductual que define el comienzo del periodo reproductivo en estado silvestre. Durante el periodo reproductivo, se han descrito distintas fases graduales y definidas, correspondientes a los periodos: pre-estral, donde los machos se integran a los grupos matriarcales, observándose los primeros comportamientos de lucha entre machos; estral, donde se registra la máxima frecuencia de cópulas y post estral, correspondiente al término del período reproductivo y caracterizado por cópulas esporádicas (6). Para la determinación de cada una de estas fases se han determinado los siguientes patrones de comportamiento: a) Cortejo de los machos: olfateo del periné, persecución de la hembra y reflejo de Flehmen, b) Comportamiento agonístico de machos: grado variable de agresión entre ellos, que genera jerarquización de acceso a las cópulas y c) Respuesta de las hembras al cortejo: caracterizada por inmovilidad ante el macho, consecuencia del estado estral (7). La caracterización de la época de parición es otro dato importante en los estudios de campo, que permite estimar de forma indirecta el periodo de actividad reproductiva de una población. Conociendo la fecha media del periodo estral (frecuencia de cópulas), es posible estimar la longitud de la gestación a través de la determinación de la fecha media de partos (8). Una serie de métodos han sido propuestos para la estimación de la fecha media de partos, siendo el método del porcentaje de partos acumulados, el más utilizado (9). Este método consiste en estimar el número de partos ocurridos previos a la fecha del estudio y se expresa como porcentaje del número total de partos de toda la temporada. De este modo, la proporción de partos acontecidos previo a la fecha de observación es equivalente al número de hembras lactantes observadas, mientras que la proporción de partos ocurridos posterior a esta fecha, corresponde al número de hembras gestantes detectadas. Esta metodología ofrece como ventaja principal, el permitir periodos de muestreo discontinuos y con intervalos variables. Adicionalmente, es posible comenzar el estudio ya iniciada la estación de partos y dar término al mismo, antes de la finalización de la misma. Lo anterior se fundamenta en la característica de la metodología, que permite trabajar con datos acumulados, entregando de este modo el grado de avance de la temporada en estudio (10).



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Medición de hormonas sexuales en sangre.

Hormonas glicoproteicas.

La aplicación de distintas técnicas utilizadas con éxito en ungulados domésticos, con el objetivo de caracterizar fisiológicamente las conductas reproductivas observadas en condiciones silvestres, ha presentado serias limitaciones en ungulados silvestres. La determinación de hormonas glicoproteicas, como la hormona luteinizante (LH) y la hormona folículo estimulante (FSH), son de gran interés en la explicación de fenómenos asociados con la estación sexual y la pubertad. Sin embargo su aplicación en especies silvestres, es más limitada en comparación con las hormonas esteroidales, debido principalmente a la característica pulsátil de su secreción, lo cual hace necesario una alta frecuencia de muestreo sanguíneo, convirtiéndolo en inviable en muchas condiciones experimentales o en especies de difícil manipulación (11).

Hormonas esteroidales.

La determinación de las concentraciones sanguíneas de estrógenos y progestágenos, se basa en la similitud del patrón de secreción y estructura de los esteroides entre las distintas especies, lo cual ha permitido el desarrollo y aplicación de las técnicas de radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis (ELISA) (12). Es así como, el análisis de las variaciones en sus concentraciones plasmáticas ha permitido, principalmente en ungulados domésticos y en algunas especies silvestres, relacionarlas con: el comienzo y término de la estación reproductiva, el inicio de la pubertad, el estro, anestro, gestación y puerperio (13). De este modo se ha caracterizado: el ciclo estral y la gestación en el ciervo rojo (C. elaphus) (14); la estacionalidad y la gestación en el corzo (C. capreolus) (15,16); el ciclo estral, la estacionalidad y la gestación en el ciervo de cola blanca (O. virginianus) (17,18,19); el ciclo estral y la estacionalidad en el gamo (D. dama) (20); y el ciclo estral y la estacionalidad en el muflón (O. musimon) (12,13). Sin embargo, en ungulados silvestres este método ha presentado limitaciones en su aplicación, relacionadas con la contención del animal durante la obtención de la muestra. Este hecho cobra mayor relevancia en cérvidos, donde se ha descrito que como consecuencia del estrés, se desencadena un alza significativa en las concentraciones de progesterona plasmática de origen adrenal, lo cual puede generar no sólo distorsión en los resultados, sino también detrimento en el bienestar del animal (11).



