“Validación de marcadores moleculares para el análisis genético de ...
Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el ...
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Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el estudio de la biología y la conservación del visón europeo, Mustela lutreola (Linnaeus, 1761)
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Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el estudio de la biología y la conservación
del visón europeo, Mustela lutreola (Linnaeus, 1761)
ACTA DE GRADO DE DOCTOR
ACTA DE DEFENSA DE TESIS DOCTORAL
DOCTORANDO DON/ÑA. Mª Teresa Cabria Garrido
TITULO DE LA TESIS: Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el estudio de
la biología y la conservación del visón europeo Mustela lutreola (Linnaeus, 1761)
El Tribunal designado por la Subcomisión de Doctorado de la UPV/EHU para calificar la Tesis
Doctoral arriba indicada y reunido en el día de la fecha, una vez efectuada la defensa por el
doctorando y contestadas las objeciones y/o sugerencias que se le han formulado, ha otorgado
por___________________la calificación de: unanimidad ó mayoría
En a de de
EL/LA PRESIDENTE/A, EL/LA SECRETARIO/A,
Fdo.: Fdo.:
Dr/a: ____________________ Dr/a: ______________________
VOCAL 1º, VOCAL 2º, VOCAL 3º,
Fdo.: Fdo.: Fdo.:
Dr/a: Dr/a: Dr/a: .
EL/LA DOCTORANDO/A, Fdo.: Mª Teresa Cabria Garrido
AUTORIZACION DEL/LA DIRECTOR/A DE TESIS
PARA SU PRESENTACION
Dr/a. Benjamín Juan Gómez Moliner con N.I.F. 14245903 W
como Director/a de la Tesis Doctoral: Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el
estudio de la biología y la conservación del visón europeo Mustela lutreola (Linnaeus, 1761)
realizada en el Departamento Zoología y Biología Celular Animal
por el Doctorando Don/ña. Mª Teresa Cabria Garrido,
autorizo la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones necesarias para su
defensa.
En Vitoria-Gasteiz a 6 de abril de 2009
EL/LA DIRECTOR/A DE LA TESIS
Fdo.: Benjamín Juan Gómez Moliner
AUTORIZACION DEL/LA DIRECTOR/A DE TESIS
PARA SU PRESENTACION
Dr/a. Rafael Zardoya San Sebastián con N.I.F. 29144932E
como Director/a de la Tesis Doctoral: Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el
estudio de la biología y la conservación del visón europeo Mustela lutreola (Linnaeus, 1761)
realizada en el Departamento Zoología y Biología Celular Animal
por el Doctorando Don/ña. Mª Teresa Cabria Garrido,
autorizo la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones necesarias para su
defensa.
En Madrid a 6 de abril de 2009
EL/LA DIRECTOR/A DE LA TESIS
Fdo.: Rafael Zardoya San Sebastián
((((( (
Departamento de Zoología y Biología Celular Animal
Facultad de Farmacia
Desarrollo y aplicación de marcadores
moleculares para el estudio de la biología y la
conservación del visón europeo,
Mustela lutreola (Linnaeus, 1761)
Tesis Doctoral dirigida por:
Dr. Benjamín Juan Gómez Moliner
Dr. Rafael Zardoya San Sebastián
Memoria que para optar al grado de Doctora presenta
MARIA TERESA CABRIA GARRIDO
Vitoria-Gasteiz, 2009
Front and back cover courtesy of Florian Möllers
European mink Mustela lutreola freehand drawing: Natalia Kleimenova
(Central Forest State Nature Biosphere Reserve, Russia 2005)
A Toni, siempre
La presente tesis doctoral ha sido realizada gracias a la financiación
aportada por la Universidad del País Vasco del proyecto de investigación
“Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el estudio, gestión
y conservación de la fauna” (Proyecto Grupos de Investigación GIU06/09)
durante los años 2007-2009. Asimismo, este trabajo ha sido realizado
gracias a la Diputación de Álava por su financiación en diversos proyectos
de investigación durante los años 2003-2007: “Desarrollo de marcadores
moleculares de aplicación específica al estudio de la biología del visón
europeo (Mustela lutreola) y a su gestión”, “Estudio del polimorfismo de la
población occidental de visón europeo mediante utilización de
microsatélites”, “Caracterización molecular de las poblaciones de visón
europeo (Mustela lutreola). Actuación derivada del plan de gestión de la
especie” y “Estudio de la problemática de la hibridación de las poblaciones
de visón europeo con turón”. Igualmente, el Ministerio de Medio Ambiente
y TRAGSA han financiado parte de esta tesis doctoral gracias a la
adjudicación del proyecto “Desarrollo de microsatélites específicos de visón
europeo (Mustela lutreola)” durante el año 2004. Los proyectos LIFE:
“Conservación del visón europeo (Mustela lutreola) en “Castilla León” LIFE
00/NAT/E7229, La Rioja” LIFE 00/NAT/E7331 y “Álava” LIFE 00/NAT/E7335
también han financiado parte del desarrollo de esta tesis doctoral.
El Departamento de Medio Ambiente y Ordenación del Territorio del
Gobierno Vasco ha participado en la financiación de esta tesis doctoral
gracias a la concesión de una beca para la especialización tecnológica de
postgraduados en materia de biodiversidad en el año 2005, con el proyecto
“Desarrollo y aplicación de marcadores moleculares para el estudio de la
biología del visón europeo y de su problema de hibridación con el turón”
(BOPV nº 97, 2005).
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En primer lugar me gustaría agradecer a mis directores de tesis, al Dr. Benjamín J.
Gómez Moliner y al Dr. Rafael Zardoya San Sebastián, la oportunidad que me han
brindado para llevar a cabo este proyecto. Gracias por vuestra implicación durante el
transcurso de esta tesis doctoral y el apoyo que he recibido en todo momento de vosotros,
sobretodo al final de esta etapa en la que los nervios siempre están a flor de piel.
A las doctoras Arantza Elejalde, Elena Guacimara González y Maria José Madeira.
Gracias por todo lo que me habéis enseñado, por vuestro conocimiento, amistad y cariño.
No sé cómo agradecer todo lo que me habéis dado y todo lo que me seguís dando, ¡sois
las mejores!. Guaci, muchas gracias por toda tu ayuda, por las mil y una ocasiones en las
que has estado al otro lado del teléfono y de internet y, cómo no, por dejarme ser una
Moratalina más.
A los futuros doctores, Ainhoa Iraola, Jonathan Rubines, Aritz Ruiz, y Vanessa
Sarasola. Habéis sido unos magníficos compañeros, además de buenos amigos. Gracias
por vuestra simpatía y por los buenos momentos que hemos vivido en nuestra segunda
casa, el laboratorio (mutil eta neskak, eutsi goiari!!!). Y como no, al resto de alumnos
internos que forman o han formado parte del Departamento de Zoología: Adriana, Álvaro,
Arianne, Aritz (Zubi), Esti (gracias por tu ayuda y por la ilusión que pusiste al trabajar con
visón), Haizea, Josu, Leire, Luisja, María, Raquel y Ohiana, por todo el tiempo que hemos
pasado juntos entre extracciones, PCRs y electroforesis.
A la Dra. Marian Martínez de Pancorbo y a su equipo del Banco de ADN: Dra. Amelia
Acha, Alejandra Álvarez, Dra. Maite Álvarez, Jose María Aznar, Dr. Sergio Cardoso, David
Celorrio, Xabier Elcoroaristizabal, David Gamarra, Naiara García, Maite Gil, Carmen
González, Aizkoa López de Lapuente, Adrián Odriozola, Leire Palencia y Laura Valverde, sin
olvidarme de Maria José Calzada (una estupenda persona), gracias por todos esos buenos
momentos compartidos entre cafés, chocolates, pastas y bizcochos…
AGRADECIMIENTOS
No me gustaría olvidar el esfuerzo que han realizado todas aquellas personas que han
cedido muestras a lo largo de esta tesis doctoral, sin las cuales hubiera sido imposible
llevarla a cabo: Gorka Belamendia, Oskar Berdión, Joseba Carreras, Juan Carlos Ceña,
Angus Davison, Pascal Fournier, Aitor Galarza, Mª Asunción Gómez (y al que está en
camino!), Jorge González, Vladimir Katchanosvky, Andreas Kranz, Luis Lobo, Javier López
de Luzuriaga (gracias por todo Javi visón), Sisco Mañas, Tiit Maran, Santiago Palazón,
Javier Pinedo, Madis Podra, Alfonso Senosiain, Dimitry Skumatov, Javier Zabala, Iñigo
Zuberogoitia, a la gente del Centro de Cría en Cautividad de Pont de Suert, Vicky Asensio,
Marina Barquin y Roger Pradera y del Centro de Recuperación de Fauna de Mártioda, Laura
Elorza, Ricardo Gutiérrez y Patricia Lizarraga. Muchas gracias a todos, porque además de
muestras, me habéis ofrecido vuestra amistad; eskerrik asko laginengatik, zuen
adiskidetasunaz baliatu naiz aurrera jotzeko; moltes gracies per les mostres rebudes de
visó europeu i per tenir la vostre amistat; merci beaucoup; thank you very much;
большое Спасибо за помощ и дружба!; Suur tänu proovide saatmise eest, ja sõpruse
eest!; mulţumesc foarte mult. Y también a los traductores: Arantza, Asier, Madis y a los
caballeros: Antonio y Jordi.
Durante el desarrollo de esta tesis he realizado varias estancias en diferentes centros
de investigación donde he conocido a gente maravillosa, de la que tengo muy buenos
recuerdos y que me gustaría mencionar. A los doctores, futuros doctores y técnicos que
están o han estado en el Museo de Ciencias Naturales de Madrid: Fernando Alda, Raquel
Álvarez, Eva Albert, Carina Cunha, Cristina Grande, Pilar Flores, Iker Irisarri, Regina Lopes
da Cunha, Annie Machordom, Lukas Rüber, Maria José Ruiz, Diego San Mauro y muchos
otros (Carlos (X2), Gary, Lourdes, Marina, Pati, Patri, Silvia, los portugueses, Elena, José y
Joaquim, etc.) con los que he compartido fantásticos momentos en el museo. Muchas
gracias porque, además de buenos compañeros, os habéis convertido en muy buenos
amigos. Por otro lado, me gustaría agradecer al Dr. Johan Michaux la oportunidad que me
ofreció para trabajar en el Centre de Biologie et de Gestion des Populations CBGP de
Montpellier (Francia). Merci beaucoup Johan par ton amitié et sympathie, il a été et c’est
un plaisir travailler avec toi. Gracias también a todos los investigadores, técnicos y
doctores que me ayudaron durante mi estancia en Francia: Philippe Audiot, Stuart Baird,
Marie-Pierre Chapuis, Sandrine Cros-Arteil, Valérie Deffontaine, Michael Fontaine, Maxime
Galan, Anne Loiseau, Sylvain, Piry y Celine Serbielle. Merci beaucoup aussi par l'aide et
l'amitié que vous m'avez offerte.
Además, quiero dar las gracias a mi cuadrilla por todos los buenos momentos que
hemos pasado juntos: Tamara Castillo Triviño, Rosana Escribano, Ion Santiago, Sergio
Urraca y mis diseñadores gráfico favoritos, Aitor Picón y Jorge Sánchez. Siempre me
habéis animado y respaldado, habéis conseguido arrancar esa sonrisa incluso en los peores
momentos y habéis andado este largo camino conmigo, así que mil gracias chicos!.
Tamara, es una gozada haber pasado y seguir compartiendo contigo todas las etapas de
mi vida, incluso en estos momentos en los que te encuentras cumpliendo tu gran sueño en
San Francisco (¡te lo mereces guapa!). Aitortxu y George, gracias por vuestra paciencia y
por todo lo que me habéis enseñado del Photoshop, Freehand etc. Aitortxu, además,
muchísimas gracias por engalanar y realzar la tesis con esta maravillosa portada.
No me gustaría terminar los agradecimientos sin mencionar a lo más importante que
hay en mi vida, mi familia. Sabéis que durante el transcurso de esta tesis doctoral me
habéis apoyado en todo momento, habéis estado conmigo, me habéis alentado y dado
fuerzas, y tengo que decir que me he sentido muy arropada. Por ello, mi mayor
agradecimiento es para vosotros: a mis padres, papá-mamá sobran las palabras porque
¿qué haría yo sin vosotros?; a mi hermana, amiga y confidente Maria José Cabria, la mejor
andereño de infantil de Vitoria-Gasteiz (y no lo digo yo lo dicen sus niños!); a Asier Lpz.
Llanos, Asiertxo te has convertido en parte fundamental e imprescindible de mi vida; a
toda la familia Cabria al completo (¡los de Villamoñico!): a mi abuela, tíos y tías, primos y
primas y a la nueva y fantástica cuarta generación; a la familia Garrido al completo (¡los
de Sta. Mª del Berrocal!): a mi abuela “la flamencona”, tíos y tías, primos y primas, y
también a Álex “Garrobin” (por ahora, único en la cuarta generación!); y a la familia Lpz.
Llanos (¡los de la Quintanaelez!), como no, también a sus cuatro generaciones al
completo, Feli gracias por recibir mis primeras lágrimas de la tesis con los brazos bien
abiertos. Ha sido maravilloso haber pasado esta larga etapa con todos vosotros y será
fantástico afrontar cualquier reto de mi vida sabiendo que siempre estaréis ahí para
apoyarme, MUCHÍSIMAS GRACIAS!
Resumen........................................................................................................ i
Summary ...................................................................................................... v
Capítulo 1: INTRODUCCIÓN ............................................................................. 1
1.1 El Visón Europeo................................................................................ 3
1.2 Aportaciones de la Genética a la Conservación de Especies Amenazadas .. 12
1.3 Marcadores Moleculares .................................................................... 19
1.4 Técnicas Moleculares ........................................................................ 25
1.5 Análisis Genéticos ............................................................................ 30
1.6 Bibliografía ..................................................................................... 41
Capítulo 2: OBJETIVOS.................................................................................. 51
Capítulo 3: RESULTADOS/RESULTS................................................................. 53
Paper I ................................................................................................... 55
Gómez-Moliner BJ, Cabria MT, Rubines J, et al. (2004) PCR-RFLP
identification of mustelid species: European mink (Mustela lutreola),
American mink (M. vison) and polecat (M. putorius) by analysis of
excremental DNA. Journal of Zoology of London 262, 311-316.
Paper II.................................................................................................. 69
Cabria MT, González EG, Gómez-Moliner BJ, Zardoya R (2007)
Microsatellite markers for the endangered European mink (Mustela
lutreola) and closely related mustelids. Molecular Ecology Notes 7, 1185-
1188.
ÍNDICE
Paper III................................................................................................. 77
Cabria MT, González EG, Gómez-Moliner BJ, Michaux JR, Zardoya R.
Patterns of genetic variation of the endangered European mink Mustela
lutreola (L., 1761). In prep.
Paper IV ................................................................................................109
Cabria MT, Michaux JR, Zardoya R, Gómez-Moliner BJ. Using Bayesian
approaches to detect hybridization between the threatened European mink
(Mustela lutreola) and polecat (Mustela putorius). In prep.
Capítulo 4: DISCUSIÓN ................................................................................137
4.1 Aplicación de Muestras no Invasivas para la Identificación de Especies....138
4.2 Variabilidad y Estructura Genética del Visón Europeo ...........................143
4.3 Procesos de Hibridación entre el Visón Europeo y el Turón ....................151
4.4 Estrategias de Conservación.............................................................159
4.5 Bibliografía ....................................................................................165
Capítulo 5: CONCLUSIONES ..........................................................................171
MAIN CONCLUSIONS....................................................................173
La presente tesis doctoral aborda el estudio del visón europeo Mustela lutreola
(Linnaeus, 1761), especie catalogada en peligro de extinción debido a la fuerte
regresión que han sufrido sus poblaciones durante el último siglo. Está considerado
como uno de los mamíferos más amenazados tanto a nivel local como internacional.
Actualmente las poblaciones se encuentran relegadas a tres núcleos poblacionales
principales: en la región nororiental (restringido a áreas aisladas de Rusia occidental
y norte de Bielorrusia), en la región suroriental (localizado en la cuenca de los ríos
Danubio y Dniester en Rumania, Ucrania y Moldovia) y en la región occidental
(limitado al suroeste de Francia y norte de España) de Europa. Con esta tesis
doctoral se ha avanzado en el conocimiento de diferentes aspectos relevantes sobre
la genética de poblaciones del visón europeo y de su interacción con el turón M.
putorius.
Un primer esfuerzo se ha orientado a desarrollar un método de identificación
de especies a partir de muestras no invasivas recolectadas en el campo, que
permitiera detectar la presencia de esta especie en peligro de extinción respecto de
otros mustélidos como el turón Mustela putorius o el visón americano Neovison vison.
Así, uno de los objetivos de esta tesis doctoral se ha basado en la aplicación de
herramientas moleculares para el análisis del DNA de las células intestinales que
quedan incorporadas en los excrementos de los animales. La técnica desarrollada,
denominada PCR-RFLP, integra la amplificación de la región control del DNA
mitocondrial con la posterior digestión del producto amplificado mediante dos
enzimas de restricción, Rsa I y Msp I. La combinación de los patrones de digestión
obtenidos para cada endonucleasa de restricción ha permitido distinguir dos
haplotipos para visón europeo (AA, AB), dos para turón (AC, AD) y tan sólo uno para
visón americano (BC), todos ellos específicos de especie. Además, estos patrones son
diferentes de los que se obtienen en otras especies de mustélidos que pueden dejar
rastros similares, como por ejemplo, la nutria Lutra lutra, la marta Martes martes o
la garduña Martes foina.
RESUMEN
i i RESUMEN
Por otro lado, esta tesis doctoral se ha dirigido a investigar los niveles de
diversidad y estructura genética poblacional de visón europeo, así como a esclarecer
el origen de las poblaciones y determinar la importancia relativa de las diferentes
causas, históricas y/o contemporáneas, que hayan podido influir sobre la estructura
genética actual de las poblaciones de visón europeo. Para facilitar la consecución de
dichos objetivos se ha elaborado una librería genómica específica de visón europeo,
gracias a la cual se han obtenido ocho marcadores microsatélites polimórficos. El
análisis de marcadores microsatélites, así como de secuencias de DNA mitocondrial
ha permitido confirmar los bajos niveles de diversidad genética detectados en las
poblaciones de visón europeo. Los mayores valores de variabilidad genética se han
localizado en la región oriental de Europa, concretamente, la región del noreste ha
resultado ser la más polimórfica. La población occidental se ha caracterizado por
mostrar los niveles más bajos de diversidad genética poblacional, así como, por
presentar un único haplotipo de DNA mitocondrial. Ello puede ser el resultado tanto
de una rápida expansión de la especie desde Europa del este, seguida de su extinción
en Europa central, o bien, de una introducción del visón europeo en Francia debida a
la acción humana. Los test realizados han indicado que las poblaciones de visón
europeo han sufrido un proceso de cuello de botella reciente a nivel global, lo que
concuerda con el declive demográfico del visón europeo sufrido desde mediados del
siglo XIX. Asimismo, los análisis realizados han apoyado estadísticamente la
diferenciación genética entre las regiones europeas donde se encuentra el visón
europeo, aunque no se ha detectado estructuración geográfica significativa entre
ellas.
La aplicación de marcadores moleculares tanto de herencia uniparental (DNA
mitocondrial de herencia materna y cromosoma Y de herencia paterna) como de
herencia biparental (microsatélites) ha permitido investigar el proceso de hibridación
interespecífica entre el visón europeo y el turón, así como cuantificar la problemática
del mismo en las poblaciones naturales de las dos especies. Los análisis de
agrupamiento mediante métodos bayesianos reflejan que la hibridación
interespecífica queda limitada a la producción de híbridos de primera generación (F1)
y al retrocruzamiento de individuos F1 con individuos puros de la especie parental
turón. Todos los híbridos F1 han resultado del cruzamiento entre un visón europeo
hembra y un turón macho, lo que parece indicar que la hibridación se produce de
forma unidireccional. Las hembras híbridas, al contrario que los machos híbridos F1,
son fértiles, lo que parece confirma la regla de Haldane, según la cual los individuos
heterogaméticos (individuos macho XY en mamíferos) son raros, estériles o bien no
RESUMEN i i i
existen. No obstante, no se descarta la presencia de barreras de aislamiento
reproductivo alternativas que impidan el retrocruzamiento entre los híbridos macho
F1 con las hembras de turón. La frecuencia de hibridación genética obtenida ha
resultado ser muy baja y parece localizarse en aquellas zonas de simpatría de ambas
especies en las que la presencia del visón es escasa.
Los resultados que se han obtenido durante el transcurso de esta tesis
doctoral han proporcionado información útil para el diseño de planes de actuación
englobados en los diversos programas de conservación de esta especie amenazada,
que se desarrollan actualmente en los diferentes países donde el visón europeo está
presente.
The present Ph.D. thesis is focused on the study of European mink Mustela
lutreola (Linnaeus, 1761), an endangered mustelid species whose population suffered
a severe decline during last century. It is considered as one of the most endangered
mammal species that needs special conservation for both long-term and short-term
species recovery. The extant populations of European mink are restricted to three
distinct geographical areas: in northeastern (limited to isolated regions of western
Russia and northern Belarus), southeastern (in the Danube and Dniester deltas in
Romania, Ukraine and Moldova) and Western (in Western France and northern Spain)
Europe. The main objective of this work is to investigate different processes and
aspects of population genetics of European mink, as well as, to
conclude/deduce/derive patterns of its interspecific relationship with polecat, Mustela
putorius.
To achieve these objectives the first approach was to develop a new reliable
and non-invasive methods for species identification from samples collected in the
field that were able to detect the presence of this endangered species, as well as, to
identify other mustelid species such as polecat or American mink Neovison vison.
Therefore, different molecular tools were applied to analyse DNA that is present in
cells incorporated in animal faeces. The molecular technique developed in this Ph.D.
thesis, named PCR-RFLP, was based on a nested PCR of mitochondrial DNA control
region followed by digestion of the resulting amplicons with two different restriction
enzymes Rsa I and Msp I. The restriction patterns obtained with both enzymes and
combination of these patterns into a restriction profile was shown to provide
identification of species specific haplotypes: two for European mink (AA, AB), two for
polecat (AC, AD) and a single for American mink (BC). Furthermore, the restriction
profile were different from those resulted for other mustelid species that could leave
similar tracks-faeces than European mink such as otter Lutra lutra, stone marten
Martes martes or beech marten Martes foina.
SUMMARY
v i SUMMARY
This Ph.D. thesis was also focused on assessing the genetic diversity of
European mink populations, determining their degree of population differentiation, as
well as, inferring the evolutionary process involved in producing population
structuring of species. Therefore, an enriched genomic DNA library of European mink
was constructed which provided eight novel polymorphic microsatellites useful for
achieving these aims. Combined analyses of microsatellite loci with mitochondrial
DNA sequences among European mink populations confirmed a low level of genetic
diversity of European mink populations. Highest genetic variability was presented in
Eastern European region; specifically the northeastern European localities were
characterized as the most genetically diverse. Conversely, the low levels of
intraspecific diversity, as well as, the presence of a single mitochondrial haplotypes
found in Western region could be attributed both to a rapid colonization process from
the East followed by the extinction of the species from Central Europe due to
anthropic introduction or migration of European mink in Western Europe. All test
performed suggested that European mink was suffer of recent bottleneck processes
at the different population analyzed which is consistent with the reported overall
demographic decline of the species occurred during the last centuries. Genetic
differentiation of European mink was statistically supported by all tested genetic
analyses, although no significant geographic structure was inferred among regions.
Finally, the application of genetic markers with different pattern of inheritance
(mitochondrial DNA, maternally inherited; Y chromosome, paternally inherited;
microsatellites, inherited from both parents) provide valuable information to study
interspecific hybridization event between European mink and polecat, as well as, to
evaluate consequences on wild populations subject to hybridize. Bayesian clustering
approaches showed that interspecific hybridization is restricted to first generation
hybrid class (F1) and backcrosses (BxII) between F1 hybrids and pure polecats. All
detected F1 hybrids resulted from crosses between European mink females and
polecat males, suggesting that hybridization process occur in a single direction
(unidirectional hybridization). Female F1 hybrids were shown to be fertile.
Conversely, males F1 hybrids seemed both to obey Haldane’s rule (i.e. heterogametic
individuals are absent, rare or sterile) or to present different alternative reproductive
isolation barriers that avoid backcross between male European mink-polecat hybrids
and polecat female.
The results obtained during this Ph.D. thesis provide reliable genetic
information useful for improving and supporting conservation plan guidelines included
SUMMARY v i i
in the conservation programs of this endangered mustelid species that are been
developed nowadays in those different countries where European mink is present.
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1
INTRODUCCIÓN
Índice de contenidos 1 . 1 E l V i s ó n E u r o p e o ............................................................................................................3
1 . 1 . 1 T a x o n o m í a d e l a f a m i l i a M u s t e l i d a e ...........................................................3 1 . 1 . 2 C a r a c t e r í s t i c a s g e n e r a l e s .................................................................................4
B i o l o g í a d e l a e s p e c i e .................................................................................................5 1 . 1 . 3 D i s t r i b u c i ó n h i s t ó r i c a y a c t u a l .......................................................................5 1 . 1 . 4 F a c t o r e s d e a m e n a z a ...........................................................................................8 1 . 1 . 5 E s t a t u s y c o n s e r v a c i ó n .....................................................................................10
1 . 2 A p o r t a c i o n e s d e l a G e n é t i c a a l a C o n s e r v a c i ó n d e E s p e c i e s A m e n a z a d a s ...............................................................................................................................12
1 . 2 . 1 A p l i c a c i o n e s d e l a s h e r r a m i e n t a s m o l e c u l a r e s ..................................14 C a r a c t e r i z a c i ó n d e l a f r a g m e n t a c i ó n y e s t r u c t u r a c i ó n d e l a s p o b l a c i o n e s ......................................................................................................................14 D e f i n i c i ó n d e E S U s y M U s ......................................................................................15 S e g u i m i e n t o d e l a b i o l o g í a d e l a s e s p e c i e s m e d i a n t e m u e s t r e o s n o i n v a s i v o s .....................................................................................................................16 C o n s e r v a c i ó n e x s i t u ..................................................................................................17 D e t e c c i ó n d e h í b r i d o s y c u a n t i f i c a c i ó n d e i n t r o g r e s i ó n g e n é t i c a ..17
1 . 3 M a r c a d o r e s M o l e c u l a r e s ..........................................................................................19 1 . 3 . 1 D N A m i t o c o n d r i a l ..................................................................................................19 1 . 3 . 2 C r o m o s o m a Y ...........................................................................................................21 1 . 3 . 3 M i c r o s a t é l i t e s ..........................................................................................................22
1 . 4 T é c n i c a s M o l e c u l a r e s ................................................................................................25 1 . 4 . 1 E l e c t r o f o r e s i s ..........................................................................................................25 1 . 4 . 2 P C R ...............................................................................................................................26 1 . 4 . 3 A n á l i s i s d e f r a g m e n t o s ......................................................................................27
G e n o t i p a d o m e d i a n t e m i c r o s a t é l i t e s ................................................................28 R F L P s ( R e s t r i c t i o n F r a g m e n t L e n g t h P o l y m o r p h i s m s ) ..........................28
1 . 4 . 4 S e c u e n c i a c i ó n .........................................................................................................29 1 . 5 A n á l i s i s G e n é t i c o s ......................................................................................................30
1 . 5 . 1 R e c o n s t r u c c i ó n d e á r b o l e s f i l o g e n é t i c o s ...............................................30 M é t o d o s d e i n f e r e n c i a f i l o g e n é t i c a ...................................................................30 E v a l u a c i ó n y s o p o r t e d e l a i n f e r e n c i a f i l o g e n é t i c a .................................32
1 . 5 . 2 R e c o n s t r u c c i ó n d e g e n e a l o g í a s i n t r a e s p e c í f i c a s .............................33 1 . 5 . 3 C u a n t i f i c a c i ó n d e l a d i v e r s i d a d g e n é t i c a d e n t r o d e u n a
p o b l a c i ó n ...................................................................................................................34 T e s t d e n e u t r a l i d a d .....................................................................................................35 E q u i l i b r i o d e H a r d y - W e i n b e r g ...............................................................................36
1 . 5 . 4 E s t r u c t u r a c i ó n g e n é t i c a d e l a s p o b l a c i o n e s ........................................37
CAPÍTULO
1
2 CAPÍTULO 1
1 . 5 . 5 D e t e c c i ó n d e h í b r i d o s ........................................................................................38 1 . 5 . 6 P r o g r a m a s i n f o r m á t i c o s ....................................................................................39
1 . 6 B i b l i o g r a f í a .......................................................................................................................41
INTRODUCCIÓN 3
1.1 El Visón Europeo
1.1 .1 Taxonomía de l a f ami l i a Mus te l i dae
El visón europeo Mustela lutreola (Linnaeus, 1761) pertenece al género
Mustela Linnaeus, 1758, clasificado dentro de la familia Mustelidae Fischer von
Waldheim, 1817 (Orden Carnivora, Clase Mammalia). Los mustélidos constituyen la
familia dentro del orden de los carnívoros que presenta el mayor número de especies
descritas, las cuales se han adaptado con éxito a hábitats dispares, tanto acuáticos,
marinos y de agua dulce, como terrestres. Actualmente se reconoce que la familia
Mustelidae comprende la subfamilia Lutrinae, donde se ubican las nutrias, y la
subfamilia Mustelinae, que engloba al resto de mustélidos (comadrejas, tejones,
visones y turones entre otros) (Bryant et al., 1993; Wilson, Reeder, 2005).
La clasificación de la familia Mustelidae ha sido objeto de mucha controversia
en relación al número de subfamilias, géneros y especies que engloba (Bryant et al.,
1993; Mc Kenna, Bell, 1997; Pocock, 1921; Wilson, Reeder, 2005). Así, sucesivos
estudios en base a caracteres morfológicos, medidas craneométricas y fórmulas
dentales, han llevado a múltiples revisiones taxonómicas durante el último siglo
(Dragoo, Honeycutt, 1997; Koepfli et al., 2008; Simpson, 1945; Wozencraft, 1993).
Esta misma disparidad de criterios también ha impedido determinar de forma
definitiva las relaciones filogenéticas de las especies que se incluyen dentro del
género Mustela (Anderson, 1989; Heptner, 1967; Wozencraft, 1989; Youngman,
1982).
Así, por ejemplo, el análisis de datos morfológicos, moleculares y citogenéticos
ha permitido ofrecer una nueva visión sobre el estatus taxonómico del visón
americano (Neovison vison; anteriormente Mustela vison). Considerada durante
mucho tiempo dentro del género Mustela, esta especie muestra importantes
diferencias respecto al resto del género, a pesar del gran parecido físico que tiene
con el visón europeo (Abramov, 2000a; Graphodatsky et al., 1976; Kurose et al.,
2000; Kurose et al., 2008; Masuda, Yoshida, 1994). Esta gran similitud se debe a
una evolución convergente por la clase de vida semiacuática y por el tipo de hábitat
que comparten (Rozhnov, 1993; Youngman, 1982). Actualmente, el visón americano
se encuentra clasificado dentro del nuevo género Neovison, junto con el visón marino
(Neovison macrodon), ya extinguido (Wilson, Reeder, 2005).
4 CAPÍTULO 1
El número de subespecies consideradas dentro de la especie Mustela lutreola,
también ha sufrido variación a lo largo del tiempo. Se han llegado a describir 14
subespecies, cada una de ellas localizada en un área geográfica distinta (Corbet,
1979; Heptner, 1967; Youngman, 1982), aunque tan sólo se consideraban como
válidas 6 ó 7, entre las que se destacan: Mustela lutreoa lutreola (Linnaeus, 1761)
localizada en Finlandia y norte de Rusia, M. l. biedermanni (Matschie, 1912) de
Francia y España, M. l. binominata (Ellerman y Morrison-Scott, 1951) del Caúcaso,
M. l. cylipena (Matschie, 1912) de Europa Central, M. l. novikovi (Ellerman y
Morrison-Scott, 1951) de Rusia central, M. l. transsylvanica (Éhik, 1932) de Rumania,
y M. l. turovi (Kutnezov y Novikov, 1939) del norte del Caúcaso (Palazón, 1998;
Rozhnov, 1993; Wilson, Reeder, 2005). Otras subespecies propuestas por diferentes
autores M. l. globeri, M. l. armonica, M. l. ebiki, M. l. hungariaca o M. l. borealis no
son aceptadas actualmente (Ruiz-Olmo, Palazón, 1991).
1 .1 .2 Carac te r í s t i c as genera les
El visón europeo está considerado, dentro de la familia Mustelidae, como una especie
de tamaño pequeño. Se asemeja al turón (Mustela putorius) y al visón americano
(Neovison vison), con los que se confunde habitualmente, aunque el visón europeo
es de menor tamaño. Tiene un cuerpo alargado, delgado y flexible, con patas cortas
y cabeza pequeña (Youngman, 1990). Presenta un dimorfismo sexual bastante
marcado, donde los machos superan el peso y el tamaño de las hembras (Blanco,
1998; Ruiz-Olmo, Palazón, 1991).
El pelaje es de un color uniforme marrón chocolate con unas manchas blancas
características en el hocico (labios superior e inferior). Este rasgo propio del visón
europeo lo diferencia del visón americano, ya que este último sólo presenta la
mancha blanca en el labio inferior. El turón, por el contrario, muestra una coloración
menos uniforme, con pelo largo marrón oscuro y con borra espesa y más clara.
Además, el turón presenta un característico antifaz blanquecino en la cara. Las
medidas craneométricas, mandibulares, así como la longitud del hueso peneano o
báculo, también permiten distinguir entre estas tres especies de mustélidos. Aunque
el conjunto de estas características favorece su diferenciación, se trata de especies
esquivas y huidizas, lo que complica su avistamiento y distinción en el campo.
Asimismo, los rastros o señales indirectas (huellas, excrementos y otros indicios) que
INTRODUCCIÓN 5
dejan el campo son bastante parecidos, dificultando aún más el seguimiento de sus
poblaciones (Palazón, 1998).
B i o l og í a de l a e spe c i e
El visón europeo es una especie territorial y solitaria que habita en áreas con
densa vegetación en los márgenes de ríos, riberas y riachuelos de cursos bajos de
agua o a orillas de lagos o lagunas (Blanco, 1998; Nowak et al., 2005; Zabala et al.,
2003). De actividad principalmente nocturna y/o crepuscular, los machos ocupan un
territorio de aproximadamente unos 10 km de cauce fluvial, que suele abarcar el
territorio de varias hembras (Garin et al., 2002a; Palazón, 1993; Sidorovich et al.,
2000). No obstante, se han presenciado individuos solitarios alejados de su área de
distribución y de los cursos de agua, lo que demuestra la capacidad de
desplazamiento que tiene esta especie para colonizar nuevos lugares (Palazón, 1993;
Ruiz-Olmo, Palazón, 1991; Youngman, 1982). En el sur de Cataluña se capturó un
macho en la cuenca del río Ebro (Ruiz-Olmo, Palazón, 1990), mientras que en el
Páramo de Masa (norte de Burgos), y con una altitud superior a los 1000 metros, se
avistó a un macho adulto (I. Zuberogoitia, com. pers.). En Alemania se han
registrado recientemente desplazamientos de alrededor de 50 km en ejemplares
radiomarcados (M. Põdra, com. pers.). Todos estos hallazgos concuerdan con los
datos obtenidos previamente en Rusia a finales del siglo XIX y principios del XX
(Youngman, 1982). Aunque muy discutidos, estos datos describían movimientos que
abarcaban distancias de hasta 900 km producidas a lo largo de 60 años.
1 .1 .3 D i s t r i buc ión h i s tó r i ca y ac tua l
Hasta el siglo XIX el visón europeo se distribuía por toda Europa central. El límite
oriental de su distribución se localizaba en la parte de Rusia occidental, desde la
cuenca del río Pechora hasta Finlandia por el norte, y llegando hasta el Cáucaso por
el sur. Su área de distribución comprendía las actuales Estonia, Bielorrusia, Polonia,
Suiza, Austria y Alemania, hasta Holanda, donde quedaba fijado su límite occidental.
Por el sur su distribución se ampliaba a las Repúblicas Checa y Eslovaca, Hungría y
Rumania, hasta el delta del río Danubio (Youngman, 1982).
6 CAPÍTULO 1
Desde el siglo XIX y mediados del siglo XX se detectó la presencia de la
especie en zonas mas suroccidentales, llegando a aparecer en Francia (primer indicio
datado en 1839) y posteriormente en el norte de España (primera cita en 1951)
(Puente Amestoy, 1956; Rodríguez de Ondarra, 1955; Senosiain Garcia, Donazar,
1983). Esta expansión hacia el oeste de Europa se produjo casi de forma simultánea
a un periodo de disminución progresiva de la especie, que tuvo lugar en todo el norte
y centro de Europa durante los siglos XIX y XX (Ruiz-Olmo, Palazón, 1991). Este
periodo de rarefacción de la especie concluyó con su extinción en Europa Central a
principios y mediados del siglo XIX (Youngman, 1982). En el norte de Europa, el
visón europeo desapareció de Estonia, Letonia, Lituania y Finlandia a finales del siglo
XX, mientras que en Europa del este se dio por extinguido a mediados del siglo XX
(Maran, 2007).
Cabe destacar que se plantearon hipótesis alternativas para explicar el
hallazgo tardío del visón europeo en Francia y España. Algunos autores lo
consideraron como un miembro habitual de la fauna autóctona desapercibido hasta
su descubrimiento, aunque esta hipótesis se considera poco probable (Youngman,
1982; Zabala, Zuberogoitia, 2003). De forma paralela a la expansión del visón
europeo hacia regiones más occidentales de Europa, se barajó la hipótesis de una
posible introducción por el hombre (Torres, Zuberogoitia, 1996; Youngman, 1982).
Con la información disponible, no se ha podido descartar ni confirmar ninguna de
estas hipótesis.
Hoy en día el visón europeo se encuentra distribuido en tres núcleos
poblacionales principales (Figura 1): en la región nororiental de Europa, en áreas
fragmentadas y aisladas de Rusia occidental y norte de Bielorrusia (Sidorovich, 1992;
Tumanov, 1999; Youngman, 1982); en la región suroriental de Europa, en Rumania,
localizada principalmente en el delta del Danubio (Gotea, Kranz, 1999); y en la
región occidental de Europa, en el suroeste de Francia y norte de España (Castién,
Mendiola, 1984; Garin et al., 2002b; Lodé, 1999; Maizeret et al., 1998; Zabala et al.,
2005). Recientemente se ha confirmado la presencia de visón europeo en el delta de
los ríos Danubio y el Dniester en Ucrania y Moldavia (de Jongh et al., 2007). En Rusia
se encuentra ligado fundamentalmente a las cuencas fluviales de tres ríos
principales: (1) el Dvina septentrional Severnaya Dvina o Northern Dvina, por el
norte, que junto a los ríos Pechora, Mezen o Vashka desembocan en los mares de
Barents y/o Blanco; (2) el Dvina occidental Zapadnaya Dvina o Western Dvina que
atraviesa el noroeste de Rusia y desemboca en el mar Báltico por el golfo de Riga; y
INTRODUCCIÓN 7
Región occidental
Región nororiental
Región suroriental
FranciaEspaña 1
234 Rumania
Volga
PechoraMezem'
Dvina Norte
Dvina Oeste Bielorrusia
Rusia
Mar Mediterráneo
Danubio Ucrania yMoldavia
Ebro
Dniester
Volga
(3) el Volga, que discurre por Rusia desde la Meseta de Valdai cerca de Moscú, donde
nace, hasta el mar Caspio, donde desemboca. En Bielorrusia, el visón europeo ha
quedado restringido a los ríos Lovat, Obol, Drissa, Luzesnienka, Ovsienka y Orsica
localizados en la región de Vitebsk (Sidorovich, 1992). En Francia, se sitúa en la
región de Aquitania y Poitou-Charentes ligado principalmente a las cuencas
hidrográficas de los ríos Garona, Charentes y Adour (Lodé, 1999; Maizeret et al.,
1998). En España, se localiza en núcleos asentados de los ríos de la vertiente
cantábrica del País Vasco y Navarra, y en la cuenca mediterránea del río Ebro,
abarcando las provincias de Burgos, Álava, La Rioja, Navarra, extremo norte de Soria
y Zaragoza (Arambarri et al., 1997; Calvo Tomás, 2006; Ceña et al., 2001; Garin et
al., 2002b; González-Esteban et al., 2004; Palazón et al., 2003; Zabala et al., 2003).
Figura 1 Mapa de distribución actual de visón europeo. Región occidental de Europa:
suroeste de Francia, en los ríos Charentes (1), Garona (2) y Adour (3), y norte de
España, en el río Ebro y ríos de la vertiente cantábrica (4); región nororiental de
Europa: Rusia occidental, en los ríos Pechora, Mezem’, Severnaya o Dvina Norte y
Zapadnaya o Dvina Oeste, y norte de Bielorrusia, en el río Zapadnaya o Dvina Oeste;
región suroriental de Europa: este de Rumania, en el delta del Danubio, y sur de
Moldavia y suroeste de Ucrania, en el delta de los ríos Danubio y Dniester.
