MARCADORES MOLECULARES (MICROSATELITES STR Y VNTR), PRUEBAS DE PATERNIDAD

JOSUE LUNA

NATALIA JIMENEZ

MIGUEL MORENO

JESÚS ORTIZ

TRABAJO DE EXPOSICIÓN. PRESENTADO AL PROFESOR:

ALFREDO LAGARES

BIOLOGÍA MOLECULAR

UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO

FACULTAD QUÍMICA Y FARMACIA

PROGRAMA FARMACIA

GRUPO 2

BARRANQUILLA

26- NOVIEMBRE-2012

TABLA DE CONTENIDO

1. introducción2. ¿qué es un marcador?3. tipos de marcadores 3.1. Marcadores morfológico3.2. Marcadores moleculares4. tipos de marcadores moleculares4.1. Marcadores moleculares bioquímicos4.2. Marcadores moleculares de ADN4.2.1. Grupo 1: marcadores basados en la hibrididación del ADN4.2.2. Grupo 2: marcadores basados en la amplificación del ADN4.2.3. Grupo 3: marcadores mixtos5. marcadores moleculares tipo STR estructura clasificación, limitaciones6. marcadores VNTR7. pruebas de paternidad8. conclusión9. bibliografía

1. INTRODUCCIÓN

Cada vez se hace más común que en nuestra vida diaria incorporemos el uso de términos como gen, ADN, diversidad genética, genoma, marcadores moleculares, prueba del ADN y otros; dada la importante aplicación que tienen en la actualidad en diversas áreas (medicina, botánica, conservación, agricultura, entre otros).

Actualmente existe una gran necesidad de realizar estudios genéticos poblacionales para una mejor comprensión de lo ocurrido en el contexto bio-social de nuestros antepasados, los cuales a su vez sirven de apoyo elemental a los trabajos relacionados a las ciencias forenses.

El análisis de polimorfismos de DNA ha significado un cambio radical en la investigación de antropología, evolución, análisis de paternidad, así como de análisis forenses y diagnóstico de enfermedades. Antes del desarrollo de estas metodologías, se solucionaban la casi totalidad de los casos con los marcadores clásicos. El análisis del polimorfismo del DNA ha simplificado estas pruebas, las ha hecho más rápidas y baratas, permitiendo además una mejor solución a casos difíciles.

Marcadores moleculares, microsatelites (STR, VNRT) y pruebas de paternidad

2. ¿Qué es un marcador?

Es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o puede ser alguna sección del ADN sin función conocida. Dado que los segmentos del ADN que se encuentran contiguos en un cromosoma tienden a heredarse juntos, los marcadores se utilizan a menudo como formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de un gen que todavía no ha sido identificado, pero cuya ubicación aproximada se conoce. Los marcadores se usan para el mapeo genético como el primer paso para encontrar la posición e identidad de un gen.

La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la posibilidad de estudiar poblaciones de organismos y seleccionar aquellos que presentan rasgos de interés para el hombre. En ocasiones, el uso de marcadores permite seleccionar los individuos aun antes de que expresen el rasgo de interés. Gracias al empleo de marcadores ha sido posible mejorar muchas especies que son la base de la alimentación del mundo. Hay dos tipos principales de marcadores: los marcadores morfológicos y los marcadores moleculares.

3. Tipos de marcadores

3.1. Marcadores morfológico

Los marcadores morfológicos fueron el primer tipo de marcadores que el hombre utilizó. Se consideran marcadores morfológicos a los caracteres de un individuo que se expresan en un ambiente específico y que el hombre identifica con un objetivo determinado. Por ejemplo, en los árboles de pino podemos usar como marcadores morfológicos el peso o tamaño de las semillas, pues se ha visto que dicha característica se asocia en la mayoría de las poblaciones con la supervivencia, el crecimiento y la reproducción.

3.2. Marcadores moleculares

Un marcador molecular es una señal dentro de la información hereditaria (el ADN). Nos permite identificar la presencia de un gen a gran distancia y de forma sencilla. Dependiendo del carácter, nos serán útiles unos u otros marcadores.

