Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública, Ciències de l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal

Máster Universitario en Calidad y Seguridad Alimentaria

MEMORIA DE

PRÁCTICAS EXTERNAS

Estudiante: Juan Carlos Garrigues Mafé

Tutor/a académico: Dr. Jordi Mañes i Vinuesa

1

ÍNDICE Datos de la práctica ....................................................................................................................... 2

Glosario ......................................................................................................................................... 3

Introducción .................................................................................................................................. 4

Productos CITROSOL S.A. ........................................................................................................... 10

Descripción de las prácticas realizadas .......................................................................... 11

Control de calidad: ............................................................................................................. 11

1. Recepción de las muestras: Registro y elaboración del informe ...................... 11

2. Determinación del pH de las muestras ................................................................. 12

3. Cuantificación de los residuos sólidos presentes en las muestras .................. 12

4. Inoculación de las muestras en placa ................................................................... 14

5. Lectura en placa: Identificación y cuantificación de los hongos. ...................... 15

6. Elaboración de medios Sabouraud Cloranfenicol Agar ...................................... 18

7. Elaboración de medios Agar-Plate-Count (PCA) ................................................ 19

8. Elaboración de placas Rodac ................................................................................. 20

9. Interpretación de los resultados obtenidos ........................................................... 21

Participación en ensayos de laboratorio ......................................................................... 22

Ensayo de resistencias ..................................................................................................... 22

Elaboración de medios enriquecidos para obtener resistencias ............................... 22

Ensayos de fitotoxicidad ...................................................................................................... 26

Determinación de la contaminación ambiental y superficial ..................................... 27

Contaminación ambiental .................................................................................................... 28

Contaminación superficial: .................................................................................................. 29

OBJETIVOS CONSEGUIDOS ............................................................................................... 31

VALORACIÓN PERSONAL .................................................................................................... 31

ANEXOS ....................................................................................................................................... 32

BIBLIOGRAFIA: ............................................................................................................................. 33

2

Datos de la práctica

Alumno: Juan Carlos Garrigues Mafé. Máster en Calidad y Seguridad Alimentaria

Tutor académico: Dr. Jordi Mañes i Vinuesa. Catedrático de Nutrición i Bromatologia.

Director del Departamento de Medicina Preventiva i Salud Pública

Tutor de empresa: Jorge Bretó Miralles. Coordinador técnico de la empresa.

Empresa: Productos Citrosol S.A.

Período: 17 de Octubre de 2014 / 15 de Mayo de 2015

3

Glosario - Tratamientos en drencher : Es un sistema de lavado que se basa en mojar o inundar

los frutos con agua, añadiendo una suspensión de fungicida. Los fungicidas utilizados

normalmente son los derivados del bencimidazol e imidazol que detienen, o al menos

retrasan el crecimiento del género Penicillium spp.

-Post-cosecha: Se refiere al conocimiento de los procesos adecuados a los que se

somete un producto cosechado, así como de la tecnología de manejo necesaria. El

objetivo principal es la preservación de la calidad, integridad física de los productos

frescos.

-Fungicida: Son plaguicidas empleados para eliminar o reducir el crecimiento de los

hongos.

-Unidades formadoras de colonia (Ufc): Es un parámetro que indicará el grado de

contaminación por microorganismos de la muestra recibida. Expresado mediante

unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro de muestra. En la placa se inoculan

0,1 ml de muestra, por tanto al valor obtenido final se deberá de multiplicar por 10, para

obtener como resultado final las Ufc/ml.

-Podredumbre de cítricos: Efecto que produce un tipo de hongos parásitos de los

cítricos y que ocasionan grandes pérdidas económicas en el sector citrícola. Los efectos

varían, dependiendo del hongo que lo cause y de los factores ambientales en que se

desarrolle dicho hongo.

-Desecador: Se trata de una herramienta que tiene múltiples utilidades, pero en este

caso se utilizará para detectar la cantidad de sólidos en la muestra recibida. Dispone de

una lámpara halógena que desencadena un calentamiento rápido y uniforme de la

muestra. Mediante la pantalla del desecador, aparecerá el resultado en gramos de

residuo seco por 100 mL de muestra. (7)

-AirTest: El nombre proviene de la marca registrada por la empresa “Betelgeux”. Se

trata de un equipo compacto que presenta una lámina perforada donde entra el aire

absorbido. Este aire, incidirá sobre una placa con medio selectivo de agar, permitiendo

la identificación y cuantificación de microorganismos. La entrada de aire, se regula de

dos formas: modificando la fuerza de entrada del aire y/o modificando el tiempo de

entrada del aire. (9)

4

Introducción Los cítricos valencianos conllevan la propiedad de Indicación Geográfica

Protegida, designada para un tipo de producto agrícola o alimenticio que posee una

determinada región geográfica y que presenta cierta calidad y reputación intrínseca al

lugar de origen donde se producen. (12)

Durante el siglo XVI, se tiene constancia bibliográfica sobre la creación de las

primeras plantaciones destinadas a la producción de cítricos. En la mitad del siglo XIX,

debido a una fuerte crisis en el

sector vinícola del territorio

valenciano, el cultivo de cítricos

se consolida como la principal

fuente de la economía

valenciana. La clave de este

gran desarrollo del cultivo de

cítricos fueron principalmente su

gran rentabilidad y el desarrollo

de importantes vías de

transporte para su exportación.

A lo largo del tiempo, se han

ido perfeccionando las diferentes técnicas agrícolas, tanto en el cultivo de cítricos como

en el proceso post-cosecha. El principal hándicap, para el perfeccionamiento de los

procesos post-cosecha son las diferentes enfermedades que afectan a los cítricos,

conocidas como “aguado” o “podredumbre de los cítricos”.

Estas enfermedades que afectan a los cítricos después de su recolección son muy

relevantes para el sector citrícola. Existen muchos parámetros que han aumentado

estos problemas en las últimas décadas, como son, la proliferación de diversas

variedades que presentan su recolección en épocas del año en las que se acrecienta la

esporulación de los hongos causantes de la podredumbre. También han contribuido a

esta causa, el aumento del tiempo en la conservación frigorífica para su

comercialización en otros periodos del año. Además de esto, una mayor externalización

del comercio de cítricos, que conlleva, un mayor período de refrigeración, debido al

transporte hacia los diferentes países consumidores de cítricos valencianos.