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Medición de hormonas sexuales en otros fluidos y tejidos.

La dificultad que representa, en ungulados silvestres, el manejo periódico de necesario en evaluaciones hormonales sanguíneas, ha generado el desarrollo de técnicas para la determinación de esteroides urinarios y fecales como métodos no invasivos (21,22). A pesar que péptidos, proteínas y hormonas glicoproteicas son componentes elementales en los diferentes procesos reproductivos, y son excretados como metabolitos reconocibles, la especificidad en cada estructura proteica (secuencias aminoacídicas) entre las distintas especies, ha limitado su aplicación con los métodos analíticos existentes (11). No obstante, en algunos ensayos se han determinado restos bioactivos de hormonas glicoproteicas, tales como la LH y la FSH, sin embargo, la complejidad del método, ha limitado su aplicación en evaluaciones de rutina. De este modo, la mayoría de los trabajos han focalizado sus objetivos en el análisis de los metabolitos de hormonas esteroidales (11).

Esteroides sexuales en orina.

Los primeros métodos no invasivos, fueron desarrollados para la determinación de estrógenos en muestras urinarias. Estás concentraciones presentan un retraso en relación a su expresión circulatoria, lo cual quedó demostrado en ensayos realizados en équidos, óvidos y suidos domésticos, donde se describe que la presencia de esteroides en circulación y su aparición en orina es menor a 5 horas (23). Las primeras técnicas para el análisis de muestras de orina utilizaron anticuerpos contra estradiol y estrona, determinándose “estrógenos totales” (24). En consecuencia, fue necesaria la hidrolización de la muestra previo al análisis (24), ya que la mayoría de los estrógenos presentes en la orina se encuentran en la forma conjugada (25,26,27). Posteriormente, la disponibilidad de anticuerpos específicos para las formas conjugadas de los esteroides urinarios, representa el mayor avance en la analítica de sus metabolitos. Esto permite una simplificación metodológica, así como un incremento de la sensibilidad del análisis. Adicionalmente, la hidrosolubilidad característica de estos metabolitos, sumado a sus altas concentraciones urinarias, hace posible una gran dilución de la muestra inicial para su análisis, facilitando la aplicación de diversas técnicas, como ELISA, Inmunofluorescencia y RIA (11).



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En la mayoría de las especies silvestres, el sulfato y/o glucuronato de estrona es el metabolito de estradiol más frecuente en orina (25,26,27) y el pregnandiol-3α-glucuronido en el caso de progesterona. Sin embargo, aunque la determinación de pregnandiol-3α-glucuronido ha sido utilizada para el estudio de la función ovárica en diferentes especies de artiodáctilos, su uso no es aplicable a la mayoría de los perisodáctilos en los que la excreción de este metabolito es escasa o nula (11,28). El análisis de los metabolitos urinarios ha hecho posible el monitoreo de la actividad ovárica en relación al desarrollo folicular, ovulación y función luteal, pudiéndose utilizar para evaluar el normal desarrollo de la función ovárica (11). Particularmente, el ciclo ovárico se caracteriza por un incremento gradual de los conjugados de estrona, alcanzando la máxima concentración justo antes de la ovulación. La concentración de pregnandiol-3α-glucuronido comienza a incrementarse previo a la disminución de los conjugados de estrona, manteniéndose elevados como reflejo de la formación de un cuerpo lúteo activo. Adicionalmente, se ha descrito el uso de anticuerpos con reacciones cruzadas con una serie de metabolitos de progesterona, como una alternativa para el estudio de la función luteal y la gestación (11). De este modo, la determinación de los patrones de excreción de conjugados urinarios de estrona, así como de pregnandiol-3α-glucuronido mediante RIA ha facilitado establecer, el ciclo reproductivo de diferentes especies, tales como el oryx (O. dammah), bongo (T. euryceros), okapi (O. johnstoni), jirafa (G. camelopardalis) (22,26,29). Específicamente, la excreción de este metabolito, en el ciervo de Eld (C. eldii), ha permitido contrastar su concentración con las de progesterona plasmática, utilizándose como un indicador de gestación. Adicionalmente, este metabolito, medido en forma simultánea y periódica con conjugados de estrona, ha hecho posible monitorear la gestación y predecir la fecha probable de parto (21). A modo de resumen, los metabolitos esteroidales urinarios más comúnmente usados han sido: pregnandiol-3α-glucuronido, 20α- dihidroprogesterona, 5 β-pregnantriol y conjugados de estrona (estrona-sulfato, estrona-glucuronido) (Tabla 2). Las principales dificultades de la determinación de metabolitos esteroidales en orina, radican en que la entrega de la muestra por parte del animal requiere entrenamiento, y que tanto los volúmenes, como horarios de obtención de la muestra, son difíciles de reproducir en largos períodos de estudio.