Los marcadores moleculares corresponden a cualquier gen cuya expresión permite un efecto cuantificable u observable (características fenotípicas), que además puede detectarse fácilmente. Este tipo de marcadores pueden evaluarse desde que los

individuos están en sus primeros estados de desarrollo, y se pueden aplicar usando a todo el individuo o sólo parte de él. Se habla de marcadores genéticos cuando se transmiten según las leyes básicas de la herencia mendeliana, por lo que es importante destacar que no todos los marcadores moleculares pueden considerarse como genéticos. Existen dos tipos de marcadores moleculares: los marcadores bioquímicos y los marcadores de ADN.

4. Tipos de marcadores moleculares

4.1. Marcadores moleculares bioquímicos

Son los que incluyen a las proteínas y las isoenzimas o haloenzimas . Las proteínas son los productos primarios de los genes y se forman mediante los procesos de transcripción y traducción, por lo que se ven menos influidos por el ambiente. Las isoenzimas fueron descubiertas por Hunter y Markert en 1957 y son diferentes variantes moleculares de una misma enzima presentes en una especie, las cuales desempeñan la misma actividad pero pueden tener diferentes propiedades.

4.2. Marcadores moleculares de ADN

Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen.

Existen diversas técnicas de biología molecular disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las técnicas que permiten obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares, Y cubrir la totalidad del genoma de un organismo.

Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos:

4.2.1. Grupo 1: Marcadores basados en la hibrididación del ADN

Estos tipos de marcadores involucran la detección de un segmento específico (marcador) en el ADN de estudio por hibridación con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). Esto implica que el investigador que busca estudiar un gen de interés, debe conocer al menos una parte de su secuencia, para poder construir una porción complementaria (sonda) que

permita “pescar” a ese gen de interés. Dentro de este grupo de marcadores se encuentran los RFLP y los VNTR o minisatélites.

La técnica de RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción) fue desarrollada a finales de los ‘70, y se basa en la detección de fragmentos de ADN de distinto peso molecular en diferentes organismos. La técnica está basada en la digestión del ADN total de un individuo con diferentes enzimas de restricción. Esta restricción produce cantidades equimolares de fragmentos para una molécula de ADN dada. Los fragmentos resultantes son separados por electroforesis en geles de agarosa y transferidos por capilaridad a una membrana de nylon (Southern Blot). Esta membrana es hibridada con una sonda radioactiva. El producto de la hibridación es visualizado por medio de una autoradiografía de rayos-X, de acuerdo al peso molecular de la banda.

Las secuencias de ADN de minisatélites (VNTR) son secuencias repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tandem (una detrás de la otra) y dispersas a través del genoma. Cada VNTR tiene distinto número de repeticiones variable, asociándose de esta manera un tamaño distinto a cada alelo. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridación o por técnicas de PCR.

4.2.2. Grupo 2: Marcadores basados en la amplificación del ADN

En este grupo se incluyen aquellos marcadores moleculares en los que se utiliza la reacción de PCR (polymerase chain reaction) o reacción en cadena de la polimerasa de ADN. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de copias de un segmento específico de ADN.

Son muchos los marcadores moleculares que están incluidos en este grupo, entre los que se encuentran los microsatélites o SSR, los RAPDs y CAPs.

Los microsatélites o SSR son los más ampliamente utilizados en estudios con marcadores moleculares, por ser una técnica relativamente sencilla y altamente reproducible. Se trata de regiones constituidas por repeticiones en tandem de unos pocos pares de bases (1 a 6). El polimorfismo de estas regiones está dado por los diferentes números de repeticiones, dando fragmentos amplificados por PCR de distinto tamaño. Aquellos alelos con mayor número de repeticiones, tendrán un tamaño mayor y correrán más retrasados en una corrida electroforética.

Marcador SSRR

4.2.3. Grupo 3: Marcadores mixtos

Son aquellos que resultan de la combinación de otros tipos de marcadores moleculares. Entre ellos se encuentran los AFLP, unos de los más utilizados en estos tipos de estudios.