En el año 2013, se generaron 2104 millones de euros en la exportación de cítricos

en la comunidad valenciana. Esta gran cifra, indica que el 38% del total de las

exportaciones agroalimentarias en España, son de cítricos valencianos.

Fotografía del proceso de recolección de cítricos en la

Comunitat Valenciana. (Principios del siglo XX).

5

El podrido de los cítricos se estima entre un 3 a un 6 por 100 del producto total de

cítricos recolectados. Este porcentaje se puede, incluso disparar si no se tienen las

precauciones pertinentes en el proceso de almacenaje, manipulación y refrigeración del

producto. Se han estimado las pérdidas causadas por la podredumbre en la exportación

de cítricos valencianos, del orden de 126 millones de euros. (11)

El mecanismo de infección de los hongos parásitos, cuando entran en contacto con

el cítrico, se consigue mediante una serie de factores ambientales. Una determinada

humedad, temperatura, iluminación, susceptibilidad de los tejidos vegetales,

interacciones con otros microorganismos presentes y/o incluso la agresividad del propio

hongo. Para que se consiga desarrollar el hongo parásito, se necesita la inoculación de

esporas, hifas, esclerocios, estromas de fructificación u otro tipo de estructura del hongo

capaz de iniciar la infección.

Si existen fisuras preexistentes en los cítricos por diversas causas, como por ejemplo

una mala refrigeración en las cámaras, se aumenta la probabilidad de parasitación de

los hongos en los cítricos. Por otro lado, también se producen estas fisuras por la acción

enzimática de algunos hongos sobre los tejidos epidérmicos del cítrico. (2,3)

Clasificación de los hongos causantes de la podredumbre en cítricos

La infección de los diferentes hongos en los frutos cítricos, se consigue por medio

de la germinación de esporas, apresorio, micelio… Según la rapidez con la que se

desarrollará el hongo, podremos clasificarlos de la siguiente manera:

Infección inactiva: En este caso, aquellos hongos que presenten un periodo de

tiempo sin germinar y pasado un tiempo, se consigan unas determinadas condiciones

ambientales favorables (humedad, temperatura, pH…) dará lugar al desarrollo del

proceso germinativo y con ello la capacidad de completar la infección en el fruto

cítrico.

Nombre Características principales Factores ambientales que favorecen su crecimiento

Imagen de la afectación del hongo al fruto cítrico

Penicillium digitatum 60% de los casos de podrido

Se desarrolla una coloración verde. Con el desarrollo de hongo, se llega a la aparición de una superficie polvorienta y verde-grisácea

Precisan de una humedad ambiental superior al 80%. No crece a temperaturas inferiores a 5ºC.

6

Penicillium italicum 20% de los casos de podrido

Se desarrolla una capa azulada que cubre la parte externa del cítrico

Precisa de una elevada humedad y de una total maduración del fruto. Es capaz de crecer a 4ºC.

Alternaria spp Afectación entre el 8-15 % de los casos de podrido.

Afectación del fruto en 2 posibles etapas: 1. En el desarrollo del fruto: Está presente en las flores y en el desarrollo del fruto. 2. En la conservación frigorífica de los frutos. En ambos casos, se produce una decoloración de la piel que cambia a marrón. Se desarrollan densas masas de micelio

Humedad: 80-85 % Temperatura: 17-18ºC.

Cladosporium spp Afectación no superior al 4% de los casos de podrido

Podredumbre verde-grisácea. Si se dan las condiciones idóneas, se producirá un reblandecimiento de la piel y posteriores fisuras.

Precisan de una humedad ambiental superior al 80%.

Fusarium spp Afectación no superior al 4% del total de los casos de podrido

-Afectación de la corteza de los frutos, situadas en la zona peduncular y estilar. Se produce una podredumbre seca de desarrollo lento. -A través de heridas. Se origina después una podredumbre blanda y con pérdida de líquidos.

Temperaturas inferiores a 10ºC y una humedad relativa no inferior a 90%.

Rhizopus spp. 1-3% de afectación del total de los casos de podrido

Causa una podredumbre blanca con pérdida de líquidos. Además, también se produce un recubrimiento algodonoso por la parte externa de los cítricos. La apariencia de los cajones es de un nido

Humedad relativa elevada y temperaturas mayores a 8ºC.

7

Sclerotinia Fuckeliana Poca afectación en los cítricos

Conocido como “moho gris”. Produce en el fruto cítrico una podredumbre blanda con exudado líquido, además de un recubrimiento marrón claro que se va oscureciendo.

Se precisa de una humedad ambiental elevada (80%) y temperatura templada (12ºC).

Trichoderma spp. No sobrepasa el 0,7% del total de los casos de podredumbre

Produce una podredumbre no blanda. El área de corteza afectada por este hongo aparece de color marrón oscuro y se presenta consistente al tacto. Se produce un cambio progresivo de color de blanco a marrón oscuro

Humedad relativa mayor del 80%. Rango de temperatura entre los 5 y los 40ºC.

Glomerella spp. Afectación no superior a 4% de los casos de podredumbre. Presenta mayor incidencia en mandarinas.

Afecta principalmente a la zona estilar y peduncular del fruto. El principio del desarrollo de la enfermedad es mediante el desarrollo de pequeñas pustulitas en superficie.

Humedad relativa del 80%

Infección inmediata: Se produce una rápida germinación de las esporas al

ponerse en contacto con el tejido vegetal del fruto, unas pocas horas. Los factores

ambientales, favorecerán o impedirán que estos hongos se desarrollen. Nos referimos

a los géneros Phytophtora y Geotrichum. En los frutos cítricos, aparecerán en pocos

días la sintomatología propia del efecto de tales hongos.

Nombre Características principales Factores ambientales que favorecen su crecimiento

Imagen de la afectación del hongo al fruto cítrico

Geotrichum spp 2-3% de los casos de podrido

El desarrollo micelar no ocurre en el desarrollo del fruto, sino que ocurre en el transporte o en almacén. Causante de la podredumbre amarga o ácida de consistencia blanda, que se transforma rápidamente en acuosa y con un fuerte olor a pútrido

Humedad relativa del 80% y con temperaturas superiores a 10-12ºC

Phytophtora spp No supera el 2% de los casos de podredumbre

Podredumbre marrón. Se produce una pérdida de coloración en los cítricos y aparición de zonas redondeadas de color gris oscuro

Por debajo de los 10ºC no existe sintomatología

8

Gráfico que muestra la prevalencia de infección que presenta el género Penicillium spp. a

causar la podredumbre en cítricos, frente al restos de las especies descritas.

