METABOLITOS DEL ETANOL CON EFECTOS ... - Universidad de...

UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

METABOLITOS DEL ETANOL CON EFECTOS EN EL SISTEMA

NERVIOSO CENTRAL: SEPARACIÓN DE LOS REGIOISÓMEROS

SALSOLINOL E ISOSALSOLINOL Y SUS RESPECTIVOS

ENANTIÓMEROS R Y S

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica,

área de especialización Toxicología y Diagnóstico M olecular

y

Memoria para optar al Título de Bioquímico por:

María de los Ángeles Juricic Urzúa

Directores de Tesis:

Dr. Yedy Israel J.

Dr. Bruce K. Cassels

Santiago, Chile

Julio, 2010

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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN

TESIS DE MAGÍSTER

Se informa a la dirección de posgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas que la Tesis de Magíster presentada por la candidata:

María de los Ángeles Juricic Urzúa

ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado

de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y

al Título de Bioquímico, en el examen de defensa de Tesis rendido el día _____ de

__________________ de 2010.

Directores de Tesis:

Dr. Yedy Israel Jacard __________________________

Dr. Bruce K. Cassels __________________________

Comisión Informante de Tesis:

Dr. Marcelo Kogan Bocian (Presidente) __________________________

Prof. Asoc. Diego Bustamante Cádiz __________________________

Dr. Hernán Pessoa Mahana __________________________

ii

A mi familia:

Victor, Bernardita, María Paz, Joaquín y Sebastián.

iii

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quisiera agradecer al Dr. Yedy Israel por haberme dado la oportunidad de

hacer mi tesis bajo su dirección, pero sobre todo por haber confiado en mí en todo momento y

por haber ido más allá de sus deberes como director de tesis, apoyándome y preocupándose

siempre de potenciar mi desarrollo como científica y como persona.

Quisiera dar también las gracias al Dr. Bruce Cassels, por haber dirigido mi tesis y haberme

guiado con paciencia durante todo este tiempo, aportando con su vasta experiencia, sus consejos

y correcciones que siempre ayudaron a mejorar mi trabajo.

A los miembros de la Comisión Informante de Magíster, los profesores Marcelo Kogan,

Diego Bustamante y Hernán Pessoa. Sus consejos y ayuda fueron muy importantes para el

desarrollo de esta tesis.

También quisiera agradecer a la Dra. Amalia Sapag por enseñarme el valor de hacer las cosas

bien hechas, por formarme en el trabajo de un laboratorio del área biológica y sobre todo por

animarme a salir de las dificultades, aconsejarme y estar presente cada vez que lo necesité.

Al profesor Julio de la Fuente, por haberme enseñado a trabajar en un laboratorio y por

haberme acompañado desde entonces hasta hoy. Junto a él, quisiera agradecer también a los

profesores Claudio Saitz, Ramiro Araya, Carolina Jullian y Claudio Olea por haberme apoyado

siempre y estar siempre presentes.

Quisiera agradecer especialmente a los profesores Diego Bustamante, Germán Gunther y José

Parada por su desinteresada ayuda para sobrellevar las dificultades técnicas que se me

presentaron.

A mis compañeros de laboratorio -Benjamín, Carlos, Mario, Mónica, Robel y Thergiory- y a

mis compañeros de universidad –Alvaro, Andrea, Caro, Chepo, Italo y Nacho-, por ser siempre

un apoyo en lo científico y, aún más importante, un apoyo en lo personal.

A mi familia, muchas gracias a todos por animarme, apoyarme y soportarme durante todo

este largo camino que ha sido mi tesis y desde mucho antes también, sin ustedes nada de esto

habría sido posible.

Finalmente, quisiera agradecer a Sebastián, por ayudarme tantas veces, por aguantarme,

consolarme y animarme. Gracias mi amor por estar siempre conmigo, por recibirme siempre con

un abrazo y por sacarme siempre una sonrisa.

iv

FINANCIAMIENTO

Esta tesis se desarrolló en el Laboratorio de Farmacoterapia Génica del Departamento de

Química Farmacológica y Toxicológica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de

la Universidad de Chile. Fue financiada por los proyectos FONDECYT 1095021 (Ethanol as a

prodrug 2009-2012) e Iniciativa Científica Milenio P-05-001F.

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ÍNDICE GENERAL

FINANCIAMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

ÍNDICE GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

ÍNDICE DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1. INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.1 Efectos del etanol en el sistema nervioso central . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2 Salsolinol generado por acetaldehído: efectos reforzantes y motivacionales . . . .

1.3 Desarrollo de metodologías para determinar los regioisómeros y enantiómeros

generados en la condensación de acetaldehído y dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3.1 Cromatografía de pares iónicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3.2 Columnas con β-ciclodextrina: separación de isómeros ópticamente activos

1.3.3 Métodos de detección de los analitos separados por HPLC . . . . . . . . . . . . .

1.3.4 Metodologías reportadas para la separación y cuantificación de los

enantiómeros R y S del salsolinol mediante HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1 Objetivo General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2 Objetivos Específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3. MATERIALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.1 Reactivos Químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2 Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.3 Columnas para HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4. MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.1 HPLC de pares iónicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4.2 HPLC de reparto en columna de gel de sílice modificado con β-ciclodextrina . .

4.3 Curvas de calibración de la dopamina y el salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . .

4.3.1 Sistema de HPLC de pares iónicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.3.2 Sistema de HPLC de reparto en columna de gel de sílice modificado con β-

ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.4 Recolección de salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.5 Espectrometría de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.6 Estabilidad de la dopamina y el salsolinol en solución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.7 Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.1 Resultados objetivo específico 1: Separación salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . .

5.1.1 Optimización de las condiciones de separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.1.2 Curvas de calibración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.1.2.1 Curva de calibración de la dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.1.2.2 Curva de calibración del salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.2 Resultados objetivo específico 2: Confirmación de las estructuras del

salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.3 Resultados Objetivo Específico 3: Determinación de la estabilidad de la

dopamina y del salsolinol comercial en solución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.3.1 Estabilidad de la dopamina en solución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.3.2 Estabilidad del salsolinol comercial en solución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.3.2.1 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 14,4 minutos y que

posiblemente corresponde a salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.3.2.2 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 26,1 minutos y que

posiblemente corresponde a isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4 Resultados objetivo específico 4: Separacion de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol,

(R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4.1 Optimización de las condiciones de separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4.2 Curvas de calibración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4.2.1 Curva de calibración de la dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4.2.2 Curva de calibración de los enantiómeros R y S del salsolinol . . . . . . . . .

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6. DISCUSIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.1 Separación de salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC de pares iónicos

acoplada a detector electroquímico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.2 Confirmación de la identidad de los picos que corresponden a salsolinol e

isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.3 Estudio de la estabilidad de la dopamina en solución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.4 Estudio de la estabilidad del salsolinol e isosalsolinol en solución . . . . . . . . . . .

6.5 Separación de los enantiómeros R y S del salsolinol e isosalsolinol mediante

HPLC de reparto en columna quiral de β-ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.6 Proyecciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.6.1 Purificación de la enzima (R)-salsolinol sintasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.6.2 Síntesis de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y

(S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.6.3 Administración intrategmental de (R)-salsolinol y (S)-salsolinol, (R)-

isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.6.4 Formación de isosalsolinol in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7. CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

8. REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Naturaleza quiral del salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 2. Reacción de condensación no enzimática de la dopamina con

acetaldehído . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 3. Sistema de HPLC de pares iónicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 4. Estructura de la β-ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 5. Separación de la dopamina y el salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 6. Estructura del salsolinol y el isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 7. Curva de calibración de la dopamina para sistema de HPLC de pares

iónicos en columna de gel de sílice-C18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 8. Curva de calibración del salsolinol comercial para sistema de HPLC de

pares iónicos en columna de gel de sílice-C18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 9. Espectros de masas de los compuestos eluidos en la HPLC del salsolinol

comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 10. Reacción de oxidación de la dopamina a aminocromo . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 11. Oxidación de la dopamina a temperatura ambiente y a 37ºC . . . . . . . . . .

Figura 12. Porcentaje de dopamina remanente en la solución tras cinco horas de

oxidación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 13. Productos de oxidación del salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 14. Estabilidad del salsolinol a temperatura ambiente y a 37ºC . . . . . . . . . . .

Figura 15. Porcentaje de salsolinol remanente en la solución tras cinco horas de

oxidación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 16. Estabilidad del isosalsolinol a temperatura ambiente y a 37ºC . . . . . . . .

Figura 17. Porcentaje de isosalsolinol remanente en la solución tras cinco horas de

oxidación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 18. Separación de dopamina, (S)-salsolinol, (R)-salsolinol e isosalsolinol . .

Figura 19. Separación de los enantiómeros R y S del sasolinol e isosalsolinol

mediante HPLC en columna quiral de gel de sílice-β-ciclodextrina a partir de las

fracciones colectadas de salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 20. Curva de calibración de la dopamina para sistema de HPLC de reparto

en columna quiral de β-ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Figura 21. Curva de calibración de los enantiómeros R y S del salsolinol para

sistema de HPLC de reparto en columna quiral de gel de sílice-β-ciclodextrina . . . .

Figura 22. Estructura de las catecolaminas: dopamina, salsolinol e isosalsolinol . . .