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Tabla 2: Principales metabolitos estudiados en ungulados según familia. Familia Género especie Metabolito Vía de excreción Referencia Cervidae

Ciervo Eld Cervus eldii

Estrona, pregnandiol-3α-glucuronido, pregnandiol

Urinario

46

Bovidae

Orix Oryx dammah

Estrógeno

Urinario

49

Elephantidae

Elefante asiático Elephas maximus

Elefante africano Loxodonta africana

Progesterona y 5α pregnano

Urinario

114

Giraffidae

Okapi Okapia johnstoni

Estrógeno

Urinario

61

Bovidae

Toro de Bali Bos jauanicus

Buey almizclero Ovibos moschatus

Antílope sable Hippotragus equinus

Pregnano 5α y 5β-reducidos

Pregnano 5α-y 5β-reducidos

Estrógeno

Fecal

56

56

77

Camelidae

Vicuña Vicugna vicugna

20-oxo- y 20α- progestágenos

Fecal

65

Cervidae

Alce Alces alces

Caribou Rangifer tarandus

Preengano 5α y 5β-reducidos


Fecal

56

Elephantidae

Elefante africano Loxodonta africana


Progestinas

Fecal

56

114 Equidae

Caballo de Przewalski Equus przewalskis

Cebra de Grevy Equus grevyi


Estrógeno

Fecal

56

58 Giraffidae

Jirafa Giraffa camelopardalis

Okapi Okapia johnstoni

Pregnano


Fecal

36

56

Hippopotamidae

Hipopótamo Hippopotamus amphibius

Estrógeno

Fecal

77

Rhinocerotidae

Rinoceronte de la India Rhinoceros unicornis

Rinoceronte negro Diceros bicornis

Rinoceronte blanco Ceratotherium simum

Rinoceronte blanco Ceratotherium simum

Rinoceronte de la India Rhinoceros unicornis Rinoceronte de sumatra Dicerorhinus sumatrensis

Pregnandiol y estrógenos totales


Pregnanos con grupo 20-diol

Androstano, pregnano, estrógeno, 17-oxo-androstano y 20-oxo-pregnano

Fecal

39

56

71

76

Tapiridae

Tapír Tapirus indicus

Estrógeno

Fecal

77

Las principales dificultades de la determinación de metabolitos esteroidales en orina, radican en que la entrega de la muestra por parte del animal requiere entrenamiento, y que tanto los volúmenes, como horarios de obtención de la muestra, son difíciles de reproducir en largos períodos de estudio.



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Esteroides sexuales en fecas.

Los primeros estudios, a través de la administración endovenosa de hormonas esteroidales marcadas radio-activamente, demostraron que la excreción a través de las heces era tan importante como por la orina. Esta caracterización, permitió determinar que la eliminación de esteroides, es principalmente de origen biliar, y secundariamente y en una pequeña proporción desde el intestino grueso (11). Estos estudios indicaron que los estrógenos fecales están conformados principalmente de 17α estradiol, 17β estradiol y estrona. En contraste, la progesterona es extensamente metabolizada previa a su excreción fecal, siendo eliminada en una serie de metabolitos fecales de 5α y 5 β pregnanos (pregnanedionas y pregnanos mono y dihidroxilados) (30). Los primeros reportes de análisis de esteroides en fecas, se describen para la determinación de estrógenos, en mujeres gestantes en el año 1976 (31), posteriormente la técnica es aplicada en aves monomórficas para la determinación de esteroides sexuales en 1978 (32), y sólo en 1984 se describe su aplicación en ungulados domésticos (33). Entre los inconvenientes que supone la detección de metabolitos de esteroides en fecas, están los cambios en la dieta y las fluctuaciones del contenido hídrico de las fecas, lo cual puede incidir en la concentración de los esteroides fecales. Surge entonces la necesidad de contar con algún referente de excreción como lo es la creatinina en orina (30). En base a lo anterior se llevan a cabo estudios, los cuales concluyen que en la mayoría de las especies, esta variación es mínima no siendo necesario un parámetro referencial en fecas (30). La ruta de excreción hormonal varía considerablemente entre especies, al igual que entre los distintos esteroides en la misma especie. La aparición de metabolitos fecales demanda un lapso mayor que la excreción vía urinaria, que se relaciona con el tiempo necesario de tránsito de la bilis entre el intestino delgado y el recto. Este período varía entre 12 a 24 horas en rumiantes y alrededor de 24 a 48 horas en animales fermentadores cecales, como elefantes, équidos, rinocerontes y suidos (33). Los estudios sobre determinación de estrógenos fecales, se han llevado a cabo utilizando anticuerpos específicos para: estrona no conjugada, 17α estradiol no conjugado y 17β estradiol no conjugado, o con anticuerpos contra estrógenos totales no conjugados. Estos métodos han demostrado ser efectivos en el diagnóstico de gestación en aquellas especies donde la unidad feto-placentaria es la fuente de grandes concentraciones de



