UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍAPOSTGRADO DE PERIODONCIA

Microbiología

MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA

Cuenca, enero del 2016

MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRAMEDIOS DE CULTIVO

Es una solución equilibrada de los nutrientes y factores de crecimiento necesarios para la multiplicación y desarrollo de los microorganismos en el laboratorio. Con el objetivo de aislar e identificar las diferentes especies o levar a cabo estudios complementario.

No existe un medio de cultivo universal para todas ellas, pues los microorganismos presenta gran diversidad metabólica y mientras hay microorganismos capases de crecer en cualquier medio, otros requieren medios especiales, en tanto que otros no cresen en ningún medio.

CONDICIONES QUE DEBE CUMPLIR

Los medios de cultivo deben cumplir con ciertos requisitos:

1. Nutrientes adecuados2. Humedad suficiente3. Un pH ajustado4. Estar estéril inicialmente

La mayoría de medios de cultivos traen sus componentes previamente mesclados que tan solo requiere adición de agua.

CONSTITUYENTES HABITUALES

Agua: componente básico, es utilizado para disolver los demás constituyentes, generalmente se la emplea destilada o desionizada y no debe contener cloro, plomo o detergente.

Extractos: pulverizados de órganos o tejidos animales o vegetales, como cerebro, carne o semillas, que proporcionan los hidratos de carbono, compuestos nitrogenados, vitaminas hidrosolubles, compuestos azufrados y sales.

Peptona: producto de la digestión de sustancias proteicas, usado como fuente de carbono, nitrógeno y energía.

Hidratos de carbono: otorga energía, oxigeno nitrógeno y carbono. El más usado es la glucosa pero puede ser usado también fructosa, sacarosa, lactosa y almidón.

Cloruro de sodio: no es imprescindible, pero regula las propiedades osmóticas, con el fin de evitar fenómeno de plasmólisis.

Líquidos corporales: sangre entera plasma o suero sanguíneo tanto de origen animal como humano, usados para aporte de factores de crecimiento.

Sistemas amortiguadores: sales como fosfato bisodico o potásico, mantiene el pH dentro del espectro de crecimiento microbiano, y como fuente de fosforo.

Iniciadores de pH: usados para dar prueba visual de las variaciones del pH.

Agentes reductores: tales como la cisteína y el tioglicolato de sodio; crean atmosfera atractiva para el crecimiento de microorganismo anaerobios aerobios facultativos y estrictos.

Agentes selectivos: cristal violeta, sales biliares, el telurio de potasio, los antibióticos. Que agregados los convierten en selectivos para determinados microorganismos.

Agar: al 1- 2 % otorga solides, a los medios de cultivo y es obtenido de ciertas algas marinas, insoluble en agua fría y funde a los 80 – 100°C y se mantiene en este estado hasta los 45°C y por debajo de esta temperatura comienza a solidificarse.

CLASIFICACIÓN:

A. POR SU ESTADO FÍSICO:

1.- LÍQUIDOS: denominado caldos, constituidos por nutrientes en solución acuosa, se los utiliza para el mantenimiento de los microorganismos. (Caldo nutritivo, infusión cerebro corazón, mitis salivarius Gold)

2.- SOLIDOS: Llamados agar, se obtiene añadiendo a un medio de cultivo liquido una sustancia gelidificante como en agar al 1.5- al 2 %, y debe colocarse en cajas Petri o tubos de ensayo, en este último se puede colocar el tubo inclinado para obtener mayor superficie de siembra (agar inclinado, pico de flauta o slant) o dejar enfriar en posición vertical (agar columna.) se utilizan para aislar e individualizar microorganismos.

3.- SEMISÓLIDOS: medios líquidos con agar al 0,3 – 0,5%, usado para determinar la motilidad de los microorganismos.

B. POR SU ORIGEN

1.- MEDIOS NATURALES: se obtiene a partir de sustancias naturales animales o vegetales, como suero leche o papa, no es constante

2.- MEDIOS SINTÉTICOS O ARTIFICIALES: como el agar nutritivo que contiene nutrientes que permiten el desarrollo de la mayoría de microorganismos no exigentes sin ofrecer ventaja a ninguno.

3.- MEDIOS SEMISINTETICOS O COMPLEJOS: a los medios sintéticos se les agrega factores de crecimiento tales como extracto de levadura, carne o vegetales, se lo utiliza para el cultivo de la mayoría de microorganismos (agar y caldo BHI)

C.- POR SU UTILIDAD

1.- MEDIOS GENERALES O COMUNES: contiene sustancias nutritivas mínimas para el crecimiento de microorganismos no exigentes, y puede ser líquidos o sólidos.