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RESUMEN

Las propiedades reforzantes del etanol en el sistema nervioso central (SNC), que se postula

son responsables de la auto-administración repetida de alcohol, se deben al aumento de la

liberación de dopamina, inducido por el etanol, en el núcleo accumbens, área del sistema

mesolímbico inervada por neuronas del área tegmental ventral. Esta acción parece estar mediada

por su metabolito primario, el acetaldehído, producido en el cerebro por la oxidación del etanol a

través de dos sistemas enzimáticos alternativos: la catalasa cerebral y el citocromo p450 2E1

(CYP2E1). Las ratas se autoadministran tanto etanol como acetaldehído directamente en el área

tegmental ventral. La concentración necesaria para producir efectos reforzantes es menor para el

acetaldehído que para el etanol, indicando que este metabolito del alcohol es un agente

reforzante más potente que el etanol.

El acetaldehído se puede condensar con la dopamina formando una mezcla de salsolinol e

isosalsolinol. Las ratas se autoadministran salsolinol comercial (que contiene entre un 8 % y un

15 % de isosalsolinol) directamente en el área tegmental ventral. Las concentraciones

autoadministradas son aún menores que las de acetaldehído, indicando una mayor potencia del

salsolinol (y/o del isosalsolinol) como agente reforzante.

Tanto el salsolinol como el isosalsolinol tienen un centro quiral y existen como los

enantiómeros R y S. En el cerebro, el salsolinol sería producido por al menos tres vías: 1)

condensación no enzimática del acetaldehído con dopamina, que produce la mezcla racémica de

(R,S)-salsolinol y, posiblemente en menor proporción, una mezcla racémica de (R,S)-

isosalsolinol; 2) condensación enzimática del acetaldehído con la dopamina, que produciría

preferencialmente (R)-salsolinol y 3) condensación enzimática del ácido pirúvico con dopamina

seguido de descarboxilación del producto, lo cual produciría preferencialmente (R)-salsolinol.

No existe claridad acerca de cuál de los isómeros, salsolinol o isosalsolinol (o la mezcla de

ambos), es responsable de las propiedades reforzantes observadas ni, específicamente, cuál de

los enantiómeros - R o S - de estos compuestos es el que tiene una mayor actividad biológica.

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Para poder determinar cuál de los isómeros presentes en el salsolinol comercial -(R)-

salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol o (S)-isosalsolinol- es el que tiene una mayor

actividad biológica y para poder profundizar en los efectos que tiene el consumo de etanol sobre

la producción de ellos in vivo, es necesario poder contar con metodologías que permitan la

producción de estos isómeros en forma separada y a su vez que permitan cuantificarlos en

muestras de origen biológico. En este sentido, los principales resultados obtenidos durante el

desarrollo de esta tesis fueron los siguientes:

(i) Se desarrolló una metodología de HPLC de apareamiento iónico en columna de gel

de sílice-C18 acoplada a detector electroquímico capaz de separar y cuantificar

dopamina, salsolinol e isosalsolinol en aproximadamente 30 min. En este sistema, la

dopamina eluye primero (13,0 min. aprox.) seguida del salsolinol y el isosalsolinol

(14,4 min. aprox y 26,1 min. aprox), permitiendo una buena separación y

cuantificación de estos analitos en concentraciones desde 10-8 M.

(ii) Se estableció que las sustancias separadas mediante HPLC de apareamiento iónico a

partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, corresponden efectivamente a salsolinol

(tiempo de retención 14,4 min. aprox.) e isosalsolinol (tiempo de retención 26,1 min.

aprox) sobre la base de que:

a) El tiempo de retención de SC1 (14,4 min. aprox.) es menor que el tiempo de

retención de SC2 (26,1 min. aprox.) y, teóricamente, cabe esperar que el

salsolinol eluya antes que el isosalsolinol por tener sus grupos hidroxilo más

disponibles para interactuar con la fase móvil.

b) La razón entre las áreas de los picos del salsolinol comercial SC1 (tiempo de

retención 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retención 26,1 min. aprox.) se

corresponde con los porcentajes de salsolinol (92%) e isosalsolinol (8%) en el

salsolinol comercial determinados por 1H-RMN.

c) El peso molecular de las sustancias separadas a partir del salsolinol comercial,

SC1 y SC2, se corresponde con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol

(179 g/mol).

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(iii) Se determinó que la dopamina se degrada (posiblemente por autoxidación) en

solución a pH 7,4 de acuerdo a una cinética de orden cero, mientras que el salsolinol

y el isosalsolinol lo hacen de acuerdo a una cinética de orden uno, siendo la

velocidad de oxidación del isosalsolinol 10 veces mayor que la del salsolinol.

(iv) Se desarrolló una metodología de HPLC de fase inversa en columna de gel de sílice

modificado con β-ciclodextrina capaz de separar y cuantificar dopamina, (R)-

salsolinol y (S)-salsolinol en aproximadamente 40 minutos. En este sistema, la

dopamina eluye primero (22,9 min. aprox) seguida de (S)-salsolinol (26,9 min.

aprox.), (R)-salsolinol (29,9 min. aprox.) y el (R) y (S)-isosalsolinol (31,3 y 32,9

min. aprox), permitiendo una buena separación y cuantificación de dopamina, (S)-

salsolinol y (R)-salsolinol en concentraciones desde 10-8 M. Si bien el isosalsolinol

pudo ser separado de dopamina y de los enantiómeros R y S del salsolinol, no se

logró separar completamente los enantiómeros R y S del isosalsolinol entre sí.

A futuro, estas metodologías permitirán la detección y cuantificación de los enantiómeros en

muestras de origen biológico y la administración selectiva de un enantiómero específico

directamente en el cerebro de las ratas, ampliando así los conocimientos que se tienen sobre las

propiedades reforzantes del etanol como una prodroga y cómo éstas pueden ser mediadas por el

salsolinol.

xii

SUMMARY

“ETHANOL METABOLITES WITH EFFECTS ON THE CENTRAL NERVOUS

SYSTEM: SEPARATION OF THE REGIOISOMERS SALSOLINOL AND

ISOSALSOLINOL AND THEIR CORRESPONDING R AND S ENANTIOMERS”

The reinforcing properties of ethanol in the central nervous system (CNS), believed to be

responsible for the repeated self-administration of ethanol, are due to the increase of dopamine

release -induced by ethanol- in the nucleus accumbens, a part of the mesolimbic system innerved

by neurons from the ventral tegmental area. This action of ethanol seems to be mediated by its

primary metabolite, acetaldehyde, which is produced in the brain from ethanol oxidation by two

alternative enzymatic systems: brain catalase and cytochrome p450 2E1 (CYP2E1). Rats self-

administer both ethanol and acetaldehyde directly into the ventral tegmental area. The

concentration needed to produce the reinforcing effects is lower for acetaldehyde than for

ethanol, suggesting that this metabolite is a more powerful reinforcing agent than ethanol.

Acetaldehyde can condense with dopamine to form salsolinol and isosalsolinol. Rats self-

administer commercially available salsolinol (which contains between 8% to 15% of

isosalsolinol) directly in the ventral tegmental area. The concentrations of salsolinol self-

administered are even lower than acetaldehyde concentrations, suggesting that salsolinol (and/or

isosalsolinol) is an even more powerful reinforcing agent.

Both salsolinol and isosalsolinol have a chiral center and exist as the R and S enantiomers. In

brain, salsolinol could be produced by at least three pathways. 1) non-enzymatic condensation of

acetaldehyde with dopamine, which produces a racemic mixture of R and S salsolinol and

possibly, to a lesser extent, a racemic mixture of R and S isosalsolinol; 2) enzymatic

condensation of acetaldehyde with dopamine which would produce, preferentially, (R)-salsolinol

and 3) enzymatic condensation of pyruvic acid with dopamine followed by decarboxylation of

the condensation product wich would produce, preferentially, (R)-salsolinol. There is no clarity

about which of the isomers, salsolinol or isosalsolinol (or both), is primarily responsible for the

xiii

observed reinforcing properties, nor, specifically, about which of the enantiomers –R or S- of

these compounds has a greater biological activity.

In order to determine which of the isomers present in comercially available salsolinol –(R)-

salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol and (S)-isosalsolinol- has stronger biological activity

and in order to better understand the effects of ethanol consumption on the in vivo synthesis of

these isomers, methodologies that allow us to produce these substances independently and

methodologies that allow us to quantify them in biological samples are needed. In relation to

this, the main results obtained in this thesis were the following:

(i) An ion pairing HPLC methodology using a silicagel-C18 column coupled to an

electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, salsolinol and

isosalsolinol in approximately 30 min., was developed. By this methodology,

dopamine elutes first (13.0 min. approx.) followed by salsolinol and isosalsolinol

(14.4 min. approx. and 26.1 min. approx.), allowing a good separation and

quantification of these analytes in concentrations above 10-8 M.

(ii) The substances separated by ion pairing HPLC from commercially available

salsolinol correspond to salsolinol (retention time of 14.4 min. approx.) and

isosalsolinol (retention time of 26.1 min. approx.). This was established on the basis

that:

a) The retention time of SC1 (14.4 min. approx.) is lower than the retention time of

SC2 (26.1 min. approx.) and, theoretically, it is expected that salsolinol elutes

before than isosalsolinol because salsolinol has its hydroxyl groups more

available to interact with the mobil phase than isosalsolinol.

b) The ratio between the areas of the peaks observed for commercially available

salsolinol SC1 (retention time of 14.4 min. approx.) and SC2 (retention time of

26.1 min. approx.) is in agreement with the expected percentages of salsolinol

(92%) and isosalsolinol (8%) in the commercially available salsolinol as

determined by 1H-NMR.

xiv

c) The molecular weight of the substances separated from commercially available

salsolinol, SC1 and SC2, is the same as the molecular weight of salsolinol and

isosalsolinol (179 g/mol).