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estrógenos: artiodáctilos domésticos (34) y équidos (35,36). En ungulados silvestres, el análisis de estrógenos fecales ha sido utilizado en el diagnóstico de gestación en búfalo rojo (S. caffer), yak (B. mutus), cebra (E. grevyi) (37), buey almizclero (O. moschatus) (38), caribou (R. tarandus) (39), gacela (G. dama) y tapir Malayo (T. indicus) (40). Sin embargo, la determinación de estrógenos fecales para el diagnóstico de gestación, ha demostrado menor efectividad en alce (A. alces) (41), y absoluta ineficacia en el hipopótamo (H. amphibius) (37), rinoceronte negro (D. bicornis), jirafa (G. camelopardalis) y okapi (O. johnstoni) (30). A pesar que algunos estudios, han reportado el alza pre ovulatoria de estrógenos a través de la medición de metabolitos en fecas de yeguas, esta aplicación ha sido menos exitosa que el diagnóstico de gestación. La prueba ha sido ineficaz tanto en alce (41) como en bóvidos domésticos (30), debido principalmente, a que el alza en la concentración de conjugados de estrona fecal durante el desarrollo folicular es muy baja (inferiores a 2,0 ng/g), sumado a la baja concentración sanguínea de estrógenos característica en ungulados, y a que su vía de excreción es principalmente urinaria (23). Estudios llevados a cabo con cromatografía de gases en combinación con inmuno ensayos, indican que la progesterona se metaboliza previo a ser excretadas por las heces en una serie pregnanos reducidos (pregnanedionas y pregnanos mono y dihidroxilados) (35,36,42,43,44,45). La progesterona no metabolizada, se encuentra escasamente en fecas y los pregnanos fecales se encuentran tanto en su forma 20-oxo, 20α-OH o como grupo 20β-OH. El número de metabolitos y series de 5α o 5β pregnanos presentes en fecas, varía entre las especies, por ejemplo los pregnanos fecales en équidos y rinocerontes son principalmente del tipo 5α pregnanos, mientras en okapis pertenecen al tipo 5β pregnanos y en bóvidos se presentan tanto 5α pregnanos como 5β pregnanos (35,43,45). La gran diversidad de metabolitos de progesterona presentes en fecas, explica la existencia de una gran cantidad de técnicas para su determinación. En general, los anticuerpos para el análisis de metabolitos fecales de progesterona, identifican el C20 de la molécula de pregnona (20-oxo, 20α-OH o 20β-OH), debido a lo cual se describe la reacción cruzada con 20-oxo-pregnanos. Como la progesterona casi no se encuentra presente en fecas, los ensayos usados para medir concentraciones de progestágenos en fecas, reportan valores de reacción cruzada con 5α-pregnano y 5β-pregnano que contengan el grupo 20-oxo (36,38,42,44,45). El análisis de metabolitos de progesterona fecales se ha utilizado exitosamente, para la evaluación de la funcionalidad del cuerpo lúteo y monitoreo de la gestación, diagnóstico de abortos, determinación del inicio