8 CAPÍTULO 1
En las últimas décadas, el visón europeo ha sufrido un gran descenso, tanto en
su área de distribución como en el número de ejemplares. La zona nororiental,
considerada como la más importante, ha visto cómo el tamaño poblacional se ha
reducido en un 80% (Dinets, 1995; Ruiz-Olmo, Palazón, 1991; Shashkov, 1995;
Sidorovich, 1993). En Rumania, donde está considerada como una especie habitual,
sobretodo en el delta del Danubio, ha sufrido una fuerte regresión en los últimos 10
años (M. A. Gómez, com. pers.). En la región occidental ha visto disminuido su
tamaño poblacional en más del 50%. En España, parece que está teniendo lugar una
disminución del tamaño poblacional, aunque su área de distribución se está
ampliando hacia zonas nororientales de la Península, siguiendo el trazado de la
cuenca hidrográfica del río Ebro, hacia Aragón (Gómez et al., 2007), y hacia zonas
noroccidentales, hacia Cantabria.
1 .1 .4 Fac to res de amenaza
Son muchas las posibles causas que se aducen para explicar la regresión y extinción
local del visón europeo, aunque no se han podido esclarecer con exactitud la
importancia de cada una de ellas (Lodé et al., 2001; Rozhnov, 1993; Sidorovich et
al., 1995; Zabala et al., 2006). Se considera que en cada región geográfica y núcleo
poblacional han podido actuar un conjunto de factores diferentes (Maran, Henttonen,
1995).
Destrucción del hábitat. El visón europeo es una especie ligada al medio
fluvial, por lo que la alteración de la vegetación y el hábitat de ribera debido a la
deforestación, la canalización de los ríos, la intensificación agraria, la desecación de
los humedales o la contaminación de las aguas bien sea por vertidos industriales,
agrícolas o ganaderos, han contribuido al declive de la especie en todo su área de
distribución (Maran et al., 1998). De hecho, la pérdida del hábitat está considerada
como uno de los factores clave en el proceso de extinción del visón europeo (Maran
et al., 1998).
Disponibilidad de presas. A pesar de que el visón europeo está considerado
como una especie generalista ha mostrado consumir, de forma preferente, el
cangrejo de río Astacus astacus en Finlandia o en los Urales. Al ser un especialista
trófico de cangrejo, la disminución de esta presa ha llevado implícita una disminución
de la presencia del visón europeo en estos lugares (Maran, Henttonen, 1995).
INTRODUCCIÓN 9
Sobreexplotación. Otro de los factores causantes del declive del visón europeo
ha sido la caza excesiva (Lodé et al., 2001). La piel de esta especie ha sido muy
apreciada a lo largo del tiempo, sobretodo en Europa del este. Durante el siglo XX, se
ha intensificado su caza por el aumento de la demanda de sus pieles, lo que ha
implicado una reducción muy significativa de esta especie a nivel local (Maran,
Henttonen, 1995).
Interacción interespecífica con el visón americano. El visón americano fue
introducido a mediados y principios del S. XX en diferentes partes de Europa por los
escapes procedentes de la industria peletera, la cual había tenido un gran auge
debido al gran valor económico que tiene su piel (Maran, Henttonen, 1995; Rozhnov,
1993). A pesar de que, hoy en día, la competencia con el visón americano es uno de
los factores principales que puede explicar el retroceso de las poblaciones de visón
europeo, hay que señalar que la extinción de este último en Europa central se
produjo con anterioridad a la introducción del visón americano (Rozhnov, 1993). El
impacto que la especie americana tiene sobre el visón europeo puede estar causado
por diversos factores, especialmente por la transmisión de la enfermedad aleutiana,
la competencia directa o la hibridación. En este último caso, se ha observado que
aunque ambos mustélidos hibridan, el feto no llega a ser viable porque es
reabsorbido (Allendorf et al., 2001; Maran et al., 1998; Rozhnov, 1993).
Interacción interespecífica con el turón. Se ha planteado la hipótesis de que la
alteración del hábitat ha podido favorecer al turón y perjudicado al visón europeo, lo
que habría podido provocar un aumento de su competencia (Maran et al., 1998). No
obstante este planteamiento no ha podido confirmarse. Otro factor de amenaza,
aunque también es discutido, es la hibridación con el turón, de la que sí resultan
híbridos viables (Rozhnov, 1993). Este fenómeno parece darse con mayor frecuencia
cuando las poblaciones de visón europeo se encuentran fragmentadas y aisladas
(Maran et al., 1998).
Enfermedades. Destaca la enfermedad aleutiana del visón (Aleutian Virus
Disease AVD) causada por un parvovirus, cuya detección se ha incrementado en los
últimos años (Mañas et al., 2001). Esta patología provoca una infección grave en el
sistema inmunitario y trastornos en órganos internos causando la muerte del animal
(Fournier-Chambrillon et al., 2004; Mañas et al., 2001). Aunque se estima que la
prevalencia de la enfermedad es alta, el parvovirus puede mantenerse en estado
latente en el hospedador, de forma que el animal no muestra los síntomas de la
enfermedad.
10 CAPÍTULO 1
Escasa diversidad genética. Varios estudios, llevados a cabo principalmente en
las poblaciones occidentales, han confirmado que las poblaciones de visón europeo
están caracterizadas por una baja diversidad genética (Michaux et al., 2005; Michaux
et al., 2004; Peltier, Lode, 2003). Estos mismos estudios indican que la población
occidental muestra un único haplotipo de DNA mitocondrial, no identificado en el
resto de poblaciones europeas. Una escasa variabilidad genética se puede traducir,
sobretodo en poblaciones fragmentadas o con tamaño efectivo pequeño, en un
incremento de la consanguinidad por el efecto de endogamia, en una disminución del
éxito reproductivo y del potencial adaptativo de la especie y, por consiguiente, en un
aumento del riesgo de extinción de la misma (Allendorf, Luikart, 2007; Frankham,
2002).
1 .1 .5 Es ta tus y conservac ión
Un programa de gestión que pretenda preservar cualquier especie amenazada exige
además de tener un amplio conocimiento sobre su biología, ecología y dinámica
poblacional, incluir aspectos como la determinación de la variabilidad genética de las
poblaciones, la cuantificación del flujo genético entre poblaciones, el conocimiento de
la estructura genética o la identificación de poblaciones aisladas. A corto plazo se
debe asegurar la protección de los hábitats naturales donde las especies viven. Sin
embargo, a largo plazo se debe garantizar preservar la capacidad que tienen las
especies para responder a los cambios ambientales. Las especies amenazadas viven,
muchas veces, en ambientes fragmentados con un número reducido de individuos y
con escaso flujo genético entre las poblaciones, de ahí que se encuentren más
influenciadas por la interacción de factores externos y por fenómenos estocásticos
ambientales, demográficos o genéticos (Frankham, 2002). Una mejora de la
diversidad genética de las poblaciones se traduce en un incremento del potencial
evolutivo de las especies y por tanto, en un aumento de la capacidad que tienen para
hacer frente a cambios ambientales. De ahí que sea crucial preservar la diversidad
genética de las especies amenazadas.
El visón europeo se encuentra catalogado como especie en peligro de extinción
dentro del Catálogo Nacional de Especies Amenazadas (BOE nº 165, ORDEN
MAM/2231/2005) y de las listas rojas de la IUCN (Internacional Union for
Conservation of Nature <www.iucnredlist.org>): categoría mundial IUCN (2008): EN
INTRODUCCIÓN 11
A2ce. La rápida extinción en Europa central y el grave declive que sufren
actualmente el resto de poblaciones, ha llevado a considerar al visón europeo como
una de las especies de mamíferos más amenazadas de Europa y del mundo (Maran,
2007). Por este motivo, en 1991 el Consejo de Europa, desde las directrices
marcadas por el Convenio de Berna, convocó, por primera vez, a un comité de
expertos de visón europeo con el fin de estimar las principales causas del declive de
la especie y plantear unas líneas de actuación básicas a aplicar en los diferentes
planes de conservación locales y estatales, para asegurar la viabilidad de las
poblaciones de visón europeo (Palazón, Ruiz- Olmo, 2006).
En Rusia, Estonia y Alemania se han llevado a cabo diversas actuaciones
orientadas a la cría en cautividad y a la reintroducción del visón europeo, con el
objetivo de formar un stock cautivo que mantenga la mayor variabilidad genética
posible. Se pretende reforzar las poblaciones salvajes aumentando el área de
distribución y la densidad poblacional. Así, a finales y principios de los años 80 y 90,
respectivamente, se realizaron las primeras sueltas de visón europeo en las islas
Kurile y dentro de las islas del archipiélago Valaam del Lago Ladoga en el norte de
Rusia (Rozhnov, 1993; Tumanov, Rozhnov, 1993). En Estonia se creó el comité para
la conservación y cría del visón europeo European mink Conservation and Breeding
Committee y se aprobó un programa de conservación ex situ que contemplaba la
creación de diversos centros de cría en cautividad en Estonia y Alemania con el fin de
de formar un stock cautivo que ejerciera de reserva genética. La puesta en marcha
de varios centros persigue minimizar los riesgos de pérdida de diversidad genética de
la población cautiva (Maran, 1992). Recientemente el visón europeo fue reintroducido
en la Isla de Hiiumaa en Estonia (Macdonald et al., 2002; Maran et al., 2009).
A principios del siglo XXI se realizó un proyecto en Rumania en el que se
contemplaba abordar la problemática del visón europeo en el Delta del Danubio, con
el fin de desarrollar medidas de actuación necesarias para su conservación (Kranz et
al., 2000-2001). Dentro de los objetivos marcados se encontraban: conocer el estado
de las poblaciones del visón europeo y las causas de su declive en el Delta del
Danubio, recoger datos sobre la biología de este mustélido y de su comportamiento,
realizar un estudio genético y poner en marcha una campaña de sensibilización y
educación para minimizar los efectos negativos de su interacción con el hombre.
En España, dentro de la Estrategia Nacional de Conservación del visón europeo
y de los diferentes Planes de Gestión y Conservación de las Comunidades
Autónomas, se encuentran recogidas diversas líneas de actuación planteadas para
12 CAPÍTULO 1
garantizar la supervivencia a largo plazo del visón europeo, reduciendo el grado de
amenaza que sufre actualmente la especie (Grupo de Trabajo del Visón Europeo,
2005). Dentro de las medidas de gestión adoptadas se encuentran: (1) el
seguimiento de la diversidad genética de cada uno de sus núcleos poblacionales; (2)
la conservación y recuperación del hábitat que ocupa, como son los bosques y la
vegetación de ribera; (3) el desarrollo de programas para evitar muertes por
atropellos y ahogamientos; (4) el seguimiento, control y erradicación de las
poblaciones de visón americano; (5) el seguimiento y control de la ADV; (6) la
puesta en marcha de diversos centros de cría en cautividad; (7) la reintroducción y el
reforzamiento de las poblaciones salvajes; y (8) el desarrollo de un programa de
sensibilización y educación ambiental (Palazón, Gómez, 2007).
Otras medidas de conservación están enfocadas al desarrollo y aplicación de
técnicas de reproducción asistida, de criopreservación de semen, óvulos o embriones
y de inseminación artificial (Amstislavsky et al., 2008). Estas biotecnologías
reproductivas se están empleando como métodos alternativos para la conservación
ex situ de especies amenazadas, ya que, entre otras cosas, facilita el manejo
genético de las poblaciones naturales (Pukazhenthi, Wildt, 2004).
1.2 Aportaciones de la Genét ica a la
Conservación de Especies Amenazadas
Numerosos trabajos científicos relativos a la conservación de la diversidad biológica
han puesto de manifiesto la importancia del conocimiento de las características
genéticas de las especies a proteger (Avise, Hamrick, 1996). El mantenimiento y la
conservación de la diversidad genética ha adquirido un papel muy importante en los
últimos veinte años y se ha convertido en una de las prioridades recogidas en todos
los programas y estrategias de conservación de especies amenazadas (Frankham,
2002; Van Dyke, 2008). Un descenso significativo de la variabilidad genética puede
generar problemas asociados a la endogamia e incidir negativamente en la capacidad
que tienen las especies para hacer frente a los cambios ambientales, lo que se
traduce en una pérdida del poder adaptativo y, en consecuencia, en un incremento
del riesgo de extinción. La genética de la conservación pretende minimizar el riesgo
de extinción de las especies por factores genéticos y preservarlas como unidades
INTRODUCCIÓN 13
dinámicas con el suficiente potencial evolutivo para poder adaptarse a los cambios
ambientales (Conner, Hartl, 2004; Frankham, 2002).
El desarrollo de nuevas técnicas (PCR, secuenciación, análisis de
fragmentos,…) y marcadores moleculares (DNA mitocondrial, microsatélites, SNPs,…)
ha permitido un gran avance de la biología molecular en los últimos 20 años. Así, se
ha generado una gran cantidad de información genética de interés aplicada, entre
otras cosas, para la conservación de las especies amenazadas (Allendorf, Luikart,
2007; Lowe et al., 2004). Además, en la actualidad los planes de gestión y
conservación de especies amenazadas están incluyendo, específicamente, el
desarrollo de diferentes estudios genéticos como estrategias de acción adicionales, ya
que ofrecen información importante acerca de la variabilidad y estructura genética de
las especies a proteger (Van Dyke, 2008).
En muchas especies de mamíferos europeos se ha podido constatar una alta
diversidad genética entre poblaciones distantes geográficamente, tal y como ocurre
con el oso pardo Ursus arctos (Randi, 2003; Taberlet et al., 1998), el erizo común
Erinaceus europaeus (Seddon et al., 2001) o varias especies de micromamíferos
(Aars et al., 2006; Brunhoff et al., 2003; Deffontaine et al., 2005). No obstante, en
otras especies se ha visto que la variabilidad genética entre poblaciones es muy
pequeña, como ocurre en el lobo europeo Canis lupus (Aspi et al., 2006; Randi,
2003; Vila et al., 1999) o en la nutria Lutra lutra (Randi et al., 2003).
En los últimos años se han efectuado varios estudios de caracterización
molecular en diferentes especies de mustélidos, dirigidos fundamentalmente a
conocer su variabilidad genética, establecer las relaciones filogenéticas inter- e
intraespecíficas, la filogeografía de las especies y su evolución. Estos trabajos
incluyen, principalmente, el análisis de isoenzimas (Lodé, 1999), microsatélites
(Belliveau et al., 1999; Fleming et al., 1999; Lecis et al., 2008), DNA ribosómico
nuclear (Hosoda et al., 1999), así como de las regiones más variables del DNA
mitocondrial, como son la región codificante para el citocromo-b (Davison et al.,
1999; Davison et al., 2000a; Davison et al., 2000b; Kurose et al., 2000) y la región
control o D-Loop (Davison et al., 2001; Davison et al., 2000b; Effenberger,
Suchentrunk, 1999; Kurose et al., 1999).
Los estudios de secuenciación de DNA mitocondrial que se han realizado con
visón europeo apuntan a una baja variabilidad genética de la especie (Davison et al.,
2000b; Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004; Peltier, Lode, 2003), de forma
similar a lo que ocurre en otras especies de mustélidos (Larson et al., 2002; Marmi et
14 CAPÍTULO 1
al., 2006; Pertoldi et al., 2006). Por otro lado, también distinguen tres núcleos
poblaciones de visón europeo respecto a los niveles de diversidad genética, siendo la
región del noreste de Europa la que se caracteriza por presentar la mayor
variabilidad. Estos estudios además, han permitido deducir que las poblaciones del
visón europeo son el resultado de un proceso de recolonización europea, posterior al
último máximo glacial (alrededor de 18.000 años), a partir de ejemplares
provenientes de un único refugio meridional (Michaux et al., 2005; Michaux et al.,
2004).
1 .2 .1 Ap l i cac iones de l as her ramien tas mo lecu la res
Las herramientas moleculares ofrecen una información muy útil para desarrollar
medidas adecuadas para una correcta gestión de las especies amenazadas (Allendorf,
Luikart, 2007; Frankham, 2002). Entre la información que nos ofrecen se pueden
destacar los siguientes aspectos: conocer la estructuración genética de las
poblaciones; estimar parámetros demográficos (flujo génico, tamaños efectivos
poblacionales, etc.); resolver las incertidumbres taxonómicas; delimitar unidades
evolutivamente significativas (Evolutionary Significative Units ESUs) y unidades de
gestión (Managament Units MUs); seleccionar las mejores poblaciones desde las que
llevar a cabo reintroducciones o refuerzos poblacionales; asesorar el manejo de las
poblaciones cautivas (conservación ex situ); identificar problemas de endogamia y
de pérdida de diversidad genética o detectar problemas de hibridación. A
continuación se hará referencia específica a los estudios moleculares abordados
durante el desarrollo de esta tesis doctoral aplicados a la biología de la conservación
del visón europeo.
Ca ra c t e r i z a c i ón de l a f r agmen ta c i ón y e s t r u c t u r a c i ón de
l a s pob l a c i one s
La mayoría de las especies se encuentran fragmentadas o estructuradas en
diferentes grupos poblacionales (Allendorf, Luikart, 2007). El estudio de la variación
genética de una especie se puede abordar a dos niveles, diferenciación genética
dentro y entre poblaciones. El conocimiento de la estructura genética de una especie
proporciona información, no sólo acerca de la distribución de la variabilidad genética
INTRODUCCIÓN 15
inter e intra poblacional sino también, sobre los diferentes procesos que han venido
actuando sobre las poblaciones, como el flujo génico, la migración, la tasa de
mutación, o los niveles de endogamia.
La fragmentación de las poblaciones procede, generalmente, de un proceso de
reducción del hábitat de las especies con posterior división en distintos grupos
poblacionales aislados (Frankham, 2002). Una de las principales consecuencias de la
fragmentación poblacional es la pérdida de la diversidad genética por deriva génica,
más acusada en poblaciones pequeñas. Por otro lado, la fragmentación poblacional
puede conducir a un aumento de la diferenciación genética interpoblacional,
consecuencia de la reducción del flujo génico entre ellas por la dificultad de que los
individuos puedan desplazarse entre poblaciones (migración). Así, la fragmentación
poblacional puede conducir a un incremento del riesgo de extinción de las especies.
El impacto genético de esta fragmentación depende de diferentes factores,
como son: el número y el tamaño de subpoblaciones que han quedado fragmentadas,
el patrón de distribución geográfica de las mismas, la distancia entre cada
subpoblación, o las características de la matriz de fragmentación. Todos estos
factores inciden en la tasa de migración y capacidad de dispersión de los individuos,
lo que está directamente relacionado con el flujo génico entre poblaciones. Además,
el impacto genético también depende del tiempo desde que se produjo la división
poblacional (Frankham, 2002).
De f i n i c i ón de ESUs y MUs
Para realizar una conservación adecuada es preciso definir cuáles son las
unidades (conjunto de organismos) que requieren ser conservadas; es decir, se
necesita disponer de un principio útil y válido que sea aplicable a los diferentes
organismos (Iriondo, 2000). Así, se desarrolló el término unidad evolutivamente
significativa (ESU Evolutionary Significant Units) (Ryder, 1986), que se refiere a
aquellos grupos de organismos que, al presentar unas diferencias significativas con
respecto a otros grupos, deberían ser conservados de forma independiente
(Allendorf, Luikart, 2007). Se han descrito diferentes criterios para definir las ESUs,
como por ejemplo, el introducido por Moritz (1994b), quien propone la aplicación de
marcadores genéticos para delimitarlas. En este caso, se considera que una ESU
queda definida por aquellos grupos recíprocamente monofiléticos para el DNA
mitocondrial o que muestran diferencias significativas en las frecuencias alélicas de
16 CAPÍTULO 1
loci nucleares. Este concepto, aunque ha sido muy empleado, ignora las diferencias
adaptativas de las poblaciones. Por el contrario, Crandall et al. (2000),
posteriormente, destacaron la importancia de considerar, no sólo los factores
genéticos, sino también los ecológicos y adaptativos para definir las ESUs. Aunque
esta última parece más adecuada, no está exenta de críticos que ven una gran
dificultad de definir correctamente las ESUs en función de ambos criterios, sobretodo
para especies amenazadas y en peligro de extinción (Allendorf, Luikart, 2007).
Las unidades de gestión (MUs Management Units), a diferencia de las ESUs, no
representan unidades independientes desde un punto de vista evolutivo ni muestran
necesariamente una diferenciación ecológica. Al contrario, suelen representar
poblaciones importantes para la persistencia a largo plazo de las ESUs. Este término,
implantado por Moritz (1994b), se establece en función de las diferencias alélicas
existentes entre poblaciones. Puede darse el caso de que una ESU quede definida por
varias MUs (Allendorf, Luikart, 2007).
Cualquiera que sea el método utilizado para definir estas unidades de
conservación, queda patente la gran importancia que tiene disponer de una
información genética adecuada.
Segu im i en t o de l a b i o l og í a de l a s e spec i e s med i an t e
mues t r eo s no i n va s i v o s
La gestión de especies amenazadas requiere conocer de forma precisa
diferentes aspectos de su biología y comportamiento. Ello exige hacer un seguimiento
de los ejemplares, lo cual en muchas ocasiones, sobre todo cuado se trata de
especies raras, elusivas o de especies en peligro de extinción, no es fácil (Piggott,
Taylor, 2003; Waits, Paetkau, 2005). En estos casos puede recurrirse a la captura de
ejemplares, lo que puede provocar un estrés e incluso provocar su muerte. De ahí
que en los últimos años se haya visto incrementada la utilización de muestreos no
invasivos (que no requieren la captura ni la molestia de los animales), tales como
recolección de excrementos, pelos, plumas, etc., materiales todos ellos muy útiles
para estudios genéticos (Taberlet, Waits, 1998). Estas muestras proporcionan una
fuente de DNA que puede ser empleada, por ejemplo, para comprobar la presencia
de una especie y su interacción con otras especies simpátricas, identificar y
cuantificar el número de individuos, determinar el sexo de los ejemplares, sus
desplazamientos, así como para estimar la estructura poblacional o evaluar los
INTRODUCCIÓN 17
niveles de diversidad genética poblacional (Lucchini et al., 2002; Marrero et al.,
2008; Piggott et al., 2006; Ruiz-González et al., 2008; Sastre et al., 2009; Taberlet,
Luikart, 1999).
Conse r va c i ón ex s i t u
La conservación ex situ se define como la conservación de las especies fuera
de sus hábitats naturales (Allendorf, Luikart, 2007). Actualmente desempeña un
papel fundamental dentro de varios planes de conservación de especies amenazadas
(Frankham, 2002). Cuando aún se conservan poblaciones naturales, la conservación
ex situ se dirige a servir de apoyo de las estrategias de conservación in situ. La
conservación ex situ de fauna se puede realizar mediante criopreservación de
gametos, de células madre o de bancos de tejidos, o mediante centros de cría en
cautividad. El mantenimiento de centros de cría en cautividad, más concretamente,
está contribuyendo de manera efectiva al apoyo de planes de conservación de
especies en peligro de extinción (IUCN, 1987). En el caso de la Península Ibérica se
está aplicando sobre diferentes especies de vertebrados y de invertebrados (Jiménez-
Pérez, Delibes de Castro, 2005). Estas técnicas también se han comenzado a realizar
utilizando las poblaciones españolas de visón europeo (Grupo de Cría en Cautividad
del Visón Europeo, 2007).
Un correcto programa de conservación ex situ exige, entre otros aspectos,
mantener unos niveles de diversidad genética relativamente altos y a largo plazo.
Para ello es preciso realizar un correcto diseño de los cruces más adecuados, para
evitar, en lo posible, los problemas asociados a la consanguinidad y la consiguiente
depresión por endogamia (Frankham, 2002).
De te c c i ón de h í b r i do s y cuan t i f i c a c i ón de i n t r og r e s i ón
gené t i c a
La hibridación se define como el apareamiento entre organismos de distintas
especies, subespecies o poblaciones (Van Dyke, 2008). Puede producirse bien de
forma natural, como parte de la dispersión de las poblaciones naturales, o ser el
resultado de factores antrópicos (Allendorf et al., 2001). Así, la introducción de
especies alóctonas o la modificación del hábitat, derivadas de la actividad humana,
han generado que especies exóticas se pongan en contacto con las nativas o que se
18 CAPÍTULO 1
interrumpan las barreras de aislamiento reproductivo que las mantenían aisladas
(Rhymer, Simberloff, 1996). La introgresión genética se refiere al proceso de
incorporación del material genético de una especie en el genoma de otra como
resultado de la hibridación (Van Dyke, 2008). Los híbridos de primera generación
(F1) se pueden cruzar entre sí, así como, retrocruzarse con individuos de las especies
parentales, lo que genera en la población un mosaico de individuos puros e
individuos híbridos con diferente grado de introgresión genética o categoría híbrida.
La hibridación se produce de forma habitual entre especies cercanas (Funk et al.,
2008; Muñoz-Fuentes et al., 2007; Verardi et al., 2006) y suele crear problemas a la
hora de determinar la integridad genética de las especies y de elaborar medidas de
conservación específicas para los individuos híbridos (Allendorf et al., 2001; Grant,
Grant, 1992; Van Dyke, 2008).
Wirtz (1999) propuso la existencia de dos vías para explicar el origen de los
híbridos interespecíficos. La primera es la hibridación recíproca donde los híbridos
resultan del cruce entre hembras de la especie A y machos de la especie B y
viceversa. En la segunda, los híbridos resultan de una sola línea de cruzamiento,
hibridación unidireccional, donde las hembras de la especie A, denominada por Wirtz
como la especie materna (mother species), se aparean con los machos de la especie
B, denominada como la especie paterna (father species), pero no a la inversa.
Se han descrito diferentes tipos de barreras que producen aislamiento
reproductivo e interrumpen el flujo génico entre las especies (Coyne, Allen Orr,
2004; Fontdevila, Moya, 2003), y que a su vez se han empleado como hipótesis que
explican los dos tipos de hibridación mencionados anteriormente, tanto la recíproca
como la unidireccional (Wirtz, 1999). Estos mecanismos se dividen en dos grandes
clases, los precigóticos y los postcigóticos. Las barreras de aislamiento precigótico
previenen y dificultan la formación de cigotos híbridos y pueden dividirse a su vez en
mecanismos que impiden el apareamiento o cópula de los organismos (por ejemplo
aislamiento estacional o temporal, ecológico o de hábitat y etológico o sexual) y
mecanismos que dificultan la transferencia de los gametos o impiden la fecundación
después de la cópula (aislamiento mecánico e incompatibilidad gamética). Por el
contrario, los mecanismos postcigóticos actúan después de la formación del cigoto.
Se desarrolla el cigoto híbrido pero, o bien tiene una viabilidad reducida o nula
(aislamiento por inviabilidad híbrida), o hay una disminución o pérdida de la fertilidad
de los individuos híbridos F1 (aislamiento por esterilidad híbrida), o bien los
individuos de categorías híbridas avanzadas o aquellos procedentes del
INTRODUCCIÓN 19
retrocruzamiento entre un híbrido con la especie parental muestran una viabilidad o
fertilidad reducida (aislamiento por depresión híbrida, o depresión por exogamia).
El aislamiento por inviabilidad o esterilidad híbrida puede afectar tanto a
machos como a hembras, es decir, ser bidireccional, pero suele ser el sexo
heterogamético (XY, macho en mamíferos) el que experimenta mayor probabilidad
de inviabilidad o fertilidad. Este proceso se conoce como la regla de Haldane (Coyne,
Allen Orr, 2004).
1.3 Marcadores Moleculares
Los marcadores moleculares se han convertido, en las últimas décadas, en una
herramienta fundamental en estudios de sistemática, ecología evolutiva y genética de
poblaciones (Avise, 1994). La selección de los marcadores (DNA mitocondrial,
nuclear, alozimas, etc.) y la metodología a desarrollar depende en cada caso de los
objetivos del estudio. Cada marcador tiene unas características propias, tales como el
tipo de herencia (mendeliana o no), de expresión (dominante o codominante), de
origen (biparental, monoparental materno o paterno), del nivel de polimorfismo o de
las tasas de evolución y divergencia que presenta (Dowling et al., 1996), que se
deberán tener en cuenta según el estudio a realizar.
A continuación se describen aquellos marcadores moleculares basados en el
DNA que se han empleado en el desarrollo de esta tesis doctoral.
1 .3 .1 DNA mi tocondr ia l
El DNA mitocondrial se encuentra en las mitocondrias, orgánulos celulares cuya
función principal es la de producir energía celular. Este genoma presenta una
secuencia de bases diferente del DNA nuclear (nDNA), usa un código genético
distinto y está caracterizado por poseer un sistema de síntesis independiente del
núcleo (Lehninger et al., 1993). El DNA mitocondrial es una molécula circular de
doble hélice que, normalmente, tiene menos de 20.000 pares de bases (pb) de
longitud en células animales (Lehninger et al., 1993). En vertebrados tiene 37 genes
(Figura 2): dos ácidos ribonucléicos ribosómicos (rRNAs), 22 ácidos ribonucléicos de
20 CAPÍTULO 1
Genoma mitocondrial de mamíferos
FV
L
IQM
12S rRNA
16S rRNA
ND1
ND2
WAN
CY
COX1
COX2COX3
SD
KATPasa8ATPasa6
GND3
ND4L
ND4
R
HSL
ND5
ND6
E
CYTBT P
RegionControl
transferencia (tRNA) y 13 genes codificantes de proteínas que participan en la
fosforilación oxidativa, que tiene lugar en la membrana mitocondrial interna
(Anderson et al., 1981; Brown et al., 1982). Además comprende una región no
codificante que recibe el nombre de región control, responsable de la regulación de
los procesos de transcripción y replicación del DNA.
Figura 2 Esquema simplificado del genoma
mitocondrial. Se señalan los 37 genes: 2 rRNAs
(12S y 16S), 22 tRNAs, que se indican con las
abreviaturas de los aminoácidos que
transportan, 13 genes codificantes de proteínas
(ND, gen NADH deshidrogenasa: ND1-ND6;
COX, gen de la citocromo c oxidasa: COX1,
COX2, COX3; gen de la ATP sintasa: ATPasa 6 y
ATPasa 8; CYTB, gen del citocromo b), además
de la región control no codificante.
El DNA mitocondrial muestra una tasa mayor de mutación que el DNA nuclear
(Brown et al., 1979). Además, está presente en un mayor número de copias dentro
de una misma célula en comparación con el DNA nuclear (Avise, 2000). Presenta un
tipo de herencia matrilineal, es decir, que el DNA mitocondrial tan sólo se hereda por
vía materna, además de carecer de recombinación. Todo ello le confiere
características muy ventajosas frente a otros marcadores moleculares, lo que implica
que sea una molécula muy empleada en estudios genéticos y de evolución (Avise,
2000).
El DNA mitocondrial se ha convertido en un marcador molecular muy válido
tanto para el estudio de procesos evolutivos a nivel poblacional como para establecer
la divergencia genética o el origen geográfico de ciertas poblaciones o especies de
interés (Avise, 2000; Moritz, 1994a; Moritz et al., 1987). También ha adquirido
importancia en el campo de la filogenia, para resolver las relaciones filogenéticas
entre taxones emparentados, o para estudiar eventos históricos como los cuellos de
botella o expansiones poblacionales, además de detectar procesos de hibridación
entre poblaciones o especies diferentes (Avise et al., 1987; Moore, 1995). En
INTRODUCCIÓN 21
particular, el gen del citocromo b y la región control han sido ampliamente
empleados para evaluar la variabilidad genética y determinar la historia evolutiva
reciente de diferentes especies y grupos de vertebrados. Además, se han aplicado de
forma más concreta, para resolver los problemas taxonómicos relativos a la familia
Mustelidae, anteriormente mencionados.
1 .3 .2 Cromosoma Y
El cromosoma Y, junto con el cromosoma X, forma la pareja de cromosomas sexuales
característica de mamíferos y es propio de individuos macho (machos
heterogaméticos XY). Es de menor tamaño que el cromosoma X y en proporción
presenta menor contenido genético (Hellborg, 2004). El cromosoma Y consiste en
una región no recombinante (Male-specific region MSY), que en humanos abarca el
95% del tamaño total del cromosoma, flanqueada por las regiones
pseudoautosómicas (pseudoautosomal region PAR) (Hellborg, 2004; Skaletsky et al.,
2003). Las regiones PAR, a través de las cuales se produce la recombinación durante
la meiosis, comprenden el otro 5% del cromosoma y son homólogas de las presentes
en el cromosoma X (Hellborg, 2004). La región MSY contiene secuencias
heterocromáticas, condensadas y que no se transcriben, y tres tipos de secuencias
eucromáticas funcionales, definidas en inglés como: X-transposed, que procede el
brazo largo del cromosoma X con el que muestra una similitud del 99%, X-
degenerate, considerada un antiguo fragmento de los cromosomas autosómicos, a
través de los cuales evolucionaron los 2 cromosomas sexuales, y ampliconic,
caracterizada por mostrar parecido con otras secuencias del MSY además de
presentar regiones palindrómicas (Skaletsky et al., 2003). Estas regiones están
involucradas en el proceso de la espermatogénesis y el desarrollo de las gónadas, de
ahí que mutaciones producidas en estas regiones, conlleven a la infertilidad del
individuo. Se pueden destacar los siguientes genes: SRY (Sex determining region Y),
SMCY (SMCY homolog, Y chromosome –mouse- pseudogene), DBY (Dead box Y), ZFY
(Zinc finger Y) y UTY (Ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene).
Al tratarse de un marcador haploide que carece de recombinación (excepto en
la región pseudoautosómica), al igual que el DNA mitocondrial, el cromosoma Y
permite trazar la filogenia de una especie a través de la línea germinal paterna, ya
que este cromosoma muestra una herencia de tipo patrilineal, es decir, que se
22 CAPÍTULO 1
hereda exclusivamente de padres a hijos (Hellborg, Ellegren, 2003). De este modo,
su análisis permite establecer la historia evolutiva de la línea paterna una especie
(Hatch et al., 2006; Pidancier et al., 2006; Yannic et al., 2008). Por otro lado, su uso
combinado con el DNA mitocondrial y otros marcadores moleculares biparentales,
como por ejemplo los microsatélites, resulta particularmente útil en estudios de
hibridación, ya que permiten detectar posibles individuos híbridos y determinar la
dirección de la introgresión (Dowling et al., 1996; Tosi et al., 2007; Vila et al., 2003).
Así mismo, el cromosoma Y ha sido ampliamente empleado para definir el sexo de los
animales, sobretodo en estudios donde se emplean muestras no invasivas o donde la
identificación del sexo, a través de los caracteres sexuales, se ve dificultada (Mucci,
Randi, 2007; Pilgrim et al., 2005).
1 .3 .3 M i c rosa té l i t es
Los microsatélites son secuencias cortas de DNA de 1 a 6 pb, repetidas en tándem un
número elevado de veces y que se encuentran distribuidas de forma aleatoria a lo
largo del genoma (Figura 3) (Jarne, Lagoda, 1996; Tautz, 1989). Se caracterizan por
ser altamente informativos, polimórficos y codominantes. Se consideran marcadores
neutros, con un tipo de herencia mendeliana simple y una tasa de mutación muy
elevada, del orden de 10-2 y 10-6 mutaciones por locus y por generación dependiendo
del organismo (Goldstein, Schlötterer, 1999; Schlötterer, 2000). Se emplean con
éxito en estudios de parentesco, para identificar y discriminar individuos
(fingerprints), en estudios de hibridación e introgresión genética, así como en
estudios poblacionales, para determinar la estructura genética, calcular las
diferencias intra e interpoblacionales o para estimar flujos génicos entre poblaciones,
etc. (Avise, 1994; Hedrick, 1999; Selkoe, Toonen, 2006).
También denominados como STRs (Short Tandem Repeats) VNTRs (Variable
Number of Tandem Repeats) o SSRs (Simple Sequence Repeats), se clasifican según
el número de nucleótidos que presenta su unidad de repetición, siendo los más
comunes los di, tri y tetranucleotídicos (Figura 3) (Selkoe, Toonen, 2006). Según su
estructura los microsatélites se pueden dividir en: (1) perfectos, que están
caracterizados por un única unidad de repetición multiplicada n veces, (2)
compuestos, que están formados por varios motivos de repetición diferentes y (3)
INTRODUCCIÓN 23
imperfectos, que contienen secuencias intercaladas entre la secuencia de repetición
(Angers, Bernatchez, 1997; Weber, 1990).
Figura 3 Secuencia de un locus de microsatélite dinucleotídico. En este caso la unidad
de repetición está repetida 10 veces (CA)10. A ambos lados del microsatélite se
encuentran las regiones flanqueantes, que servirán para el diseño de los cebadores
específicos que permitirán la amplificación del locus.
Las variaciones en tamaño de los microsatélites vienen determinadas por
cambios en el número de unidades de repetición, y suelen presentar entre 5 y 40
repeticiones (Selkoe, Toonen, 2006). Los mecanismos por los cuales se generan
pérdidas o ganancias en el número de unidades de repetición no son completamente
conocidos, aunque se considera que se deben al deslizamiento de la polimerasa
(slippage) durante el proceso de la replicación del DNA (slip-strand mispairing SSM)
(Ellegren, 2000; Schlötterer, 2000). Por otro lado, no se descarta que los procesos
de recombinación también puedan estar involucrados debido a un entrecruzamiento
desigual entre los cromosomas homólogos (unequal crossing-over UCO) (Goldstein,
Schlötterer, 1999).
Se han descrito diferentes modelos teóricos que describen el proceso de
evolución de los microsatélites, siendo los principales: el modelo de alelos infinitos
(infinite allele model IAM; Kimura, Crow, 1964), el modelo de mutación paso a paso
(stepwise mutation model SMM; Kimura, Ohta, 1978) y el modelo en dos fases (two
phase model TPM; DiRienzo et al., 1994). Bajo SMM los alelos se generan por la
ganancia o pérdida de una única unidad de repetición con la misma probabilidad µ/2
en ambas direcciones, pudiendo mutar hacia estados alélicos ya presentes en la
población. Por el contrario bajo IAM, la mutación origina alelos nuevos, no presentes
en la población con anterioridad, con una tasa de mutación µ. El modelo TPM, es una
24 CAPÍTULO 1
variante del modelo SMM, donde las mutaciones introducen ganancias o pérdidas de
una unidad de repetición con una probabilidad p, mientras que suponen ganancias o
pérdidas de X unidades de repetición bajo una probabilidad de 1-p. Otro modelo de
mutación menos citado en la literatura es el modelo de k-alelos (k-allele model KAM;
Crow, Kimura, 1970) que considera un número k de estados alélicos finitos posibles
con una probabilidad de mutación µ/(k-1) constante hacia otro estado alélico k-1.
Aplicar de forma correcta un modelo u otro es esencial debido a que la estimación de
la mayoría de parámetros poblacionales depende de los modelos mutacionales que se
asuman (Goldstein, Schlötterer, 1999; Selkoe, Toonen, 2006).
A pesar de las numerosas ventajas que caracterizan a los microsatélites, estos
marcadores también presentan una serie de inconvenientes que complican su análisis
(Selkoe, Toonen, 2006). Posibles mutaciones introducidas en la región flanqueante
de unión con el cebador o problemas técnicos asociados al proceso de amplificación
(ver técnica de la PCR más adelante) de los alelos (allele dropout) (Butler, 2005)
debido a una baja concentración de DNA, la presencia de DNA degradado en la
muestra, etc., pueden dificultar la amplificación de los alelos (Allendorf, Luikart,
2007) y suponen por lo general, déficit de heterocigotos en los análisis (Selkoe,
Toonen, 2006). Los individuos heterocigotos (aquellos que presentan dos alelos
diferentes) pueden ser considerados como homocigotos (aquellos que presentan dos
copias de un mismo alelo), al haberse detectado sólo uno de los alelos. El
deslizamiento de la polimerasa durante el proceso de amplificación de los alelos
puede producir artefactos, denominados stutter bands, que también pueden causar
problemas en la interpretación del genotipado de los microsatélites por una
asignación incorrecta de los alelos (Chapuis, Estoup, 2007).
Otra limitación importante de los microsatélites se refiere a la homoplasia
(Estoup et al., 2002; Primmer, Ellegren, 1998; Tautz, Schlötterer, 1994). En este
caso, la homoplasia se refiere a aquellos alelos que son iguales por estado (identity
in state IIS) pero no por descendencia (identity by descendent IBD) (Primmer,
Ellegren, 1998). La homoplasia suele producirse con mayor probabilidad en aquellas
especies con tamaños poblacionales grandes, entre especies o poblaciones distantes
o en aquellos loci con una alta tasa de mutación (Selkoe, Toonen, 2006). Esto puede
ocasionar un sesgo en los resultados por una subestima de las divergencias
poblacionales, lo que conduciría a una interpretación errónea de los resultados.
A pesar de todo ello, algunos de estos problemas se pueden solucionar, por
ejemplo, optimizando las condiciones del proceso de amplificado del DNA, mejorando
INTRODUCCIÓN 25
el diseño de los cebadores o secuenciando el DNA cuando existen dudas (Hillis et al.,
1996b; Selkoe, Toonen, 2006).
1.4 Técnicas Moleculares
Hoy en día existen diferentes técnicas que permiten evaluar la variación genética
existente entre individuos, poblaciones y especies, entre las que se destacan la
electroforesis, la citogenética molecular, la hibridación y amplificación del DNA, el
análisis de fragmentos, la secuenciación o la clonación (Hillis et al., 1996b). A
continuación se describen aquellas que han sido empleadas de forma habitual
durante el transcurso de los trabajos recogidos en esta memoria.
1 .4 .1 E lec t ro fo res i s
Introducida en 1937 por Arne Tiselius y aplicada hoy en día de forma rutinaria en
biología molecular, genética y bioquímica, el principio básico de esta técnica consiste
en la separación de proteínas o DNA según su carga, tamaño y/o conformación
cuando se someten a un campo eléctrico (Dowling et al., 1996; Westermeier, 1993).