AFLP consiste en amplificar en forma selectiva fragmentos de ADN cortados con enzimas de restricción. El ADN de las individuos a analizar se corta con dos enzimas de restricción distintas y luego se le ligan “adaptadores” a los extremos de los fragmentos de ADN resultantes de dicha digestión, que permite que se amplifiquen en forma selectiva algunos de esos fragmentos que tienen las bases suplementadas a los cebadores o primers utilizados. La separación de estos fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida genera entre 50 y 100 fragmentos. La ventaja de este método radica en que se puede analizar, en un solo ensayo, un gran número de regiones del genoma.

5. MARCADORES MOLECULARES TIPO STR

Los marcadores moleculares están situados en lugares específicos del genoma. Se usan para “marcar” la posición de un gen en concreto o la herencia de una característica particular. En un cruzamiento genético, las características de interés seguirán generalmente unidas a los marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que el marcador molecular esté presente, ya que el marcador indica la presencia de la característica deseada.

MICROSATÉLITES STR

Fragmentos específicos de ADN que pueden ser identificados en todo el genoma.

Los microsatélites STR (Short Tandem Repeat) son secuencias de nucleótidos que consisten en repeticiones en tándem, estas secuencias han sido encontradas frecuentemente por todo el genoma eucariótico y el número de unidades repetitivas son altamente polimórficos, es decir variables entre los individuos. Estas secuencias repetitivas pueden ser usadas como marcadores genéticos para estudios genéticos poblacionales.Los microsatélites poseen una herencia mendeliana simple, lo que significa que un individuo hereda uno de los alelos de cada progenitor. Las repeticiones de los microsatélites raramente aparecen en las secuencias codificantes, pero las repeticiones de trinucleótidos dentro o cercanas a determinados genes se asocian a ciertas alteraciones hereditarias.

Polimorfismos STRLa mayoría de nuestro ADN es idéntico al de otras personas. Sin embargo, hay regiones heredadas de nuestro ADN que pueden variar de una a otra persona. Las variaciones de la secuencia del ADN entre individuos se denominan "polimorfismos". Como descubriremos en esta Actividad, las secuencias con grado máximo de polimorfismo son muy útiles para el análisis de ADN en casos de medicina legal y en pruebas de paternidad.  Esta Actividad se basa en analizar la herencia de un tipo de polimorfismos de ADN conocido como "repeticiones cortas en tándem" o, de forma abreviada, STR (del inglés Short Tándem Repeats). Son loci polimórficos presentes en el ADN nuclear y organelas que constan de unidades repetidas de 1-6 pares de bases de longitud. Normalmente son neutros, co-dominante, y se utilizan como marcadores moleculares, que tienen una amplia cantidad de aplicaciones en el campo de la genética, incluyendo el parentesco y estudios de población. Los microsatélites también pueden ser usados para estudiar la dosis génica (mirando for duplications o supresión de una región genética particular).

Estructura : Un microsatélite esta típicamente conformado por un motivo repetitivo, en el cual se encuentra contenido la secuencia repetida, y dos regiones flanqueantes, las cuales se encuentran a ambos lados del motivo repetitivo. Sin embargo en algunos

casos, puede haber dos motivos repetitivos o más dentro de un microsatélite. Para que un microsatélite sea considerado útil como marcador molecular, toda la variación de la secuencia o polimorfismo debe hallarse dentro del motivo repetitivo, y por el contrario, las regiones flanqueantes deben estar altamente conservadas al punto de no presentar ninguna variación de secuencia.Partiendo de esta hipótesis se diseñan primers o iniciadores (también llamados cebadores) es decir, fragmentos de ADN que tienen la misma secuencia que los extremos de las regiones flanquentes para poder amplificar (o producir un alto número de copias) un microsatélite a través de una PCR.Se ha probado que los microsatélites son versátiles marcadores moleculares, particularmente para los análisis poblacionales, pero no por ello se encuentran ausentes de limitaciones. Los microsatélites desarrollados para unas especies particulares pueden con frecuencia ser aplicadas a especies emparentadas, pero el porcentaje de loci (Es el sitio que ocupa el gen o alelo en el cromosoma El alelo es un fragmento de la molécula de ADN, por lo tanto, deberíamos definir locus como el sitio que ocupa el gen en la molécula de ADN), que se amplifican satisfactoriamente puede disminuir cuando aumenta la distancia genética.Los microsatélites fueron inicialmente descritos en humanos, y en poco tiempo fueron hallados en otros mamíferos como el ratón y el cerdo. Su potencial como marcadores útiles para los estudios en plantas fue rápidamente reconocido, resultando en su aislamiento y aplicación en muchas especies.