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de la pubertad y caracterización de estacionalidad reproductiva, en una gran cantidad de especies, como bóvidos (38,46,47), équidos (35,36), suidos (48); caribú (R. tarandus) (39); rinoceronte negro (D. bicornis) (42), rinoceronte blanco (C. simum) (49), okapi (O. johnstoni) (24,43,50), alce (A. alces) (41), vicuña (V. vicugna) (44), oryx (O. dammah) (51), Grevy (E. grevyi) (52), gacela (G. dama) (53), buey almizclero (O. moschatus) (38) y jirafa (G. camelopardalis) (54). Finalmente en el caso de estudios llevados a cabo en especies en peligro de extinción como el rinoceronte Indio (R. unicornis) (55) y el oryx (O. dammah) (51,56), se ha utilizado el análisis conjunto de metabolitos de estrógenos y progestágenos, tales como estrano, pregnano y androstano. De este modo en el rinoceronte indio (R. unicornis), se ha descrito el ciclo estral y la gestación, obteniéndose que las concentraciones fecales de derivados del pregnano producidos por el cuerpo lúteo y la unidad feto-placentaria, son semejantes a una serie de reportes en rinocerontes africanos (28,42,45,49,57,58,59,60,61,62,63) y en rinoceronte de Sumatra (D. sumatrensis), demostrando de este modo similitudes endocrinas a considerar en el manejo reproductivo de la especie (64). Por otro lado, en el caso del oryx (O. dammah) estudios realizados sobre la caracterización de la estación sexual, han demostrado que los metabolitos de progesterona reflejan la actividad luteal y los de estrógenos el desarrollo folicular, relacionados con la actividad ovárica, así como descienden a niveles basales durante el anestro estacional. De este modo, en ambos casos la evaluación conjunta de estrógenos y progestágenos, ha permitido caracterizar la fisiología reproductiva en ungulados silvestres, a través de un método no invasivo de estudio (56). A modo de resumen, los principales metabolitos fecales de esteroides que se determinan actualmente son: 20-oxo-progestágenos, 20α-progestágenos, 20α-dihidroprogesterona y 20β-dihidroprogesterona. De todos ellos, la 20α-dihidroprogesterona es el que presenta la mayor correlación con las concentraciones plasmáticas de progesterona (Tabla 2).

Esteroides sexuales en leche.

A mediados de la década de 1980, salen al mercado una serie de pruebas de campo, para la medición de progesterona en leche. Este esteroide, constituye el principal esteroide sexual presente en leche y dada su gran afinidad por los lípidos de la leche, puede alcanzar concentraciones superiores a las sanguíneas. La concentración de progesterona en leche puede presentar variaciones, que se relacionan principalmente con cambios



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endocrinos del ciclo estral, más que con fluctuaciones en el contenido lipídico de la leche (65). Para la medición de progesterona en leche, se han descrito una serie de pruebas diagnósticas tipo EIA (66). Estas pruebas sólo son capaces de determinar concentraciones relativas, por lo cual los resultados son clasificados como alta o baja concentración. Los resultados, se fundamentan en la alta correlación (r=0,97) existente entre la concentración de progesterona láctea y sanguínea (65). La medición de progesterona en leche, ha sido usada casi exclusivamente en bovinos de leche, en el diagnóstico primario de hembras no gestantes post-servicio, en la prevención de errores de inseminación y en la detección de hembras en anestro prolongado (67). La difusión en la aplicación de esta prueba como herramienta diagnóstica, aún en bovinos de leche, ha sido menor a la esperada, debido principalmente al alto costo relativo de la prueba, lo cual se ve incrementado en casos de desórdenes reproductivos, por la necesidad de realizar pruebas seriadas y/o recurrir a muestras sanguíneas orientadas a establecer un diagnóstico más certero (67).

Esteroides sexuales en saliva.

Otra vía en la cual es factible evaluar esteroides, es la saliva, siendo las principales hormonas medibles glucocorticoides y en menor medida testosterona. En el caso del estradiol en saliva sólo se detecta en concentraciones equivalentes al 1 a 2 % de las séricas, pero con una alta correlación (r=0,78) (68). En consecuencia, se han realizado estudios con el objeto de encontrar otro indicador del estado ciclo reproductivo. En mujeres, se han realizado evaluaciones del estriol salival, demostrando que las concentraciones en saliva, reflejan las fluctuaciones del estradiol sérico características del ciclo menstrual (68). Más aún las concentraciones del estriol salival, presentan una alta correlación (r=0,98) con las concentraciones de estradiol libre sérico, postulándose de este modo al estriol salival como un potencial indicador de la funcionalidad de la unidad feto placentaria (69). En el caso de la progesterona salival, presenta concentraciones similares a las descritas en estrógenos. Sin embargo presenta menor correlación (r=0,53) con sus concentraciones séricas, reflejo de la progesterona libre en circulación existente durante el ciclo menstrual (70).