Así, las moléculas de bajo peso molecular se mueven con mayor facilidad a través de
una matriz, y se desplazan más lejos del punto inicial de migración con respecto a
moléculas más grandes. La movilidad se produce según su carga, de forma que al
aplicar el campo eléctrico las moléculas migrarán hacia el electrodo con carga
opuesta (Westermeier, 1993). En el caso del DNA, al estar cargado negativamente,
se desplazará hacia el cátodo. Según el medio de separación electroforética se
pueden distinguir, entre otros, la electroforesis en gel y la electroforesis capilar
(Butler, 2005).
En la electroforesis en gel se emplea una solución tampón y una matriz por la
que se produce la separación de las moléculas (Butler, 2005). La matriz es un
polímero que presenta una serie de poros de tamaño variable a través de los cuales
migran las moléculas. Según la naturaleza de la matriz a emplear se pueden
distinguir cuatro métodos diferentes: electroforesis en gel de almidón (starch gel
electrophoresis SGE), electroforesis en gel de poliacrilamida (polyacrylamide gel
26 CAPÍTULO 1
electrophoresis PAGE), electroforesis en gel de acetato de celulosa (cellulose acetate
gel electrophoresis CAGE) y electroforesis en gel de agarosa (agarose gel
electrophoresis AGE) (Dowling et al., 1996).
La electroforesis capilar es, hoy en día, una técnica altamente eficaz,
alternativa a las técnicas convencionales de electroforesis en gel. Una de las
características a destacar es que se puede aumentar la velocidad de migración de las
moléculas a través de los capilares incrementando el voltaje, ya que el sistema
permite disipar el calor generado en los capilares (Westermeier, 1993). Se trata de
un sistema automático que permite analizar varias muestras a la vez, utilizando una
cantidad mínima por muestra, y que permite transferir los resultados directamente a
un ordenador (Butler, 2005). Esta técnica se encuentra integrada en secuenciadores
automáticos de DNA.
1 .4 .2 PCR
La amplificación del DNA se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa
o PCR (Polymerase Chain Reaction) (Saiki et al., 1985). Esta técnica revolucionó el
mundo de la biología molecular ya que permite obtener fragmentos específicos de
DNA en grandes cantidades. Se fundamenta en el proceso de replicación del DNA que
tiene lugar en el núcleo celular de cualquier organismo (Palumbi, 1996). El material
genético es copiado gracias a una polimerasa termoestable, que cataliza la síntesis
del DNA, mediante la incorporación de desoxinucleótidos trifostato (deoxynucleotide
triphosphates dNTPs: dATPs, dCTPs, dGTPs y dTTPs), a partir de unos
oligonucleótidos, que actúan como cebadores (primers) y utilizando como molde el
fragmento de DNA a amplificar (Innis, Gelfand, 1990).
La PCR se realiza en condiciones in vitro óptimas, en las que se produce una
reacción cíclica, donde el número de copias de DNA inicial aumenta de forma
exponencial (Innis, Gelfand, 1990). Consiste en tres fases principales:
desnaturalización (denaturing), fase en la que se separan las dos hebras de DNA,
anillamiento (annealing), paso en la que los cebadores, complementarios a la cadena
de DNA, se unen a ella, y extensión (extending), fase en la que actúa la polimerasa y
se produce la síntesis de la nueva hebra de DNA (Figura 4). La amplificación del DNA
se realiza en sentido 5’-3’, siendo la cadena de nueva síntesis complementaria a la
hebra molde.
INTRODUCCIÓN 27
fases del procesode amplificación
hebra de DNA molde
ACTGTTCATCATGGTTGACAAGTAGTACCA
5'
5'
3'
3'
desnaturalización
ACTGTTCATCATGGT
TGACAAGTAGTACCA
5'
5'
3'
3'
anillamiento
cebador
cebador
5'
5'
3'
3'
extensión
5'
5'
3'
3'
cebador
cebador amplificaciónexponencial
Existen muchos tipos de PCR que introducen variaciones a la PCR básica, entre
las que se destacan: la PCR anidada (Nested PCR), la PCR múltiple (Multiplex PCR),
la PCR a tiempo real y la PCR de transcripción inversa o RT-PCR (Reverse
Transcription-PCR) (Innis et al., 1990). La PCR anidada, por ejemplo, se diferencia de
la PCR convencional por emplear dos pares de cebadores, los segundos internos a los
primeros, y comprender dos pasos de amplificación. La PCR múltiple o multiplex, por
el contrario, es la que se emplea de forma habitual para el análisis de los
microsatélites. En este caso, se amplifican simultáneamente varios loci de
microsatélites empleando para ello dos o más pares de cebadores en una misma
reacción de PCR (Innis et al., 1990).
Figura 4 Esquema del proceso de la PCR.
1 .4 .3 Aná l i s i s de f ragmentos
Para el estudio de los patrones de variación de los fragmentos de DNA se pueden
emplear diferentes métodos de detección en función del tamaño, número y
conformación de los segmentos de DNA.
28 CAPÍTULO 1
Geno t i pado de f r agmen to s de m i c r o sa t é l i t e s
Este método se basa en la detección del polimorfismo de los fragmentos
amplificados con repeticiones microsatélites mediante electroforesis capilar gracias al
uso de secuenciadores automáticos de DNA (Butler, 2005). Los microsatélites son
amplificados mediante una PCR, bien convencional o multiplex, donde se emplean
cebadores específicos marcados con fluorocromos. Éstos son detectados por la
fluorescencia que emiten a diferente longitud de onda cuando se excitan al pasar por
un láser durante la electroforesis capilar. Al tratarse de un sistema automático, los
resultados se informatizan e integran en el ordenador para su posterior análisis
mediante programas informáticos específicos, que muestran los resultados en forma
de electroferogramas (Figura 5). Los alelos de cada microsatélite se detectan en el
electroferograma como picos cuyo tamaño se corresponde con el tamaño en pares de
bases de cada microsatélite. La variación en el tamaño de cada alelo viene dada por
la inserción o deleción de las unidades de repetición del microsatélite, que será lo que
defina el polimorfismo de cada uno de ellos.
Figura 5 Ejemplo de un electroferograma tras el genotipado de un locus de
microsatélite en tres individuos diferentes. Cada pico se corresponde con un alelo
asignado por su tamaño como 255 y 257. (a) individuo homocigoto que presenta el
alelo 255; (b) individuo heterocigoto que muestra los alelos 255 y 257; (c)
individuo homocigoto para el alelo 257. La intensidad (altura) de cada pico varía en
función de la cantidad de fragmentos detectados por el láser.
RFLPs (Re s t r i c t i on F r agmen t L eng th Po l ymo rph i sms )
La técnica de RFLP, o polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción, se basa en la digestión mediante enzimas de restricción de material
genético amplificado. Éstas son proteínas que reconocen secuencias diana específicas
al 255 al 257 al 257
al 255
a) b) c)
600
400
200
0
250 260 270 250 260 270
1000800600
400
2000
1600
1200
800
400
0
250 260 270
INTRODUCCIÓN 29
del DNA, generalmente de 4-6 pb y palindrómicas, que cortan, comportándose como
unas tijeras moleculares. Como resultados de un ensayo de restricción se generan
fragmentos de DNA de longitud variable característicos de cada individuo, población o
especie a estudiar (Dowling et al., 1996). Este método permite detectar la variación
genética presente en los lugares de restricción. Así los mecanismos de sustitución,
inserción o deleción tienen el efecto de crear o eliminar dichos lugares de corte (de
restricción), y por tanto, de variar el número y el tamaño de los fragmentos
resultantes de la digestión con estos enzimas de restricción. Los fragmentos de DNA
resultantes pueden ser fácilmente visualizados mediante una electroforesis en gel de
agarosa.
Se trata de una técnica muy válida para la construcción de mapas físicos y de
ligamiento, para conocer la diversidad y estructura génica de las especies, para
identificar fenómenos de hibridación e introgresión genética, así como para realizar
análisis de inferencia filogenética. También se puede emplear en estudios forenses o
en casos de paternidad (Lowe et al., 2004). Esta técnica permite además, identificar
la especie a partir de material biológico no invasivo, utilizando para ello enzimas de
restricción que reconocen secuencias diana específicas de especie (Hansen, Jacobsen,
1999; Ruiz-González et al., 2008).
1 .4 .4 Secuenc iac ión
La secuenciación del DNA representa el método más directo para medir y detectar la
diversidad genética, ya que permite obtener a partir de un fragmentos genómico la
secuencia íntegra de los ácidos nucleicos, que son las unidades básicas de
información que codifican los organismos (Hillis et al., 1996a). A pesar de que hoy en
día es un método ampliamente utilizado, no fue hasta el descubrimiento de la PCR,
en los años 80, cuando este procedimiento adquirió importancia, sobre todo en
estudios de sistemática y biología molecular (Hillis et al., 1996a; Lehninger et al.,
1993). La información que se obtiene a través de esta técnica sobre la evolución de
los genes, la estructura genética de las poblaciones, la variación genética intra e
interespecífica y las relaciones filogenéticas entre poblaciones y entre taxones, entre
otros, es relativamente fácil de analizar y comparar (Hillis et al., 1996a).
Durante las décadas de 1970 y 1980 las secuenciación de DNA se realizaba de
forma manual siguiendo métodos químicos (Maxam, Gilbert, 1977) y enzimáticos
30 CAPÍTULO 1
(Sanger et al., 1977). Actualmente, se realiza de forma automática, utilizando
secuenciadores automáticos de DNA y empleando una variación al método
desarrollado por Sanger y colaboradores, que resultó ser técnicamente más sencillo
(Hillis et al., 1996a). El principio básico de esta metodología consiste en emplear,
además de los dNTPs, cuatro didesoxinucleótidos trifosfato (dideoxynucleotide
triphosphates ddNTPs: ddATPs, ddCTPs, ddGTPs, ddTTPs) marcados con fluorocromos
diferentes, que funcionan como terminadores de la síntesis de la cadena de DNA. El
DNA, previamente amplificado, se somete a un nuevo proceso de amplificación cuya
diferencia con la PCR básica radica en el bloqueo de la síntesis del DNA cuando se
incorpora un ddNTP a la nueva cadena que se está sintetizando. De esta forma se
generan fragmentos diferentes, de longitud variable, donde cada uno de ellos
presenta un ddNTP diferente en el extremo final 3’ de su cadena. El conjunto de
fragmentos resultante se separa mediante una electroforesis capilar empleando para
ello un secuenciador automático de DNA. Los ddNTPs se detectan gracias a la
fluorescencia que emiten los fluorocromos cuando se excitan al pasar por delante de
un láser (escala de color: rojo, verde, azul y amarillo/negro). Finalmente, se genera
un patrón informatizado donde la lectura de la nueva cadena de DNA se realiza
correlacionando los nucleótidos según el patrón establecido en la migración y el color
del fluorocromo con el que cada ddNPT va marcado.
1.5 Anál is is Genét icos
1.5 .1 Recons t rucc ión de á rbo les f i l ogenét i cos
Método s de i n f e r en c i a f i l o gené t i c a
Los métodos de inferencia filogenética pretenden deducir y establecer
hipótesis sobre relaciones evolutivas del pasado de las entidades (por lo general
especies o genes) que se quieren estudiar, a partir de la información actual que se
tiene de cada una de ellas (Fontdevila, Moya, 2003; Page, Holmes, 1998; Swofford et
al., 1996). Una filogenia se representa en forma de árbol, cuya topología indica las
relaciones genealógicas existentes entre cada una de las entidades y cuya longitud
de las ramas señala la distancia que hay entre ellas (Nei, Kumar, 2000). Para
construir una filogenia se pueden emplear datos morfológicos (por ejemplo
INTRODUCCIÓN 31
caracteres óseos o dentales, presencia/ausencia de alas, etc.), paleontológicos y/o
geológicos, ontogenéticos, entre otros. La filogenia molecular reconstruye la historia
evolutiva a partir de la información que se obtiene del alineamiento múltiple de
secuencias de DNA o proteínas. En general, la mejor estrategia a seguir consiste en
construir árboles filogenéticos diferentes a partir de diversos tipos de datos (p.e.
morfológicos vs. moleculares) o empleando diferentes métodos analíticos (como se
verá a continuación) para comprobar si las posibles hipótesis planteadas son
consistentes y/o robustas entre sí. No obstante, hay ocasiones en que las filogenias
obtenidas a partir de diferentes datos pueden ser distintas en incluso contradecirse,
lo cual puede indicar limitaciones en los métodos de inferencia, falta de información
en los datos o historias evolutivas diferentes (Meyer, Zardoya, 2003). Así,
fenómenos como la recombinación o la transferencia horizontal de genes dificultan la
representación de la historia evolutiva de una especie mediante un árbol filogenético
(Nei, Kumar, 2000; Posada, Crandall, 2001).
Los diversos métodos de reconstrucción filogenética se pueden clasificar según
dos criterios (Tabla 1): (1) por el tratamiento de los datos de las secuencias, en
métodos de distancias y de caracteres (discretos); y (2) por el método empleado
para la construcción de los árboles, en métodos de agrupamiento y de optimización o
búsqueda (Fontdevila, Moya, 2003; Page, Holmes, 1998).
Tabla 1 Clasificación de los métodos de inferencia filogenética en función del método de
construcción de árboles y al tratamiento de los datos utilizados: UPGMA Unweighted Pair-Group
Method with Arithmetic means (Sneath, Sokal, 1973), NJ Neighbor-Joining (Saitou, Nei, 1987),
ME Minimum Evolution (Rzhetsky, Nei, 1992), LS Least Square (Cavalli-Sforza, Edwards, 1967),
MP Maximum Parsimony (Fitch, 1971), ML Maximum Likelihood (Felsenstein, 1981) y BI Bayesian
Inference (Huelsenbeck et al., 2001). Modificado de Fontdevila y Moya (2003), Page y Holmes
(1998) y Vandamme (2003).
Tratamiento de los Caracteres Método de
Construcción Distancias Discretos UPGMA agrupamiento pareado no ponderado con
media aritmética Agrupamiento
NJ unión por vecindad
ME evolución mínima MP máxima parsimonia
LS mínimos cuadrados ML máxima verosimilitud Optimización
BI inferencia bayesiana
32 CAPÍTULO 1
Los métodos de distancias transforman la información contenida en la matriz
de datos del alineamiento múltiple en una matriz de distancias entre cada par de
secuencias, a partir de la cual se realiza la reconstrucción del árbol filogenético. Por
el contrario, los métodos basados en caracteres utilizan la información contenida en
cada posición del alineamiento múltiple directamente para buscar el árbol que
optimice la distribución de los patrones observados (Nei, Kumar, 2000; Page,
Holmes, 1998).
En función de la estrategia usada para la reconstrucción de los árboles, los
métodos de agrupamiento o clustering requieren de un procedimiento algorítmico, a
partir de cual, se obtiene la topología que mejor se ajusta al criterio establecido. En
cambio, los métodos de búsqueda emplean un criterio de optimización a partir del
cual, intentan buscar el mejor árbol de entre un conjunto de árboles posibles
(Fontdevila, Moya, 2003; Vandamme, 2003).
El método de BI busca el árbol que tiene la máxima probabilidad dados unos
datos (Huelsenbeck et al., 2001). El cálculo de esta probabilidad posterior se hace
aplicando el Teorema de Bayes, y es analíticamente muy costoso ya que implica
evaluar todos los árboles posibles y computar, para cada árbol, todas las posibles
combinaciones de longitud de las ramas y parámetros del modelo. Se han
desarrollado diversas técnicas de simulación para aproximar esta probabilidad
posterior aunque, mayoritariamente, se aplica el método de Monte Carlo con
Cadenas de Markov (MCMC Markov Chain Monte Carlo).
Eva l ua c i ón y s opo r t e de l a i n f e r en c i a f i l o gené t i c a
La obtención de una filogenia a partir de los métodos de inferencia filogenética
mencionados anteriormente, exceptuando BI, no implica que las relaciones que
muestra el árbol resultante se encuentren bien apoyadas por nuestros datos. Estos
métodos, bien sean de distancias, de ML o de MP, proporcionan árboles inferidos que
pueden llevar un error de muestreo asociado a una topología incorrecta y/o a un
error en la longitud de las ramas (Nei, Kumar, 2000). Por tanto, se hace necesario
aplicar diferentes tipos de análisis para evaluar la confianza o la robustez de la
inferencia filogenética obtenida. Existen diversos métodos, siendo el más empleado el
de bootstrap (Felsenstein, 1985). Este método no paramétrico consiste en el
muestreo con reemplazamiento del alineamiento múltiple un número determinado de
INTRODUCCIÓN 33
veces (p. ej. 1000 pseudoréplicas), y la búsqueda del mejor árbol en cada uno de los
muestreos con el método de inferencia correspondiente. Finalmente, un árbol
consenso muestra, expresado en porcentaje, el número de veces que se ha obtenido
un nodo en todas las topologías inferidas.
Por el contrario, la inferencia bayesiana, en lugar de buscar el árbol que mejor
representa la filogenia más correcta, trata de muestrear de toda la distribución de
árboles posibles los árboles con mayor probabilidad posterior y construye un árbol
consenso que presenta las agrupaciones comunes a todos ellos. Es decir, el árbol
consenso muestra el valor de probabilidad posterior de los agrupamientos, lo que
indica su soporte estadístico.
1 .5 .2 Recons t rucc ión de genea log ías in t raespec í f i cas
A nivel intraespecífico, la presencia de mutaciones recientes o de ramificaciones
múltiples, así como la coexistencia de los descendientes con sus antecesores generan
relaciones reticuladas y dificultan la construcción de árboles mediante los métodos
filogenéticos mencionados anteriormente (Hillis et al., 1996a; Posada, Crandall,
2001; Rosenberg, Nordborg, 2002). Asimismo, las matrices que incluyen datos
intraespecíficos tienen, por lo general, menos caracteres informativos para los
análisis filogenéticos, lo que reduce el poder estadístico de los métodos filogenéticos
tradicionales (Posada, Crandall, 2001). Por ello, en la última década se han
desarrollado herramientas alternativas que utilizan la información genética disponible
dentro de una especie para mostrar gráficamente la variación genética intraespecífica
(Posada, Crandall, 2001; Rosenberg, Nordborg, 2002). Estos métodos representan
las relaciones genealógicas posibles entre los haplotipos presentes en la matriz de
datos mediante conexiones en red (networks), proporcionando una herramienta de
estudio adicional para la evaluación de la estructura genética de las poblaciones
(Hillis et al., 1996a). Estos métodos están basados en principios básicos de la
genética de poblaciones como la teoría de la coalescencia (Hudson, 1990; Kingman,
1982a; Kingman, 1982b). En ausencia de selección, los haplotipos están relacionados
entre sí por su historia común, de modo que, hacia atrás en el tiempo, se juntan o
coalescen en un ancestro común.
Dentro de los algoritmos disponibles, los empleados en esta tesis fueron el
Median-Joining Network (Bandelt et al., 1999) y Statistical Parsimony (Templeton et
34 CAPÍTULO 1
al., 1992). Ambos métodos comparten el mismo fundamento teórico. Tratan de
establecer aquellas relaciones que minimicen el número de mutaciones, entre los
haplotipos contenidos en la matriz de datos. Las redes pueden incluir bucles o
reticulaciones que indican presencia de homoplasia (recombinación o mutaciones
reversas o paralelas), lo que facilita su detección (Posada, Crandall, 2001).
1 .5 .3 Cuant i f i cac ión de l a d ive rs idad gené t i ca den t ro de
una pob lac ión
La diversidad genética se define como la variación del DNA presente a nivel
individual, poblacional o de especie (Frankham, 2002). Se puede cuantificar mediante
numerosos estadísticos diferentes si se emplean datos haploides (en el caso de
secuencias de DNA mitocondrial) o diploides (en el caso de marcadores
microsatélites). El cálculo de la diversidad genética para datos de secuencias se
describe según las medidas de diversidad nucleotídica (π; Nei, 1987), definida como
la probabilidad de que dos nucleótidos tomados al azar sean diferentes, de diversidad
haplotípica (h; Nei, 1987), del número de haplotipos (Nh; Nei, 1987) o del número
medio de nucleótidos diferentes (k; Tajima, 1983), entre otras (como S, número de
sitios polimórficos).
Para datos de microsatélites, se suelen emplear las medidas del polimorfismo
de los marcadores genéticos, la riqueza alélica o la heterocigosidad (Allendorf,
Luikart, 2007; Lowe et al., 2004). El polimorfismo se refiere a la proporción de loci
variables, mientras que la diversidad o riqueza alélica se refiere a la media del
número de alelos por locus. Se encuentra influida por el tamaño muestral y el
polimorfismo de los loci, aunque existen diversos procedimientos estadísticos para
corregir estas estimas, como por ejemplo el método de rarefacción (Lowe et al.,
2004). La heterocigosidad (H) es una de las medidas más empleadas para estimar la
diversidad genética, y se puede estudiar según la heterocigosidad observada (HO) y
esperada (HE). HO viene determinada por la proporción media de individuos
heterocigotos en relación al número total de loci analizados, mientras que HE se
refiere a la probabilidad de que dos alelos elegidos al azar sean diferentes en cada
locus. Se expresa matemáticamente según la fórmula:
INTRODUCCIÓN 35
HE = 1-∑pi2
donde pi es la frecuencia media de cada uno de los alelos de las poblaciones
muestreadas. Esta expresión es también conocida como diversidad genética de Nei
(1987). Al ser una medida basada en frecuencias alélicas, su valor varía entre cero y
uno y se encuentra relativamente influida por los alelos más frecuentes (Lowe et al.,
2004).
Tes t de neu t r a l i d ad
La teoría de la coalescencia parte del supuesto de la evolución neutral de los
genes, donde las mutaciones son selectivamente neutras y mantenidas en la
población mediante el equilibrio entre mutación y deriva (Kimura, 1968; Kimura,
1983). Esto proporciona la base para el desarrollo de diversos test estadísticos que
permiten inferir, no sólo qué fuerzas evolutivas están actuando (factores selectivos),
sino también qué aspectos de la historia evolutiva de las especies están operando
(factores demográficos) (Galtier et al., 2000; Ramos-Onsins, Rozas, 2002). Se ha
observado que todos estos factores pueden cambiar los patrones del polimorfismo del
DNA. Así, con la aplicación de estos métodos sobre el DNA mitocondrial humano se
pudo concluir que su evolución se desviaba del modelo neutral, ya que los niveles de
polimorfismo detectados en la actualidad eran menores del que se esperaría
encontrar bajo condiciones de neutralidad (Excoffier, 1990). No obstante, no hay un
único test que tenga la suficiente capacidad para detectar qué factor o factores han
operado en las poblaciones. De modo que la aplicación conjunta de diversos métodos
ayuda a discernir entre las posibles causas que han intervenido, lo que incrementa la
consistencia de los resultados (Fu, 1997).
Todas las aproximaciones están basadas en el estudio del polimorfismo de la
secuencia del DNA, aunque difieren en los estimadores que emplean para determinar
si las secuencias se encuentran o no bajo el modelo de evolución neutral. Ramos-
Onsins y Rozas (2002) comprobaron la robustez de diversos estadísticos bajo
diferentes condiciones y observaron que los test Fs (Fu, 1997) y R2 (Ramos-Onsins,
Rozas, 2002) eran los que ofrecían las mejores estimas sobre la desviación del
modelo neutral debido a expansión poblacional (factores demográficos). Mientras que
un tamaño muestral reducido y el estudio de regiones nucleares con recombinación
disminuye la potencia del estadístico Fs, el test R2 es más potente cuando se
36 CAPÍTULO 1
trabajan con tamaños muestrales reducidos. Por el contrario, el test de Tajima (D;
Tajima, 1989), por ejemplo, constituye un buen estadístico para detectar cuellos de
botella frente a expansión poblacional o selección positiva (hitchhiking).
Equ i l i b r i o de Ha rdy -We inbe rg
El equilibrio de Hardy-Weinberg (HW; Hardy, 1908; Weinberg, 1908) es un
principio básico de la genética de poblaciones y describe a una población que se
encuentra en equilibrio genético. Este teorema considera que dadas las frecuencias
alélicas de una población diploide, se pueden predecir las frecuencias genotípicas de
la generación siguiente, siempre y cuando se cumplan las condiciones de panmixia,
ausencia de mutación, migración, selección natural o deriva génica, entre otras
(Allendorf, Luikart, 2007; Lowe et al., 2004).
Es fundamental conocer si los loci con los que se está trabajando se desplazan
del equilibrio de HW para interpretar correctamente de la variación genética de las
poblaciones (Lowe et al., 2004). Estos análisis se realizan mediante comparaciones
de las frecuencias genotípicas observadas respecto a las que se esperarían encontrar
en una población en equilibrio. El criterio mayoritario para detectar las desviaciones
del equilibrio es el déficit de heterocigotos, que ocurre cuando la matriz de datos
contiene más homocigotos que los esperados bajo el equilibrio de HW. Por el
contrario, habrá un exceso de heterocigotos cuando se detecten menos homocigotos
que los esperados en el equilibrio. Para evaluar si la desviación del equilibrio es
significativa o no se pueden aplicar diferentes tests estadísticos, como por ejemplo
una chi-cuadrado (χ2) o un test exacto de Fisher (Lowe et al., 2004).
Hay múltiples causas que pueden provocar desviaciones al equilibrio de HW. El
déficit de heterocigotos puede estar relacionado con factores metodológicos (causas
asociadas al muestreo, presencia de alelos nulos o existencia de una
subestructuración genética no detectada, efecto Wahlund (Nielsen et al., 2003) o con
componentes biológicas propias de los organismos (endogamia, selección positiva o
negativa hacia algún alelo,…) (Selkoe, Toonen, 2006).
INTRODUCCIÓN 37
1.5 .4 Es t ruc tu rac ión genét i ca de l as pob lac iones
La gran mayoría de las poblaciones de los organismos diploides se encuentran
estructuradas genéticamente (Balloux, Lugon-Moulin, 2002). El conocimiento y
estudio de la estructura genética poblacional es muy importante, sobretodo, en
especies amenazadas ya que proporciona una herramienta muy útil para el desarrollo
de estrategias de conservación adecuadas. La combinación de diversos factores como
procesos históricos, factores ecológicos o mecanismos de origen antrópico moldean
los patrones de estructura genética de las poblaciones, de ahí que saber cómo han
influido cada uno de ellos es importante para la conservación de las especies.
Para medir el grado de diferenciación genética poblacional (FST) se emplea
mayoritariamente el estadístico θ descrito por Weir & Cockerham (1984). Es una
medida de diferenciación genética análoga a la descrita por Wright que está basada
en el análisis de la varianza de las frecuencias alélicas. Asume un modelo de
evolución IAM (Infinite Allele Model) y es un estimador muy apropiado cuando la
diferenciación genética está causada principalmente por deriva génica (Balloux,
Goudet, 2002; Balloux, Lugon-Moulin, 2002). Existen otros métodos análogos para
evaluar la estructura genética entre poblaciones, como por ejemplo los estadísticos
GST (Nei, 1973), RST (Michalakis, Excoffier, 1996) o ΦST (Excoffier et al., 1992), este
último se emplea cuando se trabaja con datos haploides. Por ejemplo, el parámetro
RST (Michalakis, Excoffier, 1996; Slatkin, 1995), a diferencia del FST, asume el modelo
de mutación SMM (Stepwise Mutation Model) y es más apropiado cuando la
diferenciación genética entre poblaciones está causada por mutación (Pearse,
Crandall, 2004).
Una forma habitual para calcular diferenciación genética interpoblacional se
basa en el Análisis Molecular de la Varianza (AMOVA) (Excoffier et al., 1992). Este
análisis estima la variabilidad genética que queda explicada por los diferentes niveles
jerárquicos de organización, previamente establecidos (entre grupos, entre
poblaciones dentro de grupos, y dentro de poblaciones). Permite conocer los
principales componentes de la varianza y saber cómo se distribuye o reparte la
diferenciación genética entre cada uno de los niveles establecidos. La estructuración
genética puede ser evaluada mediante los índices de fijación (estadísticos-F, FIS, FST y
FIT) descritos por Wright (1951). El parámetro FIS se define como la correlación de
dos alelos entre individuos de una misma subpoblación, es decir, mide la variabilidad
genética de una subpoblación. FIS proporciona, además, una medida de la desviación
38 CAPÍTULO 1
de las frecuencias genotípicas del equilibrio de HW dentro de cada población
previamente definida, causada por la presencia de cruces entre individuos
emparentados (coeficiente de endogamia) (Allendorf, Luikart, 2007). FST es una
medida de divergencia de las frecuencias alélicas entre subpoblaciones, mientras que
FIT es una medida de la correlación de alelos en relación a la población total (Conner,
Hartl, 2004; Lowe et al., 2004)
Recientemente se han desarrollado métodos alternativos a las estimas clásicas
de genética de poblaciones citadas anteriormente (FST y análogos), que detectan
estructuración genética poblacional gracias a la aplicación de métodos de agrupación
bayesiana (Falush et al., 2003; Huelsenbeck, Andolfatto, 2007; Pritchard et al.,
2002; Pritchard et al., 2000). Estos nuevos métodos analíticos están basados en la
información de datos de frecuencias alélicas. Una de sus ventajas consiste en que
evita el posible error derivado de la agrupación previa y subjetiva de los individuos.
Asume un modelo con un número K de poblaciones (clusters) y posteriormente
asigna los individuos a cada uno de los clusters inferidos, calculando la probabilidad
posterior de pertenencia a cada una de ellos mediante la técnica de simulación de
MCMC.
1 .5 .5 Detecc ión de h íb r idos
El método recientemente desarrollado por Pritchard (Falush et al., 2003; Pritchard et
al., 2002; Pritchard et al., 2000) permite identificar individuos migrantes y detectar a
aquellos individuos que presentan características genéticas mixtas de varias
poblaciones distintas (admixed individuals). Cabe señalar que esta aplicación se
complementa con métodos análogos, como el desarrollado por Anderson y Thompson
(2002), en estudios para detectar hibridación entre especies emparentadas o
poblaciones genéticamente separadas (Oliveira et al., 2008; Soland-Reckeweg et al.,
2008; Streiff et al., 2005). Este modelo de agrupamiento Bayesiano alternativo es
muy útil ya que no requiere de información previa sobre las frecuencias alélicas de
las poblaciones o especies parentales y permite, además, trabajar con microsatélites
no específicos de especie. Parte del supuesto de que la población está formada por
varias clases de individuos, tanto parentales como híbridos (de primera generación,
F1, de segunda generación, F2 y de generaciones retrocruzadas, Bx), y calcula,
INTRODUCCIÓN 39
mediante una simulación de MCMC, la probabilidad posterior de que cada individuo
de la matriz de datos pertenezca a cada una de estas clases.
1 .5 .6 P rogramas in fo rmát i cos
En la última década han aparecido un gran número de programas que aplican los
métodos y procedimientos estadísticos citados anteriormente para caracterizar la
diversidad genética y el estudio de la historia evolutiva de las poblaciones de las
especies. A continuación se facilita un listado con los programas informáticos que se
han aplicado durante el transcurso de esta tesis, junto con la referencia bibliográfica
y el link de referencia.
Programa Referencia Bibliográfica Link de Referencia
Arlequin v.3.1 (Excoffier et al., 2005) http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/
Bottleneck v.1.2.0.2
(Piry et al., 1999) http://www1.montpellier.inra.fr/URLB/bottleneck/bottleneck.html
ClustalX v.1.83 (Thompson et al., 1997) http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/
Convert v.1.3 (Glaubitz, 2004) http://www.agriculture.purdue.edu/fnr/html/faculty/rhodes/students%20and%20staff/glaubitz/software.htm
Create (Coombs et al., 2007) http://www.lsc.usgs.gov/CAFL/Ecology/Software.html
Distruct v.1.1 (Rosenberg, 2004) http://rosenberglab.bioinformatics.med.umich.edu/distruct.html
DnaSP v.4.0 (Rozas, Rozas, 1997) http://www.ub.edu/dnasp/
FSTAT v.2.93 (Goudet, 1995) http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm
FreeNA (Chapuis, Estoup, 2007) http://www1.montpellier.inra.fr/URLB/
GenePop v.4 (Raymond, Rousset, 1995) http://kimura.univ-montp2.fr/~rousset/Genepop.htm
Genetix v.4.05 (Belkhir et al., 2000) http://www.genetix.univ-montp2.fr/genetix/intro.htm
Gimlet v.1.3.3 (Valiere, 2002) http://pbil.univ-lyon1.fr/software/Gimlet/gimlet%20frame1.html
Modeltest v.3.06 (Posada, Crandall, 1998) http://www.darwin.uvigo.es/software/modeltest.html
MrBayes v.3.0b4 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001)
http://mrbayes.csit.fsu.edu/
Network v.4.500 (Bandelt et al., 1999) http://www.fluxus-technology.com/sharenet.htm
NEWHYBRIDS v.1.1beta
(Anderson, Thompson, 2002)
http://ib.berkeley.edu/labs/slatkin/eriq/software/software.htm
PAUP v.4.0b10 (PPC)
(Swofford, 2002) http://paup.csit.fsu.edu/about.html
POWSIM (Ryman, Palm, 2006) http://www.zoologi.su.se/~ryman/#_Downloading_powsim.exe
Structure v.2.2 (Falush et al., 2003; Pritchard et al., 2000)
http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html
40 CAPÍTULO 1
STRUCTURAMA v.1.0
(Huelsenbeck, Andolfatto, 2007)
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50 CAPÍTULO 1
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OBJETIVOS
El objetivo último de los trabajos recogidos en esta memoria consiste en
desarrollar diferentes técnicas moleculares que permitan realizar una caracterización
genética de las poblaciones de visón europeo (Mustela lutreola), y aplicarlas de forma
sistemática para realizar un seguimiento de la biología y dinámica poblacional del
visón europeo, así como de su interacción con el turón (Mustela putorius). Estos
estudios son básicos para implementar planes de gestión y conservación adecuados a
esta especie en peligro de extinción.
Los objetivos específicos son:
1. Desarrollar un método no invasivo para detectar la presencia de visón
europeo que permita distinguir los indicios (excrementos) de esta especie, con
respecto de indicios similares de otros mustélidos (visón americano, turón, nutria,
marta y garduña).
2. Analizar la diversidad genética de cada una de las poblaciones actuales de
visón europeo y determinar su estructuración genética, a lo largo de todo su área de
distribución, utilizando marcadores mitocondriales y nucleares.
3. Determinar la importancia relativa de diferentes causas históricas y
contemporáneas que hayan podido influir sobre la estructura genética actual de las
poblaciones de visón europeo.
4. Desarrollar un método efectivo para certificar la naturaleza híbrida de
ejemplares de morfología intermedia entre visón europeo y turón y cuantificar la
problemática de la hibridación e introgresión genética en las poblaciones naturales de
estas especies.
CAPÍTULO
2
RESULTADOS/RESULTS
En esta tesis, los resultados se presentan en forma de cuatro publicaciones,
que son las siguientes:
This Ph.D thesis produced the following publications:
Paper I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Gómez-Moliner BJ, Cabria MT, Rubines J, et al. (2004) PCR-RFLP identification of
mustelid species: European mink (Mustela lutreola), American mink (M. vison)
and polecat (M. putorius) by analysis of excremental DNA. Journal of Zoology of
London 262, 311-316.
Paper II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Cabria MT, González EG, Gómez-Moliner BJ, Zardoya R (2007) Microsatellite markers
for the endangered European mink (Mustela lutreola) and closely related
mustelids. Molecular Ecology Notes 7, 1185-1188.
Paper III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Cabria MT, González EG, Gómez-Moliner BJ, Michaux JR, Zardoya R. Patterns of
genetic variation of the endangered European mink Mustela lutreola (L., 1761). In
prep.
CAPÍTULO
3
54 CAPÍTULO 3
Paper IV... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Cabria MT, Michaux JR, Zardoya R, Gómez-Moliner BJ. Using Bayesian approaches to
detect hybridization between the threatened European mink (Mustela lutreola)
and polecat (Mustela putorius). In prep.
PAPER I
PCR-RFLP identification of mustelid species: European mink (Mustela lutreola), American mink (M.
vison) and polecat (M. putorius) by analysis of excremental DNA
Table of contents R e s u m e n .......................................................................................................................................56 A b s t r a c t ........................................................................................................................................56 I n t r o d u c t i o n ..............................................................................................................................57 M a t e r i a l & M e t h o d s ..............................................................................................................59
S a m p l i n g a n d D N A E x t r a c t i o n ....................................................................................59 P C R a m p l i f i c a t i o n o f D - l o o p ........................................................................................60 D N A s e q u e n c i n g ..................................................................................................................60 R e s t r i c t i o n e n z y m e a n a l y s i s .......................................................................................61
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n ....................................................................................................62 A c k n o w l e d g e m e n t s ...............................................................................................................66 R e f e r e n c e s .................................................................................................................................66
56 CAPÍTULO 3
Resumen
Los recientes avances en el campo de la genética molecular han permitido el
desarrollo de nuevas técnicas y metodologías basadas en el análisis e muestras no
invasivas, que no implican estresar a los animales. A continuación se describe un
método eficaz y válido para diferenciar excrementos de visón europeo (Mustela
lutreola) de otras especies de mustélidos, como por ejemplo visón americano (M.
vison) o turón (M. putorius), mediante el análisis del DNA procedente de células
intestinales que quedan incorporadas en las heces de los animales. La técnica
consiste en una Nested-PCR de la región control del DNA mitocondrial seguida de una
digestión enzimática del amplificado de 240 pares de bases pb. Para ello se
emplearon las enzimas de restricción Rsa I y Msp I. Los patrones de restricción
obtenidos por ambas enzimas permiten identificar variación en a secuencia de DNA
específica de especie. Así, se han detectado dos haplotipos para el visón europeo
(AA, AB), otros dos para el turón (AC, AD) y uno para el visón americano (BC). Esta
técnica permite, además, distinguir excrementos de nutria (Lutra lutra), marta
(Martes martes) y garduña (M. foina).
Abstract
Recent advances in molecular scatology have allowed the development of reliable
and non-invasive methods that can be applied in monitoring of small carnivores,
without disturbance of the animals. Here a method is described that can be used to
differentiate European mink Mustela lutreola, polecat M. putorius and American mink
M. vison based on the analysis of DNA extracted from faeces. It consists of a nested
PCR of a region of the mitochondrial D-loop followed by digestion of the resulting 240
bp amplicons with the restriction enzymes Rsa I and Msp I. The restriction patterns
of both enzymes, when used together, are found to detect species-specific sequence
variation. Two different haplotypes for European mink (AA, AB), another two for the
polecat (AC, AD) and one for American mink (BC) can also be discriminated by this
technique. Two new haplotypes for the mitocondrial D-loop of mustelids are
described after DNA sequencing.
PAPER I P C R - R FL P I DE N T I F I CA TI O N O F M U S TE L I DS 57
Introduct ion
Surveys of small carnivores may be difficult when the target species are similar in
size and inhabit the same environment. Further difficulties arise when species occur
in low densities, are primarily nocturnal, have inconspicuous mating behaviour, leave
little sign, and avoid humans. In these circumstances, commonly used survey
methods for small carnivores are not suitable and to overcome these problems,
devices such as track plates or photographic bait stations are used (Zielinsky, 1997).
The European guild of semi-aquatic carnivores comprises the European mink,
the western polecat and the exotic American mink. The endemic European mink
Mustela lutreola (L.) is very similar to the American mink Mustela vison (Schreber,
1777) in a clear case of convergence with this Neartic species. Nevertheless, its
closest relative may be the western polecat Mustela putorius L. with which it can
hybridize in the wild (Youngman, 1982). The range of the European mink has
declined dramatically during the latter half of the 20th century (Maran & Henttonen,
1995; Lodé, Cormier & Jacques, 2001) having virtually disappeared from Central and
Eastern Europe and the Baltic countries. Climate change, over hunting, pollution, and
habitat modification have been put forward as hypotheses to explain the decline of M.
lutreola (Maran & Henttonen, 1995; Sidorovich, Savchenko & Budny, 1995).
Hybridization with the western polecat (Davison, Birks, Maran et al., 2000; Davison,
Griffiths et al., 2000), competition (Maran et al., 1998; Sidorovich, Kruuk et al.,
1998; Macdonald et al., 2002), and the introduction of infectious diseases by the
exotic American mink (Mañas et al., 2001) may also have a great impact on the
present decline of the endangered European mink. Lodé (2001) suggested that a
combination of intensive mustelid trapping, alterations in water quality, and habitat
modification owing to agricultural practices was critical for the European mink’s
decline in Western France during the last two decades. Consequently, this decline can
be regarded as an indication of anthropic pressures on natural habitats (Lodé et al.,
2001, 2002). Although the western polecat is also vulnerable to habitat loss and
persecution, it is widespread throughout Europe and is known to be increasing its
range in Britain (Birks & Kitchener, 1999). The American mink was brought to Europe
in 1926 both for farming and to release into the wild (Stubbe, 1993), and its
distribution has increased over Europe (Ruiz-Olmo et al., 1997; Maran et al., 1998;
Mitchell-Jones et al., 1999).
58 CAPÍTULO 3
Monitoring programmes for the endangered European mink include the other
species, and most commonly use track survey and traps (Sidorovich & Kozulin, 1994;
Palazón, 1997). Because all three species weigh between 500–700 g for females and
800–1500 g for males, identification of tracks requires skilled technicians. Moreover,
track presence is conditional on the substrate characteristics of river banks or
snowcover, both changing considerably between areas. Trapping may reduce the
survival probability of individuals (Zabala et al., 2001) and, as all methods that rely
on the capture of individuals or their signs, trapping efficiency is often affected in an
unpredictable manner by factors other than abundance (Caughley & Sinclair, 1994;
Zielinsky, 1997). When the presence of mustelids is inferred from records of their
scats, disturbance to the animals is minimal and their abundance and feeding biology
may be studied simultaneously. Nevertheless, the initial step must be identification of
the species from which the faeces originated (Maizeret et al., 1998; Murakami, 2002;
Davison, Birks, Brookes et al., 2002). Visual identification of the scats of these three
species is difficult, if not impossible, because they are of similar shape, size and
odour, and they can contain remnants of the same food items (Maran et al., 1998).