2.-MEDIOS ENRIQUECIDOS: para los requerimientos nutritivos de microorganismos exigentes, lleva agregado de suero líquido ascítico, sangre glucosa o factores esenciales, como por ejemplos sangre-agar para estreptococos, agar-sangre con hemina y medaniona para bacilos gramnegativos del biofilm de la placa subgingival.

3.- MEDIOS SELECTIVOS: para el crecimiento de determinados microorganismos mientras inhibe el crecimiento de otros, y esto se logra por:

a) por agregado de compuestos químicos, como inhibidores colorantes o antibióticos. Como por ejemplo el SS (con verde brillante y sales biliares). Para el desarrollo de la Salmonella shigella, el mitis salivarius (con cristal violeta, azul tripan y telurio de potasio) para el crecimiento de estreptococos bucales, y el medio de Sabouraud con cloranfenicol para el aislamiento de hongos.

b) por ajuste del pH: como el medio de rogosa con pH 5,4 para el crecimiento de lactobacilos.

c) por ajuste osmótico: con medios de cultivo con alto contenido de cloruro de sodio, como el medio manitol-sal, para aislar e identificar estafilococo.

4.- MEDIOS DIFERENCIALES: para diferenciar microorganismos semejantes, sobre la base de alguna propiedad bioquímica, por ejemplo los medios que contiene azúcar y colorantes, como indicador de pH, si el microorganismo produce ácidos a partir de hidratos de carbono producirá el consiguiente viraje

de color, un ejemplo es el medio base rojo fenol para identificar distintas especies de estreptococos.

5.- MEDIOS DE TRANSPORTE: aseguran la viabilidad de los microorganismos desde el momento de la toma hasta su procesamiento, son medios pocos nutritivos, líquidos o semisólidos, que no favorece el crecimiento de los microorganismos. Otros pueden inhibir la acción enzimática de autodestrucción o efectos letales de la oxidación. Como ejemplos tenemos caldo tioglicolato, solución de Ringer, medio de Stuart.

Para el transporte de origen periodontal se puede utilizar, el medio de transporte VMGA III, (Viability Medium Goteborg Anaerobically). Para el transporte de virus se utilizan suplementos de proteína para estabilizar virus frágiles y antibióticos para reducir contaminación bacteriana.

CULTIVOS ANAERÓBICOS

Para el cultivo de bacterias anaerobias, todo proceso debe efectuarse en ausencia de oxigeno desde la selección, recolección y trasporte de la muestra, hasta los cultivos, ya que estos microorganismos pueden morir en exposición al oxígeno. Y la alteración de algún paso puede conducir a resultados erróneos y proporcionar información equivocada. La siembra será realizada inmediatamente, algunos métodos consisten en la siembra en la profundidad de la placa y en tubos con medio solido o liquido cubierto con capa de vaselina.

O en medios esterilizados en forma aerobia prerreducidos (PRAS)

Condiciones aerobias más estrictas como aquellas requeridas para la incubación de microorganismos relacionados con enfermedades humanas son por ejemplo:

Jarra de evacuación-reemplazo: el aire es eliminado y reemplazado por una mescla de 85% de nitrógeno, 10% de hidrogeno y 5% de dióxido de carbono.

Jarra anaerobia con generador de gas desechable: se basa en el empleo de un sobre con dos tabletas; una de borohidrato sódico y otra de bicarbonato de sodio y ácido cítrico, se coloca la placas y tubos en la jarra

junto con los sobres y se agrega 10 ml de agua, se cierra herméticamente con la tapa donde se ubica el catalizador. La combinación de agua y tabletas generan dióxido de carbono e hidrogeno, que en presencia del paladio del catalizador reacciona con el oxígeno produciendo agua y consumiendo este oxígeno.

La anaerobiosis se comprueba introduciendo indicadores de anaerobiosis que son tiras embebidas en azul de metileno oxidado o resazurina, y se torna incolora al desaparecer el oxígeno. En la actualidad se dispone de bolsas de plástico, presentan un generador de gas d H2-CO2 al que se le agrega agua con generador de gas desechable y un sistema indicador que emplea resazurina.

Cámara de anaerobiosis: permite procesar y realizar el aislamiento e identificación de bacterias anaerobias. Puede ser construida de materiales como acero, plástico acrílico o fibra de vidrio. La mescla gaseosa empleada para eliminar el oxígeno contiene 85% de nitrógeno, 10% de hidrogeno, y 5 % de dióxido de carbono.

Las bacterias con necesidades de dióxido de carbono distintas a las atmosféricas, llamadas capnofilas, puede incubarse en un simple frasco con una vela, esta vela consume la concentración de oxigeno hasta apagarse, proporcionando una atmosfera con concentración del 3% de CO2.