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Estudios recientes, plantean al uso diagnóstico de la concentración de progesterona en saliva, como un indicador de ovulación y en conjunto con mediciones de estradiol salivar, como potenciales herramientas de evaluación de la funcionalidad ovárica (71).

Esteroides sexuales en pelo.

El pelo actúa como un reservorio biológico de distintas sustancias, que son sintetizadas por el organismo o incorporadas mediante la alimentación o vía administración parenteral. La característica propia de la matriz del pelo, de mantener diferentes sustancias durante largos periodos, ha sido utilizada por la medicina forense para la detección de narcóticos y anabólicos (72). En medicina veterinaria, se han desarrollado metodologías para el análisis y detección de esteroides en bóvidos domésticos, sometidos a tratamientos con anabólicos (72), adecuándose posteriormente los protocolos para la determinación de estradiol, progesterona y testosterona en el pelo (73). El desarrollo de protocolos de determinación de esteroides en pelo, constituye una alternativa como herramienta de estudio no invasiva en poblaciones de ungulados silvestres. Sin embargo, sus aplicaciones potenciales, para la evaluación de la endocrinología reproductiva, presenta limitaciones debido a la alta complejidad que presenta la extracción de hormonas desde la muestra, así como la generación de anticuerpos específicos. Adicionalmente, la permanencia de los esteroides sexuales en el pelo, durante largos periodos de meses y años (73), limitan aún más sus posibles aplicaciones. Esta permanencia, haría factible encontrar altas concentraciones de esteroides durante el anestro estacional, como consecuencia de la secreción durante el periodo estral, generando una potencial distorsión en los resultados y dificultad en la interpretación de los mismos (74).

Exploración ecográfica.

La ecografía puede definirse como una herramienta de diagnóstico médico, basado en las imágenes obtenidas mediante el procesamiento de los ecos reflejados por las estructuras corporales, en respuesta a la acción de pulsos de ondas ultrasónicas. Constituye un medio no invasivo para el diagnóstico de la gestación, predicción de la fecha probable de parto e identificación de las condiciones prenatales. La aplicación de la ecografía en programas de reproducción, ha permitido precisar la respuesta a tratamientos



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superovulatorios y detectar estados iniciales de gestación y desarrollo fetal, entre otras (75). La ecografía, se basa en el uso del ultrasonido, el cual puede definirse como una serie de ondas mecánicas, generalmente longitudinales, originadas por la vibración de un cuerpo elástico y propagadas por un medio material y cuya frecuencia supera el umbral del sonido audible por la especie humana: 20.000 ciclos/s (20 KHz), aproximadamente. Es así como los equipos de ultrasonido utilizan la técnica del eco pulsado, que consiste en pulsar un cristal y enviar paquetes de energía dentro del paciente. Un pequeño porcentaje es reflejado en las diferentes interfases y llega al transductor el cual la traduce a un pequeño voltaje. Los ultrasonidos, al atravesar las diferentes interfases devuelven "ecos" de diferentes amplitudes según la composición líquida del órgano abordado, generando imágenes que permiten analizar su morfología (76). La ultrasonografía en medicina reproductiva fue aplicada por primera vez a fines de la década de 1950 (77) y, como herramienta diagnóstica en animales de zoológico en 1978 (78). Desde entonces la utilización de técnicas sonográficas en programas de manejo reproductivo en especies silvestres ha sido esporádica, principalmente debido a que su aplicación presenta una serie de dificultades originadas por la gran diversidad de: tamaño corporal, posición de examen y morfología y fisiología reproductiva, entre las distintas especies (79). De este modo, el desarrollo y uso de nuevos componentes, incluidos la modificación de la configuración de los sistemas de ultrasonido comerciales, al igual que nuevas metodologías de examen, han permitido proveer de una herramienta de gran utilidad para el progreso de la reproducción asistida en especies amenazadas o en peligro de extinción. El uso de la ecografía ha permitido la caracterización detallada de la duración del ciclo sexual de la hembra, incluidos los cambios estacionales y precisar eventos como la formación de folículos y/o del cuerpo lúteo durante el ciclo estral (75). En animales silvestres, la principal limitante a los exámenes periódicos con ultrasonido, se ha relacionado con el riesgo involucrado en la inmovilización (física o química) del paciente, así como con el tiempo de entrenamiento necesario para que un animal logre aceptar el examen vía trans-rectal. Ésta vía, aunque más laboriosa, permite una mejor observación del aparato genital debido a una mayor aproximación a las estructuras exploradas, especialmente cuando se usan sondas de alta resolución con frecuencias de 7,5 MHz. Utilizando esta vía de exploración, es posible la observación directa de los folículos y los cuerpos lúteos, lo que representa una valiosa