Los hongos causantes de la podredumbre, como se ha descrito en las anteriores

tablas descriptivas, no presentan la misma prevalencia de infección a los frutos

cítricos. Existe un género, Penicillium spp., que aglutina el 80% de los casos de

podredumbre de cítricos en la Comunidad Valenciana. Este dato es muy relevante, ya

que debido a las condiciones climáticas que existen en la Comunidad Valenciana, así

como de la estacionalidad para producir determinadas especies de cítricos, ocasiona

una mayor proliferación de unas especies de hongos frente a otras. Por otro lado, es

muy notorio que la especie Penicillium digitatum, es la causante de la podredumbre

de cítricos en más de la mitad del total de los frutos afectados por esta enfermedad. (1,

2, 3, 4,5)

En definitiva, el género Penicillium spp., como veremos en el desarrollo de la memoria

de prácticas, será el hongo que más veces se identificará como causante de la

podredumbre de cítricos. Centrándose en él, la mayoría de los tratamientos aplicados a

los cítricos en el momento de almacenaje.

9

La aplicación de ceras y fungicidas en las diferentes variedades de cítricos, en

el momento del almacenaje, reduce mucho el porcentaje final de cítricos podridos. Este

parámetro es muy interesante, económicamente, para los distintos almacenes de

cítricos. Una reducción de apenas un 5 o 6 por ciento supone una disminución grande

de las pérdidas económicas de los almacenes (1,7).

Esquema que siguen los procesos de recolección, tratamientos y almacenaje de los frutos cítricos para su

comercialización.

10

Productos CITROSOL S.A.

Se trata de una empresa que desarrolla la tecnología y los productos necesarios para

solucionar los problemas que se dan en los procesos post-cosecha de frutas y verduras.

El gran desarrollo del cultivo de los cítricos en la Comunidad Valenciana, hace que se

haya especializado en el tratamiento post-cosecha para cítricos. La sede principal se

encuentra emplazada en la localidad de Potríes, localidad limítrofe con Gandía (comarca

de la Safor).

La empresa cuenta con un total de 50 empleados, con una gran variedad de

funciones y responsabilidades dentro de la empresa.

Hay que destacar, que en esta empresa se da un importante impulso a la investigación

y el desarrollo de nuevos proyectos que den soluciones a los problemas que se plantean

en los procesos post-cosecha de frutas y verduras. En la actualidad, CITROSOL es la

empresa dedicada a la solución de problemas post-cosecha, que más y mejores

recursos destina a la innovación tecnológica, siempre basado en el rigor científico.

En las instalaciones de la empresa, se pueden distinguir 4 secciones diferentes. Por

un lado, la fabricación de los productos de síntesis química, como son las ceras y los

fungicidas. Por otro lado, la construcción de las diferentes maquinarias de aplicación de

los fungicidas y las ceras. También encontramos, las oficinas centrales de la empresa

y, el laboratorio.

La sección donde se desarrollan las prácticas se encuentra en el laboratorio. A su

vez, en el laboratorio de análisis, se desarrollan 2 actividades distintas:

En primer lugar, el laboratorio de control de calidad. Se realiza un control diario de

las muestras obtenidas en los drencher de los almacenes de cítricos y también del

control de calidad de las distintas ceras. Desde que empieza la campaña de recolecta

de cítricos hasta que finaliza (Octubre-Mayo) es cuando se produce un mayor volumen

de trabajo. El laboratorio dispone de diferentes instrumentos y técnicas que hacen

posible la cuantificación de los diferentes parámetros fisicoquímicos y microbiológicos,

que sirven para estimar la calidad de los productos que distribuye la empresa.

En segundo lugar, es en el laboratorio donde se desarrollan aquellas mejoras e

innovaciones de las nuevas tecnologías y tratamientos, que solucionen los problemas

surgidos para combatir o impedir el desarrollo de patologías en frutas y verduras,

durante el periodo post-cosecha. Se dispone de herramientas suficientes para poder,

determinar la efectividad de los nuevos tratamientos. Se necesita reproducir a menor

11

escala, el efecto de los drencher de lavado o el efecto de la aplicación de las ceras en

los cítricos. Para ello, se dispone de cámaras de refrigeración y de máquinas de

aplicación de drencher y de ceras, de reducido tamaño.

El estudiante destinará la mayoría de las horas de prácticas al análisis

microbiológico y fisicoquímico de las muestras obtenidas de los drencher de

lavado. Además, también formará parte de estudios de resistencias fúngicas a

los tratamientos del drencher y ensayos de fitotoxicidad. Por último, también

formará parte del control de la contaminación ambiental y superficial de los

diferentes almacenes. Todas estas actividades desarrolladas por el estudiante,

serán descritas detalladamente en los siguientes puntos.

Descripción de las prácticas realizadas

Control de calidad:

1. Recepción de las muestras: Registro y elaboración del informe.

Existe un número de trabajadores que están destinados a la recogida de muestras

de los drencher de lavado de los diferentes almacenes. Para ello, depositan la muestra

líquida en un envase de plástico debidamente precintado y cumplimentado en su

etiquetado los siguientes parámetros: fecha de obtención de la muestra, nombre del

cliente, tratamiento/s aplicado/s, número de palés que han pasado por el drencher de

lavado.

La muestra es recibida en el laboratorio en un intervalo de tiempo variable,

dependiendo de la distancia entre el laboratorio y el almacén donde se hace el registro.

Teniéndose en cuenta, que esta empresa presenta clientes en otros países como

Sudáfrica o Brasil.

Una vez se han recibido las muestras en el laboratorio, se realiza un registro manual

y otro en una hoja Excel.

Es muy importante el buen registro inicial de la muestra, para poder diferenciarlas del

resto de muestras que llegan y no confundirlas, ya que de lo contrario, todo el trabajo

efectuado en el laboratorio será en balde.

Finalmente, una vez se han realizado todas las pruebas fisicoquímicas,

microbiológicas y se han obtenido los resultados, se realiza un informe donde se redacta

las conclusiones a las que se llega en el laboratorio de control calidad. Antes de enviar

12

los documentos al personal técnico que suministra los productos a los diferentes

clientes, se guarda una copia para posibles comprobaciones futuras de los datos (Anexo

1).