The analysis of scat DNA is a recent development that has been used for
genetic studies of endangered mammal populations (Höss, Kohn & Pääbo, 1992;
Gerloff et al., 1995; Kohn et al., 1995; Whittier et al., 1999; Palomares et al., 2002),
but also for assigning individual identity to faeces (Reed et al., 1997; Febriani et al.,
2001). Hansen & Jacobsen (1999) have used faecal samples to identify the mustelid
species Lutra lutra, Mustela vison and M. putorius. They applied the PCR-RFLP
technique on a 189 bp segment of the cytochrome-b gene. Davison, Birks, Griffiths et
al. (1999) working with a longer fragment that includes the same cytochrome-b
segment have described 16 haplotypes for mustelids, which were later increased to
21 (Davison, Griffiths et al., 2000). Masuda, Abramov & Masuda (2000) have
published the complete sequence of the cytochrome-b gene for M. lutreola. Davison,
Griffiths et al. (2000) have shown that most European mink possess the cytochrome-
b haplotype C11 (32 of 37 individuals) which is also present in the Spanish M.
putorius, and that these two species also share the cytochrome-b haplotype C5
(Davison, Griffiths et al., 2000). This makes these fragments uninformative for
species identification in the south-west population of M. lutreola range, the
geographical region where our studies are concentrated.
The aim of this work was to develop a reliable and non-invasive method for
distinguishing between scats of M. lutreola, M. putorius and M. vison by the analysis
PAPER I P C R - R FL P I DE N T I F I CA TI O N O F M U S TE L I DS 59
of mtDNA of the intestinal cells of the animal that are incorporated into faeces. Our
efforts have focused on the mtDNA control region because of its extremely rapid
evolution, which provides different haplotypes even among closely related species
and populations (Tamura, 2000). The protocol includes a nested PCR for analysing
small amounts of degraded DNA.
Materia l & Methods
Samp l ing and DNA Ex t rac t i on
DNA was analysed from hair samples of European mink (78 specimens), American
mink (15 specimens) and polecat (17 specimens). All samples were collected at
different zones in the Basque Country (northern Iberian Peninsula) and western
France. Ten of the European mink specimens came from the eastern population of
the species (Nelidovo Region, Russia). DNA was extracted from hair by ordinary
phenol-chloroform extraction (Smith et al., 1990). Fresh faeces were obtained from
the home range of wild European mink (12 samples), American mink (11 samples)
and polecat (11 samples) from control field experiments. They were collected at
various localities in the northern Iberian Peninsula and western France. Several dry
mustelid faecal samples (21 samples in total) whose species determination was
previously unknown were collected from places with possible European mink
populations. Care was taken to avoid the possibility of contaminating the samples
with human DNA by touching the faeces only with fresh leaves. Samples were
introduced in autoclaved tubes with ethanol 96% and frozen at−20 ºC until
processed.
The faecal DNA extraction procedure was based on the protocols by Boom et
al. (1990), van der Hoek et al. (1995) and Taberlet et al. (1996). Briefly, 50–100 mg
of faeces were added to a tube containing 1 ml of L6 buffer (Boom et al., 1990) and
immediately vortexed. After the incubation for 3 h at 60 ºC with constant agitation,
500 μl of the liquid phase were added to 500 μl of fresh L6 extraction buffer, and
immediately vortexed. They were centrifugated (3 min, 10 000 rev/min) and 40 μl of
silica suspension (Boom et al., 1990) were added to 900 μl of the supernatant. The
mixture was vortexed and incubated at room temperature for 10 min. The silica
suspension was sedimented by centrifugation (10 s, 13 000 rev/min) and was
60 CAPÍTULO 3
washed twice with 1 ml of L2 buffer (Boom et al., 1990), twice with 1 ml of ethanol
70% and once with 1 ml of acetone 100%. The pellet was then dried at 60 ºC for 10
min and nucleic acids were eluted at 60 ºC for 5min with 120 μl H2OmQ. The mixture
was then sedimented by centrifugation (3 min, 10 000 rev/min). The samples were
monitored by running an aliquot of the extract on an agarose gel 0.7%. Extraction
blanks were included to monitor for contamination and were processed as another
sample in the subsequent amplifications.
PCR amp l i f i ca t i on o f D- loop
4 μl of the DNA extraction mixture were added to 21 μl of the PCR mixture containing
1 μl of forward primer L15774 and 1 μl reverse primer H16498 (Shields & Kocher,
1991), 2.5 μl buffer STR 10X, 0.75 μ MgCl2 (50 mM), 2 μl dNTPs (2.5 mM), 1 μl of
BSA (10 mg/ml), 12.55 μl of sterile water and 0.2 μl Taq Polimerase (5 U/μl).
After incubation for 5 min at 94 ºC the samples were subjected to 32 cycles of
amplification in a DNA thermal cycler (GeneAmp PCR System 2700) consisting of
denaturation for 1 min at 94 ºC, annealing for 1 min at 53 ºC and extension for 1
min at 72 ºC.
4 μl of the PCR product were amplified in a nested PCR with 21 μl of the PCR
mixture described above but with different primers. Initially, we used L16007 and
H16270 (Davison, Birks, Griffiths et al., 1999). Then, the latter primer was replaced
by an antisense primer designed for this study (H16290: 5’-
CTCGAGGCATGGTGATAAAGC-3’). Both primers were ligated to the universal primer
M-13. PCR was performed as described above but for 32 cycles, and with an
annealing temperature of 56 ºC; 4μl of the final amplified product were analysed by
1.5% agarose gel electrophoresis. Negative controls were used in both reactions.
DNA sequenc ing
PCR products were sequenced using the universal M-13 primer and the dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), in an ABI
PRISM Model 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
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Res t r i c t i on enzyme ana lys i s
The CLUSTALW program was used to check and align the sequences of the 3 species
and their different haplotypes. Polymorphic sites were determined and restriction
enzymes Msp I and Rsa I were identified as those generating different RFLP patterns
for each species. The enzymes were used to cut PCR products from hair and faeces of
the 3 mustelid species. Figure 1 shows the restriction sites in mitochondrial control
region that these enzymes would be expected to cut.
Figure 1 Aligned sequences of the mitochondrial D-loop fragment from Mustela
lutreola, Mustela putorius, and Mustela vison. Arrowhead, restriction site for Msp I
(recognition sequence CCGG); downward arrows, restriction sites for Rsa I
(recognition sequence GTAC). Different haplotypes are indicated in parentheses
for each species.
Restriction enzyme incubations were run in 14 μl volume, consisting of 1.4 μl
of the appropriate 10X buffer (supplied by the manufacturers with their respective
enzymes), 0.2–0.4 μl of restriction enzyme solution to give final concentration of 2–4
62 CAPÍTULO 3
U/assay, 5 μl of the PCR product, and the remaining volume pure water. Incubations
were performed for 4 h at 37 ºC, followed by 2% agarose gel electrophoresis of 10 μl
of the digestion products.
Results and Discussion
The first PCR reaction with the universal primers L15774 and H16498 produced a
fragment of nearly 550 bp in the DNA extracted from hair, but no amplicons were
visually detected in agarose gels from faeces. The nested PCR with the primers
L16007 and H16270 gave amplicons of 220 bp in European mink and polecat when
using DNA of origins, hair and faeces. Nevertheless, no amplicons were obtained
from hair or faeces in the American mink. Based on published D-loop sequences for
European mink and polecat, together with the sequences of the American mink
obtained in this study (Figure 1), the primer H16290 (5’-
CTCGAGGCATGGTGATAAAGC-3’) was designed to replace the antisense primer
H16270. The nested PCR with the new set of primers L16007 and H16290 yielded a
single amplified fragment of nearly 240 bp for all the American mink, European mink,
and polecat (Figure 1). Differences in the whole length of the D-loop sequence were
owing to the insertions/deletions observed (Figure 1). Good amplicons were obtained
in nearly all the samples with the nested PCR. Only one sample of the 55 scats
analysed was unsuccessfully amplified after nested PCR. This indicates that this
methodology is suitable for amplifying mtDNA from scats. Moreover, the obtained
amplicons can be used for RFLP analysis as well as for DNA sequencing. There was no
difference in the quality of mitochondrial sequence from the amplification products of
DNA from faecal or hair extracts. The failure percentage from fresh and dry faeces
increased to nearly 70% when the first PCR amplification was eliminated.
Sequencing of the D-loop PCR products and comparison of the new described
sequences with those obtained from the databases were used in this work to find
nucleotide substitutions useful for the specific identification of M. vison, M. lutreola
and M. putorius. In the nearly 240 bp region sequenced (Figure 1), 44 nucleotides
(18%) were found to be different between the PCR products of the three species.
Detailed comparison of the restriction maps of the sequences obtained in this work
and those from the GenBank/EMBL databases showed that the restriction
endonucleases Msp I and Rsa I were suitable to differentiate M. vison, M. putorius
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and M. lutreola from each other. The fragment patterns of the 240 bp control region
segment digested with Rsa I and Msp I were of the expected length for all species
being previously determined by analysis of the restriction sites directly on the DNA
sequence, demonstrating complete reproducibility of these analyses. The restriction
profiles obtained for all the faecal samples were in agreement with those obtained
from hair samples of the same species.
All the D-loop haplotypes published by Davison, Griffiths et al. (2000) for the
European mustelids: D1-D24 cut into two fragments of 141–148 and 89 bp using the
Msp I restriction endonuclease. These include European minks and polecats from
eastern Europe (Russia, Belarus and Estonia) and the northern Iberian Peninsula, and
several other polecats from Mongolia, Serbia and Poland (Davison, Birks, Griffiths et
al., 1999; Davison, Griffiths et al., 2000). Nevertheless, the D-loop of M. vison is
undigested by Msp I because there is a base substitution in the cutting site (there is
an A instead of a G). In consequence, the Msp I allows identification of M. vison from
M. lutreola and M. putorius.
The digestion treatment with Rsa I cut the PCR products from all the three
species (Table 1). This restriction endonuclease differentiates M. lutreola from M.
putorius and M. vison. All the D-loop haplotypes previously described by Davison,
Griffiths et al. (2000) in M. putorius: D3, D9, D10, D11, D13, D15, D16, and D24
show the restriction pattern C described in the work, which consists of three
fragments of 127, 68 and 41 bp (see Tables 1 y 2). The same fragments were seen
in M. vison when digested with Rsa I. An unpredicted restriction fragment pattern
was observed for a specimen of M. putorius of the population from western France.
We sequenced the D-loop of this undescribed mustelid haplotype (Figure 1) and new
restriction sites were identified. The Rsa I digestion pattern for this polecat consisted
of four fragments of 82, 68, 41, and 40 bp (Table 1) which are recognized as three
bands in the agarose gel electrophoresis.
Two different restriction patterns were shown by M. lutreola mitochondrial D-
loop after digestion with Rsa I. The digestion pattern A obtained in this study is that
expected for the haplotypes D18, D20, D22, and D23 described by Davison, Griffiths
et al. (2000) for M. lutreola (see Tables 1 y 2). The digestion pattern B is expected to
occur in the haplotypes D19 and D21 described by the same authors for M. lutreola.
The western population of M. lutreola showed only the digestion pattern A, while the
specimens of the Russian population showed both patterns A and B, indicating that
the genetic variability of the western population of European mink is lower than in
64 CAPÍTULO 3
the eastern one. The other European polecat Mustela eversmannii, which seems to be
closely related to the European mink on the basis of D-loop sequence (Davison,
Griffiths et al., 2000), shows an expected haplotype C after the analysis of the D12
and D18 haplotype sequences published by Davison, Griffiths et al. (2000). The
predictable restriction pattern for Mustela furo (haplotypes D1, D2, D4, D5, D6, D7
and D8 of these authors) is also C, equivalent to that showed by M. putorius.
Table 1 Length in base pairs of the different DNA fragments
obtained in Mustela lutreola, M. vison, and M. putorius after
digestion with the endonucleases Msp I (restriction patterns: A, B)
and Rsa I (restriction patterns: A, B, C, D) in mustelids.
Enzyme Restriction pattern Fragment size (bp)
MspI A 89, 142
B 236
RsaI A 82, 40, 109
B 121, 109
C 127, 41, 68
D 82, 40, 41, 68
Table 2 Haplotypes obtained after digestion of mitochondrial Dloop amplicons with Msp I
and Rsa I in Mustela lutreola (haplotypes AA, AB), M. vison (haplotype BC) and M. putorius
(haplotypes AC, AD), showing their equivalence to the haplotypes previously described in
Davison, Griffiths et al. (2000).
Species Haplotypes (present work) Haplotypes (from Davison, Griffiths et
al., 2000)
Mustela lutreola AA D19, D21
AB D18, D20, D22, D23
Mustela vison BC New haplotype
Mustela putorius AC D3, D9, D10, D11, D13, D15, D16, D24
AD New haplotype
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Other mustelid species which could leave similar faeces also showed different
restriction profiles with these two endonucleases (data not shown). DNA amplicons of
Martes martes (227 bp), Martes foina (228 bp), and Lutra lutra (229 bp) were
undigested with Msp I. Consequently, Msp I could also be used to differentiate these
three mustelid species from polecats and European minks. Digestion patterns with
Rsa I in pine martens, stone martens, and otters are also different from those
showed by the three species studied in this work. Martes martes and M. foina
amplicons were digested into three fragments of 97 (98 for the latter), 68, and 62
bp. Lutra lutra showed only two fragments of 161 and 68 bp. These were also the
expected haplotypes for all the published haplotypes in the GenBank/EMBL for the
three mustelids, excepting M. martes which can have an extra restriction site for this
enzyme showing four fragments (97, 68, 41, and 21 bp).
PCR-RFLP of the mitochondrial D-loop is a powerful technique for
differentiation between biological samples of M. putorius, M. vison and M. lutreola.
Unambiguous interpretation of the results may be achieved visually without the need
for computer analysis. Two haplotypes for Mustela lutreola (AA, AB), two for M.
putorius (AC, AD) and another one for M. vison (BC) can be discriminated using this
technique (Table 2). Restriction digest patterns that could not be ascribed to any of
the three mustelids investigated were not observed. Moreover, other European
mustelids leaving similar faeces show different lengths for the restriction DNA
fragments. One restriction of this technique is the presence of European mink and
polecat hybrids in the field. This technique only identifies the maternal DNA. Thus,
new researches based on nuclear DNA are needed to solve this limitation.
Scat analyses are used for many purposes in mustelids. They are used to
monitor the distribution and abundance of species, as well as to identify feeding
habits (Kruuk & Parish, 1981; Clevenger, 1993; Lodé, 1997; Zielinsky et al., 1997;
Sidorovich, 2000). A reliable method of species identification, however, has not
previously been described for minks and polecats. Faecal studies constitute a non-
invasive method of mustelid species identification which can reduce the anthropic
pressures and stress caused to animals by trapping. These molecular scatological
studies could replace extensive trapping in distribution and abundance surveys of
Mustela spp., as well as providing information on the interactions between M. vison
and M. lutreola in the areas were these two species occur sympatrically or
parapatrically. The analysis of faecal mtDNA also opens up the possibility of other
research related to population genetics and phylogeographic variation.
66 CAPÍTULO 3
Acknowledgements
We are grateful to the following for supplying tissue and faecal samples: Tiit Maran
(Director of the Foundation Lutreola, Tallinn), P. L. Abad (Parque Ecológico El
Karpin), G. Belamendia (CEA – Centro de Estudios Ambientales – Museo Ciencias
Naturales de Álava), J. Carrreras (Diputación Foral de Álava), J. Pinedo y A.
Senosiain (Diputación de Navarra). Many of the samples studied have been supplied
by the LIFE projects: ‘Conservación del visón Europeo (Mustela lutreola) en La Rioja’
LIFE 00/NAT/E 7331, ‘Conservación del visón Europeo (Mustela lutreola) en Álava’
LIFE 00/NAT/E 7335, ‘Conservación del visón Europeo (Mustela lutreola) en Castilla y
León’ LIFE 00/NAT/E 7229.
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PAPER I I
Microsatellite markers for the endangered European mink (Mustela lutreola) an closely related mustelids
Table of contents R e s u m e n .......................................................................................................................................70 A b s t r a c t ........................................................................................................................................70 I n t r o d u c t i o n , M a t e r i a l & M e t h o d s , a n d R e s u l t s ...............................................71 A c k n o w l e d g e m e n t s ...............................................................................................................75 R e f e r e n c e s .................................................................................................................................75
70 CAPÍTULO 3
Resumen
El visón europeo Mustela lutreola (L., 1761) está considerado como uno de los
carnívoros más amenazados del mundo. Para caracterizar genéticamente sus
poblaciones se realizó una genoteca específica de visón europeo en la que se
obtuvieron ocho marcadores de microsatélites polimórficos. El genotipado de estos
loci reveló un bajo número de alelos por locus (entre dos y ocho), así como, un bajo
nivel de polimorfismo (los valores medios de heterocigosidad observada y esperada
por locus fueron 0.49 y 0.54, respectivamente). Asimismo, estos microsatélites se
ensayaron en siete especies de mustélidos por medio de amplificación cruzada,
resultando ser muy adecuados para el estudio de diferentes especies de mustélidos.
Los microsatélites obtenidos serán muy útiles para evaluar la diversidad y estructura
genética; determinar la divergencia genética y los niveles de flujo génico existente
entre los diferentes grupos poblacionales no sólo y detectar el posible proceso de
hibridación con el turón (M. putorius), entre otros.
Abstract
The European mink Mustela lutreola (L., 1761) is an endangered carnivore species
whose populations suffered a severe decline during the last century. The genotyping
of eight polymorphic microsatellite loci revealed a relatively low number of alleles per
locus (2-8), as well as low levels of polymorphism (Ho and He values per locus were
0.49 and 0.54 respectively). Cross-specific PCR amplifications were successful in
seven closely related mustelid species suggesting that these loci may be useful not
only for assessing genetic variability in European mink populations but also for
determining potential hybridization events between M. lutreola and other mustelid
species.
PAPER I I P RI M E R NO T E 71
Introduct ion, Mater ia l & Methods, and Results
The European mink Mustela lutreola (L., 1761) is a highly endangered semiaquatic
carnivore species (IUCN Red List of Threatened Species, http://www.iucnredlist.org).
Habitat loss, hunting, and competition with farm-released American minks largely
contributed to a severe decline of European mink during the last century (Lode et al.,
2001; Maran & Henttonen, 1995). The extant populations of European mink are
restricted to southwestern France, northern Spain, Estonia, Belarus, Russia and
Romania (Maran & Henttonen, 1995), and conform three genetically distinct
(Western, Southeastern and Northeastern Europe) demes based on mitochondrial
control region sequence data, and allele size variation of microsatellites selected from
previous studies on mustelids (Michaux et al., 2005). Recently, conservation and
breeding programs were developed in order to maintain genetic diversity in wild
populations, and to avoid the effects of inbreeding and reduction in reproductive
fitness (Michaux et al., 2005).
The present study provides eight novel polymorphic microsatellites isolated
from M. lutreola, which will allow examining population genetic structure of European
mink, as well as assessing historical demography and potential genetic bottlenecks
(Michaux et al., 2005). This genetic information will be decisive for improving
conservation of wild populations of European minks, for monitoring breeding
programs in captivity, and for studying hybridization events, which are relatively
common among these carnivores (Kyle et al., 2003).
An enriched genomic DNA library of M. lutreola was constructed following the
protocols of Hamilton et al. (1999) and Ostrander et al. (1992). Genomic DNA was
extracted using a standard proteinase K/ phenol-chloroform procedure. Isolated DNA
was partially digested with RsaI (New England Biolabs), and ligated to the adaptor
SNX (5’-CTAAGGCCTTGCTAGCAGAAG-3’) (Hamilton et al., 1999). The digested DNA
was incubated at 65ºC for 15 min with a biotin-labeled [di-]oligonucleotide probe.
Microsatellite-containing products were isolated using streptavidin magnetic beads
(Dynabeads), and PCR amplified using the SNX adaptor. PCR products were ligated
into pGEM-T (Promega), and transformed into ultracompetent Echerichia coli XL-10
Gold cells (Stratagene). Recombinant clones were transferred onto nylon membranes
(Hybond-N+, Amersham), and hybridized with the biotin-labeled probes. Positive
clones were sequenced using ABI PRISM 3700 and 3730 automated sequencers
72 CAPÍTULO 3
(Applied Biosystems) with the ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction kit (V3.0).
A total of 153 positive clones were sequenced, and 26 (GenBank Accession No:
EF093582-093585, EF093587-093591, EF380094-380110) of these contained simple
GT dinucleotide repeats. Specific primer pairs were designed based on the
microsatellite flanking region sequences to PCR amplify each locus. Only 11
microsatellites could be successfully amplified after PCR optimization. PCR assays
with the remaining primers either rendered no product or resulted in numerous
unspecific bands. PCR conditions consisted of an initial denaturing at 94ºC for 5 min,
followed by 30-35 cycles of denaturing at 94ºC for 30 s, annealing at 52-60ºC (Table
1) for 45 s, and extending at 72ºC for 45 s with a final elongation step at 72ºC for 20
min. The PCR reaction included 0.2 µM of each primer, 0.33 µM dNTPs, 2mM MgCl2,
1X reaction Buffer (160mM (NH4)2 SO4, 670mM Tris-HCI (pH8.8), 0.1% Tween-20),
0.07 mg/ml BSA, 0.5 units of BioTaq DNA polymerase (Bioline), and approximately
10-15 ng of template DNA, in a final volume of 15 µl. Microsatellite loci were tested
on 41 European mink individuals collected from a diverse set of locations in Europe
(Russia, Romania, France and Spain). Polymorphism analyses were performed on ABI
PRISM 3700 and 3730 automated sequencers (Applied Biosystems) as well as on a
MegaBASETM sequencer (Amersham-Pharmacia). Alleles were scored either using
GeneMapper® software version 3.7 (Applied Biosystems) or MegaBASETM Genetic
Profiler Software Suite version 2.2.
Genotyping analyses revealed that only eight of the 11 assayed microsatellites
were polymorphic (Table 1). One locus, MLUT11, was monomorphic whereas two
showed moderate to high stuttering. The number of alleles of the polymorphic loci
varied from 2 to 8. The average number of alleles per locus was 5.25, which is
relatively lower compared to other species of the same genus such as the American
mink (M. vison) or the stoat (M. erminea) with an average of 6.57 and 11.71,
respectively (Fleming et al., 1999). Genetic diversity was estimated based on
observed (Ho) and expected (He) heterozygosities using Genetix 4.02 (Belkhir et al.,
2000). Mean Ho and He values per locus were 0.49 (ranging from 0.05 to 0.68) and
0.54 (ranging from 0.05 to 0.76), respectively. Hardy-Weinberg (HW) and linkage
disequilibrium were tested using the exact test implemented in Genepop version3.3
(Raymond & Rousset, 1995). Statistical significance was tested by running a Markov
chain Monte Carlo (MCMC) consisting in 1000 batches of 2000 iterations each, with
the first 500 iterations discarded before sampling. According to these analyses, three
PAPER I I P RI M E R NO T E 73
microsatellites (MLUT15, MLUT20 and MLUT32) were in HW disequilibrium (P-value <
0.05). Loci MLUT20 and MLUT32 showed heterozygote deficiency, whereas locus
MLUT15 presented heterozygote excess. Analyses of genotypic linkage disequilibrium
between loci showed only two significant pairwise comparisons, suggesting overall
independence of the eight loci examined (P-value <0.05).
Table 1 Description of the eight polymorphic microsatellite loci isolated from European mink (Mustela lutreola)
based on 41 individuals. Ho and He correspond to observed and expected heterozygosities, respectively, the FIS
(Wright’s statistics) and the P value of departure from Hardy-Weinberg equilibrium (P) are listed for each locus.
The forward (F) primers were labelled with fluorescent dye for detection (FAM, HEX, NED, VIC or PET) and a GTTT
tail was added to the 5’ end of reverse (R) primers in order to improve allele definition (Brownstein et al., 1996).
GenBank Accession nº Locus Primer sequence 5’-3’ Tª Repeat motif
Clone Size (bp)
F: GGAGAGGAAAACTATACCTC EF093582 MLUT04
R: CGTGTCTTGTATAGTTTTGTTCTCC
57ºC (GT)16 113
F: GTCGTGAGTGTGGAGCATAGAG EF093583 MLUT08
R: GTTTCACTCATCGTCATCCCTTCTT
60ºC (GT)12 150
F: GTGTGTTTTGTGTATGAGC EF093585 MLUT15
R: GCATGTAAACAAAACCCATCATC
60ºC (GT)14 147
F: CTTATGGAGCAAAGTAACC EF093587 MLUT20
R: GTTTGTTTCCATCTTCCATCAGG
52ºC (GT)18 134
F: CTGGACCTCTATCAGTGTCC EF093588 MLUT25
R: GTTTAAGCATATGCATCTTTGCC
55ºC (CA)15 133
F: GCCGAATGTATTAATTACATGG EF093589 MLUT27
R: GTTTCAGAGGTAATTTGGGAGAC
55ºC (GT)8 NN (GT)15 189
F: CAAGAGGGCGCGCAAAGAGCA EF093590 MLUT32*
R: GTTTGCTTAGGTGACTTACAGTTGAT
55ºC (GT)59 247
F: GAGAGATTTTTTGGTAAACT EF093591 MLUT35
R: GTTTCACCAAAGACACAATGACAGA
55ºC (CA)8 NNN (CA)3 NNN (CA)15
201
Locus Nº alleles Allele size range (bp) Ho He FIS P
MLUT04 5 103-117 0.658 0.706 0.068 0.772
MLUT08 4 152-158 0.613 0.599 -0.024 0.722
MLUT15 5 144-152 0.677 0.574 -0.181 0.001
MLUT20 8 122-146 0.600 0.757 0.209 0.032
MLUT25 6 129-147 0.568 0.690 0.180 0.314
MLUT27 2 198-200 0.050 0.049 -0.013 1
MLUT32 8 233-263 0.561 0.729 0.233 0.030
MLUT35 4 200-206 0.195 0.206 0.052 0.387
∗The repeat motif has 8 transversions
74 CAPÍTULO 3
Potential cross-species amplification of the eight microsatellites was tested on
different species of the genera Mustela and Martes (Table 2). The locus MLUT08 could
not be successfully PCR amplified in the mustelid species. Cross-species amplification
revealed that these novel European mink polymorphic microsatellite loci could be
used in population genetic studies of other mustelid species, and for determining
hybridization between closely related species of mustelids (Kyle et al., 2003).
Table 2 Cross-species amplification data of microsatellite markers isolated from M. lutreola in eight closely related
mustelid species. The number of individuals tested (N), the number of alleles (A) and the size range of the alleles (SR)
are shown.
MLUT04 MLUT15 MLUT20 MLUT25
N A SR N A SR N A SR N A SR Meve
13 5 101-109 13 3 146-150 10 6 117-144 10 6 123-136 Mfur
3 1 101 3 1 151 3 2 124-138 3 4 129-136 Msib
8 1 99 8 1 139 8 5 133-149 8 3 127-136 Mniv
2 1 99 2 1 146 1 2 131-134 1 2 125-127 Mvis
11 1 96 11 NA* 8 6 137-162 8 6 121-134 Mmar
1 2 89-96 1 1 146 7 3 124-138 7 2 118-120 Mfoi
7 1 94 7 NA 7 NA 7 1 118
MLUT27 MLUT32 MLUT35
N A SR N A SR N A SR Meve
10 5 190-208 10 6 182-277 10 5 183-212 Mfur
3 2 200-202 3 1 236 3 2 200-201 Msib
8 4 186-196 8 5 226-267 8 6 202-223 Mniv
1 2 198-200 1 1 222 1 2 195-202 Mvis
8 5 163-171 8 1 148 8 1 165 Mmar
7 5 187-204 7 NA 7 1 162 Mfoi
7 2 187-195 7 NA 7 1 162
NA*, no amplification;
Meve, Mustela eversmannii; Mfur, Mustela furo; Msib, Mustela sibirica; Mniv, Mustela nivalis; Mmar, Martes martes; Mfoi,
Martes foina
PAPER I I P RI M E R NO T E 75
Acknowledgements
We are most grateful to Juan Carlos Ceña, Pascal Fournier, Mª Asunción Gómez,
Vladimir Katchanovsky, Andreas Kranz, Javier López de Luzuriaga, Sisco Mañas, Tiit
Maran and Dimitry Skumatov for providing us with different mustelid samples. Part of
this study was performed under the supervision of Johan R. Michaux at the CBGP
laboratory in Montpellier. E.G.G. was sponsored by a predoctoral fellowship of the
Ministerio de Educación y Ciencia (MEC). M.T.C. had a fellowship of the Basque
Country Government (Dirección biodiversidad). This work received partial financial
support from three LIFE projects (“Conservación del visón europeo (Mustela lutreola)
en “Castilla León” LIFE 00/NAT/E7229, La Rioja” LIFE 00/NAT/E7331 and “Álava”
LIFE 00/NAT/E7335), and a project from the Diputación Foral de Álava
(Departamento de Urbanismo y Medio Ambiente) to BJGM, as well as a project of the
MEC (REN2001-1514/GLO) to RZ.
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PAPER I I I
Patterns of genetic variation of the endangered European mink Mustela lutreola (L., 1761)
Table of contents R e s u m e n .......................................................................................................................................78 A b s t r a c t ........................................................................................................................................78 I n t r o d u c t i o n ..............................................................................................................................80 M a t e r i a l & M e t h o d s ..............................................................................................................82
S a m p l i n g C o l l e c t i o n .........................................................................................................82 L a b o r a t o r y p r o c e d u r e s ....................................................................................................84 M i t o c h o n d r i a l D N A a n a l y s e s .......................................................................................85 M i c r o s a t e l l i t e s t a t i s t i c a l a n a l y s e s ..........................................................................87
R e s u l t s ..........................................................................................................................................89 M i t o c h o n d r i a l D N A a n a l y s e s .......................................................................................89 M i c r o s a t e l l i t e r e s u l t s .......................................................................................................92
D i s c u s s i o n ..................................................................................................................................98 A c k n o w l e d g m e n t ..................................................................................................................104 R e f e r e n c e s ...............................................................................................................................104
78 CAPÍTULO 3
Resumen
En el último siglo, el visón europeo ha experimentado una fuerte regresión de
sus poblaciones que ha derivado en la extinción en casi toda su área de distribución
en Europa. Actualmente, se localiza en tres núcleos poblacionales aislados del oeste
(Francia y España), noreste (Rusia, Bielorrusia y Estonia) y sureste (Rumania) de
Europa. En este estudio se ha analizado la región control del ADN mitocondrial y se
ha empleado el uso del genotipo de 11 microsatélites polimórficos para determinar la
diversidad genética de las poblaciones de visón europeo, cuantificar el nivel de
diferenciación genética, así como, para inferir la estructura genética de sus
poblaciones. El nivel de variabilidad genética detectada en las poblaciones de visón
europeo fue bajo. Las poblaciones del noreste de Europa se han caracterizado por
presentar los mayores valores de diversidad intraespecífica, tanto a nivel
mitocondrial como nuclear (π: 0.004, h: 0.862, PA: 20, A: 5.364, HE: 0.613). Los
niveles más bajos de diversidad genética se han encontrado en las poblaciones del
este, las cuales han mostrado un único haplotipo mitocondrial como resultado de un
posible núcleo fundador común. Los valores elevados de diferenciación poblacional,
estimados con los estadísticos FST, ΦST y RST, podrían estar influidos por la
combinación de diferentes factores, como el fuerte descenso en el tamaño
poblacional, experimentado por las poblaciones de visón europeo, y un importante
efecto de deriva génica que podría estar asociado a él. Asimismo, también se analiza
la posible existencia de diferentes refugios glaciares en el noreste y sureste de
Europa, así como, las rutas de recolonización postglaciar establecidas desde estas
regiones.
Abstract
The endangered European mink Mustela lutreola has suffered a drastic reduction in
population size during the last century which derived to the extinction of the species
in central Europe. The remaining populations were restricted to isolated areas from
Western (France and Spain), Northeast (Russia, Belarus, and Estonia) and Southeast
(Romania) Europe. In the present study the mitochondrial DNA control region and 11
polymorphic microsatellite loci were analyzed to asses the genetic diversity of
European mink populations, to quantify their degree of population differentiation as
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well as to infer their genetic structure. Estimations of population sizes and gene flow
among populations were also determined. Low levels of genetic variability were
detected in European mink populations with the highest intraspecific diversity values
displayed by the Northeastern Europe populations on both mitochondrial and nuclear
data sets (π: 0.004, h: 0.862, PA: 20, A: 5.364, HE: 0.613). The Western populations
were the least polymorphic exhibiting a unique mitochondrial DNA haplotype
probably as a result of a common single founder nucleus. The high population
differentiation values, measured by FST, ΦST and RST, could be affected by the strong
decrease of effective population size displayed by the European mink populations and
the important genetic drift which could be associated to it. A possible existence of
glacial refuges in north and southeastern Europe as well as the postglacial
recolonization routes from these regions are also discussed.
80 CAPÍTULO 3
Introduct ion
Species distribution is the outcome of the long-term effect of both historical events
and ecological adaptations, coupled with the more recent disruption caused by
human impact. Understanding the evolutionary processes involved in producing
population structuring of species, and the consequent local community assembly is
crucial for modelling species distribution and thus, for conservation planning,
particularly under changing scenarios of e.g. global warming or human-induced
habitat loss (Dalebout et al., 2005; Guiher, Burbrink, 2008; Lovette et al., 1999;
Rhymer, Simberloff, 1996; Webb et al., 2002). In this regard, statistical analyses of
genetic markers can be particularly helpful by providing new insights on the
demography and structuring of populations (Excoffier, 2004; Selkoe, Toonen, 2006;
Wegmann et al., 2006).
European mustelids are a good model system to study the relative role of
above-mentioned factors in shaping species distribution. Current population genetic
structure of European mustelids was mostly configured by climate oscillations and
glacial advance/ retreat cycles during the Late Pleistocene, conforming to the general
pattern described for many other Palearctic species (Hewitt, 1999; Taberlet et al.,
1998). Southern regions such as the Iberian, Italian and Balkan Peninsulas, as well
as the Carpathians and Caucasus regions were shown to have played a key role as
major refuges during glacial maxima for badger Meles meles, the Eurasian otter Lutra
lutra or the European polecat Mustela putorius, (Ferrando et al., 2004; Marmi et al.,
2006; Pertoldi et al., 2006; Pope et al., 2006; Randi et al., 2003). Fossil records of
these mustelids also support post glacial recolonization from Southern Europe
(Sommer, Benecke, 2004). On the other hand, niche adaptation seems to be
particularly important in shaping mustelid distribution, which is tightly connected to
river drainages (Koepfli et al., 2008; Wozencraft, 1989). However, human-induced
destruction of riparian habitats, particularly in Central Europe, has produced local
extinction of mustelid populations leading to important gaps in their previously
continuous natural distributions (Macdonald, Mason, 1983; Maran et al., 1998b;
Pertoldi et al., 2006; Rozhnov, 1993). Hunting, and the introduction of non-native
species that can hybridize with European mustelids are other causes of local
extinction, and important factors affecting current species distribution.
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 81
Here, we focus on determining genetic structure of the European mink Mustela
lutreola, (L. 1761), a mustelid species, which is listed among the most endangered
mammals in Europe (IUCN Red List of Threatened Species,
http://www.iucnredlist.org) (Maran, 2007). The scarce fossil records of European
mink do not allow to localize the glacial refuges where this species survived during
the Quaternary ice ages (Davison et al., 2000; Sommer, Benecke, 2004; Youngman,
1982). In the past, European mink was distributed throughout Europe, mostly
associated to main river drainages (Davison et al., 2000; Youngman, 1982).
However, a gradual decline in the number of individuals started during the 19th
century, and led to local extinction of populations, first in Central Europe (Germany,
Switzerland and Austria) (Youngman, 1982), and later in Northeastern Europe
(Estonia, Latvia, Lithuania and Finland) (Maran et al., 1998b). In contrast to this
general declining pattern, the species was able to colonize Western Europe; first it
was reported in France in 1839 (Maizeret et al., 1998; Youngman, 1982) and later, it
spread to Northern Spain, via the Basque Country in 1951 (Puente Amestoy, 1956;
Rodríguez de Ondarra, 1955; Youngman, 1982). Presently, the distribution of the
European mink is restricted to three isolated areas: Western Europe, (southwestern
France and Northern Spain) (Maizeret et al., 1998; Palazón et al., 2003),
Northeastern Europe (Belarus, Russia, and has been reintroduced in the Hiiumaa
island in Estonia) (Sidorovich, 1991; Tumanov, 1999), and Southeastern Europe (in
the Danube and Dniester deltas in Romania, Ukraine and Moldova) (Gotea, Kranz,
1999). Despite the apparent expansion of the species in Western Europe, the current
conservation status of the European mink is critical due to habitat fragmentation,
over-hunting, pollution, diseases, and anthropogenic barriers (Lode et al., 2001;
Maran, Henttonen, 1995; Maran et al., 1998a; Rozhnov, 1993; Sidorovich et al.,
2000). Therefore, different restoration and reintroduction programs are being
developed in Russia, Estonia, Germany and Spain to maintain genetic diversity in
wild populations, and to avoid the effects of inbreeding and reduction in reproductive
fitness.
Previous work (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004) based on
mitochondrial DNA (mtDNA) and a reduced number of microsatellite loci revealed low
levels of genetic variability of European mink populations with little population
differentiation, and no phylogeographic structure. These studies suggested that
Eastern European populations may have the highest levels of genetic variability, and
that Western European populations originated recently from few individuals, as
evidenced by the presence of only one mtDNA haplotype (Michaux et al., 2005;
82 CAPÍTULO 3
Michaux et al., 2004). Although these molecular studies provided a good sampling of
French populations, conclusions were based on a rather limited number of individuals
form Spain, Russia, Belarus and Romania, and thus await further confirmation based
on additional molecular data.
The aim of the present study is to characterize genetic structure of European
mink throughout its current distribution based on larger samplings per population,
and using both the control region of mtDNA and a larger number of microsatellite
loci. The new molecular data should help identifying where did European mink
survive during glacial maxima, as well as determining the actual importance of river
drainages, and the effect of human impact in shaping European mink distribution.
Results would help developing best management procedures for conservation of this
threatened species.
Materia l & Methods
Sampl ing Co l l ec t i on
Hair and tissue (skin, muscle or liver) samples for genetic analysis were obtained
from 345 specimens, most captured for tracking purposes or traffic-killed. Sampling
strategy was designed so as to cover the whole distribution range of the European
mink. Individuals were obtained from the following locations: France (n=76), Spain
(n=94), Russia (n=89), Estonia (n=3), Belarus (n=28), and Romania (n=54) (Figure
1). Samples were either stored in 96% ethanol or frozen at -20ºC for optimal
conservation.
Samples rendering identical genotypes were identified with Gimlet v. 1.3.3
(Valiere, 2002), and only individuals with different genotype were used in further
analyses. Microsatellite loci and mtDNA sequences were obtained from a total of 313
and 157 different specimens, respectively. For genetic analyses, individuals were
grouped according to their regional distribution (Dataset I) into Northeastern
European (Russian, Belarus and Estonian sampling localities; mtDNA n=84,
microsatellites n=107), Southeastern European (Romanian sampling site; mtDNA
n=30, microsatellites n=44) and Western European (French and Spanish sampling
localities; mtDNA n=43, microsatellites n=162). Individuals were also grouped
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 83
according to their river drainage distribution (Dataset II) into North and Severnaya
Dvina (mtDNA n=27, microsatellites n=40), Volga (mtDNA n=28, microsatellites
n=39), and Western and Zapadnaya Dvina, and Daugava (mtDNA n=29,
microsatellites n=28) in Russia and Belarus; Danube (mtDNA n=30, microsatellites
n=44) in Romania; Charentes (mtDNA n=2, microsatellites n=9), Garonne
(microsatellites n=41) and Adour (mtDNA n=1, microsatellites n=23) in France, and
Cantabrian rivers (mtDNA n=2, microsatellites n=16) and Ebro (mtDNA n=38,
microsatellites n=73) in Spain (Figure 1). Because of their low number, specimens
obtained from Pechora (n=1) and Mezem (n=1) rivers, and those from Estonia (n=3)
were pooled together with samples from North and Western Dvina rivers,
respectively.
Figure 1 Geographical map showing sampling localities of European mink that cover
the majority of current distribution range of European mink: Western (West France:
Charentes (1), Garonne (2) and Adour (3) rivers; North Spain: Ebro and Cantabrian
rivers (4), Northeastern (West Russia: Zapadnaya or West Dvina, Volga, North or
Severnaya Dvina, Mezen’ and Pechora rivers; Estonia, North Belarus: Zapadnaya or
West Dvina river) and Southeastern (Romania: Danube) European regions. The
number of samples analysed with microsatellites and mtDNA (in brackets) markers is
also indicated.