(iii) It was determined that dopamine degradation (possibly by autoxidation) at pH 7.4

follows zero order kinetics, while salsolinol and isosalsolinol oxidations follow first

order kinetics. The rate of oxidation of isosalsolinol is about 10 times higher than

the rate of oxidation of salsolinol.

(iv) A reversed phase HPLC methodology using a silicagel-β-cyclodextrin coupled to an

electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, (R)-salsolinol and

(S)-salsolinol in about 40 minutes, was developed. In this methodology, dopamine

elutes first (22.9 min. approx.), followed by (S)-salsolinol (26.9 min. approx.), (R)-

salsolinol (29.9 min. approx.) and (R) and (S)-isosalsolinol (31.3 and 32.9 min.

approx.), allowing a good separation and quantification of dopamine, (S)-salsolinol

and (R)-salsolinol in concentrations above 10-8 M. Although this methodology

succeeded in separating isosalsolinol from dopamine and from the R and S

enantiomers of salsolinol, it was unable to completely resolve (R)-isosalsolinol from

(S)-isosalsolinol.

In the future, these methodologies will allow the detection and quantification of these

regioisomers and enantiomers in biological samples and will allow the selective administration

of a specific enantiomer directly into rat brain, extending our knowlegde on the reinforcing

properties of ethanol as a prodrug and on how these properties may be mediated by salsolinol.

1

1. INTRODUCCIÓN

El alcoholismo, o síndrome de dependencia alcohólica, es una enfermedad crónica cuyo

desarrollo y manifestaciones están influenciadas por factores genéticos, psicosociales y

ambientales (ASAM, 1990). Se caracteriza por un conjunto de síntomas fisiológicos y de

comportamiento que se desarrollan tras el consumo sostenido de alcohol y que indican que un

individuo continúa su consumo sin importar los problemas reconocidos por él mismo y

relacionados a esta sustancia (Cottler et al., 2000; WHO (OMS), 2009). Típicamente, incluye

tolerancia y síntomas de dependencia física (síndrome de privación) y/o de dependencia

psicológica (falta de control sobre el consumo, mayor prioridad puesta en el consumo que en

otras actividades y ocupaciones, consumo persistente a pesar de las consecuencias dañinas y

gran uso de tiempo en las actividades relacionadas al consumo) (ASAM 1990; Cottler et al.,

2000; WHO (OMS), 2009).

El consumo crónico de alcohol está asociado a una serie de patologías. Puede producir daño

hepático (hígado graso, hepatitis alcohólica y cirrosis hepática), inmunodeficiencia,

enfermedades cardiovasculares (cardiomiopatía, enfermedad de la arteria coronaria,

hipertensión, arritmias e infartos), cáncer (cabeza y cuello, tracto digestivo y mamas), etc.

(Alcohol and Health, 2000).

El alcoholismo constituye un problema de salud pública a nivel mundial. En Chile, un 12%

de los usuarios de alcohol de entre 12 y 64 años presenta dependencia alcohólica (600 mil de un

total de 5 millones de usuarios) y un 23,8% de la población general cae en el criterio de bebedor

problema (CONACE, 2003).

El etanol es absorbido en el estómago y, principalmente, en el intestino, distribuyéndose a

través del organismo hasta alcanzar concentraciones idénticas en el agua de todos los tejidos,

incluyendo el cerebro (Wallgren y Barry, 1970a). El metabolismo periférico del etanol es

llevado a cabo principalmente en el hígado donde es oxidado a acetaldehído por la enzima

deshidrogenasa alcohólica (“alcohol dehydrogenase”, ADH) (Wallgren y Barry, 1970b),

particularmente por la isoforma ADH1 (Galter et al., 2003). En el cerebro, donde no se expresa

2

la isoenzima ADH1 (Galter et al., 2003), la oxidación del etanol a acetaldehído es llevada a cabo

principalmente por la enzima catalasa (Aragon et al., 1992; Gill et al., 1992; Zimatkin et al.,

2006; Zimatkin y Buben, 2007) y en menor medida por la isoforma CYP2E1 del citocromo P450

(Zimatkin et al., 2006), la cual es inducida por el consumo crónico de etanol (Sanchez-Catalán et

al., 2008). La contribución de la catalasa y el citocromo P450 a la oxidación periférica del etanol

es sólo marginal (Lieber, 2005). Tanto a nivel periférico como central, el acetaldehído generado

es oxidado a acetato por la enzima deshidrogenasa aldehídica (“aldehyde dehydrogenase”,

ALDH) (Wallgren y Barry, 1970b). Es importante señalar que el acetaldehído en condiciones

metabólicas normales no cruza la barrera hematoencefálica debido a que es transformado

completamente a ácido acético gracias al alto contenido de ALDH en la microvasculatura del

cerebro (Tabakoff et al., 1975).

Los efectos aversivos del alcohol son mediados por los niveles de acetaldehído en plasma.

Entre ellos se incluyen vasodilatación periférica, taquicardia, dolor de cabeza y náuseas (Heilig y

Egli, 2006; Johnson, 2008). Estos efectos son la base de los tratamientos farmacológicos

tradicionales contra el alcoholismo, como el disulfiram, el cual -al inhibir la enzima ALDH-

conduce a altos niveles plasmáticos de acetaldehído tras la ingesta de alcohol, niveles que son

capaces de producir efectos aversivos hacia el consumo de esta droga (Heilig y Egli, 2006;

Johnson, 2008). También se han reportado variantes genéticas tanto en humanos (Chen et al.,

1999; Thomasson et al., 1991) como en ratas que, ya sea por una producción aumentada de

acetaldehído (Quintanilla et al., 2007; Rivera-Meza et al, 2010) o por una degradación

disminuida de éste (Sapag et al., 2003), constituyen un factor protector contra el alcoholismo en

humanos o podrían ser la base de la abstinencia del consumo de alcohol de las líneas de ratas no

bebedoras.

1.1 Efectos del etanol en el sistema nervioso central

El etanol en el sistema nervioso central (SNC) tiene dos tipos de propiedades generales: (i)

sedantes/anestésicas y (ii) reforzantes (Alcohol and Health, 2000). Los efectos sedantes del

alcohol parecen estar mediados por un aumento de las acciones inhibitorias del ácido gamma-

aminobutírico (GABA), en particular mediante la activación de los receptores GABAA

3

(Huidobro-Toro et al., 1987; Lobo y Harris, 2008). Por otra parte, los efectos anestésicos del

alcohol parecen estar mediados por una reducción de los efectos excitatorios del glutamato, en

particular a través de la inhibición de los receptores NMDA de este neurotransmisor (Lovinger et

al., 1989; Wirkner et al., 1999).

El etanol, al igual que otras drogas de abuso, produce efectos reforzantes en los individuos

que las consumen. Estos se refieren a aquellos efectos eufóricos, placenteros o motivacionales

que se asocian al alcohol y llevan a repetir su consumo. Se cree que las propiedades reforzantes

de muchas drogas, como la cocaína y la morfina, son causadas por su acción estimuladora de la

transmisión dopaminérgica en el sistema mesolímbico (Bozarth, 1986), sistema tradicionalmente

relacionado con el aprendizaje de la expresión de comportamientos motivados (Wise, 2004).

El sistema mesolímbico está constituido por las células dopaminérgicas del área tegmental

ventral (“ventral tegmental area”, VTA) que se proyectan fundamentalmente hacia el núcleo

accumbens (NAc) (Wise, 2004). Tanto el VTA como el NAc han sido involucrados en la

adicción a drogas como las anfetaminas, la cocaína, la morfina, la nicotina y el alcohol. Todas

estas drogas aumentan la transmisión dopaminérgica en el NAc actuando ya sea en este mismo

sitio o en las neuronas del VTA (Bozarth, 1986). La administración sistémica de etanol en dosis

bajas e intermedias aumenta la liberación de dopamina (DA) en el NAc (Imperato y Di Chiara,

1986; Bustamante et al., 2008). Los efectos del etanol en la liberación de DA parecen

relacionarse con un aumento en la actividad de las neuronas dopaminérgicas del VTA inducido

por el etanol (Imperato y Di Chiara, 1986; Diana et al., 1992; Melis et al., 2007).

Se ha sugerido que las propiedades reforzantes del etanol se deben a la acción de su

metabolito el acetaldehído. Esta teoría es apoyada por abundantes estudios (Amit et al., 1977;

Brown et al., 1979; Amit y Smith, 1985; Aragon y Amit, 1992; Foddai et al., 2004; Rodd et al.,

2005; Melis et al., 2007; Peana et al., 2008; Diana et al., 2008). En primer lugar, la

administración sistémica de acetaldehído o etanol aumenta la actividad de las neuronas

dopaminérgicas del VTA (Foddai et al., 2004). En segundo lugar, las ratas se auto-administran

acetaldehído directamente en el cerebro (Amit et al., 1977; Brown et al., 1979; Amit y Smith,

1985; Rodd et al., 2005). De hecho, las ratas se auto-administran tanto etanol como acetaldehído

directamente en el VTA. Sin embargo, las concentraciones de acetaldehído (6 x 10-6 M)

4

necesarias para la manifestación de efectos reforzantes son 1000 veces menores que las

necesarias de etanol (17 x 10-3 M) para ver los mismos efectos (Rodd et al., 2005). Finalmente,

la administración directa de acetaldehído en el VTA, en dosis conocidas por ser auto-

administradas, aumenta la concentración extracelular de DA en el NAc (Melis et al., 2007).