2. Determinación del pH de las muestras

La determinación del pH es un parámetro de interés para la realización del informe

final de calidad de los productos de la empresa. La aplicación de los diferentes

tratamientos en los drencher afectará notablemente a la variabilidad de pH analizado en

las muestras.

La determinación del pH es muy simple, se precisa de un pH-metro.

El pH-metro es un instrumento que mediante un

método electroquímico permite medir el pH de una

disolución. Se debe tener en consideración una serie

de indicaciones:

1. En primer lugar, se debe calibrar el pH-

metro antes de realizar la cuantificación de una tanda

de muestras. La calibración se realiza con patrones de

pH.

2. Por otro lado, se debe limpiar exhaustivamente el electrodo que se

introduce en la muestra para su determinación.

Se debe limpiar con agua destilada, entre la determinación de una muestra y

la siguiente.

3. El dato obtenido tiene que estar debidamente incorporado al informe del

cliente al que se está realizando el análisis.

3. Cuantificación de los residuos sólidos presentes en las muestras

La cuantificación de los residuos sólidos de las muestras que se reciben en el

laboratorio es un parámetro que hay que tener en cuenta en la conclusión final de los

análisis:

Cuando se realiza el lavado de los diferentes palés de cítricos, existe una variabilidad

en relación con la cantidad de barro que contienen. Es importante, ya que cuando se

realiza la cuantificación total de microorganismos en placa, este parámetro es muy

13

influyente, ya que en estos barros proliferan o preexisten esporas de los hongos que

producen la podredumbre de los cítricos.

Mediante el siguiente procedimiento, se obtiene la masa de residuos sólidos

(miligramos/ 100 ml) que contienen las muestras que se reciben al laboratorio. La

complejidad de esta cuantificación se resuelve mediante el uso del filtraje de la

disolución de la muestra y su cuantificación mediante la desecación total de este filtraje.

Imagen del proceso de obtención de la masa de los sólidos de las muestras recibidas.

En la Imagen A, se observan 11 filtros de papel numerados con las correspondientes muestras.

En la imagen B se observan el desecador del filtro de papel.

Para cuantificar el total de sólidos por muestra recogida se usa un instrumento que

permite determinar la masa exacta de sólidos en 100 ml de muestra recogida.

1. En primer lugar se debe enumerar cada uno de los papeles de filtro que

se precise. Cada papel de filtro corresponderá a cada una de las muestras. Se

asigna un número al papel de filtro para cada muestra recibida.

2. Seguidamente se realiza el filtraje en un papel cilíndrico de filtrado 100 ml

con agua destilada.

3. Se realiza el secado con el desecador del papel de filtro. Se obtiene la

masa de cada uno de los papeles de filtro. Con esta primera medición,

obtendremos el valor del blanco.

4. Se realiza el filtrado de las muestras recibidas, 100 ml en cada uno de los

papeles de filtro numerados.

14

5. Se realiza el secado con el desecador y se anota el valor de la masa.

Para la determinación final de la cuantificación de sólidos de una determinada

muestra, se realiza una sencilla operación matemática.

Masa del residuo sólido del blanco (filtrado de agua destilada) – Masa del

residuo sólido del filtrado de la muestra (100ml) x 10000

Con esta operación matemática se obtiene el total de sólidos (en miligramos/

100mililitro) que había en la muestra recibida en el laboratorio. Este dato debe

registrarse en el informe del cliente, para posteriores interpretaciones.

4. Inoculación de las muestras en placa

Previamente al proceso de inoculación de la muestra en la placa, se debe comprobar

que la campana de extracción está debidamente encendida y la mesa con la que

trabajamos está esterilizada.

En primer lugar se enciende la llama que permitirá crear una zona de inhibición a las

posibles contaminaciones del medio de cultivo al que se va a inocular la muestra.

PROTOCOLO

El punto más importante en esta tarea es el de la correcta inscripción

en la placa del que procede la muestra a la que se va a hacer el

recuento de patógenos en placa, así como de la fecha en la que se

hace la inoculación de la muestra y otros parámetros de interés que

identifiquen bien esta placa.

Se agita la muestra y se extrae 0.1 ml mediante una pipeta y se inocula

en la placa.

Mediante el uso de un Asa de Digralsky de vidrio, se extiende la

alícuota por la placa.

Este procedimiento se repite 2 veces por muestra recibida, de tal forma, el

recuento final del total de patógenos tendrá un menor error.

Una vez se ha realizado la siembra de la alícuota de la muestra en la placa, se cierran

con parafilm para evitar que se abra la tapa y no tengamos contaminación externa y por

último, se introduce en una estufa a 23ºC durante 2 días.

Pasados 2 días, el tiempo necesario para que se produzca el crecimiento de los

hongos en la placa, se procede a la lectura de la placa.

15

5. Lectura en placa: Identificación y cuantificación de los hongos. Pasados 2 días, se recoge de la estufa las placas inoculadas y se procede a la

identificación de posibles patógenos.

Cabe destacar, que en numerosas ocasiones el recuento total de unidades

formadores de colonias es 0, debido a que las muestras recogidas de los drencher están

siguiendo el tratamiento ajustado y no se produce crecimiento de hongos.

En otros casos, el recuento no es 0 y se tiene

que identificar el tipo de hongo y cuantificarlo.

Para ello, se utiliza una cuenta colonias que

facilita mucho el trabajo de identificación y

sobretodo cuantificación de los hongos en placa.

Esta herramienta tiene un mecanismo que

permite cuantificar las colonias de hongos

presentes, de una manera más sencilla. Pulsando

directamente en placa, al lugar donde aparecen

las colonias, va contando, de tal manera que al

finalizar el recuento, obtendremos en una

pantalla analógica el recuento total de colonias.

La mayoría de las veces que se analizan las

placas con crecimiento de hongos, se trata del

género Aspergillus spp. y/o Penicillium spp.

Imagen de un cuenta colonias. Dispone de

una lente móvil que amplifica la visión de la

placa.