84 CAPÍTULO 3
Labora to ry p rocedures
DNA was extracted using a standard proteinase K/phenol-chloroform procedure
(Sambrook et al., 1989), followed by purification with either ethanol precipitation or
the QIAGEN® DNeasy Tissue Kit.
m t D N A
A 614-bp fragment covering the 3’-end of the cytochrome b gene, and the
hypervariable region of the mitochondrial control region was amplified using two PCR
primers specifically designed for European mink (Pertoldi et al., 2006): LutbF (5´-
AGAACACCCATTCATCATTATCG-3´) and MLDloopR (5'-
AGTCATTAGTCCATCGAGATGTC-3'). PCR reactions contained 10-20 ng of genomic
DNA, 0.26 µM of each primer, 1.13 mM of each dNTP, 0.84 mM MgCl2, 1x reaction
buffer, and 0.45 units of Taq DNA polymerase. PCR amplifications consisted of an
initial denaturing step at 94 ºC for 5 min, 35 cycles of denaturing at 94 ºC for 50 s,
annealing at 58 ºC for 45 s, and extending at 72 ºC for 90s, and a final extending
step of 72 ºC for 10 min. PCR products were purified using the QIAquick PCR
Purification Kit (QIAGEN®), and sequenced on ABI PRISM 3700 and 3730 (Applied
Biosystems) automated sequencers using the BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), and following manufacturers’ instructions.
Sequences were deposited in GenBank under accession numbers EU548035-
EU548051.
M i c r o s a t e l l i t e s
A total of 11 polymorphic microsatellites loci were analyzed. Five specific
microsatellite loci (Mlut04, Mlut20, Mlut25, Mlut32 and Mlut35) were isolated directly
from Mustela lutreola (Cabria et al., 2007), whereas the rest were originally
developed for Mustela erminea (Mer09, Mer22 and Mer41) and Neovison vison
(Mvis22, Mvis72, Mvis75) (Fleming et al., 1999).
Two multiplex PCR reactions, multiplex 1 (Mlut32, Mlut35 and Mvis22) and
multiplex 2 (Mer09, Mer22, Mer41, Mvis72 and Mvis75), were performed using the
QIAGEN® Multiplex PCR Kit according to the manufacturer’s protocol at optimized
annealing temperatures. PCR reactions contained 10-15 ng of genomic DNA, 0.12-0.3
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 85
µM of primers, and 5 µl of PCR Master Mix. PCR conditions consisted of an initial
HotStart Taq DNA Polymerase activation step of 15 min at 95 ºC, followed by 35
cycles of denaturing at 95 ºC for 30 s, annealing at 57-60 ºC for 90 s, and extending
at 72 ºC for 60 s, with a final extending step at 72 ºC for 30 min. Mlut04, Mlut20 and
Mlut25 microsatellites were amplified individually using the following PCR conditions:
10–20 ng of genomic DNA, 0.1-0.2 µM of each primer, 0.3 mM dNTPs, 1.06-1.5 mM
MgCl2, 0.04-0.06 mg/ml of BSA, 1x reaction buffer, and 0.45 units of Bio Taq DNA
polymerase (Bioline). PCR conditions consisted of an initial denaturing step at 94 °C
for 5 min, followed by 35 cycles of denaturing at 94 °C for 30 s, annealing at 52–
57 °C for 45 s and extending at 72 °C for 45 s, with a final extending step at 72 °C
for 20 min. In all PCR reactions, the forward primer was labeled with a fluorescent
dye (FAM, NED, VIC or PET) to allow allele detection. PCR products were run and
analyzed with ABI PRISM and 3730 automated sequencers (Applied Biosystems).
Microsatellite allele sizes were scored with GeneScanTM 500LIZ® Size Standard using
GeneMapper v. 3.7 (Applied Biosystems). Only individuals genotyped for nine or
more loci were included in further genetic analyses.
M i tochondr ia l DNA ana lyses
P opu l a t i o n d i v e r s i t y a nd d e mog r aph i c a na l y s e s
Sequences were aligned using default parameters of CLUSTALX version 1.83
(Thompson et al., 1997), and further revised by eye in order to maximize positional
homology. Gapped positions were excluded from further mtDNA analyses. Haplotype
(h, Nei 1987) and nucleotide (π; Nei, 1987) diversity values were estimated globally,
and for each population separately, using Arlequin v.3.1 (Excoffier et al., 2005). To
detect departures from the neutral model, Tajima’s D (Tajima, 1989), Fu’s Fs (Fu,
1997) and R2 (Ramos-Onsins, Rozas, 2002) tests were performed with both Arlequin
v.3.1 and DNASP v 4.0 (Rozas, Rozas, 1997). Statistical significance was tested by
performing either 10,000 coalescent simulations in DNASP v 4.0 or 10,000 random
permutations in Arlequin v.3.1.
86 CAPÍTULO 3
Popu l a t i o n s t r u c t u r e a na l y s e s
Genetic structure among populations was determined by estimating pairwise
differences between haplotypes. Φ-statistics (Excoffier et al. 1992), were estimated
using Arlequin v. 3.1, and their significance was determined with 90,000 permutation
tests. Hierarchical distribution of mitochondrial genetic variation among populations
was determined using an analysis of molecular variance (AMOVA; Excoffier et al.,
1992) as implemented in Arlequin v. 3.1. We examined how genetic variation was
partitioned both among the two major geographical areas (Western and Eastern
Europe), and considering North- and Southeastern regions separately. Significances
of Φ-statistics and of the variance components were tested using 90,000 random
permutations. In all instances with multiple tests, P-values were adjusted using
Bonferroni correction (Rice 1989).
Phy l o gene t i c a nd n e two r k i n g an a l y s e s
The data set was analyzed with different methods of phylogenetic inference:
Neighbour-Joining (NJ; Saitou, Nei, 1987), Minimum Evolution (ME; Rzhetsky, Nei,
1992), Maximum Likelihood (ML; Felsenstein, 1981), and Maximum Parsimony (MP;
Fitch, 1971) using, PAUP* version 4.0b10 (Swofford, 2002). MP used 10 random
additions of sequences, and tree-bisection-reconnection (TBR) branch swapping. For
NJ, ME, and ML analyses the best-fit model of nucleotide substitution was estimated
based on Akaike information criterion (AIC) using MODELTEST v 3.06. (Posada,
Crandall, 1998). The best-fit model was TrN (Tamura, Nei, 1993) +I. Trees were
rooted using the midpoint rooting option in PAUP. The robustness of recovered trees
was assessed with non-parametric bootstrap (Felsestein 1985) proportions (BPs;
1000 pseudoreplicates for NJ, ME, and MP, and 100 for ML).
Intraspecific genetic variation (Posada, Crandall, 2001) was determined using
different networking approaches. First, mtDNA haplotypes were plotted on a median-
joining (MJ) network applying NETWORK v 4.112 (Bandelt et al., 1999). After
network calculation, the MP option was applied for cleaning up the network of
unnecessary median vectors. Furthermore, the network was also re-calculated
varying the parameter epsilon (a weighted genetic distance measure) in order to
explore whether and how the network could change. A second haplotype network
was constructed under parsimony with TCS v 1.21 (Clement et al., 2000).
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 87
Mic rosa te l l i t e s ta t i s t i ca l ana lyses
S t anda r d g ene t i c v a r i a b i l i t y an a l y s e s
Genetic diversity was estimated per locus and per set of populations based on
total number of alleles (NA), private alleles, allelic diversity (A), as well as observed
(HO) and expected (HE) heterozygosities (Nei, 1978) using FSTAT v 2.93 (Goudet,
1995) and Genetix v. 4.05 (Belkhir et al., 2000). Deviations from Hardy-Weinberg
equilibrium (HWE) for each locus and over all loci, as well as genotypic linkage
disequilibria between all pairs of loci were tested using the complete enumeration
method (Louis, Dempster, 1987) implemented in GenePop v 4 (Raymond, Rousset,
1995). Statistical significance was tested by running a Monte Carlo Markov Chain
(MCMC) consisting of 10,000 batches of 10,000 iterations each, with the first 10,000
iterations discarded before sampling (Guo, Thompson, 1992). The P-values were
adjusted with Bonferroni procedures for correcting for the effect of multiple tests
(Rice 1989). In addition, the unbiased Wright inbreeding coefficient FIS (Weir &
Cockerham 1984) was used also to define deviations from HWE.
The possible existence of null alleles and their frequencies were inferred using
the EM algorithm (Dempster et al., 1977) as implemented in the program FreeNA
(Chapuis, Estoup, 2007). We also evaluated their impact on the estimation of genetic
differentiation.
To estimate whether the analyzed dataset provided enough statistical power
for detecting significant genetic differentiation, we used POWSIM (Ryman, Palm,
2006). Data sets I and II were used for testing allele frequency homogeneity at each
of the eleven loci separately, or combined with Fisher’s exact and traditional chi-
squared tests. Results indicated that the probability for detecting population structure
was high, and statistically significant (data not shown). When FST was set to zero
(that simulates no divergence among samples), the proportion of false significances
(α error of type I) was in all cases lower to the intended value of 5%.
Baye s i a n c l u s t e r i n g a na l y s e s
The number of populations of European mink was inferred using two different
Bayesian clustering methods. First, we applied STRUCTURE v 2.2 (Pritchard et al.,
2000). The number of subpopulations (K) with the best value of the mean lnProb (D)
88 CAPÍTULO 3
was calculated assuming no prior knowledge of population information, with both
independent and correlated allele frequencies between populations and using an
admixture model. We performed a series of independent runs for K from one to ten
populations, setting default values with constant lambda (λ) and the same alpha (α)
values for all populations, as suggested by Pritchard et al. (2000). MCMC consisted in
105 burn-in iterations followed by 106 sampled iterations. 10 runs for each value of
K were conducted to check for consistency in the results. Furthermore, the modal
value of lambda, ∆K (Evanno et al., 2005) was also calculated to infer the best value
of K. Clusters were depicted using Distruct v.1.1 (Rosenberg, 2004).
In addition, STRUCTURAMA v1.0 (Huelsenbeck) was applied to verify
congruence among results obtained with STRUCTURE. Population structure was
inferred from genetic data assuming that the number of populations is a random
variable that follows a Dirichlet process prior (Pella, Masuda, 2006). The probability
of assigning individuals to populations was calculated with 104 MCMC cycles, and
setting α (the prior mean of the number of populations) as a random variable from 2
to 6.
P opu l a t i o n d i f f e r en t i a t i o n
Genetic differentiation between populations was assessed both with two
statistics: FST (infinite allele model, IAM; Kimura, Crow, 1964; Weir, Cockerham,
1984), and RST, an analogue that assumes variance in allelic size (stepwise mutation
model, SMM; Ohta, Kimura, 1973; Slatkin, 1995). Significance level was assessed by
conducting 10,000 and 90,000 permutations, as implemented in RstCalc package v
2.2 (Goodman, 1997) and Arlequin v. 3.1, respectively. The unbiased estimate of the
p-value was adjusted using Bonferroni correction (Rice 1989). To determine how
genetic variation was partitioned within and among populations, an AMOVA test was
performed using Arlequin v 3.1. AMOVA was conducted using the same hierarchical
scheme described for mtDNA analysis. Additionally, a new group was also tested
including the inferred clusters obtained with STRUCTURE. The significance level for
variance components was tested using a non-parametric procedure with 90,000
random permutations. The patterns of genetic differentiation among all samples were
visualized with a Factorial Correspondence Analysis (FCA) plot using Genetix program
v. 4.05. The method deals with multiple variables at the same time (allele
frequencies at different loci), and computes a linear relationship that best explain
variation between individuals.
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 89
I n f e r r i n g p opu l a t i o n d e c l i n e o r e x pan s i on
Possible severe reductions in effective population size were assessed using
BOTTLENECK program version 1.2.02 (Piry et al., 1999). The method assumes that
recently bottleneck populations should exhibit a significant excess of heterozygosity
(HE) than expected at mutation-drift equilibrium (HEQ). The analyses were carried out
assuming three different mutation models: IAM, SMM and TPM (two-phase
microsatellite mutation model, (DiRienzo et al., 1994) and applying the Wilcoxon
signed rank test for statistic detection of HE excess. Estimation was based on 10,000
replicates.
Results
Mi tochondr ia l DNA ana lyses
I n t r a - p opu l a t i o n ge ne t i c d i v e r s i t y a nd h i s t o r i c a l
d e mog r aphy
Sequence comparisons yielded 17 distinct haplotypes defined by 17 variable
sites found in a total of 476 bp of the control region sequence. The mtDNA sequence
variability was characterised by relatively low values of π (0.005 ± 0.003) and h
(0.857 ± 0.014) (Table 1). Average base frequencies were 27.51% (A), 26.10% (C),
14.51% (G) and 31.88% (T). In the generic analyses of Dataset I, the Western
region, comprising both French and Spanish localities, showed a complete absence of
mtDNA sequence variation with only a single haplotype, which was not shared with
Eastern populations. Within the geographical distribution of European mink of East
Europe, the Northeastern region showed the main levels of genetic diversity
(π=0.004 and h=0.862) (mostly observed in Russia; data not shown) (see Table 1)
and a high percentage of private (i.e. observed only in one population) haplotypes
92.31% (data not shown). On the other hand, the Southeastern (Romanian) region
was characterised by four haplotypes, with only one (Mlh16) shared with the Russian
locality (Figure 2). Romanian animals were characterized by low mtDNA variation
(π=0.0019 and h=0.352) (Table 1). Similar results were obtained within Dataset II
90 CAPÍTULO 3
(see Table 1). North and West Dvina, as well as, Volga rivers equally contributed to
the genetic diversity levels which characterized the Northeastern European region.
Tajima’s D, Fu’s Fs and R2 statistic tests performed on samples of each region
(Dataset I) and rivers (Dataset II) failed to reject the null hypotheses (Ho) of non-
expanding (stable) populations (Table 1). Non-significant (P>0.10) low negative Fs
and Tajima’s D values were found in all Eastern populations, except the Southeastern
region, whereas, West Dvina river rendered negative values and Volga river showed
both positive Fs and Tajima’s D values (Table 1) . Negative values could be explained
by an excess of rare variants, whereas positive values could reveal an excess of
intermediate-frequent variants. These statistics were not applied on the Western
region because of the presence of only one haplotype.
Table 1 MtDNA diversity estimates and neutrality test results displayed for individuals grouped according to their
regional distribution1 (Dataset I) and drainage basin2 (Dataset II). The described values are: the number of sampled
individuals (n), the number of observed haplotypes (Nh), with the private haplotypes (Ph) in brackets, the haplotype
(h) and nucleotide (π) diversities, with their standard deviations (SD) in brackets. Any of the neutrality tests
performed were significant (P>0.05).
Diversity indices Neutrality test
Sampling sites n Nh (Ph) h (SD) π (SD) Tajima's D Fu's Fs R2
All individuals tested 157 17 0.857 (0.014) 0.005 (0.003) -0.399 -3.316 0.075
Dataset I
East3 114 16(16) 0.869 (0.014) 0.005 (0.003) -0.550 -3.380 0.075
Northeast4 84 13 (12) 0.862 (0.016) 0.004 (0.003) -1.008 -3.501 0.067
Southeast5 30 4 (3) 0.352 (0.103) 0.0019 (0.0015) -0.890 0.012 0.087
Dataset II
North Dvina 27 6 0.775 (0.047) 0.004 (0.002) 0.817 -0.287 0.165
Volga 28 4 0.717 (0.050) 0.003 (0.002) 0.515 0.865 0.154
West Dvina 29 10 0.810 (0.064) 0.005 (0.003) -1.117 -2.177 0.086 1 Because of the presence of only a single haplotype in the West, this region was not included in the table. 2 The results of Danube river correspond to those results obtained for Southeastern region. 3 East: Russia, Belarus, Estonia, Romania 4 Northeast: Russia, Belarus, Estonia 5 Southeast: Romania
I n t e r - p opu l a t i o n g ene t i c s t r u c t u r e
Significant genetic structure was found among European minks from the
Western, Northeastern, and Southeastern regions (Dataset I), as supported by the
high levels of haplotype frequency differentiation (ΦST values ranging from 0,586 to
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 91
0,879) (Table 2). A more detailed analysis, comparing different sampling localities,
also rendered significant ΦST values, ranging from 0.143 (Russia vs. Belarus+Estonia)
to 0.742 (Belarus+Estonia vs. West) (data not shown). Similarly, significant genetic
differentiation was also detected among tested river basins (Table 2; Dataset II).
The hierarchical analysis of molecular variance (AMOVA) strongly supported
genetic differentiation of European mink, but fail to detect geographic structuring of
Western versus Eastern or Northerneastern versus Southerneastern region samples
(Table 3). Genetic variability was mainly explained by variation among populations
within each region (Table 3). Similarly, no evidence of genetic structuring was
observed among regions when pooling individuals according to the different drainage
basins (data not shown).
Table 2 Estimated ΦST values* for mitochondrial DNA obtained when individuals, grouped according to regional distribution
(Dataset I) and drainage basins (Dataset II), were compared.
Dataset I Northeast Southeast West Dataset II Northern
Dvina Volga Western Dvina Danube
Western rivers
Northern Dvina —
Volga 0.071 — Northeast —
Western Dvina 0.038 0.112 —
Southeast 0.586 — Danube 0.677 0.696 0.572 —
West 0.622 0.879 — Western rivers 0.789 0.817 0.662 0.879 — *Bold values were significant after sequential Bonferroni corrections.
Table 3 Analysis of molecular variance (AMOVA) of spatial genetic variation in European mink based on mitochondrial
DNA data. Significant P-values are given in bold.
Structure tested Variante components % variation F Statistics P
1. One group (Russia, Belarus+Estonia*, Romania, France+Spain**)
Among populations 1.004 63.89
Within populations 0.568 36.11
FST = 0.638 0.00
2. Two groups (Russia, Belarus+Estonia, Romania) vs. (France+Spain)
Among groups 0.280 16.51 FCT = 0.165
0.495
Among populations 0.847 50.00 FSC = 0.599
0.00
Within populations 0.568 33.49 FST = 0.665
0.00
3. Two groups (Russia, Belarus+Estonia) vs. (Romania)
Among groups 1.046 52.73 FCT = 0.527
0.334
Among populations 0.155 7.83 FSC = 0.166
0.01
Within populations 0.782 39.45 FST = 0.606
0.00
Because of low number of samples collected, Belarus and Estonian*, as well as, French and Spanish** individuals were pooled all together.
92 CAPÍTULO 3
Phy l o gene t i c a na l y s e s
The reconstructed phylogeny recovered three main clades, which lacked
bootstrap support (Figure 2a). Phylogenetic relationships within each clade showed
limited resolution. The haplotype network (Figure 2b) produced a complex pattern
that fits with a star-like genealogy with Mlh16 as central haplotype. While
Northeastern haplotypes are distributed broadly throughout the network, the
distributions of Western and Southeastern haplotypes are more localized.
Northeastern haplotypes were generally connected by only one mutational step, but
Southeastern and Western haplotypes were connected to the network through
missing haplotypes. Reconstruction of the haplotype network using statistical
parsimony rendered similar results (not shown).
M i c rosa te l l i t e resu l t s
Gene t i c v a r i a b i l i t y - S t anda r d p opu l a t i o n g ene t i c ana l y s e s
Low levels of microsatellite genetic variability (A: 5.818; HO=0.430; HE=0.578)
were found in European mink populations (Table 4). Microsatellites were polymorphic
in all tested populations, and yielded a total of 64 alleles (ranging from two to ten
alleles per population), with the exception of locus MLUT04, which presented a single
allele within the Spanish samples. Private alleles were found in both Eastern and
Western regions (Dataset I) but with different percentages, 52.46% and 9.38%
respectively (Table 4). Consistent with the mtDNA results, the Western region was
characterized with the lowest levels of genetic variability whereas the Northeastern
region presented higher estimates (mostly showed in Russia locality) (Table 4). The
Southeastern region was characterized by intermediate values (Table 4). Individuals
pooled together according to their drainage distributions rendered the same
distribution pattern of genetic diversity (see Table 4). The rivers (Volga, North and
West Dvina) from northeastern region mostly contributed to the genetic variability of
European mink.
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 93
Figure 2 (a) Phylogenetic
relationships (midpoint rooting
tree) of European mink based on
mitochondrial DNA sequence data.
Numbers represent support for NJ
(BPs above 50%), MP (BPs above
50%) and ML (BPs above 60%)
from top to bottom.
(b) Median-joining network showing
the relationships among mtDNA
haplotypes of Mustela lutreola
obtained in this study. The
geographical origin of each
haplotype is indicated by different
colours (dark blue: Russia, blue:
Belarus, light blue: Estonia, green:
Romania, orange: France and red:
Spain). Circles sizes are
proportional with the haplotype
frequency. White circles show the
missing intermediate haplotypes
states and the connections
represent one mutation step
(except for the branch emphasized
in italics).
Mlh1
Mlh2
Mlh6
Mlh4
Mlh3
Mlh5
Mlh13
Mlh12
Mlh7
Mlh11
Mlh8
Mlh9
Mlh10
Mlh16
Mlh17
Mlh14
Mlh15
0.001 substitutions/site
575265
50__
51__
777074
64__
94 CAPÍTULO 3
Table 4 Summary of genetic variability estimates for eleven microsatellite loci tested in European mink. The
calculations described are: the number of individuals tested (n), the number of total alleles (NA), the total private allele
(PA) with the percentage in brackets, the allelic diversity (A), as well as, the observed and expected heterozygosities,
HO and HE respectively, and the mean FIS (Wright’s statistics). The values are listed for all sampling localities and for
each geographical region* (Dataset I), as well as, for the different river basins** (Dataset II) analysed.
Sampling sites n NA PA (%) A HO HE FIS
All individuals tested 313 64 5.818 0.430 ± 0.113 0.578 ± 0.148 0.255
Dataset I
East (North and South) 151 61 32 (52.46%) 5.546 0.532 ± 0.150 0.618 ± 0.156 0.141
Northeast 107 59 20 (33.90%) 5.364 0.559 ± 0.153 0.613 ± 0.164 0.089
Russia 88 57 13 (22.81%) 5.182 0.569 ± 0.151 0.619 ± 0.159 0.082
Belarus+Estonia 19 42 2 (4.76%) 3.818 0.503 ± 0.230 0.54 ± 0.207 0.095
Southeast (Romania) 44 35 2 (5.71%) 3.182 0.464 ± 0.170 0.496 ± 0.139 0.065
West 162 32 3 (9.38%) 2.909 0.336 ± 0.161 0.439 ± 0.201 0.236
France 73 29 1 (3.45%) 2.636 0.389 ± 0.182 0.430 ± 0.206 0.095
Spain 89 29 1 (3.45%) 2.636 0.291 ± 0.184 0.353 ± 0.215 0.178
Dataset II
North Dvina 40 54 3 (5.56%) 4.909 0.563 ± 0.188 0.618 ± 0.181 0.090
West Dvina 28 47 2 (4.26%) 4.273 0.546 ± 0.187 0.582 ± 0.185 0.064
Volga 39 51 2 (3.92%) 4.636 0.560 ± 0.147 0.598 ± 0.146 0.065
Charentes 9 25 2.273 0.364 ± 0.223 0.409 ± 0.213 0.117
Garonne 44 33 1 (3.03%) 3 0.373 ± 0.186 0.426 ± 0.205 0.128
Adour 23 26 2.364 0.451 ± 0.233 0.432 ± 0.198 -
0.045
Cantabrian rivers 16 25 2.273 0.317 ± 0.193 0.382 ± 0.252 0.176
Ebro 73 29 2.636 0.285 ± 0.185 0.337 ± 0.210 0.155 *Because of low number of samples from Estonia, this locality was analysed with individuals from Belarus. **The results of Danube river correspond to those results obtained for Southeastern region.
After Bonferroni correction, only the Spanish population showed significant
departures (P<0,001 n=55 comparisons) from HWE for the following loci: MVIS22
(FIS=0.265), MVIS72 (FIS=0.274), and MER41 (FIS=0.422), due to a heterozygote
deficit as indicated by the corresponding positive inbreeding coefficient. Estimates of
null allele frequency were from moderate to low (<0.2) and FST values obtained from
the corrected data set were very similar to those calculated from the original data set
(data not shown), suggesting that putative null alleles would have a negligible effect
on the average genetic diversity estimates in our dataset and all loci were used for
further analyses.
No evidence of linkage disequilibrium was found in the analyzed populations as
any of the corresponding exact tests remained significant after Bonferroni correction
(P=0,000182 n=275 comparisons). Thus, microsatellite loci used in this study were
considered statistically independent.
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 95
Pa t t e r n s o f p opu l a t i o n g ene t i c s t r u c t u r e
The Bayesian clustering procedure (Pritchard et al., 2000) yielded consistent
estimates of the highest likelihoods (ln[Pr(X/k)]) for the model with k=4 (Figure 3a).
The same result was obtained when a Dirichlet process prior was assumed (Pella,
Masuda, 2006). According to average proportions of membership of each pre-defined
population (Q), most individuals from France, Spain and Romania were significantly
assigned to three different inferred clusters (Q>0.90) (see Figure 3b). The remaining
individuals coming from the northeastern (Russia, Belarus+Estonia) region were
clustered in only one inferred group with assignment probability higher than 0.85. On
the other hand, the uppermost hierarchical level of structure was shown at k=2 when
the modal value of ∆K was estimated (Evanno et al., 2005) (Figure 3c). The inferred
clusters corresponded to the two main analyzed (Western and Eastern) regions, and
the average proportion of membership to each of the inferred clusters was very high
(Q>0.95 in both cases).
Figure 3 Summary of the clustering results for
European mink populations performed with
STRUCTURE. (a) Detection of the number of
populations as a function of the highest posterior
probability (mean LnP[D]) over the number of
clusters K (K=4).
(b) Clustering results depicted using Distruct program (Rosenberg, 2004). Each individual is
represented as a vertical line partitioned into K segments, which length is related to their membership
proportions to each inferred K clusters (blue -cluster 1-, green -cluster 2-, orange -cluster 3- and red -
cluster 4-). The average membership proportion of each pre-defined population (drainage –above- or
sampling localities –at bottom- distributions) to each cluster (Q) is displayed in brackets.
-8000
-7500
-7000
-6500
-6000
-5500
-5000K=1 K=2 K=3 K=4 K=5 K=6 K=7 K=8 K=9 K=10
K
Mea
n Ln
P(D)
96 CAPÍTULO 3
(c) Detection of the number of populations as a
function of the ΔK over the number of clusters
after applying the correction suggested by
(Evanno et al., 2005).
Consistent with the mtDNA analysis, all but one pairwise FST comparisons
based on microsatellite data rendered high values, which were significant (after
Bonferroni correction) both at the region (Dataset I) and drainage (Dataset II) levels
(Table 5). The only exception was the comparison between Garonne and Charentes
rivers in France (FST=0.001; P<0.0014) (Table 5). In addition, and in agreement with
the results of the Bayesian clustering, a pairwise FST comparison between Spanish
and French individuals was also significant (FST=0.234; P<0.0083) (Table 5). Similar
results were obtained with RST estimates, although lower values were obtained (Table
5). All comparisons were significant except those involving Charentes and Garonne
(FST=0.005; P>0.0014), and North Dvina and Volga (FST=0.004; P>0.0014) rivers in
France and Northeastern Europe, respectively (Table 5; Dataset II).
Table 5 Estimates∗ for FST (below diagonal) and RST (above diagonal) between geographical regions-pairs (Dataset I)
and drainage basins sample pairs (Dataset II) from eleven microsatellite loci tested in European mink individuals.
Bold values were significant after sequential Bonferroni corrections.
Dataset I Northeast Southeast West
Northeast — 0.073 0.067
Southeast 0.128 — 0.093
West 0.184 0.282 —
Dataset II North Dvina
West Dvina Volga Danube Charentes Garonne Adour Cantabrian Ebro
North Dvina — 0.064 0.004 0.070 0.109 0.098 0.077 0.101 0.117
West Dvina 0.021 — 0.033 0.120 0.136 0.134 0.154 0.169 0.190
Volga 0.022 0.041 — 0.078 0.103 0.098 0.065 0.089 0.099
Danube 0.130 0.137 0.160 — 0.232 0.199 0.155 0.109 0.101
Charentes 0.174 0.175 0.215 0.320 — 0.006 0.082 0.212 0.264
Garonne 0.170 0.170 0.215 0.304 0.004 — 0.052 0.184 0.235
Adour 0.168 0.172 0.198 0.281 0.075 0.047 — 0.117 0.104
Cantabric 0.192 0.186 0.236 0.243 0.274 0.217 0.118 — 0.063
Ebro 0.307 0.304 0.330 0.366 0.359 0.299 0.177 0.112 —
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
K=2 K=3 K=4 K=5 K=6 K=7 K=8 K=9 K=10
K
∆K
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 97
The hierarchical AMOVA showed significant geographic structuring (FST=0.224,
P<0.000; Table 6). However, no genetic structuring was supported when regional
information was considered (Table 6). The genetic variation in the data set was
significantly explained by variation among and within populations (Table 6). In
addition, no genetic structuring was determined among inferred clusters when
clustering results obtained by STRUCTURE was tested (Table 6) or among regions
when individuals were pooled according to drainage basins (data not shown).
In agreement with the results of the other genetic analyses, the factorial
correspondence analysis gathered European minks samples into three well-defined
groups, Western, Northeastern, and Southeastern, respectively (Figure 4). The two
principal component axes explained 10.30% and 6.20% of the total genetic diversity
respectively.
Table 6 Analysis of molecular variance (AMOVA) of spatial genetic variation in European mink based on
eleven microsatellites data. Bold P values were significant values.
Structure tested Variance % total F Statistics P
1. One group (Russia, Belarus+Estonia, Romania, France, Spain)
Among populations 0.654 22.44
Within populations 2.259 77.56 FST = 0.224 0.000
2. Two groups (Russia, Belarus+Estonia, Romania) vs. (France, Spain)
Among groups 0.335 11.07 FCT = 0.111 0.101
Among populations 0.434 14.33 FSC = 0.161 0.000
Within populations 2.259 74.60 FST = 0.254 0.000
3. Two groups (Russia, Belarus+Estonia) vs. (Romania)
Among groups 0.354 11.02 FCT = 0.111 0.332
Among populations 0.068 2.13 FSC = 0.161 0.001
Within populations 2.788 86.86 FST = 0.131 0.000
4. Four groups (Russia, Belarus+Estonia) vs. (Romania) vs. (France) vs. (Spain)
Among groups 0.604 12.88 FCT = 0.205 0.101
Among populations 0.077 11.27 FSC = 0.329 0.000
Within populations 2.259 76.85 FST = 0.232 0.000
98 CAPÍTULO 3
Axe 1 (10.30%)
West
French individuals
Spanish individuals
Russian individuals
Northeast
Southeast
Belarus individuals
Figure 4 Factorial correspondence analysis plot performed by GENETIX with eleven
microsatellites that shows the multivariate relationships of European minks sampled.
Each axe displays the percentage of the total variation in allele frequencies.
I n f e r r i n g p opu l a t i o n d e c l i n e o r e x pan s i on
The Wilcoxon test under the IAM model detected, with significant statistical
support (P<0.05), recent bottlenecks in all tested European mink regions and sample
locations except Belarus. However, no significant results were obtained when the
SMM and TPM (95% SMM) models were assumed. In addition, recent bottleneck was
only statistically supported under IAM in Eastern (North and West Dvina, Volga and
Danube), Charentes and Cantabrian rivers. Conversely, the same test performed
under IAM, TPM and SMM was only significant for Adour river whereas neither
Garonne nor Ebro rivers exhibited significant HE excess under any of the three
mutation models assumed.
Discussion
The present study is the most thorough to date regarding population genetics of
European mink. It covers in more detail the whole range of distribution of the
European mink and considerably increases the number of samples per locality with
respect to previous studies (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004). Our results
confirm the status of the northeastern European localities as the most genetically
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 99
diverse (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004). They also extend the
conclusions derived of the low genetic variability of the western populations due to a
recent colonization. Furthermore, as European mink typically inhabits the margins of
riverbanks or woodland streams, our study provided ecological information of how
the species is partitioned throughout Europe.
Ge ne t i c d i v e r s i t y o f E u r ope an m i n k p opu l a t i o n s
Both mitochondrial and nuclear genetic data found low levels of genetic
variability for European mink, as previously reported (Michaux et al., 2005; Michaux
et al., 2004). At the mitochondrial level, inferred genetic diversity values are similar
to those reported for non-threatened mustelid species, such as the European polecat
Mustela putorius (h=0.876 and π=0.00274; Pertoldi et al., 2006), the badger Meles
meles (h=0.9 and π=0.008; Marmi et al., 2006), but higher than those of
endangered mustelid species such as the sea otter Enhydra lutris (h=0.412 and
π=0.00098; Larson et al., 2002). At the microsatellite level, inferred genetic diversity
values were similar to those obtained for non-threatened mustelis species such as
the Eurasian otter Lutra lutra (HE=0.74 HO=0.55; Randi et al., 2003), the Eurasian
badger Meles meles (HE=0.43-0.64 HO=0.38-0.59; Pope et al., 2006), the American
mink Neovison vison (HE=0.61; O'connell et al., 1996), the pine marten Martes
martes (HE=0.53; Kyle et al., 2003) and the wolverine Gulo gulo (HE=0.347-0.393
HO=0.347-0.376; Walker et al., 2001), but higher than endangered mustelids, such
as the black-footed ferret Mustela nigripes (HE=0.38 HO=0.35; Wisely et al., 2003),
and the sea otter (HE=0.426 HO=0.433; Larson et al., 2002). However, it should be
stressed out that the main contribution to overall levels of genetic variation of
European, both at the mitochondrial and the microsatellite level, comes from Eastern
localities, or rivers when individuals were pooled and analyzed according their river
drainage distributions, whereas Western localities show lower levels of genetic
variation than those observed in other threatened mustelid species (see above).
The present study is the most thorough to date regarding population genetics
of European mink. It covers in more detail the whole range of distribution of the
European mink and considerably increases the number of samples per locality with
respect to previous studies, which undersampled the Eastern region as well as
Spanish localities (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004). Our results confirm
and strengthen the suggestion of previous studies with respect to the status of the
northeastern European localities as the most genetically diverse (Michaux et al.,
100 CAPÍTULO 3
2005; Michaux et al., 2004). They also extend the conclusions derived on the genetic
variability of European mink in French localities to Spain. Furthermore, as European
mink typically inhabits the margins of river banks or woodland streams, our study
provided signs of how genetic variability is partitioned throughout Europe.
I n f e r r i n g d emog r aph i c d ynam i c s
Our results show that demographic histories of the European mink populations
were consistent with the neutral Wright-Fisher model of evolution according to the
non-significant results of the different neutrality tests (Tajima’s D, R2, and Fu’s Fs)
applied on mitochondrial DNA data. Not only the populations are not expanding, but
the detected significant levels of heterozygosity excess of nuclear data with the
Wilcoxon signed rank test suggest that European mink has suffered of recent
bottleneck processes at the different populations analyzed (localities, regions and
river drainage basins), which is consistent with the reported overall demographic
decline of the species occurred during the last centuries (Youngman, 1982). Only the
Garonne and Ebro rivers, as well as, Belarus population seemed to be the exception
to the general genetic trend detected for European mink and resulted for the latter in
mutation-drift equilibrium both based on mitochondrial and nuclear data.
Popu l a t i o n g ene t i c s t r u c t u r e a nd phy l o g eog r aphy
Bayesian clustering, FST pairwise comparisons and hierarchical AMOVA
analyses agreed in rejecting the null hypothesis of panmixia for European mink, as it
was expected given the disjunct distribution of its localities. Both ΦST and FST based
on mitochondrial and nuclear data revealed that European mink is significantly
differentiated among Western, Northeastern, and Southeastern regions, suggesting
low genetic flow among them. Genetic structuring is also evident within each region
among sample localities, as well as among river drainages when microsatellite data is
analyzed. The different levels of genetic differentiation presented at mitochondrial vs.
nuclear loci could be explained by the distinct mutation rates characterizing these
two genetic markers. Similar values of RST and FST based on microsatellite data may
indicate that genetic differentiation among populations could be mostly explained by
differences in frequencies caused by random genetic drift rather than by new
mutations (Balloux, Lugon-Moulin, 2002; Reynolds et al., 1983). The inferred RST and
FST values could be overestimated due to the combination of different factors such as
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 101
population fragmentation and low effective population sizes (Alo, Turner, 2005;
Frankham, 2002; Lagercrantz, Ryman, 1990). Although population differentiation
was also statistically supported by AMOVA, no significant geographic structure was
inferred among regions, and variation was mostly found among and within sampling
localities.
However, Bayesian clustering analysis of microsatellite data also revealed
genetic differentiation among populations which showed a high percentage of correct
assignments to localities, and supported the existence of at least two main genetic
units for European mink defined by the Western and the Eastern populations,
respectively. Putative split of the Western region into French and Spanish populations
and of the eastern region into Northern and Southern populations was suggested also
by the analysis, as well as by the FCA plotting.
The phylogenetic and networking methods only reveal subtle
phylogeographical structuring (Northeast, Southeast and West Europe). The absence
of well-defined phylogenetic relationships among European mink populations as well
as the presence of high frequency internal (ancestral) haplotypes connected by single
mutation steps to external nodes (recent haplotypes) could be explained by the
recent divergence of populations, and/ or by putative high levels of local extinction.
Similar patterns have been previously reported for other mustelid species such as
otter (Ferrando et al., 2004), pine marten (Davison et al., 2001) or European polecat
(Davison et al., 2001; Pertoldi et al., 2006).
R e l a t i v e c o n t r i bu t i o n o f h i s t o r i c a l a n d c o n t e m po r a r y
e ve n t s t o g e ne t i c s t r u c t u r e o f E u r o pe a n m i n k
The current distribution and genetic structure of European mink is the result of
historical, ecological and human impact processes. Northeastern populations retained
the most abundant internal haplotypes in reconstructed networks, and hold the
highest levels of genetic diversity, which support the hypothesis of survival during
glaciations in a Northeastern refugee located around the Upper Volga region (Michaux
et al., 2005; Michaux et al., 2004). Different species such as the Norway spruce
Picea abies (Lagercrantz, Ryman, 1990), the moor frog Rana arvalis (Babik et al.,
2004) or the spruce bark beetle Ips typographus (Stauffer et al., 1999) have been
proposed to survived glaciations in such refuge, and afterwards expanded through
distinct postglacial colonization routes into different areas of Russia during warming
102 CAPÍTULO 3
periods. Fossils of European mink from Last Glaciation to Holocene were found in
Moscow district, Estonia, Latvia or Poland (Davison et al., 2000; Sommer, Benecke,
2004), supporting the existence of a glacial refuge in Northeastern Europe. Moreover,
the presence of tundra and steppe forests during the Late Valdai Glaciation could
have facilitated the survival of European mink in north Europe (Simakova, 2006;
Velichko, 1995). Other fossil records of European mink dated on the Holocene that
were found in the Netherlands or Ukraine (Sommer, Benecke, 2004) could support
the posterior spread into central Europe. On the other hand, Southeastern Europe
could not be discarded as another putative glacial refuge due to old fossil records
found in Upper Würmian site of the “La Adam” Cave in Romania (Davison et al.,
2000), and could explain the high percentage of the haplotype Mlh8 in that region.
Therefore, European mink genetic structure is consistent with the glacial
refuge theory (Hewitt, 1996; Hewitt, 1999), which hypothesized that populations
living in refuge regions during ice ages were less affected by climatic changes and
should be more genetically diversified. Rapid expansion from refuge populations
would involve serial bottlenecking with progressive loss of allelic diversity, resulting
in less genetic diversity among populations present in the more recently colonized
places.
More recently, habitat changes caused by human interactions and direct
exploitation of natural population (Maran et al., 1998) could have also influenced in
the current population structure and distribution of genetic variability of European
mink. Habitat destruction, overhunting or introduced species have recently decreased
the population size of European mink (Youngman, 1982) and consequently, they
have contributed to reduce the genetic diversity found in the Southeastern.
The presence of European mink in Western Europe has been the object of
great debate due to the controversy arisen around its origin (Youngman, 1982). The
low levels of intraspecific diversity, as well as, the presence of a single mtDNA
haplotype found in this population could be attributed both to a rapid colonization
process from the East followed by the extinction of the species from Central Europe
due to anthropic introduction or migration of European mink in Western Europe
(Michaux et al., 2005). Several surveys have reported the great capacity of migration
of European mink which could lead to colonize new areas distant from each other
(Palazón, 1993; Youngman, 1982) and move, more than 50 km (Pödra, M. pers.
comm.) However, and although this behaviour (movement) often appear during the
reproductive period on populations with low number of individuals, when animals are
PAPER I I I P A T TE R N S O F G E NE TI C VA RI AT I O N O F Mu s t e l a l u t r e o l a 103
trying to find other specimen to mate, this could support the hypothesis previously
proposed by Michaux et al. (2005) which a small number of individuals currently
established on the Western European region. In any case, the observed population
structure may be associated to an important genetic drift occurred on the Western
European region, probably associated to the foundation of this population from a very
limited number of animals from Central Europe. The extinction of the species from
Central Europe difficult the possibility of discern among the different hypotheses
suggested. Nevertheless, the interactions of historical events, ecological factors and
human interactions have represented an important role on the current
phylogeographic patterns of European mink.
C o n s e r v a t i o n s t r a t e g i e s
Loss of genetic diversity is directly related to reduction in reproductive fitness,
as a consequence of increase inbreeding rates, which mainly affect to fragmented
populations with low population size (Frankham, 2002). Riparian wetland habitat
restoration is an important plan, strongly recommended in any conservation
programs, because of the connection scattered population connection. As European
mink is a riparian ecosystems-dependent animal species, this initiative increases the
gene flow among local population and thus reduces the consequences of genetic
decline, such as loss of evolutionary potential of this threatened species.