Por otra parte, la inhibición de la oxidación del etanol a acetaldehído, usando el inhibidor de

la catalasa 3-aminotriazol, inhibe el efecto del etanol sobre la actividad de las neuronas

dopaminérgicas del VTA (Melis et al., 2007) y resulta en una disminución del consumo

voluntario de etanol en ratas (Aragon y Amit, 1992). El acetaldehído (sistémico a altas dosis o

intraventricular) es capaz de inducir una preferencia de lugar condicionada en ratas (Amit y

Smith, 1985; Melis et al., 2007; Peana et al., 2008). Además, al ser inyectado directamente en el

VTA, aumenta la actividad locomotriz de estos animales (Sánchez-Catalán et al, 2009). Se ha

visto también que el acetaldehído es capaz de inducir una preferencia de lugar condicionada y

aumentar el consumo voluntario de alcohol en las ratas bebedoras UChB (Quintanilla y Tampier,

2003).

1.2 Salsolinol generado por acetaldehído: efectos reforzantes y motivacionales.

En estudios más recientes se ha sugerido que parte de los efectos del acetaldehído en el

sistema nervioso central pueden estar mediados por el producto de la condensación de éste con

dopamina: el salsolinol (Nakahara et al., 1994; Jamal et al., 2003; Rodd et al., 2008).

El salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina) es un alcaloide que se

produce naturalmente en mamíferos. El salsolinol tiene un centro quiral en el carbono 1 y existe

como los enantiómeros R y S (Figura 1) (Naoi et al., 2004).

En ratas, el salsolinol se encuentra fundamentalmente en el cuerpo estriado (Matsubara et al.,

1987; Jamal et al., 2003) e hipotálamo (Matsubara et al., 1987) y, en bajos niveles, en el

hipocampo y el mesencéfalo (Matsubara et al., 1987). Se ha informado que la administración

crónica de etanol en el cerebro aumenta los niveles de salsolinol en el estriado (Sjoquist et al.,

1982; Matsubara et al., Collins et al., 1990; 1987; Jamal et al., 2003; Rojkovicova et al., 2008) y

5

el hipotálamo (Matsubara et al., 1987). Sin embargo la administración crónica de etanol parece

no afectar los niveles de salsolinol en el núcleo accumbens (Baum et al., 1999; Lee et al., 2010).

Figura 1: Naturaleza quiral del salsolinol.

La figura muestra la estructura química de los enantiómeros R y S del salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina).

En humanos, el (R,S)-salsolinol se encuentra principalmente en el núcleo accumbens, el

núcleo caudado, el putamen, la sustancia nigra y el hipotálamo. En todos estos tejidos la razón

(R)-salsolinol/(S)-salsolinol es cercana a 2 (Musshoff et al., 2000).

El salsolinol sería producido en el cerebro por al menos tres vías independientes: 1)

Condensación no enzimática de la dopamina con acetaldehído, la cual produce una mezcla

racémica de (R)-salsolinol y (S)-salsolinol (Bates et al, 1986; Dostert et al., 1988; Naoi et al.,

2004); 2) Condensación enzimática de dopamina con acetaldehído ((R)-salsolinol sintasa), la

cual produciría el enantiómero (R)-salsolinol y se relacionaría con el consumo de etanol (Naoi et

al., 1996) y 3) Condensación enzimática de dopamina con ácido pirúvico ((R)-salsolinol sintasa)

seguida de la descarboxilación enzimática. Esta reacción produciría el enantiómero (R)-

salsolinol y putativamente daría cuenta de la mayor síntesis endógena de este compuesto (Naoi

et al., 1996). Sin embargo no se ha descrito un mecanismo de descarboxilación.

En estudios in vitro, se ha visto que la condensación no enzimática de acetaldehído con

dopamina genera, como producto secundario, el isosalsolinol (1-metil-7,8-dihidroxi-1,2,3,4-

tetrahidroisoquinolina) (King et al., 1974), el cual también es un compuesto quiral (Figura 2). La

cantidad relativa que se produce de cada isómero in vitro depende en gran medida del pH al cual

6

se lleva a cabo la reacción (Bates et al., 1986). A pH 7, la condensación de dopamina con

acetaldehído genera un 50% aproximadamente de cada isómero (Bates et al., 1986).

Figura 2: Reacción de condensación no enzimática de la dopamina con acetaldehído.

El acetaldehído se condensa con la dopamina para formar una mezcla de salsolinol e isosalsolinol, ambos compuestos con un centro quiral en el carbono 1 (King et al., 1974).

Mediante 1H-RMN se ha determinado que el salsolinol distribuido comercialmente (Sigma)

contiene entre un 85% y un 92% de (R,S)-salsolinol y entre un 8% y un 15% de (R,S)-

isosalsolinol (comunicación personal Dr. Bruce Cassels). No se puede descartar que este último

compuesto sea también formado in vivo y tenga una acción reforzante (o incluso que sea la

sustancia que genere los efectos reforzantes del salsolinol disponible comercialmente; vide

infra).

Se ha observado que el salsolinol (comercial) también es capaz de ejercer efectos reforzantes

en el sistema mesolímbico. De hecho las ratas se autoadministran salsolinol (3 × 10-8 M a 3 × 10-

7 M) directamente en el VTA posterior (Rodd et al., 2008). Además, el salsolinol es capaz de

inducir una preferencia de lugar condicionada (Matsuzawa et al., 2000) y aumentar la actividad

locomotriz en ratas (Hipólito et al., 2010), ambos efectos que parecen ser mediados por la

activación de los receptores µ-opioides. En este sentido, el uso de antagonistas de los receptores

opioides (naltrexona o naloxona) o el uso de un antagonista específico de los receptores µ-

opioides (β-funaltrexamina) permite suprimir la preferencia de lugar condicionada (Matsuzawa

et al., 2000) y el aumento de la actividad locomotriz (Hipólito et al., 2010) inducidos por el

salsolinol.

7

Es importante considerar que el salsolinol utilizado para estos experimentos es el disponible

comercialmente y contiene tanto salsolinol como isosalsolinol (y sus respectivos enantiómeros R

y S). Por lo anterior, es imposible asegurar cual(es) de estos cuatro isómeros ((R)-salsolinol, (S)-

salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-salsolinol) genera(n) los efectos reforzantes observados.

Según algunos autores, los efectos reforzantes del salsolinol estarían mediados por su

enantiómero R (Nakahara et al., 1994; Naoi et al., 2004). De hecho, la perfusión con altas

concentraciones de (R)-salsolinol (10-3 M) en el estriado de ratas aumenta los niveles de DA y

serotonina (5-HT) y disminuye los niveles de sus metabolitos DOPAC, HVA y 5-HIAA

(Nakahara et al., 1994; Naoi et al., 2004) debido a que inhibe en forma competitiva la

monoamino oxidasa A (MAO-A) y la catecol-O-metiltransferasa (COMT), enzimas involucradas

en la generación de los citados metabolitos (Naoi et al., 2004). Estos efectos son inducidos en

forma más potente por el enantiómero (R)-salsolinol que por el enantiómero S (Naoi et al.,

2004). El salsolinol en altas concentraciones también inhibe la tirosina hidroxilasa (enzima

involucrada en la síntesis de L-DOPA) y los derivados del salsolinol, como el N-metil salsolinol,

inhiben en forma no competitiva la triptofano hidroxilasa (enzima involucrada en la síntesis de

serotonina) (Naoi et al., 2004).

Hasta ahora, no se conoce con exactitud el mecanismo de acción por el cual el salsolinol

comercial ejerce sus acciones reforzantes en el cerebro. Sin embargo, como ya se mencionó,

diversas investigaciones sugieren que el salsolinol podría actuar como agonista de los receptores

µ-opioides (Matsuzawa et al., 2000; Sánchez-Catalán et al., 2009; Hipólito et al., 2010).

A pesar de la mayor importancia que pareciera tener el (R)-salsolinol por sobre su

enantiómero S, en ratas expuestas en forma crónica a etanol se observa un aumento tanto del (R)-

salsolinol como del (S)-salsolinol en el mesencéfalo, núcleo caudado y putamen junto con una

disminución de la razón (R)-salsolinol/(S)-salsolinol. Esto parece indicar que la mayor síntesis

de salsolinol debida al consumo de alcohol ocurre a través de la condensación no enzimática de

la dopamina con acetaldehído (Rojkovicova et al., 2008). Queda, sin embargo por entender si

esta condensación no enzimática es la que genera los efectos motivacionales y determinar si la

enzima salsolinol sintasa, que produce preferencialmente el enantiómero R, tiene una

localización que haga que este producto sea preferencialmente motivacional. Es por consiguiente

8

importante determinar con certeza cual de los compuestos, salsolinol o isosalsolinol, y cual de

sus enantiómeros, R o S, es el que posee una mayor actividad biológica.

1.3 Desarrollo de metodologías para determinar los regioisómeros y enantiómeros

generados en la condensación de acetaldehído y dopamina.