16

Imagen captada del contador de microorganismos, donde se pueden observar el

crecimiento de diferentes géneros de hongos en placas inoculadas de muestras recibidas:

a) ufc: 2ufc/ 0,1 mL género: Aspergillus spp.

b) ufc: Incontable género: Penicillium spp.

c) ufc: 0 ufc/mL género: No existe crecimiento

d) ufc: 50 ufc/ mL género: Aspergillus spp.

e) ufc: 220 ufc/ mL género: Aspergillus spp., Penicillium spp.

f) ufc: Incontable género: Crecimiento de bacterias*

Una vez obtenida la suma del total de unidades formadoras en placa, sin distinguir

entre géneros. Se realiza la media entre los datos de las 2 placas y se multiplica por 10.

El resultado obtenido proporcionará las unidades formadoras de colonia por mililitro.

*A priori, el crecimiento de bacterias debe de ser 0, ya que el tipo de medio que se

utiliza para el crecimiento de hongos, presenta cloranfenicol que actúa cómo inhibidor

del crecimiento de bacterias. Aunque, existen casos en los cuales las bacterias son

resistentes a tal compuesto.

Principalmente, como ya se ha indicado en la introducción, cabe esperar que la gran

mayoría de géneros de hongos que aparezcan en las muestras analizadas en placa,

pertenezcan al género Penicillium spp. Es por ello, que a lo largo de la estancia en esta

17

empresa, esporádicamente se encuentra algún caso de contaminación por los géneros

Cladosporium spp. y Rhizopus spp., también causantes de infecciones en los cítricos.

(Izq.) Crecimiento de Rhizopus (A) en una muestra recogida. Es un

caso poco frecuente.

(Dcha.) Crecimiento de 2 especies: (A) Penicillium spp., (B)

Aspergillus spp.

El crecimiento de hongos del género Aspergillus spp., no tiene mucha importancia

microbiológica ya que este género no ocasiona un gran perjuicio para la viabilidad de

los frutos en los almacenes.

1ª placa: Aspergillus spp.: 1 ufc/ 0,1 mL Penicillium spp.: 6 ufc/ 0,1 mL

2ª placa: Aspergillus spp.: 2 ufc/ 0,1 mL Penicillium spp.: 63 ufc/ 0,1 mL

3ª placa: Aspergillus spp.: 0 ufc/ mL Penicillium spp.: Incotanble (> 1500 ufc/ mL)

18

6. Elaboración de medios Sabouraud Cloranfenicol Agar

Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos

patógenos y saprófitos. El medio de cultivo selectivo agar-sabouraud permite que se

desarrollen los hongos que provocan la podredumbre en los cítricos. Utilizado por

primera vez por el médico francés Raymound Sabouraud. Las características de este

medio son las siguientes:

40 g/L glucosa: Nutriente que permite el crecimiento de los hongos.

Fuente de carbono y de energía.

15 g/L agar: La matriz sobre la cual va a crecer el hongo.

15 g/L pluripeptona: Fuente de nitrógeno.

0,05 g/L Cloranfenicol: Inhibe el crecimiento de hongos

pH 5.6: pH relativamente ácido que permite el crecimiento de los hongos,

en cambio esta acidez es un factor limitante del crecimiento de las bacterias.

PROTOCOLO:

-Se utiliza una concentración de 65,5 gramos de concentrado de SCA con 1 litro de

agua destilada.

-Hay que tomar precauciones en el proceso de mezcla del soluto con el disolvente,

ya que la inhalación del producto en seco es tóxico. Por tanto, hay que utilizar mascarilla

para evitar riesgos innecesarios.

-Se debe agitar la disolución.

-Se introduce el recipiente con la disolución en el autoclave para calentarla y

esterilizarla. (118-121 ºC durante 15 minutos.)

-En condiciones de esterilidad (campana de extracción y llama) y mediante el uso de

placas Petri estériles, se vierte el medio de cultivo hasta la mitad de la placa. Una vez

rellenadas un determinado número de placas, se procede a activar la luz UVA de la

campana de extracción, que por su actividad biocida, reducirá la probabilidad de

contaminación.

-Una vez solidificado el medio, las placas Petri serán debidamente guardadas y

precintadas mediante parafilm, para que las resguarde de una posible contaminación y

debidamente etiquetadas con la fecha de elaboración y el tipo de medio de cultivo que

se trata, en este caso SCA.

19

Mediante un Litro de medio de cultivo líquido de SCA se pueda aplicar suficiente

medio para 66 placas Petri estériles aproximadamente.

Imágenes A, B y C del proceso de la elaboración de los medios de cultivo SCA para identificación y

cuantificación de hongos causantes de la podredumbre de los cítricos.

Imagen B, se observa la irradiación de rayos UVA como agente biocida.

7. Elaboración de medios Agar-Plate-Count (PCA)

La elaboración del medio PCA, a diferencia del medio SCA, sirve para detectar

bacterias. Estas placas son utilizadas en la determinación de la contaminación ambiental

y superficial. El recuento de bacterias en placa, es indicativo del estado de desinfección

en la que se encuentra una determinada zona, como se detalla en el punto de

determinación de la calidad ambiental y superficial.

En estos casos, el laboratorio de microbiología solo informa de la presencia o

ausencia de bacterias al cliente. No obstante, se procede el envío de las muestras a un

laboratorio secundario para realizar las pruebas bioquímicas, serológicas y/o

moleculares que identifiquen la especie de bacteria, si procede.

Las características del medio son los siguientes:

- 1,5 % de agar.

-0,5% de peptona

-0,25% de extracto de levadura.

-0,1% de glucosa

-pH neutro.

20

Imagen de la elaboración de placas PCA ( plate-agar-count) para detección de bacterias.

Se sigue el mismo protocolo de elaboración de los medios de cultivo, así como las

mismas condiciones de esterilidad anteriormente descritas.

La única diferencia entre la elaboración de estos dos medios, es la cantidad de

concentrado que se añade al litro de agua destilada (25 g.).

8. Elaboración de placas Rodac

La finalidad de la elaboración de estos tipos de placas es diferente a las anteriores

placas descritas. Las placas Petri sirven para cultivar mediante un inóculo de una

muestra y observar si en este inóculo había microorganismos.

La finalidad de estas placas rodac o placas de contacto es la detectar

microorganismos presentes en superficies. Colocando directamente esta placa sobre la

superficie de una cámara frigorífica, maquinaria, paredes de los almacenes, etc. Se

comprueba el estado de contaminación de diferentes lugares que pueden estar en

contacto con los cítricos y por tanto, posibles fuentes de contaminación.