Furthermore, the current captive breeding programs (with breeding facilities in
Estonia, Germany and Spain) have been developed in order to alleviate the low
genetic diversity of wild populations by reintroduction of captive animals, which are
supposed to retain high levels of genetic diversity. Therefore, the conservation
strategy should be focus on avoid genetic deterioration of captive population which
lead to loss genetic diversity and thus result in inbreeding depression. A genetic
control of breeding animals, as well as, a reinforcement of captive populations, based
on translocations of specimens from Northeastern European region, should support
and enhance the long-term evolutionary potential of the European mink. Concretely,
the genetic management of Spanish breeding centre may optimized by introducing of
new individuals form French population which would facilitate the gene flow among
different locations within Western region. Nevertheless, special cautions must be paid
on outbreeding depression which lead to reduction in reproductive fitness and thus to
loss of ability to local environment adaptation as a result of mixing distinct animals
(Rhymer, Simberloff, 1996).
104 CAPÍTULO 3
Acknowledgment
We are most grateful to Gorka Belamendia, Juan Carlos Ceña, Angus Davison, Pascal
Fournier, Asunción Gómez, Vladimir Katchanovsky, Andreas Kranz, Javier López de
Luzuriaga, Sisco Mañas, Tiit Maran, Santiago Palazón, Madis Pödra and Dimitry
Skumatov for providing us with different mustelid samples. We also thank to the
anonymous reviewers for their helpful comments. This work received partial financial
support from three LIFE projects (“Conservación del visón europeo (Mustela lutreola)
en “Castilla León” LIFE 00/NAT/E7229, La Rioja” LIFE 00/NAT/E7331 and “Álava”
LIFE 00/NAT/E7335), and different projects from the Diputación Foral de Álava
(Departamento de Urbanismo y Medio Ambiente) and the University of the Basque
Country (GIU 06/09) to BJGM.
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PAPER IV
Using Bayesian approaches to detect hybridization between the threatened European mink (Mustela
lutreola) and polecat (Mustela putorius)
Table of contents R e s u m e n .....................................................................................................................................110 A b s t r a c t ......................................................................................................................................110 I n t r o d u c t i o n ............................................................................................................................112 M a t e r i a l & M e t h o d s ............................................................................................................113
S a m p l e c o l l e c t i o n a n d l a b o r a t o r y p r o c e d u r e s ................................................113 M t D N A s e q u e n c i n g .....................................................................................................114 Y c h r o m o s o m e s e q u e n c i n g ....................................................................................115 M i c r o s a t e l l i t e s g e n o t y p i n g ....................................................................................115
D a t a a n a l y s e s .....................................................................................................................116 R e s u l t s ........................................................................................................................................118
M i t o c h o n d r i a l D N A s e q u e n c e d i v e r s i t y a n d i d e n t i f i c a t i o n o f m a t e r n a l o r i g i n .......................................................................................................................................118 Y c h r o m o s o m e s e q u e n c e d i v e r s i t y a n d i d e n t i f i c a t i o n o f p a t e r n a l o r i g i n .......................................................................................................................................121 G e n e t i c d i v e r s i t y a n d s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n a t m i c r o s a t e l l i t e l o c i ...122 B a y e s i a n i n f e r e n c e f o r p o p u l a t i o n s t r u c t u r e a n d h y b r i d s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n .......................................................................................................................126
D i s c u s s i o n ................................................................................................................................128 I d e n t i f i c a t i o n o f h y b r i d i z a t i o n ..................................................................................128 L o w p r e v a l e n c e o f h y b r i d s .........................................................................................129
A c k n o w l e d g m e n t ..................................................................................................................133 R e f e r e n c e s ...............................................................................................................................133
110 CAPÍTULO 3
Resumen
En este estudio se pretende dar a conocer el fenómeno de hibridación e introgresión
genética que tienen lugar entre el visón europeo y el turón. Un total de 446
muestras, recogidas en diferentes poblaciones de Europa, fueron analizadas con 13
loci microsatélites (de herencia biparental). Asimismo, marcadores de DNA
mitocondrial (de herencia materna) y cromosoma Y (de herencia paterna) fueron
secuenciados para establecer la dirección de la hibridación. Se aplicaron diferentes
análisis Bayesianos que revelaron unos bajos niveles de hibridación genética en las
poblaciones de estas dos especies de mustélidos. La hibridación parece producirse de
forma unidireccional, ya que, al menos en los casos estudiados, el apareamiento
tiene lugar únicamente entre visones europeos hembra y turones macho. Además, el
retrocruzamiento también parece producirse en una única unidirección, ya que tan
sólo se ha observado que tiene lugar entre híbridos de primera generación con
individuos parentales de la especie turón. Concretamente, se produce entre híbridos
hembra y turones macho, lo que indica que los híbridos hembra de primera
generación son fértiles. Este hecho parece confirmar, por un lado, la regla de
Haldane, que establece que entre híbridos interespecíficos cuando uno de ellos esta
ausente, es estéril o raro se corresponde con el sexo heterogamético; por el otro,
también puede confirmar la presencia de barreras de aislamiento alternativas que
impiden el apareamiento entre turones hembra con híbridos macho de primera
generación. Los datos genéticos que se obtienen de este estudio han demostrado que
la detección de híbridos a través de la observación de características morfológicas
puede llevar a conclusiones erróneas, debido a que los rasgos híbridos no son
siempre aparentes.
Abstract
In this study we provide valuable information concerning hybridization and genetic
introgression phenomena occurred between European mink and polecat mustelid
species. 446 samples collected from different populations through Europe were
analyzed with 13 microsatellite nuclear markers (biparentally inherited). In addition,
mtDNA (maternally inherited) and Y chromosome (parentally transmitted) were also
sequenced in order to detect direction of hybridization. Bayesian approaches applied
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 111
revealed that hybridization process occurred at low level and appeared to be
asymmetric due to pure polecat males mate with pure European mink females.
Furthermore, backcrossing was observed to occur only with polecat parental
population. Conversely, reciprocal crosses were not detected with European mink. All
backcrosses detected showed European mink mitochondrial DNA suggesting females
F1 hybrids are fertile. These results agree with both Haldane’s rule where
heterogametic sex is absent, rare or sterile and the presence of reproductive isolation
barriers between male European mink-polecat hybrids and female polecats. Genetic
data revealed that hybrid distinction by morphological observations could provide
misleading identifications because species-specific phenotype characters are not
always apparent.
112 CAPÍTULO 3
Introduct ion
The hybridization is defined as the mating between individuals of genetically different
populations or taxa (Allendorf et al., 2001). Conversely, introgression involves gene
flow by interbreeding of first generation hybrids and parental species (Rhymer,
Simberloff, 1996). However, hybridization not always implicates introgression
phenomena. The hybrids could be unviable or infertile. Furthermore, reciprocal
crosses could not occur and the hybridization or introgression could have one
predominant direction of interspecific mating. The habitat fragmentation, the
introduction of species, as well as, environmental modifications by human
interactions have been described as the main causes that increase the rate and
proportion of hybridization and introgression (Allendorf, Luikart, 2007; Rhymer,
Simberloff, 1996). These phenomena are difficult to manage because there is no
unique common solution to every animal or plant species. A great debate has arisen
regarding the appropriate management action to develop due to different aspects
should be considered, such as the frequency and the type of hybridization, the
consequences on species subject to hybridize or the level of introgression (Allendorf
et al., 2001; Rhymer, Simberloff, 1996). Alleviate hybridization by hybrids removal
or pure individuals introduction into the wild populations are two of the options to
consider, although the efficiency still remains unclear (Frankham, 2002).
Nevertheless, the protection and development of specific management programs for
pure species protection should be one of the main solutions to encompass.
Hybridization is a common event documented in Order Carnivora (Beaumont et
al., 2001; Lehman et al., 1991; Randi et al., 2001; Vila et al., 1999; Vila et al.,
2003), and seems to occur also in Mustelids between European mink (Mustela
lutreola) and polecat (Mustela putorius) (Birks, 1995; Davison et al., 1999; Lynch,
1995) Rozhnov, 1993(Sidorovich, 2001). Hybrid identification among these two
mustelid species was based on the presence of intermediate phenotype (Heptner,
1967; Novikov, 1939; Ognev, 1931; Rozhnov, 1993; Tumanov, Zverev, 1986).
Sidorovich (2001) studied the density and ecological features of hybrid individuals
within the sympatric areas and reviewed the morphological traits for hybrid
identification. Colour pattern was considered the main characteristic distinction
feature although body size was another important trait to be considered. It is
supposed that hybrid individuals exhibit distinctive morphological characters, such as,
dorsal pelage, mask, underhair, guardhair and ears, intermediate to parental
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 113
individuals (Davison et al., 2000b; Sidorovich, 2001). However, the mixture of
morphological characters is sometimes ambiguously recognizable hindering hybrids
detection. Furthermore, phenotypic characters failed to determine whether hybrid
individual belong to first generation hybrid (F1), backcross or later generation hybrid
class (Allendorf et al., 2001).
The application of genetic markers provided advantages against phenotypic
characters and has been successfully used for hybrid detection in many plant and
animal species (Rhymer, Simberloff, 1996). Lode et al. (2005) investigated allozymic
and microsatellite variation in order to identify diagnostic alleles among the two
mustelid species and to determine the effective hybridization rate in France. Although
the molecular markers applied yielded valuable results for hybrids detection, several
questions, such as the direction of hybridization, the hybrid classification or the level
of introgression in the wild populations, still remain unknown.
The first approach of this study was to identify species-specific mitochondrial
DNA (mtDNA; maternally inherited) and Y chromosome (paternally transmitted)
haplotypes of European mink and polecat pure populations in order to reveal the
direction of hybridization. Biparentally inherited nuclear markers were applied
subsequently to identify all hybrid individuals, as well as, to classify them into
different hybrid categories (pure species, F1, F2 or backcrosses). Furthermore, the
genetic data obtained will provide valuable information concerning the possible
existence of reproductive isolating barriers, as well as, the viability and fertility of F1
hybrid individuals. Samples were collected from different populations through Europe
in order to determine the hybridization proportions in the different regions and to
elucidate if the hybridization is a common event among these two mustelids. The
genetic data resulted will provide additional information about the hybridization role
in the decline of the threatened European mink.
Materia l & Methods
Samp le co l l e c t i on and l abora to ry p rocedures
In order to detect hybridization and to assess the genetic introgression rates among
the species, it is important to identify species-specific haplotypes or alleles with
114 CAPÍTULO 3
individuals located in allopatric areas (i.e. no overlapping geographical areas and free
of hybridization). Thus, 40 out of 116 sampled polecats were obtained from pure
populations (Russia n=3, Germany n=4, Turkey n=1, Slovene n=8 and Spain n=24)
where European mink was not present. We extended the sample collection of a
previous study (Cabria et al, in prep) with four more samples of European mink.
Overall, the number of European minks was 317 collected from three different
European regions: the Northeastern (Russia, Belarus and Estonia), Southeastern
(Romania) and Western (France and Spain). Finally the number of putative hybrids
was 15 samples from four localities, East Europe (n=1), Russia (n=2), Belarus (n=1)
and Spain (n=11). Morphological characteristics of each individual were used as prior
information for species classification. Hence, the samples were considered as putative
pure species (M. lutreola or M. putorius) and/or putative hybrids before genetic
analysis.
Genomic DNA of the newly analyzed specimens was isolated from muscle, liver
or hair samples stored individually in ethanol 96% and frozen at -20º for optimal
conservation, as previously described in Cabria et al (in prep) .
MtDNA sequenc i ng
Control region was selected as one molecular marker because it was
successfully used in previous studies of mustelids (Gómez-Moliner et al., 2004;
Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004; Pertoldi et al., 2006). Primers used for
mtDNA amplifications as well as PCR and sequencing conditions were as described in
Cabria et al. (in prep.). We analyzed variation in mtDNA control region of 39 samples
(polecats, n=20, European minks, n=4 and hybrids, n=15). The resulted mtDNA
sequences were aligned with 17 (GenBank accession numbers: EU548035-
EU548051) and 24 (GenBank accession numbers: AY962022 to AY962045) mtDNA
haplotype sequences available for European mink and polecat, respectively. The
otter, Lutra lutra (GenBank accession number: NC011358.1), the American mink,
Neovison vison, and the Siberian weasel, Mustela sibirica, were used as outgroups.
The new seven mtDNA haplotypes obtained in this study for M. putorius and for two
outgroups (M. sibirica and N. vison) are available in GenBank under accession
numbers FJ556593-FJ556597 and FJ589734-FJ589735, respectively.
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 115
Y c h r omosome s e quen c i n g
The two Y chromosome sequence data set containing two different portions of
Dead Box polipeptide Y, introns 5 (DBY5) and 7 (DBY7) (Hellborg, Ellegren, 2003),
were analyzed to determine the paternal origin of the individuals by nucleotide
species-specific identification. PCR amplifications were conducted in a final volume of
15 μl containing 0.53 μM of each primer, 1.33 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x reaction
buffer, 0.13 mg/mL BSA, 0.5 U of Bio Taq DNA polymerase (Bioline), and
approximately 10–20 ng of template DNA. PCR conditions consisted of an initial
denaturing at 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles of denaturing at 94 °C for 50 s,
annealing at 49.5 °C for 50 s and extending at 72 °C for 90 s with a final elongation
step at 72 °C for 10 min. PCR products were purified by QIAquick PCR Purification Kit
(QIAGEN®), and subsequent sequenced in automated DNA sequencers (ABI PRISM
3700 and 3730) using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems), and following manufacturer's instructions.
Eight male European minks (Russia n=6, Belarus n=1, Spain n=1) and 10
male polecats from pure populations (Russia n=4, Belgium n=2, Slovene n=1, France
n=1, Spain n=2) were sequenced in order to detect species-specific nucleotides
within Y chromosome sequences. The Y chromosome haplotypes of M. putorius and
M. lutreola have been deposited in GenBank under accession numbers FJ556591 and
FJ556592, respectively.
M i c r o s a t e l l i t e s ge n o t y p i n g
11 microsatellite loci previously tested on European mink populations (Cabria
et al. in prep), the locus MVIS99, developed for the American mink Neovison vison
(Fleming et al., 1999), as well as, one specific locus, MLUT27, isolated for European
mink (Cabria et al., 2007) were selected for the study. These 13 microsatellite loci
successfully amplified in both mustelid species.
PCR amplifications for microsatellite markers MLUT27 and MVSI99 (Cabria et
al., 2007) (Fleming et al., 1999) were optimized carrying out the following protocol:
0.2 μM of each primer, 0.33 mM dNTPs, 1.6-2.13 mM MgCl2, 1x reaction buffer, 0.07
mg/mL BSA, 0.45 U of Bio Taq DNA polymerase (Bioline), and approximately 10–20
ng of template DNA, in a final volume of 15 μl. PCR conditions consisted of an initial
denaturing at 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles of denaturing at 94 °C for 30 s,
116 CAPÍTULO 3
annealing at 55–60 °C for 45 s and extending at 72 °C for 45 s with a final
elongation step at 72 °C for 20 min. PCR conditions for the rest microsatellites loci
were carried out as described in Cabria et al. (in prep.).
Da ta ana lyses
The Gimlet program version 1.3.3 (Valiere, 2002) was used to identify and to correct
the genotyping errors. Two polecats had identical genotypes and were considered to
be the same individual. Therefore, they were discarded for further analyses. A total
of 114 polecats remained in the microsatellite data set.
Paternal and maternal hybridization was detected directly by nucleotide
comparisons among the European mink and polecat mtDNA and DBY5 sequences.
For mtDNA data, sequences were aligned using the default parameters of
Clustal X version 1.83 (Thompson et al., 1997). Alignments were subsequently
revised by eye. Gapped positions were excluded from the data set. Nucleotide (π)
and haplotype (h) diversities were assessed using Arlequin version 3.1 (Schneider,
2000) for mtDNA data set. Phylogenetic trees were constructed using two methods of
phylogenetic inference: Neighbour-joining (NJ; (Saitou, Nei, 1987) and Bayesian
inference (BI; (Huelsenbeck et al., 2001) with PAUP version 4.0b10 (Swofford, 2002)
and MrBayes v 3.0b4 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001; Ronquist, Huelsenbeck, 2003),
respectively. NJ was performed with 10 random addition sequences and TBR branch
swapping. TrN+I+Г was the best-fit model of nucleotide substitution selected
according to the Akaike Information Criterion (AIC) using ModelTest version 3.6
(Posada, Crandall, 1998). Support of the recovered trees was evaluated with non-
parametric bootstrap proportions (BPs-1000 pseudoreplicates). BI was performed
with four simultaneous chains, each of 106 generations, sampled every 100
generations (the first 1000 trees were discarded as “burn-in”). The model used was
GTR (according to the AIC that are available in MrBayes).
For the microsatellite alleles data, genetic diversity index, assessed as number
of alleles per locus (NA), number of private alleles (PA), allelic richness (AR) observed
(HO) and expected (HE) heterozygosities and inbreeding coefficient (FIS), were
calculated per locus and sampling site loci for European mink an polecat species
using Genetix version 4.05 (Belkhir et al., 2000) and FSTAT version 2.93 (Goudet,
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 117
1995) softwares. Deviation form Hardy-Weinberg (HW) equilibrium was tested using
the exact test implemented in GenePop version 3.3 (Raymond, Rousset, 1995).
Statistical significance was evaluated by running a Markov Chain Monte Carlo (MCMC)
consisting of 10,000 batches of 10,000 iterations each, with the first 10,000
iterations discarded before sampling (Guo, Thompson, 1992). Significance levels
were adjusted with sequential Bonferroni correction in order to correct for the effect
of multiple tests (Rice, 1989).
The patterns of genetic differentiation were visualized by a Factorial
Correspondence Analysis (FCA) using Genetix program v. 4.02 (Belkhir et al., 2000).
Multiple variables (allele frequencies at different loci) are considered to compute a
linear relationship that best explain the variation between individuals.
Biparental multilocus genotypes were analyzed with two different Bayesian
approaches in order to identify the admixture proportions and the assignment of
individual to populations:
1.- The program STRUCTURE version 2.2 (Falush et al., 2003; Falush et
al., 2007; Pritchard et al., 2000) was applied to determinate the level of
admixture calculated as the proportion of the genome of individuals
originated from each of the two species. Simulations were run using a
burn-in period of 105 sweeps followed by 106 MCMC iterations. Independent
runs of K were performed from one to five clusters and repeated ten times
to check for consistency in the results. Admixture ancestry and correlated
allele frequency models were used without prior knowledge of genetic
information.
2.- The Bayesian model-based clustering method developed by Anderson
and Thompson (Anderson, Thompson, 2002) was implemented in the
NEWHYBRIDS 1.1 beta program. The method identifies hybrid individuals
on the basis of the posterior probability (Q) of belonging to different pure
parental or hybrid categories generated during n=2 or n=3 generations of
potential interbreeding. Six distinct genotype frequency classes were
defined: pure species I, pure species II, F1 hybrids, F2 hybrids, and
backcrosses with pure species I (BxI) and with pure species II (BxII).
Simulations were run with 106 sweeps for burn-in period and 106 MCMC
iterations. The Jeffreys-like and the Uniform priors were assumed for Θ
(allele frequencies) and π (mixing proportions) in order to verify the
congruence of the results. Computations were executed with and without
118 CAPÍTULO 3
prior genetic information about the individual’s genotype frequency
category and the allele frequencies information. Thus, polecat individuals
from allopatric areas were used for the prior information options.
The clusters obtained with both Bayesian statistical methods were displayed in
a graphical plot using the program Distruct version 1.1 (Rosenberg, 2004). According
to (Kaeuffer et al., 2007) the correlation coefficient rLD was estimated before running
Bayesian clustering analyses to evaluate its influence on the clustering estimation, as
well as to avoid the clustering bias generated by the presence of high rLD values. The
rLD between all pair of loci was calculated using Genetix software (Belkhir et al.,
2000) and did not show significant association between pairs of loci (data not
shown).
Results
Mi tochondr ia l DNA sequence d ive rs i t y and iden t i f i ca t ion
o f mate rna l o r i g in
The 79 mtDNA nucleotide sequences (including outgroups) were included in a data
set that produced an alignment of 491 positions without gaps. Two European minks
and two polecats were unsuccessfully amplified. A total of 38 mtDNA haplotypes were
found for European mink (17 haplotypes) and polecat (21 haplotypes). The
sequences of M. lutreola and M. putorius were distinguished by 5 specific nucleotide
differences. The mtDNA sequence variability of European mink and polecat was
defined by relative low values of π, 0.0062 (±0.0037) and 0.0081 (±0.0046)
respectively, and h, 0.864 (±0.058) and 0.935 (±0.023), respectively. Two main
clades were recovered with high bootstrap support (NJ BPs>70% and BI BPPs>90%)
which correspond to European mink (Clade I) and polecat (Clade II) species (Figure
1). The clades also included some sequences of individuals with mitochondrial
genome that did not correspond to phenotypic characteristics.
All European mink tested ere clustered into the Clade I whereas three
individuals (Ind_318 to 320), morphologically identified as polecat species, had
Mustela lutreola mtDNA and were included in the Clade I (Figure 1; Table 1). These
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 119
NvisNC011358.1
Msib
Ind_446*Ind_445*Mlh2
Ind_319*
Ind_443*Ind_444*
Ind_318*
Ind_441*
Ind_320*
Mlh11
Ind_439*Ind_440*
Ind_442*
Ind_437*Ind_438*
Mph28
Mph29
Mph27
Ind_1*
Ind_432
0.001 substitutions/site
Mph25
Mph26
CLADE I
Mustela lutreola
77100
7390
CLADE II
Mustela putorius
Ind_433Mph7
Ind_434Mph20Mph24
individuals shared the same European mink mtDNA haplotype Mlh11, which is found
in the Western European region (Cabria et al., in prep.). This result suggested that all
these individuals could be either pure European minks or hybrids with M. lutreola
ancestry in the maternal line. The other 15 mtDNA nucleotide sequences of
individuals with polecat’s phenotype were included in the Clade II, which also
grouped haplotypes of M. putorius from different European regions. Ten of these
sequences carried polecat haplotypes previously described (Pertoldi et al., 2006),
whereas the other 5 mtDNA nucleotide sequences produced 4 new haplotypes
(Mph25, Mph26, Mph27 and Mph28) not described for M. putorius (Figure 1; Table
1).
Figure 1 Phylogenetic relationships (NJ
phylogram) of M. lutreola (Clade I) and
M. putorius (Clade II) inferred from
mtDNA haplotype data set and
computed using distance methods (NJ)
and Bayesian inference (BI). Letters
indicate putative hybrids (Ind_432 to
Ind_446), individuals phenotypically
identified as European mink (Ind_1) or
polecat (Ind_318 to Ind_320) and
European mink (Mlh2, Mlh11) and
polecat (Mph7, Mph20 and Mph24 to
Mph29) mtDNA haplotypes. Numbers
represent support for NJ (BPs on top)
and BI (BPPs at bottom). Asterisks (*)
identifies those confirmed hybrid
individuals by genetic analyses whereas
arrows ( ) indicate those new mtDNA
haplotypes found in polecat. Ind_435
and Ind_436 correspond to polecat
mtDNA haplotype Mph25 and Mph29,
respectively. Outgroups are: Lutra lutra
(NC011358.1), Neovison vison (Nvis)
and Mustela sibirica (Msib).
120 CAPÍTULO 3
Putative hybrids Ind_433 to 435 were included in the Clade II and showed
distinct mtDNA haplotypes described for polecat (Mph7, Mph20, Mph24 and Mp25)
(Pertoldi et al., 2006). Conversely, 11 putative hybrid specimens (Ind_432 and
Ind_437 to 446) were included in the Clade I and were found to carry the European
mink mtDNA haplotypes Mlh2 and Mlh11, indicating the M. lutreola origin at maternal
line. Only the putative hybrid Ind_436 were grouped in Clade II and presented one
mtDNA haplotype not recovered previously neither for M. lutreola nor M. putorius
(Figure 1; Table 1).
Table 1 Summary of the mtDNA and Y chromosome nucleotide sequence results and posterior probability assignments obtained by
STRUCTURE and NEWHYBRIDS for four individuals morphologically identified as European mink (Ind_1) and polecat (Ind_318 to Ind_320),
and 15 putative hybrids (Ind_432 to Ind_446). The table includes the phenotype and genetic species identification, sex and origin of each
specimen, the haplotypes achieved for both maternally (haplotypes Mlh2 and Mlh11 for M. lutreola and Mph7, Mph20, Mph24, Mph25 and
Mph29 for M. putorius) and paternally (haplotype Mlh-DBY5 for M. lutreola and Mph-DBY5 for M. putorius) inherited molecular markers and the
individual proportions membership (qi), using no prior genetic information, generated by both STRUCTURE and NEWHYBRIDS programs.
Sequences STRUCTURE
Sample Sex Country Phenotype Genetic mtDNA DBY5 Cluster I Cluster II
Ind_1 ♀ Spain E. mink F1 hybrid Mlh11 NA 0.529 (0.345-0.710) 0.471 (0.290,0.655)
Ind_318 ♂ France polecat F1 hybrid Mlh11 Mph-DBY5 0.448 (0.279-0.622) 0.552 (0.377,0.721)
Ind_319 ♂ Spain polecat BxII hybrid Mlh11 Mph-DBY5 0.383 (0.212-0.566) 0.617 (0.434,0.788)
Ind_320 ? Spain polecat BxII hybrid Mlh11 NA 0.148 (0.019-0.316) 0.852 (0.684,0.982)
Ind_432 ♂ Spain hybrid E. mink Mlh11 Mlh-DBY5 0.999 (0.995-1.000) 0.001 (0.000,0.005)
Ind_433 ♂ Spain hybrid polecat Mph7 Mph-DBY5 0.001 (0.000-0.005) 0.999 (0.995,1.000)
Ind_434 ♂ Spain hybrid polecat Mph20 & Mph24 Mph-DBY5 0.001 (0.000-0.005) 0.999 (0.995,1.000)
Ind_435 ♂ Russia hybrid polecat Mph25 Mph-DBY5 0.001 (0.000-0.005) 0.999 (0.995,1.000)
Ind_436 ♀ Russia hybrid polecat Mph29 NA 0.002 (0.000-0.008) 0.998 (0.992,1.000)
Ind_437 ? Spain hybrid BxII hybrid Mlh11 NA 0.181 (0.054-0.344) 0.819 (0.657,0.946)
Ind_438 ♂ Spain hybrid F1 hybrid Mlh11 Mph-DBY5 0.541 (0.346-0.732) 0.459 (0.269,0.654)
Ind_439 ♂ Spain hybrid F1 hybrid Mlh11 Mph-DBY5 0.548 (0.361-0.729) 0.452 (0.271,0.640)
Ind_440 ♀ Spain hybrid F1 hybrid Mlh11 NA 0.513 (0.329-0.695) 0.488 (0.305,0.672)
Ind_441 ♀ Spain hybrid F1 hybrid Mlh11 NA 0.536 (0.356-0.712) 0.464 (0.288,0.644)
Ind_442 ♀ Spain hybrid BxII hybrid Mlh11 NA 0.367 (0.197-0.552) 0.632 (0.448,0.803)
Ind_443 ♂ Spain hybrid F1 hybrid Mlh11 Mph-DBY5 0.478 (0.285-0.674) 0.523 (0.327,0.716)
Ind_444 ♂ Spain hybrid F1 hybrid Mlh11 Mph-DBY5 0.464 (0.286-0.647) 0.536 (0.353,0.714)
Ind_445 ♂ Russia hybrid F1 hybrid Mlh2 Mph-DBY5 0.437 (0.259-0.621) 0.563 (0.379,0.741)
Ind_446 ♂ Belarus hybrid F1 hybrid Mlh2 Mph-DBY5 0.437 (0.259-0.621) 0.563 (0.379,0.742)
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 121
(table 1 continued) NEW HYBRIDS
Sample Pure I Pure II F1 F2 Bx I Bx II
Ind_1 0.000 0.000 0.999 0.00021 0.0003 0.0004
Ind_318 0.000 0.000 0.997 0.001 0.0001 0.0025
Ind_319 0.000 0.000 0.015 0.061 0.000 0.923
Ind_320 0.000 0.485 0.000 0.003 0.000 0.513
Ind_432 1.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Ind_433 0.000 0.999 0.000 0.000 0.000 0.00002
Ind_434 0.000 0.999 0.000 0.000 0.000 0.00001
Ind_435 0.000 0.999 0.000 0.000 0.000 0.00002
Ind_436 0.000 0.999 0.000 0.000 0.000 0.0002
Ind_437 0.000 0.074 0.000 0.005 0.000 0.922
Ind_438 0.000 0.000 0.931 0.030 0.037 0.002
Ind_439 0.000 0.000 0.999 0.00024 0.001 0.0003
Ind_440 0.000 0.000 0.988 0.006 0.004 0.001
Ind_441 0.000 0.000 0.992 0.003 0.004 0.001
Ind_442 0.000 0.000 0.00003 0.084 0.000 0.917
Ind_443 0.000 0.000 0.997 0.001 0.001 0.002
Ind_444 0.000 0.000 0.998 0.0002 0.00012 0.001
Ind_445 0.000 0.000 0.991 0.001 0.0001 0.008
Ind_446 0.000 0.000 0.991 0.001 0.0001 0.008
Each individual was assigned to Cluster I and Cluster II, which correspond for European mink and polecat, respectively, in
STRUCTURE, as well as, to different genotype frequency classes: Pure I (pure European mink), Pure II (pure polecat), F1, F2,
BxI (backcross with European mink) and BXII (backcross with polecat) in NEWHYBRIDS. The 90% credibility intervals (CI)
generated by STRUCTURE are shown in brackets. NA: non-amplified
Y ch romosome sequence d ive rs i t y and iden t i f i ca t ion o f
pa te rna l o r ig in
DBY7 data set produced an alignment of 463 positions and failed to detect nucleotide
variation among the sequences of these two mustelid species. Therefore, it was
discarded as molecular marker to detect the paternal origin of the samples. On the
other hand, DBY5 data set produced an alignment of 429 positions and the Y
chromosome sequences for Mustela lutreola and M. putorius were distinguished by 3
distinct species-specific nucleotides. Y chromosome haplotype Mlh-DBY5 was found in
European mink individuals analyzed whereas polecats were fixed for haplotype Mph-
DBY5. Two individuals morphologically identified as polecat species (Ind_318 and
Ind_319) presented Y chromosome haplotype Mph-DBY5, as well as, were found to
122 CAPÍTULO 3
carry European mink mtDNA haplotype Mlh11, which confirm the hybrid origin of
these samples (Table 1). Furthermore, the Y chromosome haplotype Mph-DBY5 was
also reported for 9 male putative hybrids: Ind_433 to Ind_435 (polecat mtDNA) and
Ind_438, Ind_439 and Ind_443 to Ind_446 (European mink mtDNA), suggesting
polecat ancestry in the paternal line and a hybrid origin for the animals 438,439 and
443 to 446 (Table 1). Only one male putative hybrid Ind_432 (European mink
mtDNA) showed the Y chromosome haplotype Mlh-DBY5, which indicate the
European mink ancestry in the paternal line and a pure origin for it (Table 1).
Genet i c d i ve rs i t y and spec ies i den t i f i ca t i on a t
m ic rosa te l l i t e l oc i
Almost all microsatellite loci were polymorphic in both species and yielded a total of
67 (ranging from two to 10 alleles) and 74 (ranging from two to 11 alleles) alleles in
European mink and polecat species, respectively (Figure 2 and Table 2). Only the loci
MLUT27 and MVIS99 showed a single allele in European mink. Comparison of HE and
HO did reveal slight differences between the European mink and polecat species
(Table 2). Inbreeding coefficients were positive at all loci in European minks whereas
negative FIS values were found at loci MLUT35, MVIS75 and MVIS99 within polecat
species, suggesting an excess of heterozygote (Table 2). Significant departure from
HW equilibrium after Bonferroni corrections was observed at 4 loci in the populations
of European mink whereas only one locus in polecat populations deviated from HW
equilibrium proportions. The program FreeNA (Chapuis, Estoup, 2007) was applied to
test the presence of null alleles in the microsatellite data set. The results rejected the
hypothesis of putative null alleles caused bias in genetic diversity and population
differentiation estimates.
Differences in allele frequency distribution as well as the presence of private
alleles are considered the most significant parameter of population or species
distinction in order to assess genetic introgression (Beaumont et al., 2001; Oliveira
et al., 2008). A total of 23 (34.33%) and 20 (27.03%) private alleles were found in
M. lutreola and M. putorius, respectively (Figure 2 and Table 2). A threshold
frequency of 0.05 was considered to avoid sampling and/or genotyping errors.
Interestingly, the alleles found at microsatellite loci MLUT04 and MLUT25 were
species-specific with a slight difference in allele size (Figure 2). The alleles found in
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 123
Mustela lutreola were higher in length differing by 5 to 10 bp (data not shown). On
the other hand, most of the shared alleles by the two mustelid species showed
differences at the frequencies distribution (Figure 2).
Table 2 Summary of the genetic variability assessed per loci and species. The table includes:
the number of alleles (NA), the private alleles (PA), the allelic richness (AR), observed (HO) and
expected (HE) heterozygosities and the inbreeding coefficient (FIS). PA, private allele (P≥>0.05)
Mustela lutreola
Locus NA PA AR HO HE FIS
MLUT04 4 4 4.000 0.3311 0.4534 0.270
MLUT20 9 5 8.070 0.4984 0.7389 0.326
MLUT25 6 3 4.875 0.5064 0.6265 0.192
MLUT27 1 ⁄ 1.000 ⁄ ⁄ ⁄
MLUT32 10 2 8.937 0.5641 0.6987 0.193
MLUT35 4 1 3.987 0.2300 0.2799 0.178
MER09 4 1 3.999 0.3962 0.5056 0.217
MER22 7 4 6.536 0.5279 0.6943 0.240
MER41 5 1 4.690 0.3387 0.5905 0.427
MVIS22 6 1 5.726 0.5590 0.7329 0.238
MVIS72 8 1 7.206 0.4286 0.6197 0.309
MVIS75 2 ⁄ 2.000 0.3163 0.4144 0.237
MVIS99 1 ⁄ 1.000 ⁄ ⁄ ⁄
All 67 23 4.771 0.3613 0.4888 0.261
Mustela putorius
Locus NA PA AR HO HE FIS
MLUT04 3 2 3.000 0.1584 0.2278 0.306
MLUT20 6 3 5.909 0.4775 0.6794 0.298
MLUT25 5 3 4.902 0.4865 0.6507 0.253
MLUT27 3 2 2.992 0.0991 0.1276 0.224
MLUT32 11 2 10.616 0.2523 0.2866 0.120
MLUT35 2 ⁄ 2.000 0.0364 0.0359 -0.014
MER09 5 ⁄ 4.812 0.1351 0.1675 0.194
MER22 5 1 4.994 0.1273 0.1871 0.321
MER41 7 1 6.992 0.5946 0.6648 0.106
MVIS22 10 4 9.994 0.6273 0.8256 0.241
MVIS72 9 ⁄ 8.912 0.5636 0.7035 0.200
MVIS75 4 ⁄ 3.819 0.0450 0.0445 -0.012
MVIS99 4 1 3.819 0.0450 0.0445 -0.012
All 74 20 5.597 0.2806 0.3573 0.215
124 CAPÍTULO 3
M LUT 04
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1
1 2 3 4 5 6 7
M LUT 25
0
0 , 15
0 , 3
0 , 4 5
0 , 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M LUT 27
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1
1 2 3
M V I S99
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1
1 2 3 4
M LUT 32
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
M LUT 35
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1
1 2 3 4
M L U T 2 0
0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M E R09
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1
1 2 3 4 5 6
M E R22
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M E R41
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
1 2 3 4 5 6 7 8
M V I S72
00 , 1
0 , 20 , 30 , 4
0 , 50 , 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M V I S75
0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1
1 2 3 4
Figure 2 Histograms showing the frequency
distributions of alleles of 13 microsatellite
loci obtained for Mustela lutreola (light grey)
and M. putorius (dark grey) species.
M V I S22
0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 125
Mustela lutreola
Axe 1 (15.80%)
Mustela putoriusHybrids F1
Backcrosses BxII
Ind_432
Ind_1Ind_318
Ind_319 Ind_320
Ind_434
Ind_433
Ind_435
Ind_436
Ind_437
Ind_438Ind_439
Ind_440Ind_441
Ind_442
Ind_443
Ind_444
Ind_445Ind_446
0 1
0
-1
A factorial correspondence analyses based on 13 microsatellite data showed
strong differentiation (FST=0.531; P<0.001) among the two mustelid species
gathered in two defined groups (Figure 3). Eight putative hybrids (Ind_438 to
Ind_441 and Ind_443 to Ind_446) plotted in a group which also included two
samples considered European mink (Ind_1) and polecat (Ind_318) upon
morphological characters. All these samples occupied an intermediate position as
would be expected for hybrids between M. lutreola and M. putorius. Analyses of
hybrid genotypes performed with NewHybrids program classified them into first
generation (F1) hybrid type (see below for further information). Putative hybrids
Ind_319 and Ind_320 and polecat samples Ind_437 and Ind_442 were placed on an
intermediate position partially overlapped with polecats individuals and were
assigned to Backcross genotypic class BxII (backcross with polecat) (Figure 3; see
also Table 1 and Figure 4). The putative hybrids Ind_432 and Ind_433 to 436 were
grouped together with European minks and polecats, respectively. This result
indicated that those individuals are pure specimens, as suggest by the microsatellite
analyses.
Figure 3 Two-dimensional correspondence analyses reflected strong differentiation
among European minks (yellow squares) and polecats (blue squares) at nuclear loci.
Putative hybrids (white squares), localized at an intermediate position, were classified
into hybrid categories F1 or BxII (backcross with polecat), as showed the Bayesian
model-based clustering method implemented in NEWHYBRIDS program (see also
Table 1 and Figure 3 for further information).
126 CAPÍTULO 3
Mustela lutreola
Mustela lutreola Mustela putorius
Mustela putorius Putativehybrids
Putativehybrids
Pure I Pure II F1 F2 Bx I Bx II
Cluster I Cluster II
Ind_1Ind_318-320
Ind_1
Ind_432
Ind_433-436
Ind_437-446
Ind_318-320
Ind_432
Ind_433-436
Ind_437-446
a)
b)
Bayes ian in fe rence fo r popu la t i on s t ruc tu re and hybr id
spec ies i den t i f i ca t i on
Both Bayesian clustering approaches applied yielded consistent results. The Bayesian
clustering approach implemented in STRUCTURE software provided the existence of
two distinct genetic clusters as revealed the highest likelihood (ln[Pr(X/K)]) for the
model at k=2 (data not shown). The number of clusters was also fixed at K=2 as
suggested when we calculated the model value of ΔK (Evanno et al., 2005). Cluster I
grouped together the majority of European mink samples (except individual Ind_1),
with an estimated average proportion of membership (Q) higher than 0.95 (Figure
4a). Cluster II included most of individuals morphologically identified as polecat with
QII>0.95 (Figure 4a).
Figure 4 Detection of hybrids conducts by STRUCTURE (a) and NEWHYBRIDS (b) without
including prior genetic information. Each individual is represented as vertical line partitioned into
two segments (a) or six coloured segments (b), which length is proportional to: (a) the
individual’s estimated membership coefficients and (b) individual’s probability of belonging to the
six genotype classes. In a) the analyses was performed assuming two (K=2) distinct genetic
clusters. In b) the different genotype categories are: Pure I (European mink), Pure II (polecat),
F1, F2, BxI (backcross with European mink) and BxII (backcross with polecat). Individuals are
listed at the same order in all analyses. Putative hybrids (Ind_432 to Ind_446) and individuals
phenotypically identified as European mink (Ind_1) and polecat (Ind_318 to Ind_320) are
specified in both graphs.
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 127
All individuals tested, except some individuals, were assigned to each one
inferred clusters, Cluster I or II, with an individual assignment probabilities (qi)
higher than 0.95. Only two European mink individuals were assigned to Cluster I with
qi=0.897 and 0.925 (data not shown). Furthermore, qi values refer to the proportion
of the individual’s genome originated from European mink or polecat population
(Pritchard et al., 2000). Therefore, qi values higher than 0.95 provided estimates of
the ancestry of individuals with appropriate accuracy. Only Ind_1, from the Western
European region and considered as pure European mink, was assigned to both
clusters with an intermediate qi values (qi < 0.60), which is expected in first (F1)
generation hybrid. In addition, three polecat samples (Ind_318 to Ind_320), also
from West Europe, showed assignment probabilities below 0.90 (0.148 < qi < 0.852)
indicative of admixed ancestry. All these results are listed in Table 1 and Figure 4a
and provide strong evidence for considering these individuals as hybrids. Most of the
putative hybrids (Ind_437 to Ind_446) were assigned to both clusters with qi values
below 0.60 (0.148 < qi < 0.852) and therefore they were genetically identified as
hybrids due to their admixed genome (Figure 4a; Table 1). The other 5 putative
hybrids were assigned to Cluster I (Ind_432) with qi > 0.95 and to Cluster II
(Ind_433 to Ind_436) with qi > 0.95. These individuals can be considered as pure
European mink or polecat species because of the high qi values displayed. Very
similar results were obtained when different models were considered in the analyses.
The Bayesian analyses performed with NEWHYBRIDS revealed strong posterior
probabilities of belonging to each one of predefined genotype frequency categories.
All individuals considered morphologically as European mink, except Ind_1, were
assigned to parental species, named pure species I (Pure I) (Figure 4b), with average
posterior probabilities of 0.999, ranging from 0.978 to 1 (data not shown). Only
Ind_1 was placed within F1 hybrid class with a posterior probability of 0.999 (Table
1, Figure 4b). The results obtained with NEWHYBRIDS agreed with previous analyses
on considering the sample Ind_1 as hybrid. On the other hand, high percentage
(99%) of polecats were assigned to parental species class II (Pure II) with posterior
probabilities higher than 0.95 (Figure 4b). Two polecats (Ind_318 and Ind_319) from
Western European populations, which were assigned as intermediate individuals by
STRUCTURE, were also considered as hybrids by NEWHYBRIDS analysis (Figure 4b).