CLASIFICACIONES Los microsatélites se clasifica de acuerdo al número de nucleótidos que posea el motivo de repetición como: mono, di, tri, tetra, penta o hexanucleótido.

Puro o perfecto: Un solo motivo repetido n veces en serie. ej: (AC)9 Puro interrumpido: Un solo motivo repetido n veces, donde se intercalan nucleótidos

entre las distintas repeticiones. ej: (CA)2AA(CA)12 Compuestos: Dos o más motivos repetidos en serie. ej: (GT)2(TG)10 Compuestos interrumpidos: Al menos uno de sus motivos presenta nucleótidos

intercalados. ej.: (CT)4(GT)2CTAT(GT)15 Complejos: Combinaciones entre cualquiera de las clases anteriores, sin ningún

patrón de orden definido. ej: (ACC)8+TG+(GA)12+(TTA)5+GC+(TTA)4

Clasificación de los microsatélites según el tamaño de la unidad de repeticiónUrquhart (1994) clasificó a los STRs en simples, compuestos y complejos. Brinkmann (1996) proponen denominarlos STRs con microvariabilidad baja, intermedia y alta.

STRs Simples o de baja microvariación: Están formados por dos o más unidades de repetición contiguas e idénticas, tanto en longitud como en secuencia. La diferencia en tamaño entre los distintos alelos es de una unidad de repetición. La presencia de alelos intermedios es excepcional. Tienen el incoveniente de su baja heterocigosidad homocigoto es cuando los dos alelos o genes de un loci SON IGUALES EN LONGITUD, y heterocigoto es cuando los dos alelos NO SON IGUALES EN LONGITUD. Si hacemos correr molèculas de ADN de dos individuos diferentes cortadas con la misma enzima de restricciòn en un gel por medio de electricidad (electroforesis)y visualizamos una banda de ADN de cada individuo en la misma posiciòn del gel, decimos que son homocigotos. Todas las molèculas de ADN que se encuentren en esas banda tendràn la misma longitud, porque en la electroforesis el ADN se separa por su tamaño. Si amplificamos un determinado fragmento de ADN de un individuo por medio del "PCR", y en la electroforesis vemos una banda, decimos que es homocigoto para el fragmento. Si observamos dos bandas muy cercas y comprobamos que el procedimiento fue correcto, decimos que es heterocigoto para el fragmento..

STRs compuestos o de microvariación intermedia: Los sistemas comprenden dos o más unidades de repetición contiguas diferentes, que varian tanto en secuencia como en longitud.

STRs Complejos o de alta microvariación: Pueden contener varios bloques de unidades de repetición de longitud variable, con secuencias intermedias más o menos variables. Son frecuentes los alelos intermedios y las sustituciones simples de bases en algunas unidades, lo que ocasiona importantes variaciones tanto estructurales como en tamaño. Son los STRs más difíciles de tipar y se acompañan también de una tasa de mutación más alta.

LIMITACIONES: limitaciones con menores frecuencias o efecto, se darían en el caso que mutaciones, ocurridas en el sitio de apareamiento de los indicadores, tendrían