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herramienta para la caracterización del estado fisiológico de ungulados silvestres (80). En el caso de la vía trans-abdominal, ha sido aplicada exitosamente sólo en pequeños ungulados, en el diagnóstico y seguimiento de la gestación con gran nivel de eficacia y precocidad. Esta vía de exploración, por la distancia existente entre el transductor y el órgano objeto de estudio, presenta limitaciones en la exploración de estructuras ováricas y de estructuras uterinas en ausencia de gestación. De este modo, la exploración ecográfica trans-abdominal, ha permitido el diagnóstico de gestación temprana, a los 45 días, en muflón (O. aries) y cabra montés (C. hircus). Estos trabajos, han utilizado sondas de 5 MHz de frecuencia, que dada la menor potencia obtienen imágenes ecográficas de mayor definición (12). El uso conjunto de ecografía y análisis endocrinos, particularmente a través de métodos no invasivos, ha hecho posible complementar y dar soporte a los hallazgos ultrasonográficos. Es así como, en pecarí de collar (P. .tajacu) se ha evaluado la gestación, a través de la determinación progesterona y estradiol, y sumado con la ecografía ha permitido determinar anticipadamente el tamaño de camada y ajustar el plano nutricional en cautiverio (81). Otra importante aplicación de la ultrasonografía, tiene relación con el monitoreo del estado reproductivo durante la implementación de programas anticonceptivos, los cuales han ido en aumento, debido al incremento de algunas especies silvestres de bóvidos y cérvidos en cautiverio. De esta manera cambios morfológicos detectados mediante ecografía, durante los tratamientos anticonceptivos, han sido correlacionados con análisis farmacocinéticos y hormonales, permitiendo evaluar la eficiencia y reversibilidad de los métodos de control poblacional (82). La aplicación del ultrasonido ha entregado información crucial sobre la anatomía reproductiva de la hembra, momento de la ovulación y ha sido útil como herramienta complementaria en el proceso de inseminación y el de transferencia embrionaria, permitiendo por ejemplo guiar el catéter en la profundidad del tracto genital para la correcta deposición del semen o de los embriones (83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93). El ultrasonido ha sido esencial en el desarrollo y aplicación de la inseminación artificial en especies únicas de ungulados como el corzo (C. capreolus), el rinoceronte blanco (C. simun), el tapir Malayo (T. indicus) (86,87), y en cérvidos sudamericanos, como la corzuela parda (M. gouazoubira) (88).



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Del mismo modo, estudios recientes muestran que la ecografía ha sido de gran utilidad para la selección de hembras receptoras en programas de transferencia de embriones inter e intra específicos, principalmente en aquellas familias donde coexisten especies silvestres y domésticas con una alta similitud genética, como es el caso en Bovidae, Camelidae y Cervidae. Por el contrario, la utilización de esta técnica se ha visto restringida en especies que no se encuentran relacionadas con alguna especie doméstica, como es el caso del yak (B. mutus) (94). Finalmente, la utilización de la ecografía como herramienta diagnóstica, ha permitido la eliminación de potenciales vientres con alteraciones uterinas, como metritis e hidrometra, y con alteraciones ováricas, como quistes foliculares y luteínicos, resultante en el incremento de las tasas de fertilidad y gestación en cautiverio (95).

CONCLUSIONES

Como característica general, la estrategia reproductiva de ungulados silvestres se encuentra condicionada por la estación sexual y la variación del período gestacional, las cuales han propiciado en las distintas especies, la sincronización de la temporada de partos con las mejores condiciones ambientales (Tabla 1). El conocimiento de la biología reproductiva de los ungulados silvestres, se ha visto limitada por las dificultades de manejo y obtención de muestras, generando el desarrollo de técnicas principalmente no invasivas. De esta manera, los estudios etológicos han hecho posible una primera aproximación a las especies en su medio natural, sin perturbar el comportamiento de la especie en estudio. Sin embargo, esta metodología presenta limitaciones para explicar fenómenos fisiológicos. Con este objetivo, se implementan técnicas de análisis de hormonas en sangre, tanto glicoproteicas como esteroidales. El análisis de hormonas glicoproteicas presenta dificultades en su evaluación, generadas por el patrón de liberación pulsátil, junto a la gran diversidad de su estructura entre las distintas especies. Los esteroides, presentan similitud estructural entre las especies, junto a un patrón de secreción más homogéneo, lo cual ha promovido el desarrollo y aplicación de sus técnicas. En ambos casos el carácter invasivo de la técnica relacionada con la obtención de la muestra, constituye la principal limitante en su uso. El desarrollo de métodos no invasivos, permiten la interpretación de fenómenos reproductivos, sin requerir la inmovilización del animal. La medición de hormonas sexuales y sus metabolitos en orina, se centran en el