Ind_318 was assigned to F1 genotype class with a posterior probability of 0.997
whereas Ind_319 was classified into the BxII class with a posterior probability of
0.923 (Table 1). Furthermore, Ind_320 from polecat populations was ambiguously
128 CAPÍTULO 3
assigned to pure species II and BxII genotype classes with posterior probabilities of
0.485 and 0.513, respectively (Figure 4b; Table 1).
Putative hybrids (Ind_432 to Ind_446) were classified into different genotype
frequency classes with high posterior probabilities ranging from 0.922 to 1 (Table 1).
Ind_432 was listed as Pure I class whereas Ind_433 to Ind_436 were classified as
pure individuals but within the class Pure II (Figure 4b). The other 10 putative
hybrids were confirmed to have admixed genotype. Ind_437 and Ind_442 were
assigned to genotype frequency class BxII whereas Ind_438 to Ind_441 and Ind_443
to Ind_446 were classified as first-generation hybrids. The posterior probabilities of
all these specimens are listed in Table 1. All results were consistent with those
obtained with STRUCTURE which evidenced mixed ancestry. Detection of backcrossed
hybrids provided valuable information about the gene flow and introgression between
both species.
The results obtained using prior genetic information, as well as, using Jeffreys-
like prior agreed with those results obtained without prior information. Only Ind_320
was assigned with high posterior probabilities of 0.984 in BxII class, suggesting that
this specimen could be a backcrossed originated from mating between pure polecat
and F1 specimens.
Discussion
Iden t i f i ca t ion o f hybr id i za t i on
The analyses performed in this study provided valuable information about
hybridization events between these two mustelid species. The presence of species-
specific genetic markers facilitated the pure-bred species distinction, as well as,
hybrids detection and classification. Thus, it enabled the possibility of identifying
cryptic hybridization. Furthermore, the application of these molecular techniques
provided reliable information regarding the presence and the rate of the introgression
phenomena occurred in the populations. In addition, the utilization of maternally and
paternally inheritance markers provided accurate information about the direction of
the hybridization.
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 129
Despite the low mtDNA sequence variability found in these mustelid species,
the Bayesian/NJ procedures revealed two distinct genetic clades including all
European mink and the great majority (97%) of polecat samples analyzed. Only
three individuals (Ind_318 to Ind_320), identified as polecats by their phenotype, fall
into the Mustela lutreola clade (Clade I). The European mink maternal origin was also
confirmed for putative hybrids due to the high percentage (67%) of individuals
showing European mink mtDNA. On the other hand, and although several studies
have reported low levels of Y chromosome variability (Hellborg, Ellegren, 2004), the
nucleotide species-specificity found in DBY5 genetic marker allowed detecting the
Mustela putorius paternal origin of the putative hybrids. Only one male (Ind_432)
showed M. lutreola Y chromosome nucleotide sequence and was also confirmed as
pure European mink by microsatellite markers.
High proportion (97%; N=432) of the analyzed samples were confirmed as
pure M. lutreola or M. putorius species based on microsatellite molecular markers.
Five of these individuals, considered as putative hybrids, were classified as pure M.
lutreola or M. putorius based on microsatellite loci while mtDNA and Y chromosome
data corroborated their pure ancestry in the maternal and paternal line, respectively.
These samples were misidentified based on phenotypic characters due to a possible
unusual morphology.
Low preva lence o f hybr ids
Low hybridization rates were reported in this study. Only 3% of samples showed
admixed ancestry as revealed the microsatellite loci and the mtDNA and Y
chromosome data (Table 1). The majority of the genetically detected intermediate
individuals corresponded with the first-generation hybrid class and only 4 out of 446
samples tested were confirmed as backcrosses individuals with reliable accuracy. The
presence of individuals identified as European mink-polecat intermediates by
phenotype has been widely reported previously (Davison et al., 2000a; Maran et al.,
1998). Furthermore, backcrosses were also observed in captivity as a result of pure
polecats mating with an F1 individuals (Maran, Henttonen, 1995). The genetic
analyses performed in this study have supported the viability not only of the F1
hybrids but also of the backcrosses in the wild, suggesting that there are no
reproductive isolation barriers between Mustela lutreola and M. putorius in contrast
130 CAPÍTULO 3
to the embryonic abnormalities observed among European mink and American mink
Neovison vison, where the embryo is reabsorbed at early stages (Rozhnov, 1993).
The new data revealed that the hybridization process occur in a single
direction. Females of the endangered M. lutreola mate with male M. putorius due to
all F1 hybrids tested exhibited European mink mtDNA and polecat Y chromosome
sequences. The reciprocal cross was not observed. The absence of F1 hybrids with
polecat mtDNA and European mink Y chromosome sequences could be associated
with the presence of behavioural or sexual isolation between individuals of these two
mustelid species. Polecat females have similar or higher body size than European
mink males hindering cross-attraction between species and avoiding courtship or
copulation initiation (Coyne, Allen Orr, 2004). The same predominant hybridization
direction was observed among polecats and ferrets (Mustela furo) (Davison et al.,
1999). The bigger sized male polecats mate with smaller female ferrets, suggesting
that the behavioural isolating barriers may not be unusual among mustelids.
Nevertheless, other extant types of both prezygotic and postzygotic isolating barriers
are not discarded.
Despite the low number of backcrosses detected (N=4), all individuals showed
European mink mtDNA suggesting that females F1 hybrids are fertile. Conversely,
male F1 hybrids seems to be sterile obeying Haldane’s rule (i.e. heterogametic
individuals are absent, rare or sterile) (Coyne, Allen Orr, 2004). Nevertheless, the
presence of alternative reproductive isolation barriers between male European mink-
polecat hybrids and female polecats is not discarded. Similar size of female polecats
could prevent mating with male F1 hybrids such as mating between male European
mink and female polecat cited above.
Furthermore, backcrossing seems to be also unidirectional because it was
observed to occur only with polecat parental species. Conversely, there was no
evidence of reciprocal backcross with European minks (i.e. genetic introgression of
polecat mtDNA or microsatellite alleles into European mink populations).
Nevertheless, this prediction should be checked in further investigations testing a
higher number of putative hybrids.
Parental species are supposed to be better adapted to environment than
hybrids due to admixed genotype of the latter, although this assumption is not
always true (Barton, 2001; Rhymer, Simberloff, 1996). European mink-polecat
hybrids have shown to be viable and well adapted to the habitats available
(Sidorovich, 2001). However, several questions deserve further examinations as for
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 131
example if hybridization phenomena result in a reduction of fitness of hybrid
individuals, as compared to parental species, and thus in outbreeding depression.
High percentage (77%) of individuals identified as hybrids by genotype
showed admixed phenotype and was correctly recognized as hybrids by
morphological characters. On the other hand 23% of individuals with admix genotype
were recognized as pure European mink or polecat by phenetic characters. These
cryptic hybrids could correspond with young animals which do not exhibit the typical
colour pattern and their hybrids status are thus difficult to detect by morphology (J.
López de Luzuriaga and T. Maran, pers. comm.). The genetic markers applied and
the Bayesian procedures performed in this study provided highly efficient methods
not only for confirming the admixed ancestry of those specimens with ambiguous
phenotype, but also for detecting cryptic hybrids as well as for corroborating the pure
or admixed ancestry of those samples with unusual morphology.
The 85% of the genotypically confirmed hybrids were captured in the Western
European populations whereas only 15% of samples corresponded to the Eastern
populations. High proportion (91%) of those hybrids was detected in the Ebro river
region of the Spanish populations. Although these results should be considered
cautiously due to a high sampling effort was made in this particular area. Therefore,
the hybridization rate could be biased and underestimated outside the Ebro river.
Intense sampling throughout European populations, particularly at polecat
populations, could slightly increase the total hybridization and introgression
proportions reported in this study. In addition, it could provide valuable genetic
information about genetic integrity of polecat populations. Nevertheless, the
hybridization that is considered an uncommon event could be more frequent in those
sympatric areas where European mink survived in low densities, as previously
proposed Maran et al. (1998). However, considering the results of the present work,
the hybridization and introgression events did not appear to be contributed to the
historical decline of the endangered European mink populations (Davison et al.,
2000b; Maran et al., 1998). Conversely, it should be take into account that the role
of hybridization could have changed during the last decades. The current low density
of European mink populations could lead to increase the frequency and rate of
hybridization (Sidorovich, 2001). Therefore, the hybridization process could become
a substantial threat due to the possible avoidance of mate of parental species, as well
as, the aggressive behaviour exhibited by hybrids animals against European mink
species (M. A. Gómez and J. López de Luzuriaga, pers. comm.). Nevertheless, further
132 CAPÍTULO 3
new investigations are required to examine the importance, as well as, the biological
consequences of these phenomena in both European mink and polecat populations.
The combination of genetic data with biological information will be necessary for
improving current Mustela lutreola conservation programs and for developing new
management actions not only for the identified hybrid individuals but also for Mustela
putorius.
PAPER IV H YB R I D I ZA T I ON B E TW EE N M. l u t r e o la an d M. pu t o r i us 133
Acknowledgment
We are most grateful to Gorka Belamendia, Juan Carlos Ceña, Angus Davison, Pascal
Fournier, Asunción Gómez, Vladimir Katchanovsky, Andreas Kranz, Javier López de
Luzuriaga, Sisco Mañas, Tiit Maran, Santiago Palazón, Madis Podra and Dimitry
Skumatov for providing us with different mustelid samples. This work received partial
financial support from three LIFE projects (“Conservación del visón europeo (Mustela
lutreola) en “Castilla León” LIFE 00/NAT/E7229, La Rioja” LIFE 00/NAT/E7331 and
“Álava” LIFE 00/NAT/E7335). It was also financed by the Basque Country University
(project number GIU06/09) and by the Diputación Foral de Álava (Departamento de
Urbanismo y Medio Ambiente).
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DISCUSIÓN
Índice de contenidos 4 . 1 A p l i c a c i ó n d e M u e s t r a s n o I n v a s i v a s p a r a l a I d e n t i f i c a c i ó n d e E s p e c i e s .....................................................................................................................................138 4 . 2 V a r i a b i l i d a d y E s t r u c t u r a G e n é t i c a d e l V i s ó n E u r o p e o ..................143
4 . 2 . 1 D i v e r s i d a d g e n é t i c a d e l a s p o b l a c i o n e s d e v i s ó n e u r o p e o .......144 4 . 2 . 2 H i s t o r i a d e m o g r á f i c a d e l a s p o b l a c i o n e s .............................................146 4 . 2 . 3 E s t r u c t u r a g e n é t i c a ...........................................................................................147 4 . 2 . 4 C o n t r i b u c i ó n d e d i v e r s o s f a c t o r e s a l a e s t r u c t u r a g e n é t i c a d e l a s p o b l a c i o n e s d e v i s ó n e u r o p e o .........................................................................148
4 . 3 P r o c e s o s d e H i b r i d a c i ó n e n t r e e l V i s ó n E u r o p e o y e l T u r ó n ......151 4 . 3 . 1 P u e s t a a p u n t o d e m a r c a d o r e s m o l e c u l a r e s p a r a d e t e c t a r h í b r i d o s e n t r e v i s ó n e u r o p e o y t u r ó n ..................................................................153 4 . 3 . 2 C u a n t i f i c a c i ó n d e l a h i b r i d a c i ó n ................................................................154
4 . 4 E s t r a t e g i a s d e C o n s e r v a c i ó n .............................................................................159 4 . 4 . 1 M u e s t r e o s n o i n v a s i v o s ...................................................................................159 4 . 4 . 2 M a n t e n i m i e n t o d e l p o l i m o r f i s m o g e n é t i c o ...........................................160 4 . 4 . 3 H i b r i d a c i ó n : I m p l i c a c i o n e s p a r a l a c o n s e r v a c i ó n ...........................163
4 . 5 B i b l i o g r a f í a .....................................................................................................................165
CAPÍTULO
4
138 CAPÍTULO 4
4.1 Apl icación de Muestras no Invasivas para la
Ident i f icación de Especies
Uno de los principales problemas de trabajar con especies amenazadas y de
comportamiento elusivo reside en la obtención del material biológico suficiente que
permita realizar estudios genéticos específicos. La genética aplicada a la conservación
de especies se ha visto favorecida en la última década desde que se puso a punto la
metodología para trabajar con muestras no invasivas (Non-invasive Genetic Sampling
NGS), de forma que la recolección de muestras no implicara la captura de los
animales objeto de estudio (Waits, Paetkau, 2005). La importancia de estas técnicas
aplicadas sobre muestras no invasivas se ha constatado a lo largo de estos últimos
años por multitud de estudios, dado que no requieren perturbar a los animales y, en
ocasiones, las muestras son fácilmente accesibles. Todo ello las ha convertido en
técnicas rutinarias de estudio de numerosas especies (Adams, Waits, 2007;
Bellemain et al., 2005; Dallas et al., 2003; Ruiz-González et al., 2008; Sastre et al.,
2009). La información genética que se obtiene de este tipo de muestras es muy útil
para diseñar estrategias de conservación apropiadas para las especies, sobretodo
para aquellas que se encuentran en peligro de extinción (Pérez et al., 2009). No
obstante, a pesar de las ventajas de trabajar con muestras no invasivas, su
aplicación no está exenta de inconvenientes. En 1998 Taberlet y Waits pusieron de
manifiesto la falta de estudios que, por entonces, abordaran los problemas
metodológicos que este tipo de muestras no invasivas llevan consigo.
El tipo de muestras no invasivas como fuente de DNA es diversa. Así, se
pueden utilizar restos de excrementos, pelo, plumas, fragmentos de cáscaras de
huevos o rastros de saliva (Waits, Paetkau, 2005). Sin embargo, algunas de estas
muestras presentan una baja cantidad de células del propio animal, a partir de las
cuales se debe extraer el DNA (Schmaltz et al., 2006). Además, en la mayoría de los
casos el DNA extraído es de poca calidad (está degradado) o tiene inhibidores lo cual
genera problemas de amplificación del DNA durante el proceso de la PCR. Por otro
lado, la muestra puede estar contaminada con DNA de otros organismos, lo que
provoca problemas añadidos de amplificación cruzada (Broquet et al., 2007;
Sundqvist et al., 2008; Waits, Paetkau, 2005).
Hoy en día se han desarrollado numerosas investigaciones con el objetivo de
solventar las dificultades técnicas y optimizar las metodologías de estudio de
D ISCUSIÓN 139
muestras no invasivas. Estas investigaciones se han enfocado en mejorar los datos
que se obtienen de ellas y, a su vez, en proporcionar resultados más fiables y
precisos (Bonin et al., 2004; Miquel et al., 2006; Pompanon et al., 2005; Taberlet,
Luikart, 1999). En todo este proceso la técnica de la PCR ha cobrado una gran
importancia, ya que permite obtener un elevado número de copias del fragmento de
DNA a partir de una baja cantidad del mismo, lo que ha facilitado el uso de las
muestras no invasivas (Saiki et al., 1985). Dentro de las estrategias que actualmente
se emplean para evitar los problemas derivados del manejo de muestras no invasivas
se encuentran aquellas que tratan de evitar la contaminación de las mismas desde su
recogida, las que procuran solventar los problemas de bajo éxito del proceso de
amplificación del DNA, o las que reducen las altas tasas de error del genotipado de
los microsatélites mediante análisis estadísticos (Bonin et al., 2004; Miquel et al.,
2006; Piggott et al., 2004; Pompanon et al., 2005; Taberlet, Luikart, 1999; Waits,
Paetkau, 2005).
El estudio de identificación de especies a partir del análisis de excrementos
requiere aplicar marcadores moleculares que maximicen la probabilidad de obtener
un resultado válido. Generalmente estos estudios emplean el genoma mitocondrial
dado que tiene la ventaja de estar presente en una cantidad de copias muy superior
al genoma nuclear en una única célula (Waits, Paetkau, 2005). El número de células
intestinales que quedan incorporadas en los excrementos de los animales es, por lo
general, muy bajo. De ahí que el análisis del DNA mitocondrial facilite el estudio con
muestras degradadas ya que incrementa la tasa de éxito de la extracción del DNA y,
en consecuencia, de la amplificación del mismo.
Uno de los inconvenientes de trabajar con excrementos radica en la dificultad
de identificar la especie a la que pertenece una muestra biológica recogida en el
campo (Davison et al., 2002; Hansen, Jacobsen, 1999). En muchas ocasiones
diferentes especies pueden dejar rastros muy similares lo que puede llevar a error en
la interpretación de los resultados. La aplicación de herramientas moleculares ha
permitido solventar este problema (Bosch et al., 2005). Como metodologías
utilizadas se encuentran, por ejemplo, el uso de cebadores de PCR específicos de
especie, la obtención de fragmentos de PCR de longitud específica de cada especie o
la obtención de los patrones específicos de restricción del producto amplificado
(Bosch et al., 2005; López-Giráldez et al., 2005). Esta última técnica de PCR-RFLP ha
sido la aplicada en esta tesis doctoral (artículo I).
140 CAPÍTULO 4
Un primer esfuerzo de los trabajos realizados con visón europeo, se ha dirigido
a desarrollar un método de identificación de especies (visón europeo, visón
americano y turón) a partir de las muestras de excrementos recolectadas en el
campo (artículo I). Antes del desarrollo de esta técnica no existía método alguno que
permitiera esta identificación específica, ya que los excrementos de estas tres
especies no pueden distinguirse por su morfología (Maran et al., 1998a). Con
anterioridad Hansen & Jacobsen (1999) desarrollaron una metodología para
diferenciar muestras de excrementos de visón americano, turón y nutria basada en la
amplificación de una región del citocromo b y su posterior digestión mediante dos
enzimas de restricción (Taq I y Nla I). No obstante, el fragmento utilizado del
citocromo b no permite diferenciar entre turón y visón europeo. Por ello, nuestros
esfuerzos se han dirigido hacia la región control del DNA mitocondrial, zona
altamente variable (Avise, 1994).
Con el fin de hacer frente al problema del menor éxito de obtención de
amplificados puros a partir de excrementos, la técnica utilizada ha sido una Nested
PCR de un fragmento corto de DNA mitocondrial. La Nested PCR es una variante de la
PCR convencional que comprende dos pasos consecutivos de amplificación del DNA
que permiten aumentar la probabilidad de éxito en el resultado final (Hillis et al.,
1996). Primero, se realiza una reacción con cebadores externos que comprenden una
región más amplia y que permiten aumentar la cantidad de DNA molde para los
pasos siguientes. En segundo lugar, con el producto amplificado resultante, se realiza
una nueva PCR con otros dos cebadores internos. En el primer paso de PCR se ha
amplificado un fragmento de 592 pares de bases de longitud, que engloba el final del
citocromo b y el principio de la región control, mientras que en el segundo paso se
obtiene un fragmento de menor longitud (230 pb). La utilización de estos dos pasos
sucesivos de amplificado de DNA ha proporcionado buenos productos de amplificado
prácticamente en todas las muestras analizadas de visón y turón (artículo I). Sólo un
excremento de los 55 examinados ha dado problemas durante el proceso de
amplificación del DNA. De hecho, al eliminar el primer paso de PCR, la probabilidad
de error en el amplificado se incremento hasta un 70%. La validez de los resultados
obtenidos con excrementos se ha comprobado con el análisis de muestras de pelo
cuya procedencia era conocida. La concordancia entre los patrones de digestión
obtenidos tanto con excrementos como con pelo ha corroborado la eficacia de la
metodología empleada para la identificación de las tres especies de mustélidos. Las
endonucleasas de restricción seleccionadas en esta tesis doctoral, Msp I y Rsa I, han
D ISCUSIÓN 141
proporcionado unos patrones de restricción diagnósticos para cada una de las tres
especies de mustélidos estudiadas (artículo I, tabla 2).
Por otra parte, los patrones de restricción no sólo han permitido determinar la
especie de mustélido a la que pertenece una muestra sino también distinguir
diferentes haplotipos para cada una de las especies estudiadas, excepto para visón
americano (artículo I, tabla 2). Además se puede destacar la universalidad de esta
herramienta molecular ya que es diagnóstica para cualquier muestra de estas tres
especies, independientemente de su procedencia geográfica. Se ha podido certificar
que se obtienen diferentes patrones de restricción distinguibles para las tres especies
de mustélidos, incluso considerando todos los haplotipos previamente descritos para
ellas (Davison et al., 2001; Davison et al., 2000b; Statham et al., 2005). Los nuevos
haplotipos identificados durante el desarrollo de este trabajo también se ajustan a los
patrones de RFLP diagnósticos de especie (artículo I, tabla 2).
Los diferentes haplotipos publicados para el visón europeo por Davison et al.
(2000b) han proporcionado diferentes patrones de digestión con los enzimas
seleccionados en este estudio. Los haplotipos D1-D24 han generado dos fragmentos
tras el corte con la endonucleasa de restricción Msp I (patrón de restricción A;
artículo I, tabla 1). Estos haplotipos incluyen visones europeos procedentes de la
región de Europa del este (Rusia, Bielorrusia y Estonia), del norte de la Península
Ibérica y turones de Mongolia, Serbia y Polonia (Davison et al., 1999; Davison et al.,
2000b). Por el contrario, el fragmento de DNA mitocondrial objeto de estudio no es
digerido por este enzima de digestión en el visón americano debido a la sustitución
de una base nucleotídica en la secuencia diana del enzima Msp I (CCGG por CCAG).
Este patrón se ha definido como B (artículo I, figura 1). En consecuencia, esta
endonucleasa permite diferenciar muestras no invasivas de visón americano de
aquellas que son de visón europeo o turón.
Por otra parte, el enzima Rsa I reconoce diferentes puntos de corte para cada
una de las especies estudiadas (artículo I, tabla 1). El visón europeo ha presentado
dos patrones de restricción diferentes, el tipo A, que se espera encontrar para los
haplotipos D18, D20, D22 y D23 publicados por Davison et al. (2000b), y el patrón B,
mostrado por los haplotipos D19 y D21. En la región occidental de visón europeo se
ha encontrado tan sólo el patrón de restricción A, mientras que en la región de
Europa del este se han obtenido ambos patrones A y B, lo que sugiere que la mayor
diversidad genética se localiza en las localidades de la región del este. Todos los
haplotipos descritos anteriormente para turón: D3, D9-D11, D13, D15, D16 y D25
142 CAPÍTULO 4
(Davison et al., 2000b), al igual que el visón americano han mostrado el patrón de
restricción descrito como C (artículo I, tablas 1). Además, se ha descrito un patrón
adicional para una muestra de turón procedente del oeste de Francia consistente en
tres lugares de corte del enzima que han producido cuatro fragmentos de diferente
longitud (patrón D; artículo I, tabla y figura 1). Así pues, tras combinar los resultados
procedentes de la digestión con los enzimas Msp I (patrones A y B) y Rsa I (patrones
A-D) se han podido diferenciar haplotipos específicos de especie de los tres de
mustélidos estudiados (artículo I, tabla 2).
La aplicación de estos enzimas de digestión sobre otras especies de mustélidos
(nutria Lutra lutra, marta Martes martes y garduña Martes foina) proporciona
diferentes patrones de restricción fácilmente distinguibles, con excepción del turón de
la estepa Mustela eversmanni y el hurón Mustela furo que presentan uno de los
haplotipos que muestra el turón al combinar los dos enzimas, el haplotipo AC. Este
estudio se ha basado en el análisis de los haplotipos publicados para todas estas
especies (Cassens et al., 2000; Davison et al., 2001; Davison et al., 1999; Ketmaier,
Bernardini, 2005). Estas especies de mustélidos pueden dejar rastros similares a los
de visón europeo, americano y turón, de manera que los excrementos también
pueden ser fácilmente confundidos con los que dejan estos últimos. Así pues, el
empleo de esta metodología resulta muy útil además para identificar restos
depositados por otros mustélidos con los que las tres especies objeto de estudio
pueden coexistir en el medio natural. Al igual que ocurre con el visón americano, la
endonucleasa de restricción Msp I al no encontrar la secuencia diana, no produce
ningún corte en el DNA amplificado de nutria, marta y garduña. De esta manera, los
excrementos de estas tres especies pueden ser diferenciados con respecto a los del
visón europeo o turón por esta endonucleasa de restricción. Además, los patrones de
restricción que se han generado con el enzima Rsa I son diferentes a los ya obtenidos
para turón, y visón europeo y americano. La marta y la garduña tienen dos puntos de
corte, es decir, un patrón de restricción con tres fragmentos generados, mientras que
la nutria tan sólo muestra un lugar de restricción.
Con posterioridad al desarrollo de este método, se ha publicado otro
alternativo para identificar muestras de excrementos depositados por estas tres
especies de mustélidos basados en el análisis del DNA nuclear (López-Giráldez et al.,
2005). Esta técnica emplea las diferencias en las secuencias de inserción o elementos
de secuencia de inserción cortos de DNA repetitivo (Short Interspersed Nuclear
Element SINE) de la región flanqueante del microsatélite Mel08 para identificar
D ISCUSIÓN 143
especies. La longitud de esta región es doble en visón americano que en visón
europeo o en turón, por lo que puede ser discriminado fácilmente aplicando tan sólo
un paso de PCR. Por el contrario, el visón europeo se diferencia del turón por mostrar
un patrón de restricción diferente al que presenta este último tras la digestión del
producto de PCR con el enzima Aci I. Así, el turón, al presentar dos lugares de
restricción reconocibles por el enzima Aci I, se puede diferenciar de forma sencilla del
visón europeo tras un proceso de digestión enzimática. El primero mostrará tres
fragmentos de restricción mientras que el fragmento amplificado del último no será
digerido.
4.2 Var iabi l idad y Estructura Genét ica del Visón
Europeo
La aplicación de técnicas y marcadores moleculares se ha convertido en una
herramienta indispensable en el desarrollo de cualquier programa de conservación
(Frankham, 2002). En las últimas décadas, el avance teórico, técnico y analítico ha
proporcionado información muy útil para la elaboración de estrategias de gestión que
se ajustan de manera adecuada para cualquier especie que se desee preservar
(Selkoe, Toonen, 2006; Silva, Russo, 2000). Los microsatélites son los marcadores
moleculares más populares. Se trata de herramientas moleculares que, dada su
variabilidad, proporcionan numerosas ventajas a la hora de examinar los patrones de
diversidad y estructura genética de las poblaciones. También son muy útiles para
determinar tasas de migración y flujo génico, así como para establecer el tamaño
poblacional. Además, permiten conocer la historia demográfica de las especies y
determinar diversos factores que han afectado a las poblaciones como los cuellos de
botella, entre otros (Selkoe, Toonen, 2006). Para ello, es necesario que los
microsatélites que sean polimórficos en las poblaciones a analizar. Varios estudios se
han orientado al aislamiento y caracterización de marcadores específicos de especie
en mustélidos (Beheler et al., 2005; Carpenter et al., 2003; Dallas, Piertney, 1998;
Davis, Strobeck, 1998; Fleming et al., 1999; Huang et al., 2005; Jordan et al.,
2007). Gracias a estos trabajos, se cuenta con un número adecuado de
microsatélites polimórficos que proporcionen información necesaria para mejorar y
optimizar las estrategias de conservación de varias especies de mustélidos.
144 CAPÍTULO 4
La librería genómica construida durante el transcurso de esta tesis para el
visón europeo (artículo II) ha proporcionado diversos microsatélites altamente
polimórficos con los que realizar los subsiguientes análisis genéticos. Esta librería
genómica se llevó a cabo según los protocolos descritos por Hamilton et al. (1999) y
Ostrander et al. (1992). Después de un arduo procedimiento metodológico, se
obtuvieron 153 secuencias, de las que tan sólo 26 mostraron, finalmente, las
repeticiones dinucleotídicas GT. Se diseñaron primers específicos para cada uno de
estos microsatélites y tras los análisis de genotipado se comprobó que sólo 8
resultaron ser polimórficos: MLUT04, MLUT08, MLUT15, MLUT20, MLUT25, MLUT27,
MLUT32 y MLUT35.
La mayoría de estos marcadores han amplificado de forma satisfactoria en
otras especies de mustélidos como por el ejemplo en visón americano, turón, armiño
Mustela erminea, comadreja M. nivalis, marta europea Martes martes o garduña M.
foina. Así pues, estos nuevos microsatélites pueden ser empleados también en los
estudios de estas especies, además de constituir una herramienta muy apropiada
para identificar los fenómenos de hibridación que caracterizan a varias de estas
especies (Davison et al., 2001; Davison et al., 1999; Davison et al., 2000a; Kyle et
al., 2003).
4 .2 .1 D ive rs idad genét i ca de l as pob lac iones de v i són
europeo
Los análisis realizados durante esta tesis doctoral cubren, aproximadamente, la
distribución completa un área geográfica hasta ahora no estudiada con tanto detalle
en trabajos anteriores (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004). Gracias al
extenso rango geográfico cubierto, se han podido realizar diversos análisis agrupando
los individuos en relación con su procedencia geográfica. Estas agrupaciones se
corresponden con las regiones del este (noreste: Rusia, Bielorrusia y Estonia;
sureste: Rumania) y oeste (Francia y España) de Europa. Por otro, se ha analizado
cómo se distribuye la diversidad genética a través de los ríos europeos con presencia
de la especie, agrupando los individuos según la distribución de las cuencas
hidrográficas, del este (noreste: ríos Severnaya o Dvina norte, Volga y Zapadnaya o
Dvina oeste; sureste: río Danubio) y del oeste (ríos Charente, Garona y Adour en
Francia y río Ebro y ríos de la vertiente cantábrica en la península Ibérica). Asimismo,
D ISCUSIÓN 145
los análisis se han realizado con un mayor número de marcadores moleculares,
incluyendo tanto los microsatélites específicos de visón europeo, desarrollados
durante el transcurso de esta tesis (artículo II), como los elaborados para otros
mustélidos, y que anteriormente fueron aplicados en visón europeo por Michaux et
al. (2005).
Los resultados de diversidad genética del visón europeo (artículo III), tanto en
lo relativo al DNA nuclear (A: 5.818; HO = 0.430; HE = 0.578) como mitocondrial (π:
0.005 ± 0.003; h: 0.857 ± 0.014), han sido similares a los obtenidos anteriormente
por otros autores (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004; Peltier, Lode, 2003).
Así, se han confirmado los bajos niveles de variabilidad genética de la especie en
todo su rango de distribución. En cuanto al DNA mitocondrial, los valores de
diversidad genética inferidos han sido similares a los obtenidos para otras especies
de mustélidos consideradas no amenazadas por la IUCN, como por ejemplo, el turón
(h=0,876 y π=0,00274; Pertoldi et al., 2006) o el tejón Meles meles (h=0,9 y
π=0,008; Marmi et al., 2006). No obstante, estos valores han sido mayores que los
hallados para especies catalogadas en peligro, como por ejemplo, la nutria marina
Enhydra lutris (h=0,412 y π=0.00098; Larson et al., 2002). Por otra parte, en lo
relativo a los resultados de microsatélites, las poblaciones de visón europeo han
presentado valores de variabilidad genética comparables a los hallados para
diferentes especies de mustélidos clasificados por la IUCN como no amenazados,
como la nutria (HE=0,74 HO=0,55; Randi et al., 2003), el tejón (HE=0,43-0,64
HO=0,38-0,59; Pope et al., 2006), el visón americano (HE=0,61; O'connell et al.,
1996), la marta (HE=0,53; Kyle et al., 2003) o el glotón Gulo gulo (HE=0,347-393
HO=0,347-376; Walker et al., 2001). De forma similar a los resultados del DNA
mitocondrial, la variabilidad genética obtenida en los estudios con microsatélites, ha
sido mayor que la obtenida para otras especies de mustélidos consideradas en
peligro, como por ejemplo, el turón de patas negras Mustela nigripes (HE=0,38
HO=0,35; Wisely et al., 2003) o la nutria marina (HE=0,426 HO=0,433; Larson et al.,
2002).
Los mayores valores de variabilidad genética se han encontrado en las
poblaciones de visón europeo de la región oriental, tanto a nivel de DNA mitocondrial
como nuclear. Concretamente, la población del noreste de Europa ha resultado ser la
más polimórfica, confirmando la pauta mostrada anteriormente para las poblaciones
de visón europeo de Europa del este (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004).
Por el contrario, se constata la escasa variabilidad genética (artículo III, tablas 1 y 4)
146 CAPÍTULO 4
encontrada en las localidades de Europa occidental, de acuerdo con las publicaciones
previas (Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004). Esta variabilidad es incluso
menor que la obtenida para otras especies de mustélidos (Marmi et al., 2006;
Pertoldi et al., 2006). De igual manera, los mayores valores de variabilidad genética
se obtuvieron en las regiones del este cuando los individuos fueron agrupados por
cuencas hidrográficas. Los ríos del noreste de Europa se han caracterizado por
presentar los mayores valores de diversidad genética. Este mismo patrón de
distribución de la diversidad genética, con las poblaciones más polimórficas situadas
en el este de Europa, también se ha encontrado en otras especies de mustélidos,
como el turón o el tejón (Marmi et al., 2006; Pertoldi et al., 2006; Pope et al., 2006).
4 .2 .2 H i s to r i a demográ f i ca de l as pob lac iones
La diversidad genética de las especies puede verse seriamente disminuida por
eventos como cuellos de botella o un efecto fundador (Frankham, 2002; Lowe et al.,
2004). Los efectos que tienen sobre la variación en las frecuencias alélicas y sus
consecuencias son similares si las poblaciones atraviesan por un evento u otro. Las
poblaciones que han atravesado un cuello de botella han sufrido un descenso drástico
del tamaño poblacional, seguida de una expansión demográfica. El efecto fundador
indica que una población se establece a partir de un número muy reducido de
individuos iniciales (Frankham, 2002). Estos procesos conllevan problemas de
pérdida de la variación genética, de incremento de las tasas de endogamia y de
pérdida del potencial evolutivo de las especies (Cornuet, Luikart, 1996). Es por ello
importante identificar la existencia de estos fenómenos, sobretodo a la hora de
conservar y preservar especies raras o amenazadas, con el fin de elaborar
estrategias de gestión adecuadas que disminuyan el riesgo de extinción que resulta
de estos procesos (Cornuet, Luikart, 1996; Ramey II et al., 2000).
Los resultados no significativos de los diversos test de neutralidad (test D de
Tajima (1989); test Fs de Fu (1997); test R2 (Ramos-Onsins, Rozas, 2002))
realizados a nivel de DNA mitocondrial han indicado que las poblaciones de visón
europeo no han mostrado signos de expansión (artículo III). No sólo no hay
evidencia de expansión poblacional sino que el exceso de heterocigotos detectado a
nivel nuclear según el Wilcoxon signed rank test sugiere que, a nivel global, las
poblaciones de visón europeo han sufrido un proceso de cuello de botella reciente.
D ISCUSIÓN 147
Esto concuerda con el declive demográfico del visón europeo sufrido desde mediados
del siglo XIX (Youngman, 1982).
4 .2 .3 Es t ruc tu ra gené t i ca
La distribución geográfica que presentan las poblaciones de cualquier especie, su
estructuración genética y el tamaño poblacional actual, son el resultado de la acción
conjunta de diversos factores, tales como los eventos históricos y las adaptaciones
ecológicas, propias de cada especie (Frankham, 2002). Además, son también el
resultado de otros factores de origen fundamentalmente antrópico, como la
persecución directa, la alteración del hábitat o la introducción de especies exóticas
que pueden llegar a poner en peligro de extinción a la especie, tal y como ha ocurrido
con el visón europeo (Maran et al., 1998b; Youngman, 1982). Para elaborar planes
de gestión adecuados dirigidos a la conservación de especies amenazadas es preciso
conocer qué factores históricos han originado los patrones actuales de estructuración
genética de las poblaciones, así como aquellos otros que están actuando en el
momento presente.
Los diferentes análisis que se han llevado a cabo para conocer la
estructuración genética en visón europeo (comparaciones pares de FST, AMOVA y
agrupamiento bayesiano) han coincidido en rechazar la hipótesis nula de panmixia,
como cabría esperar para poblaciones residentes en localidades que se encuentran
tan aisladas unas de otras (artículo III).
Las localidades del oeste, noreste y sudeste de Europa se encuentran
significativamente diferenciadas entre sí, tal y como han indicado los valores de ΦST y
FST obtenidos con datos de DNA mitocondrial y nuclear, respectivamente (artículo
III). Ello sugiere que ha existido un bajo flujo génico entre estas regiones geográficas
analizadas. No obstante, el grado de diferenciación genética detectado ha sido
distinto a nivel mitocondrial y nuclear, lo que puede ser debido a las diferentes tasas
de mutación que caracterizan a estos dos tipos de marcadores genéticos (Allendorf,
Luikart, 2007; Avise, 1994). Valores similares de RST y FST, obtenidos a partir de
datos de microsatélites, indicarían que la diferenciación genética detectada puede ser
explicada, mayoritariamente, por un proceso de deriva génica en lugar de por la
aparición de nuevas mutaciones (Balloux, Lugon-Moulin, 2002; Reynolds et al.,
1983). En cualquier caso, los valores de RST y FST obtenidos deben tomarse con
148 CAPÍTULO 4
cautela ya que pueden estar influidos por la combinación de diferentes factores,
como por ejemplo, procesos de fragmentación poblacional, de cuellos de botella o de
deriva génica. La estima de estos estadísticos puede estar sobrevalorada, sobretodo,
cuando hay un bajo nivel de flujo génico entre las poblaciones (Frankham, 2002;
Lagercrantz, Ryman, 1990; Zhivotovsky, 2001).
Aunque los análisis de AMOVA soportan estadísticamente la diferenciación
genética entre las regiones europeas donde se encuentra el visón europeo, no se ha
detectado estructuración geográfica significativa entre ellas. La mayor parte de la
variación genética se encuentra distribuida entre y dentro de las localidades
muestreadas.
El alto porcentaje de asignación obtenido tras los análisis de agrupamiento
Bayesiano ha revelado la existencia de, al menos, dos unidades genéticas principales
en visón europeo, definidas por las regiones del este y oeste de Europa. A su vez,
cada uno de estos dos grupos se encuentra subdividido: la región del este en las
localidades del norte y sur, y la región del oeste en la de Francia y en la de la
Península Ibérica. Estos resultados se encuentran también reflejados en el análisis
factorial de correspondencias realizado.
Las redes de haplotipos y los métodos de reconstrucción filogenética han
puesto de manifiesto la presencia de una ligera estructuración geográfica entre las
regiones del oeste, noreste y sudeste de Europa. La ausencia de relaciones
filogenéticas bien soportadas entre los haplotipos de visón europeo, así como la
existencia de haplotipos internos (ancestrales) de alta frecuencia conectados a nodos
externos (haplotipos recientes) por ramas con un solo evento mutacional, puede
explicarse por una reciente divergencia de las poblaciones y/o por la presencia de
altos niveles de extinción local.
4 .2 .4 Cont r i buc ión de d ive rsos fac to res a l a es t ruc tu ra
genét i ca de l as pob lac iones de v i són europeo
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral (artículo III) respaldan la hipótesis de
la posible supervivencia de la especie durante la última glaciación en refugios de la
región del noreste de Europa, localizados en la zona del curso alto del Volga (Michaux
et al., 2005; Michaux et al., 2004). Especies como, por ejemplo, el abeto rojo Picea
D ISCUSIÓN 149
abies (Lagercrantz, Ryman, 1990), la rana de los pantanos Rana arvalis (Babik et al.,
2004) o el tipógrafo o barrenillo grande del abeto Ips typographus (Stauffer et al.,
1999) también han presentado refugios glaciales situados en zonas del noreste y sur
de Europa (o Eurasia), en áreas cercanas a Moscú, la región del Cáucaso, el sur de
los montes Urales, Crimera o Turquía. Ello ha permitido reconocer áreas de refugio
glacial alternativas a las más comúnmente descritas, situadas en la cuenca
mediterránea, como son las penínsulas Ibérica, Itálica, y Balcánica (Bilton et al.,
1998; Hewitt, 1999; Randi, 2007; Taberlet, 1998). A partir de estas áreas de refugio
se produjeron diferentes procesos de colonización postglacial, mediante los cuales
tuvo lugar la expansión a través de diferentes rutas de colonización hacia nuevas
áreas tras el retroceso de los hielos. A pesar de que los restos prehistóricos de visón
europeo son escasos, existen algunos datados entre la última glaciación del
Pleistoceno y el Holoceno. Estos restos se han encontrado en diferentes regiones de
Rusia (distrito de Moscú), Estonia, Letonia o Polonia (Biskupin) (Davison et al.,
2000b; Sommer, Benecke, 2004; Youngman, 1982), lo que apoya de forma
independiente la existencia del mencionado refugio glacial en el noreste de Europa.
Además, la presencia de tundra y estepas durante el final del periodo glacial Würm
(periodo equivalente a Valdai) pudieron facilitar la supervivencia del visón europeo en
el norte de Europa (Simakova, 2006; Velichko, 1995). Asimismo, otros hallazgos de
visón europeo del Holoceno localizados en diferentes zonas de Ucrania y Holanda
pueden respaldar la expansión posterior hacia las regiones del centro Europa
(Davison et al., 2000b; Sommer, Benecke, 2004). No obstante, no se puede
descartar la posibilidad de considerar el sudeste de Europa como otro refugio glacial
dado que también se han encontrado restos antiguos de visón europeo en el
yacimiento de la cueva La Adam en Rumania, datado como perteneciente al periodo
Würm superior (Davison et al., 2000b). La alta frecuencia del haplotipo Mlh8 en esta
región apoyaría esta hipótesis.