Este tipo de placas es muy eficaz y rápido ya que permite conocer el estado de

determinadas superficies sin la necesidad de desplazar parte del laboratorio de análisis

hasta el lugar de muestreo, ni tampoco del personal técnico del laboratorio, ya que sin

apenas formación se pueden realizar los controles.

21

Posteriormente, estas placas debidamente tapadas y selladas con parafilm, se

envian al laboratorio de análisis, y se procede al recuento de unidades formadoras de

colonias.

Imagen de una placa de contacto elaborada

en el laboratorio.

9. Interpretación de los resultados obtenidos

Este punto, es el más importante de todo el proceso de análisis realizado en el

laboratorio. El recuento de hongos en placa será transferido a una hoja Excel. Así como,

los datos que se han registrado, en la cuantificación de los distintos fungicidas, gracias

a diferentes técnicas cromatográficas y espectrofotométricas, son transferidas a este

mismo documento (anexo 1). En esta hoja Excel, aparece el nombre del cliente al que

pertenece la muestra a la que se realiza el seguimiento del Drencher en sus

instalaciones, así como del/os tratamientos fungicidas que se le aplican. Se detalla, la

fecha en la cual se hizo la extracción de las muestras y en esta misma fila de la tabla,

se anotan los resultados fisicoquímicos y microbiológicos estimados en el laboratorio.

Al final de la fila, aparece una casilla con el nombre “observaciones”, en esta se debe

introducir datos relevantes que el cliente deberá saber sobre los tratamientos aplicados.

El trabajo finaliza con la participación de los distintos técnicos comerciales que

administran los tratamientos directamente a los drencher. En los futuros análisis que se

realicen del mismo cliente, se tiene que ajustar las dosis de los tratamientos utilizados

para reducir al mínimo el crecimiento de los hongos

.

22

Participación en ensayos de laboratorio

Ensayo de resistencias

En los diferentes tratamientos poscosecha antifúngicos sobre los cítricos, se

consigue reducir, en gran medida, la cantidad de podrido. No obstante, existen casos

en los que el hongo consigue resistir a ciertos compuestos antifúngicos y/o a ciertas

concentraciones. Existen biotipos de las especies de Penicillium spp que pueden

llegar a ser resistentes a los funguicidos usados normalmente. Por ello, estos

ensayos son muy útiles, porque se consigue determinar, a partir del aislamiento de

un hongo que ha causado podredumbre, el tratamiento y la concentración al que es

efectivo. (6)

Para poder estimar el tratamiento y la concentración específica que inhibe el

crecimiento de este hongo se deben de realizar los siguientes ensayos:

En primer lugar, se deben elaborar placas fortificadas. Las placas fortificadas son

placas con medio SCA al que se le ha añadido una concentración conocida de un

determinado fungicida. Se elaboran placas con SCA y fungicidas diferentes o

mezclas de estos (Imazalil, pyrimethanil…), además de la elaboración de estas

placas se realizaran a un gradiente de concentración del fungicida (1ppm, 2ppm,

5ppm). Si existe crecimiento del hongo en un determinado tratamiento y/o

concentración, quiere decir que este hongo tiene cierta resistencia al fungicida.

Elaboración de medios enriquecidos para obtener resistencias

Para la elaboración de estos medios de crecimiento fortificados, se precisa añadir

la cantidad exacta de fungicida para el qual se desea comprobar la posible

resistencia.

A continuación se describe el procedimiento de elaboración de medio SCA

fortificado para un determinado fungicida:

- Se procede a diluir en 1 litro de agua destilada una cantidad conocida

(ppm) del producto fungicida (Imazalil, pyrimethanil…). Utilizando un matraz

aforado, se añade la cantidad necesaria del producto antifúngico para obtener

una concentración determinada y se afora con agua destilada hasta obtener 1

litro de disolución.

23

- Para verificar que se ha seguido bien el proceso y obtenido la dilución

deseada, se procede a la detección mediante el análisis cromatográfico del valor

real de la disolución.

- Una vez verificado el valor real de la disolución, se procede a seguir el

protocolo anteriormente descrito de elaboración de placas con medio SCA.

Las placas de SCA fortificadas, se deben rotular debidamente, indicando la diferentes

concentraciones y fungicidas , así se evitan errores en las estimaciones finales.

Una vez obtenidas las diferentes placas SCA fortificados y debidamente

rotuladas, se procederá a la inoculación del medio del hongo problema:

El procedimiento que se sigue es muy sencillo. Se debe producir un crecimiento

inicial del hongo problema sobre una placa en medio SCA (no fortificado).

Posteriormente, se inoculan porciones de el medio de cultivo con el crecimiento del

hongo, en las diferentes placas fortificadas para conocer al tratamiento y a la

concentración a la cuál es resistente el hongo problema.

La inoculación del hongo se realiza de la siguiente forma:

Se realiza un cultivo previo, inoculando el hongo problema sobre una placa en

medio SCA. Se deja unos días en la estufa a 20ºC para obtener un crecimiento

total en la placa.

Imagen que muestra el procedimiento de inoculación de los discos de agar con el hongo

problema en un gradiente de concentración de placas fortificadas.

24

Con la ayuda de un cilindro de acero de un diametro pequeño (arededor de 0,5

cm) se realizan una serie de agujeros sobre el medio donde ha crecido el hongo.

De tal manera, que quedan una serie de discos simétricos en la placa.

Con la ayuda de un asa de siembra de platino, debidamente esterilzada, se

extrae el disco de agar. Una vez se ha conseguido extraer, con sumo cuidado,

se depositará en la placa con el medio SCA fortificado.

Se deposita el disco en la parte central de la placa. Además, se debe depositar

la superfície donde ha crecidoel hongo en contacto directo con el medio de agar

fortificado.

Por último, son debidamente cerradas con parafilm y se guardan en la estufa a

23ºC para posteriores interpretaciones de los resultados.

Imagen del resultado de un ensayo de resistencias.Se utilizaron 2 tratamientos d

(A y B) a diferentes concentraciones (1ppm, 2ppm y 5 ppm). El tratamiento A, se

utilizó el fungicida Imazalil. Por otro lado, para el tratamiento B, se utilizó el fungicida

pyrimethanil.