No existe claridad en que los métodos reportados por Naoi et al. (1996) separen

eficientemente las formas (R/S)-salsolinol. Además, ni estos autores ni los otros que han

estudiado el tema han abordado el análisis del (R/S)-isosalsolinol. Por todo lo anteriormente

expuesto, es necesario poder cuantificar los isómeros estructurales salsolinol e isosalsolinol y sus

respectivos enantiómeros, esto con el fin de poder detectar y cuantificar cada uno de estos

isómeros en cerebro (por microdiálisis) y también con el fin de poder a futuro purificar cada uno

de estos isómeros para administrarlos en forma pura.

1.3.1 Cromatografía de pares iónicos

La cromatografía de líquidos de alta eficacia (High Performance Liquid Chromatography,

HPLC) es uno de los métodos analíticos de separación de compuestos más ampliamente

utilizados para compuestos no volátiles. En ella, la muestra se inyecta en una fase móvil líquida

y, mediante la presión aplicada por una bomba, alcanza una columna que contiene la fase

estacionaria. De esta manera, en la HPLC, los componentes de una muestra se separan en virtud

de las diferencias en su distribución entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria. La HPLC

de reparto en fase inversa (fase estacionaria no polar y fase móvil relativamente polar) en su

modalidad de cromatografía de pares iónicos, permite la separación de especies iónicas mediante

el uso de un contraión lipofílico de carga opuesta a la del analito en la fase móvil. La

combinación del analito con el contraión forma una especie neutra que es retenida por la fase

inversa estacionaria (Skoog et al., 2001a). Este sistema permite aumentar el tiempo de retención,

en columnas de fase inversa, de analitos cargados que de otra manera serían pobremente

retenidos. La HPLC de pares iónicos es comúnmente utilizada para la separación de

catecolaminas y sus metabolitos (Bustamante et al., 2002; Acworth y Cunningham, 1999),

9

puesto que estos compuestos a pH ácido (3,0-3,5) se encuentran protonados. El salsolinol y el

isosalsolinol también se encuentran protonados a pH ácido lo que les confiere una carga positiva

que puede ser neutralizada usando el contraión cargado negativamente octilsulfato, permitiendo

que sean retenidos por una columna de fase inversa (Figura 3).

Figura 3: Sistema de HPLC de pares iónicos

La figura muestra el mecanismo de retención de los analitos mediante HPLC de pares iónicos. En ella se observa como los analitos salsolinol e isosalsolinol protonados en su grupo amino, tal como se encontrarían a pH ácido, forman una especie neutra al asociarse con el contraión octilsulfato y como es esta especie neutra la que es retenida por la columna de gel de sílice-C18 mediante la interacción de la cadena lipofílica del octilsulfato y la cadena de 18 carbonos de la columna. También pueden apreciarse las diferencias en la posición de los grupos hidroxilo del salsolinol y el isosalsolinol que hacen que el grupo hidrxilo en la posición 8 del isosalsolinol esté estéricamente impedido para interactuar con la fase móvil por el grupo metilo en la posición 1.

1.3.2 Columnas con β-ciclodextrina: separación de isómeros ópticamente activos

Los métodos más exitosos para separar isómeros ópticos (enantiómeros) se basan en explotar

las interacciones diferenciales que pueden tener lugar como resultado de su orientación espacial

única. Esto se puede lograr introduciendo al sistema, ya sea en la fase móvil o la estacionaria, un

material quiral para inducir una selectividad particular (Scott, 2003a). En la cromatografía de

10

reparto con fases estacionarias quirales, la interacción diferencial de cada enantiómero del

analito con el enantiómero unido químicamente a la fase estacionaria produce una diferencia en

los tiempos de retención de cada uno de ellos (Scott, 2003a; Skoog et al., 2001a).

Las ciclodextrinas son oligosacáridos producidos por la degradación parcial del almidón

seguida del acoplamiento enzimático de unidades de D(+)-glucosa, unidos entre sí por enlaces

α-(1,4)-glicosídicos. Las ciclodextrinas son estructuras toroidales y el tamaño de su cavidad

depende del número de unidades de D(+)-glucosa que posean. La β-ciclodextrina (Figura 4)

tiene 7 unidades de D(+)-glucosa y una cavidad de 6,0 a 6,5 Å de diámetro (Menges y

Armstrong, 1991; Scott, 2003a).

Figura 4: Estructura de la β-ciclodextrina.

La figura muestra las 7 unidades de D(+)-glucosa de la β-ciclodextrina formando una estructura toroidal.

Las ciclodextrinas son capaces de formar complejos de inclusión, es decir pueden incluir

sustancias dentro de su cavidad hidrofóbica central interactuando con ellas mediante fuerzas de

Van der Waals, puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, etc (Menges y Armstrong,

1991; Huang et al., 2009).

Las unidades de D(+)-glucosa le confieren a esta macromolécula su naturaleza quiral,

permitiendo su utilización para la separación de enantiómeros. Los soportes de gel de sílice

11

unidos químicamente a moléculas de ciclodextrina se encuentran entre las fases estacionarias

quirales más usadas para la separación de isómeros ópticos (Scott, 2003a).

1.3.3 Métodos de detección de los analitos separados por HPLC

Existen muchos métodos que permiten la detección y el análisis cualitativo (por los tiempos

de retención) o cuantitativo (por las áreas bajo la curva del pico correspondiente) de los analitos

separados por HPLC (Skoog et al., 2001b).

Entre ellos se encuentran la detección por espectrofotometría de UV, la detección

electroquímica, la detección por espectrometría de masas, etc. (Skoog et al., 2001b). El detector

electroquímico es ampliamente utilizado por su gran aplicabilidad y sensibilidad y registra el

paso de sustancias oxidables o reducibles (Scott, 2003b). Un tipo de detector electroquímico es

el detector amperométrico. En él la diferencia entre el potencial del electrodo de trabajo y el

electrodo de referencia es constante. Al pasar una sustancia oxidable por el electrodo se origina

una corriente medida en amperes debida a la oxidación del analito y que es proporcional a la

concentración de éste en la solución (Tóth et al., 2004). Esta corriente es detectada por el equipo

y transformada en un potencial de salida correspondiente a la corriente producida en el electrodo

de trabajo y dependiente de la sensibilidad a la que se ha puesto el detector. Posteriormente, este

potencial es graficado (eje y) versus el tiempo de elución de la sustancia (eje x), dando origen a

los picos cromatográficos (Bioanalytical Systems Inc., 2000).

Este sistema de detección ha sido utilizado tradicionalmente para la detección y

cuantificación de catecolaminas (Bustamante et al., 2002; Tsunoda, 2006) y también de

salsolinol (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al, 1989b; Pianezzola et al., 1989;

Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997).

12

1.3.4 Metodologías reportadas para la separación y cuantificación de los enantiómeros R y S

del salsolinol mediante HPLC

Existen varios métodos descritos en la literatura para la separación de los enantiómeros R y S

del salsolinol mediante HPLC (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al, 1989b;

Pianezzola et al., 1989; Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996;

Deng et al., 1997; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008 y Cai et al., 2008). De estas

metodologías, todas –a excepción de las desarrolladas por Strolin Benedetti et al. (1989a y b) y

Pianezzola et al. (1989), quienes derivatizan el salsolinol para formar diasteroisómeros- usan un

compuesto quiral en la fase móvil o en la fase estacionaria para permitir la separación. La

mayoría usa una fase estacionaria unida químicamente a un compuesto quiral, por ejemplo la β-

ciclodextrina (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Rojkovicova

et al., 2008 y Cai et al., 2008). Sin embargo, Deng et al. (1997) describieron un método que usa

una columna de fase inversa (columna de gel de sílice-C18) y β-ciclodextrina en la fase móvil

para separar ambos enantiómeros.

En los métodos que usan β-ciclodextrina, el salsolinol forma complejos de inclusión con este

compuesto quiral. La estabilidad de los complejos de inclusión formados entre el R o S salsolinol

y la ciclodextrina es diferente para cada enantiómero, siendo mayor la estabilidad del complejo

formado entre el (R)-salsolinol y la β-ciclodextrina (Huang et al., 2009). De esta manera, cuando

se usa β-ciclodextrina en la fase móvil el tiempo de retención es menor para el (R)-salsolinol que

para el (S)-salsolinol (Deng et al., 1997), mientras que cuando se usa β-ciclodextrina unida

químicamente a la fase estacionaria, el tiempo de retención es menor para el (S)-salsolinol que

para el (R)-salsolinol (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al, 1996; Liu et

al., 2000; Cai et al, 2008; Rojkovicova et al, 2008; Huang et al, 2009).

Se han descrito fundamentalmente dos métodos para la detección y cuantificación de cada

enantiómero, R o S salsolinol, separados por HPLC: mediante detector electroquímico (Strolin

Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al., 1989b; Pianezzola et al., 1989; Baum y

Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997) y mediante

espectrometría de masas (Haber et al., 1995; Liu et al., 2000; Musshoff et al., 2000; Lee et al.,

2007; Rojkovicova et al., 2008; Cai et al., 2008).