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análisis de estrógenos y progestágenos, con un grado de efectividad variable según especie. Su limitación radica en la baja replicabilidad de la toma de muestra. La determinación de hormonas y metabolitos esteroidales en fecas, provee un mayor grado de certeza en la obtención de la muestra y mayor diversidad de metabolitos utilizables para el diagnóstico, en comparación con orina. De este modo, se describe el diagnóstico de gestación a través de la determinación de los metabolitos 17-oxo-androstano y 20-oxo-pregnano fecales, como indicadores adicionales al pregnandiol y estrógenos urinarios. Más aún, en grandes ungulados, la determinación de metabolitos de progesterona en fecas, permite el diagnóstico de gestación, en forma más temprana que el análisis de pregnandiol urinario. Sin embargo, pruebas que han sido efectivas en especies domésticas, como el análisis del alza pre-ovulatoria de estrógenos, presentan serias limitaciones en grandes ungulados silvestres. Para lograr una mayor efectividad, la muestra requeriría un proceso de limpieza más exhaustivo, extracción más rigurosa y pruebas de mayor sensibilidad. Finalmente los métodos usados en fecas, presentan gran diversidad en el proceso de extracción y en el grado de reactividad cruzada, generando que los resultados obtenidos entre estudios sean difíciles de comparar. Se han descrito en humanos y animales domésticos, técnicas de análisis de esteroides en otros fluidos y tejidos que presentan nuevas posibilidades de aplicación en especies silvestres. La medición de esteroides en leche, presenta actualmente una aplicación limitada, dadas por el alto costo relativo y baja precisión de la prueba. Sin embargo las principales fortalezas de esta técnica, que permite proyectar su aplicación en especies silvestres, radican en la facilidad de la toma de muestra, y en la alta correlación existente con la progesterona sanguínea. En el caso de esteroides en saliva, las ventajas de la prueba están dadas por la facilidad de obtención de la muestra y la alta correlación existente entre estrógenos salivares y sanguíneos. Sin embargo, la ausencia de estudios en ungulados silvestres, debido a la baja concentración presente en saliva, hace necesario el desarrollo de sistemas de extracción más eficaces y pruebas más sensibles. Adicionalmente en las distintas especies de ungulados silvestres sería necesario realizar estudios de excreción de estrógenos y progestágenos en saliva y, su relación con los distintos eventos reproductivos. En el caso de la medición de esteroides en pelo, es necesario un mayor conocimiento sobre la relación existente entre los ciclos anuales de muda de pelo y reproductivo, dada la característica de la matriz de almacenar esteroides por largos períodos. Lo anterior junto a la simplificación en las técnicas



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analíticas, permitirían convertir a esta técnica en una herramienta no invasiva de uso rutinario en ungulados silvestres. Los métodos descritos anteriormente no son suficientes para caracterizar cambios fisiológicos y especialmente morfológicos, asociados al ciclo folicular y a la gestación. Así, adquiere relevancia la ecografía como herramienta no invasiva. La ecografía, constituye una técnica práctica, confiable y precisa, para el monitoreo y manejo del ciclo sexual, inseminación artificial, transferencia embrionaria y tratamiento anticonceptivo. Sus limitaciones, se relacionan principalmente, con la inmovilización requerida en su aplicación y con el limitado conocimiento de la fisiología y morfología de cada especie. Finalmente, el desarrollo de metodologías de estudio que integren las técnicas descritas, harán posible una aproximación más precisa del estatus reproductivo de las distintas especies de ungulados silvestres en estudio, conocimiento esencial para el manejo exitoso de su reproducción en su hábitat o en cautiverio.

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REDVET: 2010, Vol. 11 Nº 10

Recibido 01.10.10 / Ref. prov. JUL0933B_REDVET / Revisado 27.05.10 / Aceptado 26.08.10 Ref. def. 101009_REDVET / Publicado 01.10.2010

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