En la imagen superior, se puede observar el resultado final de un ensayo de

resistencias. Existe claramente la inhibición del crecimiento del hongo problema a

tratamiento con el fungicida Imazalil en todas las concentraciones (A). En cambio, el

hongo es resistente al tratamiento con pyrimetanil (B), ya que se observa un

crecimiento micelar en la placa fortificada. Además, en la placa de crecimiento de

25

concentración 5 ppm, se observa un halo de crecimiento menor que el

correspondiente a concentraciones menores. Este menor tamaño del halo, puede

indicar que el hongo es sensible a concentraciones superiores a 5ppm del fungicida

utilizado. Es posible, que se realice un estudio posterior del hongo problema para

determinar si existen resistencias a concentraciones superiores a 5 ppm de

pyrimethanil. El hongo problema, se trata de la especie Penicillium italicum, ya que

presenta su coloración tipica azulada en el momento de la esporulación.

Imagen del resultado de un ensayo de resistencias.Se utilizaron 2 tratamientos d (A y

B) a diferentes concentraciones (1ppm, 2ppm y 5 ppm). El tratamiento A, se utilizó el

fungicida Imazalil. Por otro lado, para el tratamiento B, se utilizó el fungicida pyrimethanil.

En el caso que se muestra en la imagen superior, se observa una resistencia a

los 2 tratamientos, imazalil (A) y pyrimethanil (B). Además, no existe una reducción

del halo de crecimiento del hongo en las diferentes concentraciones de los

fungicidas. Se puede observar, como prácticamente el diámetro del halo de

crecimiento es similar tanto en el control (placa de SCA) como en el resto de placas

fortificadas de los 2 fungicidas a diferentes concentraciones. Al igual que en el caso

anteriormente descrito, se trata de la especie Penicillium italicum, ya que presenta

26

la coloración azulada típica del momento de esporulación. Sin embargo, se observa

que en la placa fortificada con Pyrimethanil de concentración 5ppm, no existe

esporulación. Posiblemente, a esta concentración se inhibe la esporulación de esta

cepa.

Ensayos de fitotoxicidad

Los ensayos de fitotoxicidad se utilizan para conocer la corrosión de los diferentes

tratamientos anti-fúngicos aplicados sobre los cítricos recolectados. La gran

importancia que tienen estos ensayos es debido a la existencia de variedades

diferentes de cítricos que se comercializan, y a que continuamente se crean nuevas.

Además de ello, existen grandes diferencias fisiológicas entre las variedades de

cítricos que traen consigo diferentes sensibilidades de la piel a los tratamientos. Así

pues, es totalmente contraproducente que un determinado tratamiento fungicida

ocasione lesiones en la piel del cítrico, ya que podría producir que un hongo

colonizará el fruto debido a esta lesión.

A continuación se pasará a describir el protocolo seguido para realizar el ensayo

de fitotoxicidad:

Imagen que muestra los pasos que se siguen a la hora de realizar un ensayo de fitopatogenicidad

sobre un cítrico de la variedad Nadurcott.

27

- Primeramente, se deben de obtener un número de cítricos de la variedad

en cuestión que sea relevante para poder confirmar la afectación, mayor o

menor, del tratamiento.

- Posteriormente, se aplica 1mL del tratamiento en un cilindro de algodón

de 25mm. Dichos cilindros se aplicarán en la parte más convexa del cítrico. Este

procedimiento se complica en algunas variedades, debido a su grado de

convexidad.

- Posteriormente se aplica un trozo de cartulina cuadrada con un número,

que indicará el tratamiento aplicado en dicha parte del cítrico. Por último,

mediante una tira de parafilm, se mantendrá bien sujeto al cítrico.

- Pasados 24 horas, a una temperatura de 22ºC y humedad relativa del 80-

90%, se observará el posible efecto.

Este tipo de ensayos tienen una gran importancia comercial, ya que si un

determinado tratamiento fungicida produce daños fisiológicos en la superficie

den una determinada variedad de cítricos, puede incluso llevar a ocasionar el

rechazo por parte del consumidor.

Determinación de la contaminación ambiental y superficial

Con cierta periodicidad se debe comprobar cuál es el grado de contaminación

microbiológica en el que se encuentras los diferentes almacenes de cítricos. Se debe

de controlar la carga microbiológica presente en diferentes puntos de los almacenes,

ya que pueden ser un foco de contaminación para los frutos almacenados en estas

instalaciones. Para reducir la podredumbre de cítricos, este es un parámetro

fundamental y consigue una mayor efectividad de los tratamientos fungicidas

utilizados. Por consiguiente, si se reduce la carga microbiana existente, el

tratamiento post-cosecha será más efectivo ya que el número de conidios presentes

en la superficie del cítrico será menor.

A la caracterización de la contaminación ambiental y superficial, les siguen una

serie de medidas de desinfección múltiples. Posteriormente, se debe volver a

realizar la determinación de la contaminación, para verificar que el tratamiento de

desinfección ha sido realmente efectivo e indicativo de la optimización de las

diferentes instalaciones para almacenar, transportar y refrigerar los frutos cítricos.

Cada almacén, presenta unas características y una serie de parámetros que

propicia a que se controle con mayor frecuencia una serie de puntos críticos que

otros. Pero, en definitiva, el procedimiento que se sigue es el siguiente:

28

Contaminación ambiental

Por un lado, la obtención directa de la contaminación ambiental. El

personal encargado de realizar esta comprobación, no debe de interferir

en absoluto en los resultados obtenidos, por tanto se deben de tomar unas

series de indicaciones de higiene

-Mediante el uso de guantes, se coge una placa de SCA o PCA y se

deposita sobre la mano.

-Se abre la placa y se dejará abierta durante 60 segundos a una altura

aproximada de 1,5m. Una vez pasados estos segundos, se procede a

cerrar la placa con parafilm, identificarla y depositarla en la estufa a 23ºC

durante 2 días.

-Finalmente, haremos el recuento (Ufc) existentes en la placa. Se trata

de una determinación cualitativa de estado de contaminación ambiental

en la que se encuentra una determinada zona.

-La otra posibilidad, presenta un mayor control de las condiciones

ambientales. En este caso, se utiliza una herramienta denominada

AirTest. Con esta herramienta, se consigue regular los litros de aire que

pasarán al medio SCA/PCA. Finalmente, se realiza el recuento de

colonias existentes y se obtiene un resultado estimado de la

contaminación fúngica de la zona analizada en relación con los litros de

aire que pasaron por el medio.