CULTIVOS PARA HONGOS

Para el aislamiento debe emplearse un medio selectivo y orto no selectivo, los medios utilizados para su aislamiento deben cumplir las siguientes características:

Medios enriquecidos Con y sin agregados de sangre Con y sin cicloeximida Con y sin agregados de agentes antibacterianos

Medios enriquecidos como el agar SABHI (agar dextrosa de sabouraud con infusión cerebro corazón) usado para aislar hongos saprofitos y patógenos, como los dermatofilos. Par aislar algunos microrganismos se requiere elementos nutricionales especiales como medios de cultivo con 5-10% de sangre de carnero para especies como histoplasma capsulatum.

Para evitar el sobre desarrollo de ciertos hongos filamentosos se empleara cicloheximida, sin embargo no todos son inhibidos por esta como por ejemplo Cryptococcus neoformans, Candida krusei, y especies de Aspergillus. Para la eliminación de posible contaminación bacteriana se usara uno o más antibióticos como penicilina, estreptomicina, gentamicina o cloranfenicol. El agar mycosel posee ambos inhibidores y se indica su uso para aislamiento primario de dermatófilos.

La identificación de los hongos filamentosos se basa en las características de las colonias como textura color y velocidad de crecimiento, y el aspecto de las esporas que pueden formarse, pero requiere tiempo para su producción.

Para los hongos levaduriformes se basa en el estudio delas características morfológicas macroscópicas y microscópicas y patrones bioquímicos de asimilación de azúcar, requiere de uno o más días para su correcta interpretación. En los últimos años se ha facilitado el estudio de levaduras debido a la introducción de cultivos cromógenos, que permiten aislamiento e identificación simultánea al generarse colonias con diferente textura y color para distintas especies.

Existen diversas marcas comerciales como Albicas ID y Candida ID- bioMerieux, Francia; CHROMagar cándida- CHROMagar Company, Francia.

CULTIVOS CELULARES

Algunas bacterias nunca han podido ser cultivadas como en el caso del bacilo de la lepra (Micobacterium leprae) o la espiroqueta que causa la sífilis (Treponema pallidum). Con excepciones, bacterias intracelulares obligadas como las rikettsias y las clamidias tampoco proliferan en medios artificiales, los virus solo crecerán en animales de experimentación, huevos embrionarios o células vivas.

Para aislar y conservar virus el medio más antiguo es la inoculación en animales de experimentación como ratones lactantes o adultos, cobayos, conejos y en algunos casos primates. Pero debido al costo de mantenimiento, complejidad de instalaciones, el riesgo de manipulación de animales infectados y presencia de virus latentes se los ha ido reemplazando por cultivos celulares. Pero aún se requiere el uso de animales, sobre todo para el estudio de la inmunidad de enfermedades virales, ensayos de vacunas, estudios de virus oncogénicos, antisueros y pruebas antimicrobianas.

SIEMBRA

Es la colocación de un microorganismo en un ambiente artificial apropiado, para que lleve a cabo su metabolismo, desarrollo y reproducción. Las técnicas de siembra varían según el estado físico de medio o necesidades gaseosas del microorganismo.

Una condición básica de la siembra es que se realice bajo rigurosa asepsia para evitar el crecimiento de microorganismos contaminantes, la siembra tiene como finalidad el cultivo que es el crecimiento poblacional de microorganismos, en un medio de cultivo bajo condiciones de laboratorio.

Una de las condiciones para el cultivo es la temperatura de incubación, la cual debe brindar condiciones óptimas para el crecimiento de microorganismos, la mayoría se desarrollan a 35°C de temperatura. Sin embargo las temperaturas disgenesicas pueden ser altas como 60°C típico para el desarrollo de S. faecalis o de 44°C para E, coli pero también pueden ser bajas como 4°C para el cultivo de Listeria.

Para el desarrollo de aerobios basta con colocar la caja o tubo de siembra a 35°C en estufa para cultivo, cuya atmosfera es igual a la ambiental. La mayoría de hongos cresen a 30°C sim embargo de pueden aislar a temperatura ambiente o a 35°C. Los tiempos de incubación varían, para los hongos filamentosos será de entre 15 a 30 días en cambio las levaduras al igual que muchas bacterias entre 24 a 48 horas.

Las placas o tubos donde se sospeche la existencia de anaerobios, debe incubarse al menos durante 48 horas a temperatura de entre 35 a 37°C y reincubarse durante 2 a 4 días más para permitir el crecimiento lento de las colonias.