13

Hasta la fecha sólo se ha descrito someramente una metodología para separar (R,S)-salsolinol

del (R,S)-isosalsolinol, utilizando una columna de gel de sílice-C18 y como fase móvil KH2PO4

0.01 M (pH 4,5), al parecer sin agregado de un contraión lipofílico (Bates et al., 1986). En

ninguno de los artículos citados anteriormente en relación con la separación de los enantiómeros

del salsolinol se hace referencia a la formación de isosalsolinol producto de la condensación de

dopamina con acetaldehído. Esto podría ser consecuencia de la incapacidad de estos sistemas

quirales de separar los regioisómeros o de la baja concentración de isosalsolinol en las muestras

utilizadas. Sin embargo, cabe esperar que el uso de β-ciclodextrina unida químicamente a la fase

estacionaria permita también la separación de los enantiómeros R y S del isosalsolinol.

14

2. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.1 Objetivo General

Implementar métodos analíticos que permitan la separación de los isómeros estructurales

salsolinol e isosalsolinol y sus respectvos enantiómeros R y S formados en la condensación de

dopamina con acetaldehído in vitro.

2.2 Objetivos Específicos:

1) Desarrollar metodologías para separar mediante HPLC de pares iónicos el salsolinol de su

isómero estructural isosalsolinol.

2) Confirmar que las estructuras de las sustancias separadas a partir de salsolinol comercial

mediante HPLC de pares iónicos corresponden a los isómeros estructurales, salsolinol e

isosalsolinol.

3) Determinar la estabilidad de la dopamina y del salsolinol comercial en solución.

4) Desarrollar metodologías para separar mediante HPLC de pares iónicos en columnas de β-

ciclodextrina, o eventualmente otra fase estacionaria, los isómeros (R)-salsolinol, (S)-salsolinol,

(R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol

15

3. MATERIALES

3.1 Reactivos químicos

Merck (Darmstadt, Alemania): metanol grado HPLC, acetonitrilo grado HPLC, ácido fosfórico

85% (H3PO4) (p.a.), ácido acético glacial (p.a.), fosfato de sodio dibásico heptahidratado

(Na2HPO4·7H2O) (p.a.), acetato de amonio (p.a.).

J.T. Baker (Ecatepec, Estado de México, México): isopropanol grado HPLC.

Sigma (St. Louis, MO, EE.UU): clorhidrato de (±)-salsolinol, clorhidrato de dopamina, ácido

etilendiaminotetraacético (EDTA) (sal disódica), octil sulfato de sodio, hidróxido de sodio

(NaOH).

Winkler (Santiago, Chile): ácido perclórico 70% (HClO4) (p.a.), fosfato de sodio monobásico

monohidratado (NaH2PO4·H2O) (p.a.).

3.2 Soluciones

Soluciones de dopamina y salsolinol: Las soluciones madre de los clorhidratos de dopamina y

salsolinol comercial (que contiene tanto salsolinol como isosalsolinol) se prepararon en ácido

perclórico 0,1 M, para prevenir la oxidación de estos compuestos. En el caso de la dopamina se

preparó una solución 1,37 × 10-2 M y, en el caso del salsolinol comercial, se disolvieron 27 mg

de esta sustancia en 10 ml de ácido perclórico 0,1 M. Considerando que el salsolinol comercial

contendría, de acuerdo a estudios realizados por 1H+-RMN, un 92% de salsolinol y un 8% de

isosalsolinol (comunicación personal Dr. Bruce Cassels), la solución de salsolinol comercial

preparada sería 1,15 × 10-2 M en salsolinol y 1,00 × 10-3 M en isosalsolinol. Las diluciones que

se usaron para los distintos experimentos fueron preparadas en ácido perclórico 0,1 M o fosfato

de sodio 0,1 M pH 7,4 según se necesitara prevenir la oxidación o emular condiciones

fisiológicas, respectivamente.

16

Tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4: El tampón de fosfato de sodio se preparó en agua

destilada y desionizada. Contiene fosfato de sodio dibásico 0,08 M y fosfato de sodio

monobásico 0,02 M. El pH de la solución fue ajustado a pH 7,4 usando hidróxido de sodio 1M.

Otra soluciones: Todas las soluciones acuosas usadas se prepararon en agua destilada y

desionizada mediante el purificador de agua NANOpure Infinity UF de Barnstead-Thermolyne

(Dubuque, IA, EE.UU.).

3.3 Columnas para HPLC

Supelco (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.): columna de gel de sílice-C18 SUPELCOSIL

LC-18 de 250 mm de largo, 4,6 mm de diámetro interno y partículas de 5 µm.

Macherey-Nagel (Düren, Alemania): columna de gel de sílice modificada con β-ciclodextrina

NUCLEODEX β-OH de 200 mm de largo, 4 mm de diámetro interno y partículas de 5 µm.

17

4. MÉTODOS

4.1 HPLC de pares iónicos.

La separación de dopamina, salsolinol e isosalsolinol se llevó a cabo mediante HPLC de

pares iónicos acoplada a detector electroquímico. Para ello se usó una bomba isocrática

Shimadzu LC-10AD (Kyoto, Japón) acoplada a un detector amperométrico BASi LC-4C (West

Lafayette, IN, EE.UU). Las muestras, de un volumen de 50 µl, se inyectaron a la columna a

través de un inyector Rheodyne (Rohnert Park, CA, EE.UU.). Como fase estacionaria se usó una

columna de gel de sílice-C18 Supelcosil LC-18 (Supelco, Sigma-Aldrich) de 250 mm de largo,

4,6 mm de diámetro interno y un tamaño de partícula de 5 µm. La temperatura de la columna fue

de 30ºC, para lo cual se usó un horno Shimadzu CTO-10A (Kyoto, Japón). Como fase móvil se

utilizó tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 3,4 con un 20% de metanol como modificador

orgánico; además la fase móvil contiene EDTA 0,03% y octilsulfato como contraión (141

mg/L). Se usó una velocidad de flujo de la fase móvil de 0,4 mL/min. El potencial de oxidación

del electrodo fue fijado en 700 mV y la sensibilidad del detector electroquímico en 20 nA. Los

resultados fueron analizados mediante el programa computacional CLASS CR10 Versión 1.2

(Shimadzu Corporation, 1993).

La capacidad del sistema para separar dopamina, salsolinol e isosalsolinol fue evaluada

mediante el cálculo del coeficiente de resolución (R) entre cada par de analitos, el cual está

determinado por los tiempos de retención (tr) de cada sustancia y el ancho de la base del pico

(W) correspondiente de acuerdo a la fórmula: R = 2(trA – trB)/(WA + WB). Mientras mayor es el

coeficiente de resolución, mayor es la separación de los analitos. Para un pico cromatográfico

ideal (simétrico), un coeficiente de resolución mayor o igual a 1 indica una separación

esencialmente completa de los analitos (Skoog y Leary, 1994).

18

4.2 HPLC de reparto en columna de gel de sílice modificado con β-ciclodextrina

La separación de los enantiómeros R y S salsolinol se llevó a cabo mediante HPLC de reparto

en columna quiral acoplada a detector electroquímico. Para ello se usó una bomba isocrática

Shimadzu LC-10AD (Kyoto, Japón) acoplada a un detector amperométrico BASi LC-4C (West

Lafayette, Indiana, EE.UU). Las muestras, de un volumen de 50 µl, se inyectaron a la columna a

través de un inyector Rheodyne (Rohnert Park, CA, EE.UU.). Como fase estacionaria se usó una

columna de gel de sílice-β-ciclodextrina NUCLEODEX β-OH de Macherey-Nagel (Düren,

Alemania) de 200 mm de largo, 4,0 mm de diámetro interno y un tamaño de partícula de 5 µm.

La temperatura de la columna fue de aproximadamente 2ºC, para lo cual se puso en contacto

directo con la columna una compresa de frío-calor Nexcare (St.Paul, MN, EE.UU.), enfriada

durante 80 minutos en el congelador hasta alcanzar 2ºC. Para cada muestra se usó una compresa

de frío-calor recién enfriada. Como fase móvil se utilizó acetato de amonio 25 mM de pH 3,8

con un 10% de acetonitrilo como modificador orgánico. Se usó una velocidad de flujo de la fase

móvil de 0,2 mL/min. El potencial de oxidación del electrodo fue fijado en 700 mV y la

sensibilidad del detector electroquímico en 20 nA. Nuevamente, la capacidad del sistema para

separar los analitos fue medida mediante el cálculo del coeficiente de resolución (R).

4.3 Curvas de calibración de la dopamina y el salsolinol comercial

4.3.1 Sistema de HPLC de pares iónicos

Se hicieron curvas de calibración para la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol con el fin

de determinar la relación entre la concentración de cada sustancia y el área del pico

correspondiente a ella en el cromatograma. Para la dopamina, se realizaron diluciones sucesivas

de una solución de dopamina 1,37 × 10-3 M preparada a partir de la solución madre de esta

sustancia, usándose para la realización de la curva de calibración seis concentraciones de

dopamina comprendidas en el rango de 1,37 × 10-7 M a 2,74 × 10-6 M. Para el salsolinol y el

isosalsolinol, se realizaron diluciones sucesivas de una solución de salsolinol comercial 1,15 ×

10-3 M de salsolinol y 1,00 × 10-4 M de isosalsolinol preparada a partir de la solución madre de

salsolinol comercial. Para la realización de la curva de calibración del salsolinol se usaron seis

19

concentraciones de salsolinol comprendidas en el intervalo de 2,88 × 10-7 M a 5,30 × 10-6 M.

Para la realización de la curva de calibración del isosalsolinol se usaron seis concentraciones

comprendidas en el rango de 2,50 × 10-8 M a 5,00 × 10-7 M. El cálculo de las concentraciones de

salsolinol e isosalsolinol se hizo suponiendo que el clorhidrato de salsolinol comercial contiene

un 92% de salsolinol y un 8% de isosalsolinol. Todas las curvas de calibración se hicieron por

triplicado.