-Para determinar la contaminación (Ufc) que se encuentra en 1m3, se

utiliza la siguiente formula:

Ufc x 1000/ volumen de aire muestreado

29

A continuación se van a describir 2 ejemplos de determinación de la contaminación

En la imagen A, las pruebas de

determinación de la contaminación ambiental se

realizaron mediante la simple apertura de una placa

SCA. En la placa, se desarrollaron los siguientes

géneros de hongos: diferentes especies de

Penicillium spp. y especies del género Cladosporium

spp (aparecen dentro de los círculos rojos).

Por otro lado, la imagen B muestra la contaminación de una placa mediante el

procedimiento que se obtiene con el airtest. Se

puede observar un conjunto de puntos en la

placa. Estos puntos que se observan son colonias

de hongos (Penicillium spp.). El airtest dispone de

una lámina de plástico agujereada por donde

entra el aire y deposita las esporas en la placa, en

este caso, la contaminación ambiental era

elevada ya que en la totalidad de estos agujeros

se produjo el crecimiento de una colonia de

Penicillium spp y Aspergillus spp.

Contaminación superficial:

Se trata de una estimación complementaria a la anterior descrita. En este caso,

se analiza la cantidad de hongos o esporas que existen en una superficie determinada,

debido a su susceptibilidad o por el impacto que puede ocasionar sobre los cítricos.

Sería el caso, por ejemplo, de la superficie de las cintas transportadoras de los cítricos

para ser enmalladas. Es un punto crítico que puede ocasionar una colonización de

hongos en los cítricos.

El procedimiento para la determianción de la contaminación superficial sobre una

cinta transportadora de cítricos.

30

En primer lugar, se debe identificar la zona donde se va a efectuar la muestra.

Se utilizarán placas de contacto de medio SCA, anteriormente descritas. Además, se

deben de tomar las medidas de higiene pertinentes para

la obtención real de la contaminación en la zona

estudiada.

Se aplica por contacto directo las placas de

contacto (rodac) sobre la superficie de las cintas

transportadoras, durante 10 segundos. Por último, las

diferentes placas utilizadas, se mantendrán en la estufa

a 20ºC. Pasados unos días, se realizarán las diferentes estimaciones, sobre los

resultados obtenidos tras la lectura de las placas de contacto.

La determinación de la contaminación de una superficie se estima, mediante el recuento

total de hongos que existen. Las placas rodac están cuadriculadas, y presentan

cuadrados de longitud de 1 cm por cada lado. De tal manera, que el recuento total de

hongos se divide finalmente por una superficie total 24 cm2

Este valor, nos permitirá conocer el estado de contaminación en el que se encuentra

una determinada zona de interés.

Placas Identificación de hongos

1ª placa Se observan colonias del género Penicillium spp.

2ª placa Se observan colonias de los géneros: Aspergillus spp. y

Penicillium spp.

3 ª placa Se trata de una placa muy contaminada y con gran diversidad de

especies de hongos: Rhizoppus spp , Penicillium spp .

Cladosporium spp , Aspergillus spp.

31

OBJETIVOS CONSEGUIDOS

1. Determinación de diferentes parámetros fisicoquímicos en el control de

calidad de productos: pH, densidad, concentración de sólidos no volátiles…

2. Colaboración con la gestión de la documentación al registro de la entrada

y salida de productos químicos.

3. Pruebas microbiológicas: Inoculación, identificación y cuantificación de

hongos

4. Participación en ensayos para el control de resistencias en hongos y en

ensayos de fitotoxicidad de cítricos.

5. Determinación de la calidad ambiental a partir de la cuantificación de la

contaminación ambiental y superficial.

6. Ampliación de conocimientos y habilidades sobre tratamientos post-

cosecha para frutos cítricos.

VALORACIÓN PERSONAL

La elaboración de las prácticas en el máster de calidad y seguridad alimentaria

en esta empresa, me ha aportado una gran experiencia a nivel profesional y

académico. Así mismo, he ampliado mis conocimientos en cuanto a las técnicas y

tratamientos aplicados al control de la podredumbre de los cítricos. Cabe destacar,

la gran acogida del personal de laboratorio al estudiante de prácticas, dando el

máximo apoyo en la realización de sus tareas en él.

En mi opinión, la realización de unas prácticas relacionadas con el sector

agroalimentario, son necesarias para poder aplicar los conocimientos adquiridos en

la licenciatura y el máster, así como, aprender una serie de técnicas específicas del

ámbito en el que se trabaje.

Por último, la cesión de cierta responsabilidad en la realización de las tareas, así

como la ordenación de los objetivos diarios a realizar por el estudiante de prácticas,

son también muy importantes en la formación del estudiante, para afianzar la actitud

responsable y ordenada de su futuro profesional.

32

ANEXOS

33

BIBLIOGRAFIA:

1. L.T. Timmer, S.M. Garnsey, J.H.Graham (2002) Plagas y enfermedades de los

cítricos. Ediciones Mundi—Prensa.The American Phytopathological Society.

2. R. Barkai-Golan (2001), Postharvest Diseases of Fruits and Vegetables.

Development and Control Department of Postharvest Science of Fresh

Produce, Institute of Technology and Storage of Agricultural Products, The

Volcani Center, Israel

3. Smilanick, J. L., Mansour, M. F., and Sorenson, D. 2006. Pre- and postharvest

treatments to control green mold of citrus fruit during ethylene degreening. Plant

Dis. 90:89-96.

4. James E. Adaskaveg (2004) Major postharvest diseases of citrus in California and their management. Department of Plant Pathology and Microbiology University of California

5. Patricia J.Lindsey, Susie S.Briggs, Kirby Moulton, Adel A.Kader (1989) Postharvest Fungicides on citrus: Issues and alternatives. Department of Agricultural and resource economics. University of California.

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http://es.mt.com/es/es/home.html?cmp=sea_37010312&bookedkeyword=mettle

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www.tecnicoagricola.es/tratamientos-en-drencher-en-almacenes-postcosecha/

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9. Betelgeux. Equipo de alto rendimiento para el control microbiológico del aire.

AirTest Dirección URL: www.betelgeux.es (Consulta, 24 de Marzo de 2015)

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500 (Consulta 20/04/2015)

11. Institut valencià de competitivitaT. Dirección URL: http://www.ivace.es/

(Consulta,19 de Mayo de 2015)

12. indicación geográfica protegida: Cítricos valencianos Dirección URL:

http://www.citricosvalencianos.com/ (Consulta.,19 de Mayo de 2015)

34