Luego de la inoculación e incubación los microorganismos se multiplican formando una masa macroscópicamente visible denominada colonia, que es un clon procedente de un mismo germen y a partir del cual será posible realizar el aislamiento y trasplante.

AISLAMIENTO

La siembra del material proveniente de una muestra clínica por lo general da como resultado cultivos mixtos, del cual es imprescindible separar los distintos tipos de colonias para obtener cultivos puros o axénicos, ya que los cultivos mixtos proporcionaran información de poca utilidad o errónea. Solo los cultivos puros permiten realizar p estudios sobre propiedades bioquímicas y sensibilidad a antimicrobianos selectivos conocido como antibiograma.

Existe diversa técnicas de aislamiento, las más usadas se basan en un medio de cultivo solido en el cual los microorganismos dan origen a colonias separadas, como cada colonia procede de una sola célula se habla de unidad formadora de colonias (UFC).

Los métodos de aislamiento más frecuente son:

Siembra por agotamiento por estrías: método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inocuo (material microbiano usado para sembrar), sobre un medio solido contenido en una capsula de Petri. A medida que se realizan las estrías las bacterias pasan del asa al medio en un número cada vez menor, de manera que las estrías iniciales proporcionan crecimiento confluyente en tanto que a lo largo de las últimas estrías se conforman colonias bien aisladas.

Siembra por diseminación en superficie: consiste en colocar 0,005ml (una gota) de inoculo en el centro de una placa de Petri, con medio de cultivo. Se la extiende con espátula de Drigalsky, hacia adelante y atrás mientras se hace girar la placa, se tapa se invierte la placa y envía a incubación.

Siembra de difusión seriada: consiste en realizar diluciones sucesivas con el objeto de sembrar cantidades conocidas de estas diluciones en las capsulas de Petri, esto permitirá conocer el número de microorganismos viables. La viabilidad en microorganismos se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio de cultivo.

EXAMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE UN CULTIVO

Los microorganismos ofrecen indicios de su identidad, la determinación de las características generales de las colonias debe realizarse a través de la inspección macroscópica de la superficie de la placa de agar. Se recomienda iluminación adecuada y la utilización de una lupa.

El estudio de las colonias incluye determinar su tamaño, forma, elevación, margen o bordes, color, superficie, densidad y consistencia. Se consideraran las reacciones que se producen en el agar, como por ejemplo tipos de hemólisis en agar sangre (alfa, beta, gamma y alfa prima), producción de pigmentos y cambios en los medios diferenciales en los cuales los colorantes indicadores del y otros ingredientes sirven como marcadores de actividad enzimática y ayudan a identificar aislamientos microbianos.

TRASPLANTE

Consiste en sembrarlo en un nuevo medio de cultivo a fin de perpetuar la especie aislada, como los trasplantes requieren de permanentes medios de cultivo, tiempo y dinero, los laboratorios recurren a medios de preservación menos costosos, efectivos y seguros.

Preservación de microorganismos aislados

Este tiene los siguientes propósitos:

1. Mantenimiento de sepas para la identificación definitiva por un laboratorio de referencia.

2. Realización de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos no habituales.

3. Fines didácticos.4. Realización de trabajos de investigación.5. Realización de estudios epidemiológicos en casos de brotes de

infecciones nosocomiales, en casos aislados de agentes nosocomiales o agentes etiológicos raros o potencialmente patógenos.

Técnicas para la preservación:

Refrigeración: para conservar las sepas durante un plazo corto.

Cuando se requiere conservar durante un largo periodo de tiempo se dispone de:

Criopreservación: congelamiento y almacenamiento de células a muy baja temperatura, congelación de entre -20 a -40 °C , o a -70 a -90°C en ultra congelación, así como -130 a -195°C en termos con nitrógeno líquido. Se les adiciona los crioprotectores con el fin de evitar los daños de la congelación a la célula, los más comunes son leche descremada, glicerol, sacarosa. La temperatura para bacterias y hongos es de -60 a -70°C y su conservación supera los 10 años.

Liofilización: consiste en la eliminación de agua y otros solventes a partir de una solución congelada por el proceso de sublimación (paso de líquido congelado a estado gaseoso sin pasar por la fase liquida). Permite conservar el material a temperatura superior a las requeridas para mantener suspensiones congeladas, y puede prescindirse las cadenas de frio. El resultado es un producto estable y fácilmente rehidratable, con este método se logra periodos de conservación de más de 20 años.

BIBLIOGRAFÍA:

NEGRONI, M; MICROBIOLOGÍA ESTOMATOLÓGICA fundamentos y guía práctica; 2° Edición; Panamericana; Buenos Aires; 2009.