4.3.2 Sistema de HPLC de reparto en columna de gel de sílice modificado con β-ciclodextrina

Se hicieron curvas de calibración para la dopamina, el (R)-salsolinol y el (S)-salsolinol con el

fin de determinar la relación entre la concentración de cada sustancia y el área del pico

correspondiente a ella en el cromatograma. Para la dopamina, se realizaron diluciones sucesivas

de una solución de dopamina 1,37 × 10-3 M preparada a partir de la solución madre de esta

sustancia, usándose para la realización de la curva de calibración seis concentraciones

comprendidas en el intervalo de 1,37 × 10-7 M a 2,74 × 10-6 M. Para el (R) y (S) salsolinol, se

realizaron diluciones sucesivas de una solución de salsolinol comercial 1,15 × 10-3 M de

salsolinol y 1,00 × 10-4 M de isosalsolinol preparada a partir de la solución madre de salsolinol

comercial. Para cada curva, se usaron seis concentraciones de (R) y (S) salsolinol comprendidas

en el intervalo de 1,44 × 10-7 M a 2,88 × 10-6 M. Los cálculos de la concentración de (R) y (S)

salsolinol se hicieron considerando que del total de salsolinol contenido en el clorhidrato de

salsolinol comercial, un 50% corresponde a (R)-salsolinol y un 50% a (S)-salsolinol. No se

realizó curva de calibración para el isosalsolinol en el sistema de HPLC de reparto en columna

de gel de sílice-β-ciclodextrina por no haberse logrado resolver completamente los respectivos

enantiómeros R y S. Todas las curvas de calibración se hicieron por triplicado.

4.4 Recolección de salsolinol e isosalsolinol

Para los experimentos en los que fue necesario recolectar las fracciones separadas a partir del

salsolinol comercial por el método de HPLC de pares iónicos antes descrito y que se presume

corresponden a salsolinol e isosalsolinol, se desconectó el sistema del detector amperométrico y

20

se recolectaron en forma manual fracciones de aproximadamente 0,6 ml cada una. Luego se

analizó el contenido de cada una de estas fracciones evaluando su tiempo de retención en el

sistema de HPLC de pares iónicos acoplado a detector electroquímico. Posteriormente, sólo se

utilizaron aquéllas fracciones en las que se encontró una sola sustancia.

4.5 Espectrometría de masas

Los análisis de espectrometría de masas fueron llevados a cabo por el Centro de Estudios para

el Desarrollo de la Química (CEPEDEQ) de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

de la Universidad de Chile. Para los análisis de espectrometría de masas se usó un espectrómetro

de tipo electrospray-trampa iónica ESI-IT Esquire 4000 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen,

Alemania). La nebulización mediante electrospray se realizó usando nitrógeno a una temperatura

de 300ºC, una presión de 10 psi y un flujo de 5 L/min. La adquisición de los espectros se realizó

en polaridad positiva. El control del espectrómetro se realizó a través del programa

esquireControl Versión 5.2 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Alemania).

4.6 Estabilidad de la dopamina y el salsolinol en solución

La estabilidad de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol en solución a pH 7,4 se evaluó

dejando una solución de la sustancia respectiva expuesta al aire durante al menos 8 horas a

temperatura ambiente y a 37ºC. Para estudiar la estabilidad de la dopamina se usó una solución

con una concentración inicial de 3,43 × 10-6 M. Para estudiar la estabilidad del salsolinol

comercial se usaron dos soluciones: a) una solución 2,88 × 10-6 M de salsolinol y 2,50 × 10-7 M

de isosalsolinol para estudiar la estabilidad de la sustancia que eluye a los 14,4 min y se supone

que corresponde a salsolinol y b) una solución 1,15 × 10-4 M de salsolinol y 1,00 × 10-5 M de

isosalsolinol para estudiar la estabilidad de la sustancia que eluye a los 26,1 min y se supone que

corresponde a isosalsolinol. En todos los casos, las soluciones fueron preparadas a partir de la

respectiva solución madre y diluidas en tampón fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4.

21

La concentración de cada sustancia en la solución se determinó mediante HPLC de pares

iónicos de acuerdo al método ya referido y usando las curvas de calibración de la dopamina, el

salsolinol y el isosalsolinol, que relacionan el área del pico correspondiente con la concentración

del analito en la solución. Para determinar cual es la cinética de desaparición de la dopamina, el

salsolinol y el isosalsolinol, se graficó la disminución de la concentración de cada sustancia en el

tiempo y se determinó el orden de la reacción como de orden cero1 u orden uno2 dependiendo de

si la gráfica correspondía a una función lineal o a una función exponencial, respectivamente. La

determinación de las ecuaciones integradas de velocidad que representan la cinética de

desaparición de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol se hizo usando los datos obtenidos

para las distintas mediciones independientes realizadas para cada sustancia. Para ello se

determinó mediante una regresión lineal, usando el programa Microsoft Office Excel 2003, la

ecuación de la recta que mejor se ajusta a la disminución de la concentración de la sustancia en

tiempo o a la disminución del logaritmo natural de la concentración de la sustancia en el tiempo

según se tratara de una reacción de orden cero u orden uno, respectivamente.

Para determinar los porcentajes de dopamina, salsolinol e isosalsolinol remanentes tras 5

horas de oxidación, se calculó primero la concentración de cada sustancia remanente en la

solución a las 5 horas interpolando el valor en la curva que relaciona la concentración de la

sustancia correspondiente con el tiempo de reacción. Luego se calculó el porcentaje remanente

de cada sustancia en la solución considerando la concentración inicial de la sustancia como un

100%. Este cálculo se hizo para cada uno de los experimentos realizados para cada sustancia.

Los resultados se presentan como el promedio ± desviación estándar.

1 Orden de reacción cero: Corresponde a una reacción en la que la velocidad es constante y no depende de la concentración de los reaccionantes. En ella la concentración de los reaccionantes es una función lineal del tiempo de reacción de acuerdo a la siguiente ecuación integrada de velocidad: [A] = -kt + [A]o Donde [A] corresponde a la concentración del reaccionante A, k a la constante de velocidad y t al tiempo de reacción (Logan, 2000). 2 Orden de reacción uno: Corresponde a una reacción en la que la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de uno de los reaccionantes. En ella el logaritmo natural de la concentración de uno de los reaccionantes es una función lineal del tiempo de reacción de acuerdo a la siguiente ecuación integrada de velocidad: Ln [A] = -kt + ln [A]o Donde [A] corresponde a la concentración del reaccionante A, k a la constante de velocidad y t al tiempo de reacción (Logan, 2000).

22

4.7 Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron como mínimo dos veces y los resultados se expresaron

como el promedio de los resultados ± la desviación estándar de la media (SD). Las diferencias se

consideraron significativas a p < 0,05. El cálculo de la significancia de los resultados para cada

experimento se realizó mediante el análisis t de Student usando el programa SISA

(www.quantitativeskills.com/sisa/statistics/t-test).

23

5. RESULTADOS

5.1 Resultados objetivo específico 1: Separación del salsolinol y el isosalsolinol.

5.1.1 Optimización de las condiciones de separación

Para la separación y cuantificación de las especies dopamina, salsolinol e isosalsolinol se usó

HPLC de pares iónicos acoplada a detección electroquímica.

Se observó que alguna sustancia contenida en la solución de ácido perclórico 0,1 M (PCA)

usada para preservar las soluciones de dopamina y salsolinol comercial es retenida por la

columna, eluyendo a los 5,770 ± 0,007 min (n = 22) (Figura 5A). Una situación similar se

observó para la solución de tampón de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 usada para emular

condiciones fisiológicas, donde alguna sustancia contenida en la solución es retenida por la

columna eluyendo a los 6,029 ± 0,006 min (n = 21) (Figura 5B). Por otra parte, la dopamina

(DA), sustancia precursora del salsolinol e isosalsolinol, es retenida por la columna eluyendo a

los 13,015 ± 0,174 min (n = 18) (Figura 5C).

Para el salsolinol comercial (SC), que contiene entre un 8% y un 15% de isosalsolinol, se

observan dos picos en el cromatograma: SC1, con un tiempo de retención (tr) de 14,397 ± 0,015

min (n = 18) y SC2, con un tiempo de retención (tr) de 26,137 ± 0,025 min (n = 18) (Figura 5D),

reflejando la presencia de al menos dos sustancias oxidables en la solución.

Bajo las condiciones de operación anteriormente detalladas se consiguió separar dopamina de

los dos picos de salsolinol (Figura 5E) con coeficientes de resolución de 1,783 para la separación

de dopamina de SC1, 14,018 para la separación de dopamina de SC2 y 10,743 para la separación

de los dos picos del salsolinol comercial entre sí. Estos resultados indican que el sistema de

HPLC de apareamiento iónico implementado es capaz de separar eficientemente dopamina y

ambos picos del salsolinol comercial en aproximadamente 30 minutos.

24

Figura 5: Separación de la dopamina y el salsolinol comercial.