como resultado alelos nulos (alelos nulos cUando un alelo no puede ser amplificado, debido, principalmente, a una mutacion en el punto de hibridacion del cebador. Ese alelo no amplifica y el individuo es catalogado como homocigoto, La existencia de alelos nulos es especialmente dificil de detectar cUando su frecuencia es baja. Estos alelos pueden originarse por mutaciones en regiones flanqueantes)En caso de identificacion de paternidades, cabe sospechar la presencia de alelos nulos cUando todos los marcadores apuntan a un progenitor homocigoto para el marcador excluyente, y que el descendiente sea tambn homocigoto para ese marcador, con el alelo maternal).Otra limitación es la presencia de “bandas tartamudas” estas se encuentra frecuentemente asociadas con la amplificación de ADN repetitivo como es el caso de los microsatélites. Las bandas tartamudas son producto de amplificación por PCR que difieren en una unidad de repetición con respecto a la longitud del alelo original. La ocurrencia de estos artefactos dificulta la lectura geles e inclusive, repetidamente son confundidos como alelos, complicando el análisis genotípico.

Análisis de microsatélites: Consiste en la amplificación de secuencias con pequeñas repeticiones en tándem que no se conservan dentro de la especie. Una vez amplificadas se separan los fragmentos para comprobar el número de repeticiones (mediante electroforesis capilar o en gel), de forma que se pueden distinguir patrones de repeticiones que pueden ser comparables y asociables”.Método de SSR (Simple Secuence Repets) Este método usa regiones altamente polimórficas que tienen secuencias cortas repetidas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición y estas regiones de la DNA se puede utilizar para diferenciar entre las personas. Estos STRs loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR.

6. Marcadores VNTR

VNTR: (Variable number tandem repeat) Están compuestas por una unidad básica de secuencia de 6-25[9] nucleótidos que se repite en tándem generando secuencias de entre 100 y 20.000 pares de bases. Se estima que el genoma humano contiene unos 30.000 minisatélites.

Detección de los VNTR

La detección de los VNTR se pueden detectar por hibridación del ADN o por técnicas de PCR. En el primer caso, el ADN genómico es digerido con enzimas de restricción que reconocen sitios adyacentes a la región repetida. Los fragmentos se separan por electroforesis, se inmovilizan en una membrana y se detectan mediante sondas al igual que los marcadores RFLPs. La longitud de los fragmentos de restricción producidos en diferentes individuos varía de acuerdo al número de repeticiones del minisatélite. La diferencia básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la técnica de VNTR las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma son detectados simultáneamente, mientras que en los RFLP, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma, por lo que se detectan uno o pocos loci cada vez. De esta manera, en el autorradiograma no se obtiene un patrón simple de bandas como en el caso de los RFLP, sino un perfil complejo de bandas múltiples.

Los minisatélites también pueden ser detectados mediante la amplificación por PCR de los segmentos del genoma que contienen diferente número de repeticiones, utilizando para ello iniciadores o "primers" que flanqueen los VNTR. Luego de la amplificación del ADN, los fragmentos se visualizan mediante electroforesis y tinción con bromuro de etidio o técnicas análogas. Esta opción se ha vuelto más frecuente con el aumento de información de secuencias en bases de datos que permiten el diseño de iniciadores flanqueantes de minisatélites.

7. PRUEBAS DE PATERNIDAD

Una prueba de paternidad es aquella que tiene como objeto probar la paternidad, esto es determinar el parentesco ascendente en primer grado entre un individuo y un hombre (presunto padre). Los métodos para determinar esta relación han evolucionado desde la simple convivencia con la madre, la comparación de rasgos, Tipo de sangre ABO, análisis de proteínas y antígenos HLA. Actualmente la prueba idónea es la prueba genética basándose en polimorfismo en regiones STR.

La prueba de paternidad genética se basa en comparar el ADN nuclear de ambos. El ser humano al tener reproducción sexual hereda un alelo de la madre y otro del padre. Un hijo debe tener para cada locus un alelo que provenga del padre. Esta comparación se realiza comparando entre 13-19 locus del genoma del hijo, del presunto padre y opcionalmente de la madre, en regiones que son muy variables para cada individuo llamadas STR (Short Tandem Repeat).

Procedimiento

II- PROCESO DE LABORATORIO • Extracción del ADN

Se extrae el ADN de 1 mm de la mancha utilizando el método de extracción de Whatman FTA, siguiendo las instrucciones del fabricante.

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para STR

Es un proceso que permite obtener en pocas horas millones de copias de uno o varios fragmentos de ADN llamados Short Tandem Repeat (STR), que son secuencias cortas y repetitivas del ADN, distribuidas a lo largo del genoma humano. Tales fragmentos son una fuente rica de marcadores heredables mitad de la madre y mitad del padre.

El Laboratorio de Genética Médica utiliza los principales sistemas STR’s validados a nivel mundial (International Society of Forensic Group, FBI y otros) por su alto poder de discriminación entre personas, su carácter constante, seguro y reproducible en el laboratorio. Se buscan específicamente con "sondas de localización" llamadas primer o cebadores. El laboratorio usa mínimo 13 sistemas STR (VWA, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820, D5S818, D13S317, D16S539, D21S11, D18S51, FGA, D8S1179, D3S1358) y otros sistemas adicionales (D2S1338, D19S433,FESFPS, LPL, F1A01, F13B, AMELOGENINA) los cuales son identificados en el ADN de cada una de las personas en estudio.

• Detección automatizada de STR´s

Para la visualización de estos segmentos de ADN el Laboratorio utiliza el equipo secuenciador ABI AVANT de la casa Applied Biosystem, con tecnología de detección del ADN basada en láser fluorescente.

ANÁLISIS GENÉTICO En el informe de resultados, en las columnas madre, hijo y presunto padre se anotan los alelos de cada uno de los STR identificados en el ADN de la madre, el hijo y el presunto padre, respectivamente. La nomenclatura es internacional y se encuentra en internet GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). En la columna paternidad se especifica la no exclusión o exclusión observada para cada uno de los marcadores. Se acepta la no paternidad cuando por lo menos tres marcadores STR presentes en el hijo no se encuentran en el padre. Los índices de paternidad, IP y Wa, son el resultado del análisis bayesiano de los STR estudiados. Se encuentra la probabilidad estadística de que los marcadores STR de la tripleta conformada por la madre, el menor y el presunto padre señalado sea cierta, en

relación estadística con los marcadores de la tripleta conformada por la madre, el menor y un hombre tomado al azar. Se utiliza la frecuencia de cada uno de los alelos de la población. La probabilidad acumulada de paternidad (Wa) combina cada uno de los sistemas STR estudiados; El índice de paternidad (IP) se halla a partir de un razonamiento estadístico sobre la razón de verosimilitud, X/Y, en donde X indica la probabilidad del presunto padre de ser el padre, comparado con un hombre al azar de la población, Y. Dado que el valor de X depende de los resultados de las pruebas de laboratorio realizados al trío, el valor de Y corresponde a la frecuencia en la población del alelo del hijo que obligadamente ha recibido del padre. El IP debe ser de 100.000 a 1 o más a favor de la paternidad. La probabilidad de exclusión acumulada (P.E.A.) aplicada permite excluir una falsa paternidad con un poder superior al 99.99%.

8. CONCLUSIÓN

Los marcadores moleculares permiten identificar enfermedades genéticas, no identificando el gen que causa dicha enfermedad. Entre éstos se encuentran los Microsatélites los cuales son regiones altamente repetitivas y polimórficas, muy abundantes a nivel del genoma; varían en el número de repeticiones, se distribuyen mediante las leyes mendelianas; son de herencia codominante (se distinguen todos los homocigotos entre sí y estos de los heterocigotos).

Para detectar microsatélites se necesita poco ADN. Éstos pueden estar ubicados en regiones no codificantes.

Los microsatélites son muy importantes porque permiten la identificación de una enfermedad, así mismo se pueden utilizar como huellas genéticas o digitales.

9. BIBLIOGRAFÍA

[1] http://es.wikipedia.org/wiki/Microsat%C3%A9lites[2]http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/Basic/Ya%C3%B1ez_A_V/t_completo.pdf[3]http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtual/tesis/Basic/Ya%C3%B1ez_A_V/antecedentes.htm[4] http://www.biologia.arizona.edu[5] http://www.slideshare.net/ralfonsos/genoma-humano-fijacion1presentacion[6] http://www.plos.org/press/pone-03-07-