La figura muestra los cromatogramas que se obtienen usando HPLC de pares iónicos acoplada a detección electroquímica bajo las condiciones descritas anteriormente. Sobre cada pico se indica a que sustancia corresponde: DA, dopamina; SC1, primer pico salsolinol comercial y SC2, segundo pico salsolinol comercial. A) Ácido perclórico 0,1 M. B) Tampón de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4. C) Solución de dopamina 1,37 × 10-6 M en ácido perclórico 0,1 M. D) Solución de salsolinol comercial (2,88 × 10-6 M de salsolinol y 2,50 × 10-7 M de isosalsolinol) en ácido perclórico 0,1 M. E) Cromatograma de una solución que contiene dopamina 1,37 × 10-6 M y salsolinol comercial (2,88 × 10-6 M de salsolinol y 2,50 × 10-7 M de isosalsolinol) en ácido perclórico 0,1 M, se observa una buena resolución de los picos correspondientes al ácido perclórico (5,759 min), la dopamina (13,498 min) y el salsolinol comercial (14,996 min y 27,635 min).

25

Existen dos factores que llevan a especular que SC1 corresponde a salsolinol mientras que

SC2 corresponde a isosalsolinol: (i) Los tiempos de retención de SC1 y SC2 y (ii) la abundancia

relativa de SC1 y SC2.

Con respecto a los tiempos de retención de SC1 y SC2, se cree que SC1 corresponde a

salsolinol y SC2 a isosalsolinol porque se espera que el salsolinol sea retenido menos tiempo en

la columna que el isosalsolinol, puesto que los grupos hidroxilo del salsolinol están más

disponibles para interactuar con el solvente que los del isosalsolinol, donde uno de los grupos

hidroxilo está impedido estéricamente por el grupo metilo en la posición 1 (Figura 6).

Con respecto a la abundancia relativa de SC1 y SC2, el clorhidrato de salsolinol comercial

contiene entre un 85-92% de salsolinol y un 8-15% de isosalsolinol (comunicación personal Dr.

Bruce Cassels), por lo que cabe esperar que el área del pico en el cromatograma correspondiente

a salsolinol sea mucho mayor que la del correspondiente a isosalsolinol. Si se supone que una

misma cantidad de dos sustancias estructuralmente muy similares producen corrientes también

muy similares al ser oxidadas en el detector electroquímico, entonces se puede inferir que la

razón entre las áreas de los picos correspondientes es equivalente a la razón entre las

concentraciones de dichas sustancias. Si se aplica lo anterior a los picos observados para el

salsolinol comercial y se observa que las áreas de éstos están en la razón de 11,5 ± 1,6 (n = 18),

se puede inferir que SC1 corresponde a un 91,91 ± 1,01% del total de sustancias oxidables (con

un potencial de oxidación de 700 mV) del salsolinol comercial, mientras que SC2 corresponde al

8,09 ± 1,01%. Estos porcentajes se corresponden en forma bastante aproximada con el contenido

estimado por 1H-RMN de salsolinol e isosalsolinol en el clorhidrato de salsolinol comercial (85-

92% y 8-15%, respectivamente) (comunicación personal Dr. Bruce Cassels).

26

Figura 6: Estructura del salsolinol y el isosalsolinol.

La figura muestra las estructuras y las numeraciones de los átomos de carbono del salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina) y del isosalsolinol (1-metil-7,8-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina). Se observa como el grupo hidroxilo en la posición 8 del isosalsolinol está estéricamente impedido por el grupo metilo en la posición 1, mientras que en el salsolinol ambos grupos hidroxilo están libres para interactuar con el solvente.

5.1.2 Curvas de calibración

Se realizaron curvas de calibración para la dopamina y el salsolinol comercial, con el fin de

determinar como se relaciona la concentración de cada una de estas sustancias con la señal

entregada por el detector electroquímico en términos de área del pico correspondiente en el

cromatograma.

5.1.2.1 Curva de calibración de la dopamina

En la Figura 7 se observa que el área del pico correspondiente a dopamina se relaciona en

forma lineal con la concentración de dopamina en la solución de acuerdo a la ecuación: área pico

= 1235,4 [DA] (10-7 M). Esta relación se mantiene en el intervalo de 1,37 × 10-7 M a 2,74 × 10-6

M, sobre esta concentración la señal se satura.

5.1.2.2 Curva de calibración del salsolinol comercial

Como ya se mencionó, se observó que en el sistema de HPLC de apareamiento iónico

implementado el salsolinol comercial se separa en dos sustancias con tiempos de retención

promedio de 14,397 min y 26,137 min. Si bien la identidad de los picos no ha sido confirmada,

27

como se indicara anteriormente, se sospecha que el que eluye primero (SC1) es el salsolinol y el

segundo (SC2) el isosalsolinol y así se considerará para los efectos de la curva de calibración.

Área pico = 1235,4 [DA] (10-7 M)

R2 = 0,9917

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0 5 10 15 20 25 30

concentración dopamina (10-7 M)

Áre

a pi

co (

unid

ades

arb

itrar

ias)

Figura 7 Curva de calibración de la dopamina para sistema de HPLC de pares iónicos en columna de gel de sílice-C18.

La curva de calibración para dopamina en sistema de HPLC de pares iónicos en columna de gel de sílice-C18 fue realizada por triplicado inyectando un volumen de 50 µl de muestra. En ella se observa que el área del pico de dopamina se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9917) con la concentración de dopamina ([DA]), expresada en 10-7 M, de acuerdo a la ecuación: área del pico = 1235,4 * [DA] (10-7 M). El área de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de área entregados por el programa computacional de análisis (CLASS CR10)

La Figura 8 muestra que las áreas de los picos que corresponden a SC1 y SC2 se relacionan

en forma lineal con la concentración de salsolinol (área pico = 1074,1 [Sal] (10-7 M)) e

isosalsolinol (área pico = 1036,4 [Isal] (10-7 M)) en la solución, respectivamente. Para el primer

pico (Figura 8A), correspondiente a SC1 y que se supone que es salsolinol, esta relación se

mantiene en el intervalo de 2,88 × 10-7 M a 5,75 × 10-6 M de salsolinol. Para el segundo pico

(Figura 8B), correspondiente a SC2 y que se supone es isosalsolinol, esta relación se mantiene al

menos en el intervalo de 2,50 × 10-8 M a 5,00 × 10-7 M de isosalsolinol.

28

A

Área pico = 1074,1 [Sal] (10-7 M)

R2 = 0,9956

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 10 20 30 40 50 60 70

concentración salsolinol (10-7 M)

area

pic

o (u

nida

des

arbi

traria

s)

B

Área pico = 1036,4 [Isal] (10-7 M)

R2 = 0,9913

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 1 2 3 4 5 6

concentración isosalsolinol (10-7 M)

Áre

a pi

co (

unid

ades

arb

itrar

ias)

Figura 8: Curva de calibración del salsolinol comercial para sistema de HPLC de pares iónicos en columna de gel de sílice-C18.

La curva de calibración para el salsolinol comercial en el sistema de HPLC de pares iónicos en columna de gel de sílice-C18 fue realizada en triplicado inyectando un volumen de 50 µl de muestra. Para los efectos de la curva de calibración se considera que SC1 corresponde a salsolinol y SC2 a isosalsolinol A) El área del pico de SC1 se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9956) con la concentración de salsolinol ([Sal]), expresada en 10-7 M, mediante la ecuación área del pico = 1074,1 * [Sal] (10-7 M). B) El área del pico SC2 se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9913) con la concentración de isosalsolinol ([Isal]), expresada en 10-7 M, mediante la ecuación área del pico = 1036,4 * [Isal] (10-7 M). El área de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de área entregados por el programa computacional de análisis (CLASS CR-10)

29

5.2 Resultados objetivo específico 2: Confirmación de las estructuras del salsolinol e

isosalsolinol.

Como ya se mencionó, se supone que las dos sustancias separadas a partir del clorhidrato de

salsolinol comercial por el sistema de HPLC de pares iónicos implementado, SC1 y SC2,

corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente.

El salsolinol y el isosalsolinol tienen ambos un peso molecular de 179 g/mol. Por esta razón y

como primera aproximación a la identificación de los picos que se observan mediante HPLC de

apareamiento iónico para el salsolinol comercial, se colectaron las fracciones correspondientes a

cada uno de los picos y a cada una se le registró un espectro de masas en un espectrómetro de

tipo electrospray-trampa iónica ESI-IT Esquire 4000 (Bruker Daltonik GMBH, Alemania).

En polaridad positiva, la ionización del analito produce un ion precursor que corresponde al

analito protonado y que se designa por (M+H+), indicando que su masa corresponde a la del

analito más la de un protón. En los espectros de ambas fracciones (Figura 9) se observa que el

ion precursor (M+H+) tiene una relación masa/carga de 180, indicando que corresponden a

sustancias cuyo peso molecular es de 179 g/mol. Esto refuerza la hipótesis de que las sustancias

aisladas y designadas como SC1 y SC2 corresponden a salsolinol e isosalsolinol y no a otra

sustancia oxidable que pudiera estar presente en el salsolinol comercial.

Luego, el ion precursor es fragmentado en la trampa iónica produciendo un espectro de

fragmentación que es único para cada sustancia en términos de la relación masa/carga de los

fragmentos producidos y/o en la abundancia relativa de cada uno de estos fragmentos. Así, para

dos sustancias muy similares, como es el caso de los regioisómeros salsolinol e isosalsolinol,

cabe esperar que el espectro de fragmentación sea similar en cuanto a la relación masa/carga de

los fragmentos producidos, dado que la fragmentación del ion precursor puede producirse en

sitios análogos generando algunos fragmentos que serán iguales para ambos compuestos y otros

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