Por lo tanto, la estructura genética del visón europeo es compatible con la
teoría del refugio glacial (Hewitt, 1996; Hewitt, 1999), la cual señala que los cambios
climáticos han afectado en menor grado al polimorfismo genético de aquellas
poblaciones que han sobrevivido en las zonas de refugio durante las épocas glaciales.
Considera además, que los fenómenos de rápida expansión de las especies podrían
haber comprendido procesos de cuellos de botella continuados, que derivan en una
pérdida progresiva de diversidad alélica. Esto daría como resultado una reducción de
la variabilidad genética desde las áreas refugio, caracterizadas por niveles de
diversidad genética más altos, hacia las regiones que han sido colonizadas más
150 CAPÍTULO 4
recientemente. Sin embargo, no siempre se cumple este supuesto. Existen diferentes
factores (el número de individuos fundadores, la existencia de contactos secundarios,
la acción humana etc) que pueden alterar los niveles de diversidad genética de la
áreas de refugio glacial y dificultar su detección (Achere et al., 2005; Avise, 2000;
Bernatchez, Wilson, 1998; Nieberding et al., 2006). En estos casos, las poblaciones
asentadas en los refugios glaciales podrían no presentar los mayores niveles de
diversidad molecular (Hewitt, 1996).
Por otro lado, diversas perturbaciones causadas por factores antrópicos, como
la alteración del hábitat, la sobreexplotación de las poblaciones o la introducción de
especies exóticas (Maran et al., 1998b), parece que están incidiendo negativamente
en la supervivencia del visón europeo y han podido influir de forma notable en la
estructuración y en la distribución de la variación genética actuales del visón
europeo. Estos factores han contribuido a disminuir de forma considerable el tamaño
poblacional de visón europeo y, en consecuencia, es posible que hayan contribuido a
reducir también su diversidad genética, particularmente en la población del sudeste
y, quizás también en las del oeste de Europa (Youngman, 1982). La región del
noreste de Europa, por su mayor extensión geográfica parece estar menos afectada
por el drástico descenso poblacional, lo que concuerda con sus niveles de diversidad
genética más altos.
La presencia de visón europeo en la región de Europa occidental ha sido objeto
de un gran debate en el último siglo debido a la controversia surgida entorno a su
origen (Youngman, 1982). Los bajos niveles de diversidad genética poblacional así
como la presencia de un único haplotipo de DNA mitocondrial que caracteriza a esta
región, puede ser el resultado tanto de una rápida expansión de la especie desde
Europa del este, seguida de su extinción en Europa central, o bien, a una
introducción del visón europeo en Francia debida a la acción humana. Varios estudios
han constatado la gran capacidad de migración que tiene el visón europeo, lo que
habría podido contribuir a la colonización de áreas situadas a gran distancia (Palazón,
1993; Youngman, 1982). Recientemente, se han registrado movimientos de
individuos de la especie de alrededor de 50km en Alemania (Pödra, M., com. per.).
Aunque el visón europeo puede desplazarse a largas distancias, generalmente, este
comportamiento se encuentra relacionado con el periodo reproductor y ligado a un
número restringido de individuos cuando los animales están intentando encontrar
pareja, de manera que podría apoyar la hipótesis propuesta por Michaux et al.
(2005). Según estos autores, el escaso polimorfismo que presenta la población
D ISCUSIÓN 151
occidental de visón europeo podría ser consecuencia, por un lado, de una
colonización de tipo leptocúrtico (Ibrahim et al., 1996; Michaux et al., 2005; Michaux
et al., 2004), de modo que los ejemplares colonizadores se encontraran ya
empobrecidos genéticamente por un cuello de botella previo. Por el contrario, otra
posible explicación, es la introducción antrópica de unos pocos ejemplares en Francia.
En ambos casos, el escaso polimorfismo se debería a un efecto fundador,
posiblemente seguido de un posterior empobrecimiento por deriva génica. La
extinción de la especie de Europa central dificulta la posibilidad de discernir entre las
dos hipótesis planteadas.
4.3 Procesos de Hibr idación entre e l Visón
Europeo y e l Turón
La hibridación es un hecho bastante común entre especies estrechamente
emparentadas (Allendorf et al., 2001). Como proceso natural que es, ha jugado un
papel muy importante en la evolución de numerosas especies, sobretodo en plantas
(Arnold, Hodges, 1995; Wirtz, 1999). No obstante, la hibridación supone, en muchos
casos, un inconveniente añadido en la elaboración de planes de conservación de
especies ya que genera numerosos problemas a la hora de desarrollar y establecer
las medidas de gestión específicas (Allendorf et al., 2001; Davison et al., 2000a).
Estos problemas están relacionados con la dificultad de definir el término de especie
y establecer qué es hibridación, de detectar los individuos híbridos, así como, de
conocer los efectos que tiene la hibridación en las poblaciones de las especies
afectadas (Allendorf et al., 2001). Por otro lado, fenómenos tales como la alteración
o modificación del hábitat o la disminución de los efectivos poblacionales de una
especie, entre otros, pueden incrementar su frecuencia y su impacto negativo sobre
especies amenazadas (Rhymer, Simberloff, 1996).
La mayoría de los estudios de hibridación se han basado en el análisis de los
caracteres fenotípicos (Arnold, Hodges, 1995; Rhymer, Simberloff, 1996). Sin
embargo la detección de individuos híbridos mediante el estudio exclusivo de la
morfología no está exenta de problemas. Se asume que los híbridos muestran
características intermedias entre las especies parentales, aunque puede existir una
gran diversidad de morfologías variables en las especies parentales (Allendorf et al.,
2001). Además los híbridos de segunda y posteriores generaciones pueden no
152 CAPÍTULO 4
mostrar los caracteres intermedios distintivos, lo que dificulta aún más la
identificación de los híbridos mediante la morfología. El progreso y la mejora de las
técnicas moleculares en los últimos años ha proporcionado herramientas muy
eficaces no sólo para la detección de los híbridos, sino también para determinar la
dirección del fenómeno de la hibridación, permitiendo discernir si se produce de
forma recíproca o unidireccional (Allendorf et al., 2001; Rhymer, Simberloff, 1996).
Así pues estos métodos moleculares resultan muy útiles para cuantificar el grado de
hibridación e introgresión genética que presentan las poblaciones y para desarrollar
las medidas de gestión adecuadas para conservar las especies que se encuentran
afectadas por este fenómeno (Barilani et al., 2007; Muñoz-Fuentes et al., 2007;
Oliveira et al., 2008; Soland-Reckeweg et al., 2008; Verardi et al., 2006).
Dentro de la familia Mustelidae se conocen varios casos de hibridación
interespecífica, todos ellos considerados como un riesgo para la integridad de las
poblaciones naturales, tal como es el caso de la hibridación entre el turón y el hurón
Mustela furo (Davison et al., 1999), el visón americano y el visón europeo (Davison
et al., 2000a; Ternovsky, 1977) o la marta europea y la marta cibelina Martes
zibellina (Davison et al., 2001). Por otro lado, aparte de la hibridación interespecífica,
el cruzamiento entre poblaciones distintas dentro de una misma especie es un
fenómeno que también se produce dentro de la familia Mustelidae y que puede tener
efectos negativos para la conservación. Recientemente, se ha puesto de manifiesto
que el cruzamiento entre las poblaciones salvajes de visón americano en Canadá y
las poblaciones asilvestradas procedentes de escapes de granjas de ría es un factor
de amenaza adicional que sufren las poblaciones naturales de visón americano (Kidd
et al., 2009).
La presencia de individuos con características morfológicas intermedias entre
el visón europeo y el turón, tanto en el hábitat natural de las especies como en
cautividad, ha sido advertida con anterioridad por diferentes autores mediante el
estudio del fenotipo (Maran et al., 1998b; Sidorovich, 2001; Ternovsky, 1977). En
cautividad se han observado, además, individuos descendientes de la primera
generación de retrocruzamiento entre individuos híbridos F1 con ejemplares puros de
turón (Ternovsky, 1977).
D ISCUSIÓN 153
4.3 .1 Pues ta a punto de marcadores mo lecu la res para
de tec ta r h íb r idos en t re v i són europeo y tu rón
Una primera aproximación en estudios de hibridación mediante marcadores
moleculares se basa en identificar haplotipos específicos de especie bien de DNA
mitocondrial o del cromosoma Y, si se trabaja con marcadores uniparentales, o de
alelos específicos si se emplean los marcadores biparentales (Rhymer, Simberloff,
1996). Para establecer la dirección de la hibridación es fundamental analizar
marcadores uniparentales dado que al heredarse por vía exclusivamente materna
(DNA mitocondrial) o paterna (cromosoma Y) permite conocer cómo se han
producido los cruces entre las especies o si uno de ellos es más frecuente que otro o
qué tipo de barreras de aislamiento reproductivo se están originando (Allendorf et
al., 2001). Sin embargo los estudios realizados exclusivamente con marcadores
uniparentales tienen sus limitaciones sobretodo dificulta la clasificación de los
híbridos dentro de cada una de las categorías híbridas (Rhymer, Simberloff, 1996).
La aplicación de marcadores biparentales, como por ejemplo los microsatélites,
permite detectar los híbridos de forma más efectiva y segura. Además el desarrollo
de nuevos programas informáticos que emplean datos obtenidos a partir del genotipo
de marcadores biparentales y que están basados en métodos bayesianos ha
aumentado la resolución estadística y aplicabilidad de estos estudios (Randi, 2008).
Los métodos más empleados son las aproximaciones bayesianas desarrolladas por
Pritchard et al. (Falush et al., 2003; Pritchard et al., 2002; Pritchard et al., 2000) y
Anderson y Thompson (Anderson, Thompson, 2002), mencionados en el apartado de
Análisis Genéticos (sección 1.5.5) del Capítulo 1 de esta tesis doctoral (Lecis et al.,
2008; Randi, 2008; Streiff et al., 2005).
Con respecto a la hibridación interespecífica entre el visón europeo y el turón,
se ha podido confirmar que la aplicación de los marcadores desarrollados,
uniparentales y microsatélites, es muy eficaz. A pesar de la baja variabilidad
encontrada a nivel de DNA mitocondrial en estas dos especies de mustélidos
(Michaux et al., 2005; Michaux et al., 2004; Pertoldi et al., 2006), los análisis
realizados mediante procedimientos Bayesianos y de análisis de distancias (NJ) han
establecido la presencia de dos clados diferentes (artículo IV): el Clado I, donde
quedan agrupados todos los visones europeos analizados y el Clado II, que reúne a la
casi totalidad de los ejemplares identificados morfológicamente como turones (93%;
N=41). Sólo tres de los individuos identificados por su fenotipo como turón (Ind_318
154 CAPÍTULO 4
a Ind_320) se han agrupado dentro del Clado I, que corresponde a la especie visón
europeo (artículo IV, figura 1). Un alto porcentaje (73%; N=11) de los ejemplares
considerados como posibles híbridos han presentado secuencias de DNA mitocondrial
atribuidas a visón europeo, lo que confirma que el origen materno de estos
individuos corresponde a la especie de visón europeo.
Por otro lado, varios estudios han revelado unos niveles de variabilidad
genética muy reducidos en el cromosoma Y de mamíferos (Hellborg, 2004; Hellborg,
Ellegren, 2004). A pesar de ello, se han encontrado tres nucleótidos específicos de
especie para visón europeo y turón, respectivamente, al comparar las secuencias
nucleotídicas del marcador estudiado DBY5. Estas diferencias han permitido certificar
que el origen paterno de los ejemplares macho considerados como posibles híbridos
por sus características morfológicas intermedias, corresponde a la especie turón. Sólo
un individuo macho (Ind_432; artículo IV), clasificado como posible híbrido, ha
presentado una secuencia nucleotídica del cromosoma Y característica de la especie
visón europeo. Sin embargo cabe señalar que se ha confirmado que este ejemplar
es, en realidad, un visón europeo puro, lo que se ha confirmado tanto por los datos
del genoma nuclear como mitocondrial.
Con respecto a los marcadores microsatélites, se ha observado que un alto
porcentaje de las muestras analizadas (97%; N=432) pertenecen, de forma íntegra,
a las especies visón europeo o turón, respectivamente. Cinco individuos que fueron
considerados previamente como posibles híbridos han sido clasificados dentro de las
especies de visón (Ind_432) y turón (de Ind_433 a Ind_436) tras los análisis
genéticos (según los estudios de las secuencias de DNA mitocondrial y cromosoma Y,
y del genotipado mediante microsatélites), confirmando así su ascendencia pura,
tanto en la línea materna como en la paterna. Esto indica que pueden tomarse como
híbridos, ejemplares puros y que una morfología inusual, por sí sola no es
concluyente.
4 .3 .2 Cuant i f i cac ión de l a h ib r idac ión
En el caso que nos ocupa, la hibridación entre visón europeo y turón, la tasa de
hibridación detectada ha sido muy baja, lo que sugiere que el fenómeno de
hibridación entre estas especies es un hecho poco común (artículo IV), tal y como ya
había sido indicado anteriormente (Lodé et al., 2005). Sólo un 3% (N=14) de los
D ISCUSIÓN 155
individuos analizados han presentado porciones de genoma variables
correspondientes a ambas especies, tal y como revelan los resultados de los datos de
microsatélites y de secuenciación del DNA mitocondrial y del cromosoma Y (Tabla 1;
artículo IV). La mayoría de los ejemplares genéticamente detectados como individuos
híbridos se asignan a la categoría de híbridos de primera generación (F1), los cuales
resultan del cruce entre una hembra de visón europeo y un macho de turón. Otros
tres ejemplares son incluidos con una alta probabilidad en la categoría de individuos
resultantes del retrocruzamiento entre un híbrido F1 y la especie parental turón. Un
cuarto ejemplar fue asignado a esta ultima categoría con una menor probabilidad.
En cuanto a la correlación entre identificación morfológica y genética, un alto
porcentaje (67%; N=10) de individuos identificados morfológicamente como híbridos
han sido correctamente asignados a diferentes categorías de híbridos tras los análisis
genéticos. Esto indica que los ejemplares híbridos muestran un patrón de
características fenotípicas intermedias a las dos especies de mustélidos fácilmente
reconocibles. A pesar de esto, un 33% (N=5) de los individuos reconocidos como
híbridos mediante el fenotipo, han resultado pertenecer a una de las dos especies
parentales, lo que sugiere que existe un patrón morfológico inusual que puede
dificultar la identificación de híbridos basándose exclusivamente en las características
morfológicas. Por otro lado, hay que destacar que, un 29% (N=4) de los individuos
que han sido confirmados genéticamente como híbridos no fueron reconocidos
morfológicamente como tales. Esto pone de manifiesto que existe un cierto grado de
hibridación críptica no reconocible a través de la morfología, lo que puede subestimar
el fenómeno de la hibridación que está teniendo lugar entre estas dos especies de
mustélidos. Estos individuos que no manifiestan el patrón de morfología típica (color
y tamaño intermedios a las dos especies) asociada a los híbridos se corresponden,
generalmente, con animales jóvenes subadultos, de ahí que su estatus híbrido sea
difícil de detectar por el fenotipo (López de Luzuriaga, J. y Maran, T., com. pers.).
Los análisis genéticos que se han llevado a cabo sustentan, no sólo, la
viabilidad en el estado salvaje de los híbridos F1 y de los individuos procedentes de la
primera generación de retrocruzamiento, sino también, la fertilidad de los primeros,
lo que sugiere que el aislamiento genético entre estas dos especies del mismo género
no es completo. En otras palabras, las barreras de aislamiento reproductivo entre el
visón europeo y el turón no son del todo efectivas. Por el contrario, sí se han
observado anomalías embrionarias en los cruces entre el visón europeo y el
americano, que pertenecen a dos géneros distintos. Estas anomalías están
156 CAPÍTULO 4
relacionadas con los mecanismos que conllevan a la inviabilidad y reabsorción del
embrión híbrido en sus primeras etapas del desarrollo (Rozhnov, 1993).
En referencia a los nuevos datos que se aportan en esta tesis se puede
considerar que el fenómeno de hibridación entre visón europeo y turón se produce en
una única dirección. Los resultados obtenidos mediante los estudios de DNA
mitocondrial, de herencia materna, y del cromosoma Y, de herencia paterna,
respaldan que el cruce tiene lugar entre visones europeos hembra con individuos
macho pertenecientes a al especie turón. Esta afirmación se basa en que todos los
híbridos F1 que han sido detectados han mostrado secuencias de DNA mitocondrial
de visón europeo y secuencias de cromosoma Y de turón. Por el contrario, no se ha
encontrado ningún indicio sobre el cruzamiento contrario, es decir, que la hibridación
no es recíproca. La ausencia de híbridos F1 con DNA mitocondrial de turón y
cromosoma Y de visón europeo podría estar asociada con la existencia de barreras de
aislamiento reproductivo, como por ejemplo, mecanismos de aislamiento sexual o
etológico entre los individuos de estas dos especies de mustélidos. Las hembras de
turón tienen tamaños corporales similares o mayores que los visones europeo
macho, lo que podría hacer que las hembras de turón rechacen a los machos de
visón europeo (Coyne, Allen Orr, 2004; Wirtz, 1999). Este mismo tipo de hibridación
(hibridación unidireccional) se ha observado entre turones y hurones (Davison et al.,
1999). Los turones macho, que muestran mayores tamaños corporales, se aparean
con hurones hembra de menor tamaño. Esto apoyaría la posibilidad de considerar al
tamaño corporal de las especies como un impedimento (factor limitante) importante
en el apareamiento de los individuos de las diferentes especies, y por tanto, de que
tenga lugar un tipo de cruce y no el otro. No obstante, no se descarta la existencia
de otros tipos de aislamiento reproductivo tanto precigóticos como postcigóticos
(Coyne, Allen Orr, 2004) que puedan tener lugar entre los machos de visón europeo
y las hembras de turón.
Por otro lado, y de forma alternativa, la selección sexual se ha considerado
como la hipótesis que mejor explica el fenómeno de la hibridación unidireccional en la
mayoría de casos estudiados (Wirtz, 1999). La hipótesis de la selección sexual no
sólo explicaría la alta incidencia de casos de hibridación unidireccional sino que,
también, predice que la dirección se produce siempre en el mismo sentido, es decir,
que “la especie materna” (the mother species;Wirtz, 1999) se corresponde con las
hembras de la especie menos abundante. Trasladando este supuesto al caso de
estudio de hibridación entre el visón europeo y turón y, en función de los resultados
D ISCUSIÓN 157
obtenidos, se puede considerar que serían las hembras de turón las que rechazarían
a los machos de visón europeo. De igual forma harían, en un principio, las hembras
de visón europeo, aunque al no encontrar machos de su misma especie podrían
finalmente aceptar aparearse con machos de turón. No obstante, se desconocen
datos concretos acerca de la abundancia del turón que permitan apoyar la hipótesis
de la selección sexual como hipótesis que mejor explica la hibridación unidireccional
que tiene lugar entre estas dos especies de mustélidos (Blanco, 1998b; Zuberogoitia
et al., 2001).
Entendiendo la introgresión genética como la introducción del material
genético de una especie en otra (Frankham, 2002), se puede considerar que no llega
a producirse una introgresión genética entre el visón europeo y el turón. En relación
a los resultados obtenidos, la hibridación interespecífica queda limitada a la
producción de híbridos de primera generación (F1) y al retrocruzamiento de
individuos F1 con individuos puros de la especie parental turón. No se ha encontrado
ningún caso de apareamiento entre un híbrido F1 con un ejemplar puro de la especie
parental visón europeo. Tampoco se han identificado casos de cruce entre dos
individuos F1.
A pesar del bajo número detectado de híbridos procedentes de
retrocruzamientos (N=4), todos ellos han presentado secuencias de DNA mitocondrial
que se corresponden con visón europeo, lo que sugiere que las hembras híbridas F1
son fértiles y se reproducen. No obstante, la baja densidad de estos híbridos puede
indicar, por un lado, que la fertilidad de estas hembras sea menor en comparación
con las hembras de la especie parental (turón), tal y como anteriormente sugirieron
Lodé et al. (2005). Por otro lado, podría estar relacionado con la baja frecuencia de
híbridos F1, de forma que a la dificultad de encontrar otro híbrido F1 se suma la
dificultad de encontrar un ejemplar de la especie parental con el que cruzarse.
Además, no hay evidencia de híbridos F2 descendientes del retrocruzamiento
entre híbridos F1 macho con turones hembra, lo que implicaría que estos híbridos F1
macho podrían ser estériles o bien tener una fertilidad reducida. De ser esto cierto,
se podría estar cumpliendo la regla de Haldane, la cual establece que, en la
descendencia híbrida (F1) de dos especies, los individuos heterogaméticos
(individuos macho XY en mamíferos) son raros, estériles o bien no existen (Coyne,
Allen Orr, 2004). Aunque también cabe la posibilidad de que se estén produciendo
otro tipo de barreras de aislamiento reproductivo diferentes, tales como las que
ocurren entre el visón europeo macho con el turón hembra. En este caso, el tamaño
158 CAPÍTULO 4
corporal de los híbridos F1 macho, al ser similar al de las hembras de turón, puede
resultar en un factor limitante significativo. Aún así, se requiere completar el estudio
con el análisis de un mayor número de muestras para confirmar o descartar estas
hipótesis planteadas.
En función de estos resultados, no parece que la integridad genética de
ninguna de las dos especies de mustélidos analizados, sobretodo la de turón, se
encuentre amenazada por problemas de hibridación. Se puede considerar que la
hibridación entre ambas es un fenómeno poco corriente y que no desemboca en una
introgresión genética. De todas formas, es necesario insistir en la importancia de
realizar más estudios que integren no sólo análisis genéticos sino también
observaciones sobre la biología y comportamiento de los híbridos para evaluar el
impacto que tienen los híbridos sobre las especies parentales, tanto de visón europeo
como de turón.
En relación con el origen y la localización de los ejemplares híbridos cabe
destacar que el 86% (N=12) de los individuos fueron capturados en diferentes
localidades de la región de Europa occidental. Una alta proporción (92%; N=11) de
estos híbridos han sido detectados en la cuenca mediterránea del río Ebro, lo que
podría indicar que las localidades ibéricas serían zonas potenciales de la presencia de
híbridos y donde se estarían produciendo factores especiales que favorecen el
cruzamiento entre el visón europeo y el turón. Por el contrario, tan sólo dos de los
ejemplares híbridos (14%) proceden de la región oriental. A pesar de la significativa
diferencia en proporción de híbridos presentes en ambas regiones, los resultados
obtenidos deben tomarse con mucha cautela ya que el esfuerzo de muestreo
realizado en las localidades de la región occidental de Europa fue mayor. De ahí que
los niveles de hibridación podrían estar sesgados y subestimados en el resto de
localidades. Un extenso esfuerzo de muestreo a través de las diferentes localidades
de Europa, particularmente de las poblaciones de turón en zonas de simpatría con
visón europeo, podrían incrementar ligeramente las proporciones de hibridación e
introgresión genética detectadas. Además, podría proporcionar información genética
adicional sobre la integridad genética de las poblaciones de turón.
D ISCUSIÓN 159
4.4 Estrategias de Conservación
4.4 .1 Mues t reos no invas ivos
Como ya se ha comentado anteriormente, las muestras no invasivas son una fuente
de información muy útil para la genética de la conservación ya que no requiere
manipular directamente a los animales. De esta manera se reduce mucho el riesgo
que supone la captura de las especies o la interferencia con ellos (Waits, Paetkau,
2005). Las aplicaciones del muestreo no invasivo son muy importantes para el
seguimiento genético de las especies y proporciona información adicional muy
conveniente para elaborar estrategias de conservación específicas para cada caso
(Schwartz et al., 2007). Por un lado, permiten detectar la presencia de especies y su
interacción con especies simpátricas. Además, permiten identificar individuos y, en
consecuencia, hacer un seguimiento de sus desplazamientos, así como inferir datos
sobre su densidad y abundancia. También pueden aplicarse a conocer el porcentaje
de machos y hembras que forman las poblaciones de una especie en una región
concreta. Permiten, también, conocer los hábitos alimenticios de las especies
(Adams, Waits, 2007; Dallas et al., 2003; Fernandes et al., 2008; Frantz et al.,
2006; Sastre et al., 2009; Solberg et al., 2006). Por otro lado, permiten investigar la
diversidad y la estructura genética de las poblaciones de la especie estudiada
(Goossens et al., 2004; Iyengar et al., 2005; Piggott et al., 2006; Schwartz et al.,
2007; Waits, Paetkau, 2005).
El muestreo no invasivo puede suponer una alternativa efectiva a las técnicas
de trampeo que se realizan actualmente para conocer la distribución y abundancia de
las tres especies de mustélidos mencionadas durante esta tesis doctoral, el visón
europeo, el visón americano y el turón. La combinación de las herramientas
moleculares con el muestreo no invasivo puede proporcionar información relevante
acerca de la interacción del visón europeo tanto con el visón americano como con el
turón, con los que vive en simpatría. Estos métodos pueden ser muy útiles para
identificar la presencia de visón europeo en áreas donde anteriormente no se
localizaba, en zonas de posible expansión de la especie. Asimismo, la aplicación de
esta metodología proporciona información referente a la interacción con el visón
americano, sobretodo en zonas de contacto entre esta especie y el visón europeo,
con el fin de realizar descastes de la primera para proteger a la última. Por otra
parte, puede ayudar a obtener información sobre las poblaciones del turón, especie
160 CAPÍTULO 4
de la que se desconocen datos sobre densidad y tamaño poblacional (Blanco, 1998b),
lo que a su vez contribuiría a revisar las medidas de gestión establecidas para este
mustélido.
Conviene mencionar que el estudio basado en el análisis de excrementos
puede ser muy práctico si se trabaja con visón americano o turón. La recogida de
excrementos, en este caso, se vería facilitada por el hecho de que ambas especies, a
diferencia del visón europeo, depositan los excrementos en zonas visibles y
accesibles o en letrinas, dado que, tanto el visón americano como el turón, realizan
un marcaje territorial (Blanco, 1998a). El visón europeo no comparte este
comportamiento. Como medida alternativa para el estudio del visón europeo se
podría plantear el uso de trampas de pelo con el fin de recoger muestras no
invasivas. El pelo que queda adherido en las trampas proporciona otra fuente
importante de muestras no invasivas (Mowat, Paetkau, 2002).
4 .4 .2 Manten im ien to de l po l imor f i smo genét i co
Uno de los mayores problemas de cara a la conservación del visón europeo es el
riesgo que conlleva el aislamiento, el reducido tamaño y el bajo polimorfismo
genético que caracteriza a sus poblaciones (Frankham, 2002). Para evitar en la
medida de lo posible el riesgo de extinción de la especie las estrategias y planes de
conservación deberían estar orientados a resolver los problemas que amenazan a las
poblaciones de visón europeo (Spielman et al., 2004). Por un lado, reducir las
presiones antrópicas ayudaría a recuperar a especie a corto plazo. Por el otro, la
supervivencia de la especie se podría garantizar, a largo plazo, manteniendo su
diversidad genética (Michaux et al., 2005).
En este sentido, la restauración de los hábitats de rivera fluviales, el
seguimiento de la enfermedad aleutiana (Mañas et al., 2001) y los programas de
descaste del visón americano, que se han llevado a cabo en algunos puntos con
presencia de visón europeo, son acciones de conservación muy importantes (Grupo
de Trabajo del Visón Europeo, 2005). Estas medidas de gestión, además de reducir
los factores de amenaza, proporcionan un medio natural óptimo para la recuperación
de la especie, ya que posibilita, entre otros, la conexión entre las diferentes
poblaciones que hayan quedado aisladas. El hecho de facilitar los movimientos
migratorios entre las diferentes poblaciones locales de las cuencas fluviales puede
D ISCUSIÓN 161
contribuir a evitar la pérdida de diversidad genética y los problemas derivados de
depresión por endogamia.
Otras actuaciones que se pueden realizar para conservar el polimorfismo
genético, sobre todo entre poblaciones aisladas y con bajo polimorfismo genético,
consisten en las traslocaciones de ejemplares (Frankham, 2002). No obstante, antes
de proceder a realizar actuaciones en este sentido, se debe tener la certeza de que
no conlleven riesgos que puedan ocasionar efectos contrarios a los perseguidos.
Entre estos riesgos, se deben considerar: 1-la posible transmisión de patologías para
los que una población es inmune, pero transmisora y la población de destino no está
inmunizada de igual manera; 2-la posibilidad de depresión por exogamia, debida a
adaptaciones ecológicas diferentes entre poblaciones tan distantes como la estepa
rusa y el ambiente mediterráneo ibérico, en referencia a la especie objetivo de
nuestros trabajos; y 3-la pérdida de poblaciones singulares desde el punto de vista
evolutivo (Frankham, 2002). En este sentido, los trabajos desarrollados dentro de
esta tesis, nos han permitido dar respuesta al punto 3 aquí enumerado. Todos los
estudios realizados, tanto mediante marcadores mitocondriales como mediante
microsatélites, coinciden en señalar que las diferencias genéticas interpoblacionales
son escasas. De hecho, las tres poblaciones de visón europeo han surgido,
posiblemente, a partir de la expansión de un único refugio glacial (Michaux et al.,
2005; presente trabajo), a partir del inicio de la última deglaciación, ocurrida hace
unos 16.000 años. Todo ello nos indica que estas poblaciones pueden ser
consideradas como una única ESU, tomando exclusivamente el criterio genético y
siguiendo la metodología propuesta por Crandall et. al. (2000): no podemos rechazar
la intercambiabilidad genética entre las diferentes poblaciones, ni en épocas pasadas,
ni en la época actual. De hecho, las diferencias genéticas interpoblacionales
observadas son el resultado de un aislamiento reciente, por lo que no parecen existir
problemas genéticos en las posibles traslocaciones entre poblaciones. En relación a
las adaptaciones ecológicas, el visón europeo es un mustélido ligado al medio fluvial
que no parece mostrar ninguna preferencia específica en las regiones geográficas
donde se distribuye (Michaux et al., 2005). Por lo tanto, tomando en consideración
los criterios genéticos y ecológicos, las tres poblaciones actuales de visón europeo
constituyen una única ESU.
No obstante, de momento no se han identificado indicios de problemas de
depresión por endogamia, por lo que el principio de precaución nos lleva a considerar
que, a efectos de medidas de gestión actual, las tres poblaciones deben ser
162 CAPÍTULO 4
consideradas como unidades de manejo (MUs) diferentes (Michaux et al., 2005). De
detectarse problemas de disminuciones poblacionales drásticas o de depresión por
endogamia en un futuro, las actuaciones de conservación podrían justificar la
realización de traslocaciones. De todas formas, el problema aún no resuelto es el de
la posibilidad de transmisión de infecciones desde una población a otra. La resolución
de este aspecto debe ser previa a cualquier actuación en este sentido.
Los centros de cría en cautividad constituyen medidas de conservación ex situ
fundamentales de cara a la conservación a medio y largo plazo de especies en peligro
de extinción (Frankham, 2002). Constituyen un componente adicional para la
conservación, ya que permiten disponer de ejemplares para llevar a cabo futuras
repoblaciones en aquellas situaciones donde las poblaciones naturales cuentan con
un número reducido de efectivos (refuerzos poblacionales) o hayan desaparecido
(reintroducciones).
En la actualidad, hay diversos programas de cría en cautividad de visón
europeo con centros en Rusia (Novosibirsk), Alemania (Osnabrück), Estonia
(zoológico de Tallin) y España (Pont de Suert-Lleida) integrados en los programas
Europeos para la conservación de especies amenazadas (European Endangered
Species Program EEP). Estas poblaciones cautivas sirven de reservorio de las
poblaciones naturales, pero se debe hacer un esfuerzo en que la población cautiva
conserve su polimorfismo genético a largo plazo. De ahí que una de las líneas de
actuación de los centro de cría en cautividad debe dirigirse a evitar el deterioro
genético de estas poblaciones cautivas, evitando, en la medida de lo posible, los
problemas inherentes a la depresión por endogamia. Por tanto, una medida de
gestión eficaz requiere un control y seguimiento genético de los animales para
evaluar el estado y evolución de las poblaciones cautivas. Los marcadores genéticos
desarrollados durante esta tesis, han sido utilizados para cuantificar el polimorfismo
genético de los fundadores del programa de conservación ex situ del visón europeo
de Pont de Suert. Además, han servido para hacer una caracterización de los
descendientes de cada cruce. Toda esta información ha sido básica para diseñar los
cruces más adecuados entre individuos con los que mantener el polimorfismo de los
ejemplares de este programa de cría.
Por otro lado, es aconsejable reforzar las poblaciones cautivas mediante la
introducción de nuevos ejemplares procedentes de las localidades presentes en la
misma MU. Una recomendación para optimizar la gestión genética del centro de cría
de Pont de Suert sería la incorporación de nuevos individuos procedentes de
D ISCUSIÓN 163
diferentes ríos de la región occidental, tanto de Francia como de España, poblaciones
separadas entre sí hace apenas unas décadas. Además, de cara al manejo de las
poblaciones cautivas, la conclusión de que las tres poblaciones de visón europeo
constituyen una misma ESU, abre la posibilidad de futuros intercambios de
ejemplares entre los diferentes centros.
4 .4 .3 H ib r idac ión: Imp l i cac iones para l a conservac ión
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral han indicado que la hibridación entre
el visón europeo y el turón es un fenómeno poco común. No obstante, hay que
señalar que podría ser más frecuente en aquellas zonas de contacto donde el visón
europeo sobrevive en bajas densidades tal y como se ha propuesto con anterioridad
(Lodé et al., 2005; Maran et al., 1998b). En Bielorrusia Sidorovich (2001) observó
que tras la reducción de las poblaciones de visón europeo en el medio natural, se
produjo un aumento en la frecuencia de aparición de híbridos, de forma que esta
disminución favoreció el cruzamiento interespecífico con el turón, lo que puede
afectar negativamente a ambas especies. La hibridación entre estas dos especies de
mustélidos ha sido considerada como uno de los posibles factores de amenaza
causantes del declive de las poblaciones de visón europeo en el último siglo (Lodé et
al., 2001; Maran, Henttonen, 1995; Youngman, 1982; Zabala et al., 2006). No
obstante, los resultados de nuestros estudios indican que parece tratarse de un
evento poco común.
La hibridación puede resultar una amenaza sobretodo para la supervivencia de
especies raras y/o amenazadas (Wirtz, 1999). Este proceso se vuelve más crítico
cuando las poblaciones de estas especies, que cuentan con un número reducido de
individuos, conviven en simpatría o entran en contacto con otras especies del género
que son más abundantes (Allendorf et al., 2001). Este hecho podría confirmarse en el
caso de la hibridación entre el visón europeo y el turón, convirtiéndolo, hoy en día,
en un factor de amenaza que puede ir cobrando importancia en las zonas donde la
presencia de visón europeo se hace más escasa.
Entre los problemas derivados de la hibridación podrían destacarse aquellos
relacionados con la reproducción. Al igual que ocurre con el visón americano, el
apareamiento entre las hembras de visón europeo con machos de turón incapacitaría
a las hembras de apareamientos posteriores con machos de su misma especie,
164 CAPÍTULO 4
interrumpiendo la reproducción durante ese año. Por otro lado, la presencia de un
macho híbrido ocupando el territorio de varia hembras de visón europeo, también
afectaría negativamente a la reproducción de esas hembras. En cuanto a la
capacidad de supervivencia de los híbridos, en ocasiones suele ocurrir que las
especies parentales están mejor adaptadas al nicho ecológico que les rodea que los
individuos híbridos, los cuales al poseer características intermedias, pueden verse
desfavorecidos en el medio natural de las especies parentales (Rhymer, Simberloff,
1996). Sin embargo, este supuesto no siempre se cumple, dado que existen casos
donde lo que ocurre es todo lo contrario de manera que la selección natural puede
favorecer la adaptación de los híbridos (Barton, 2001; Rhymer, Simberloff, 1996).
En el caso que nos ocupa, los híbridos entre visón europeo y turón han mostrado ser
viables y sobrevivir en los hábitats disponibles (Sidorovich, 2001). Sin embargo, hay
diversas cuestiones que requieren ser investigadas, como por ejemplo, la capacidad
reproductora de los individuos híbridos. El bajo número de híbridos detectados
resultantes del retrocruzamiento puede indicar que estos individuos muestran una
fertilidad reducida, lo que supondría un claro ejemplo de depresión por exogamia. No
obstante, no se puede descartar que la baja abundancia de los propios híbridos F1
limite a su vez la posibilidad de retrocruzamiento con la especie parental.
Por otra parte, se deberían plantear estudios más detallados que proporcionen
datos concretos acerca de las consecuencias que tiene el fenómeno de hibridación
sobre las poblaciones tanto de visón europeo como de turón. Para abordar de forma
adecuada el problema de la hibridación es necesario conocer si, además, estos
individuos híbridos entran en competencia directa con las especies parentales y si
esto puede llegar a convertirse en un factor añadido que agravara la situación actual
de estas especies de mustélidos. En cualquier caso, los datos obtenidos sugieren que
los híbridos no son viables en las generaciones sucesivas. Por ello, y por el efecto
negativo que pueden tener en las poblaciones de visón europeo, y de turón, deberían
ser descastados con el fin de posibilitar que algún ejemplar de las especies
parentales pueda ocupar ese territorio y dar lugar a una descendencia fértil.
D ISCUSIÓN 165
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CONCLUSIONES
Las principales conclusiones que se derivan del desarrollo de esta tesis doctoral,
son las siguientes:
1. Se ha desarrollado un método de diferenciación eficaz y fiable entre visón
europeo, visón americano y turón, a partir de muestras no invasivas y basado en la
técnica de PCR-RFLP aplicada sobre un fragmento de 240 pb de la región control del DNA
mitocondrial y mediante cortes con las enzimas de restricción Rsa I y Msp I.
2. Se ha construido una librería genómica enriquecida para el visón europeo que
ha proporcionado nuevos microsatélites altamente polimórficos, muy útiles para analizar la
diversidad y estructura genética de las poblaciones de visón europeo, así como para
estudiar el proceso de su hibridación con turón.
3. Se confirma la baja diversidad genética del visón europeo, tanto a nivel nuclear
(microsatélites) como mitocondrial. La región oriental (noreste: Rusia, Bielorrusia y
Estonia; sureste: Rumania) presenta los mayores niveles de polimorfismo genético.
4. Se constata la escasa variabilidad genética definida previamente para las
poblaciones de visón europeo de Europa occidental (Francia y España) a nivel nuclear,
siendo monomórficas para la región control del DNA mitocondrial. Este bajo polimorfismo
parece ser consecuencia de un efecto fundador, posiblemente seguido de un
empobrecimiento por deriva génica. Ello es coherente, tanto con una colonización de tipo
leptocúrtico, como con una introducción antrópica de unos pocos ejemplares en Francia y
la posterior expansión hacia España.
5. Todos los análisis realizados apoyan estadísticamente la diferenciación genética
del visón europeo entre las regiones europeas donde se encuentra, aunque no se ha
CAPÍTULO
5
172 CAPÍTULO 5
detectado estructuración geográfica significativa entre ellas. La mayor parte de la variación
genética se encuentra distribuida entre y dentro de las regiones definidas: nororiental,
sudoriental y occidental.
6. De igual forma, todos los análisis realizados apoyan estadísticamente la
diferenciación genética entre poblaciones cuando los individuos se agrupan por cuencas
fluviales, no detectándose estructuración geográfica significativa entre ellas. La mayor
parte de la variación genética se encuentra distribuida entre y dentro de las poblaciones
definidas: ríos del noreste (Severnaya o Dvina norte, Volga y Zapadnaya o Dvina oeste) y
sureste (Danubio) de Europa y ríos de la región occidental (Francia: Charentes, Garona,
Adour; España: Ebro y vertiente cantábrica).
7. Los test realizados han indicado que las poblaciones de visón europeo han
sufrido un proceso de cuello de botella reciente a nivel global, lo que concuerda con el
declive demográfico del visón europeo sufrido desde mediados del siglo XIX.
8. Tomando en consideración los criterios genéticos y ecológicos, se puede
considerar que las poblaciones de visón europeo residentes en las tres regiones europeas
constituyen una única Unidad Evolutivamente Significativa (ESU). No obstante, a efectos
de desarrollar medidas de gestión actuales, las tres poblaciones deberían ser consideradas
como Unidades de Manejo (MUs) diferentes.
9. Las herramientas moleculares desarrolladas, basadas en el estudio de
secuencias de DNA mitocondrial (de herencia materna) y del cromosoma Y (de herencia
paterna), así como mediante el genotipado con microsatélites nucleares, permiten
identificar con fiabilidad el carácter híbrido o puro de ejemplares de visón europeo y turón,
el grado de hibridación en las poblaciones naturales, establecer la dirección de la
hibridación y detectar casos de hibridación críptica.
10. Los análisis de agrupamiento mediante métodos bayesianos reflejan que la
hibridación interespecífica queda limitada a la producción de híbridos de primera
generación (F1) y al retrocruzamiento de individuos F1 con individuos puros de la especie
parental turón. Todos los híbridos F1 han resultado del cruzamiento entre un visón
europeo hembra y un turón macho. Las hembras híbridas F1 son fértiles. En relación a los
machos híbridos, puede confirmarse tanto la regla de Haldane, según la cual los individuos
heterogaméticos (individuos macho XY en mamíferos) son raros, estériles o bien no
existen, como la presencia de otras barreras de aislamiento reproductivo alternativas, que
impidan el retrocruzamiento entre los híbridos macho F1 con las hembras de turón.
MAIN CONCLUSIONS
From the studies performed in this PhD thesis, the following conclusions can be
drawn:
1. A new PCR-RFLP method has been developed in order to identify European
minks, polecats and American minks. It is based on the analysis of a fragment of 240 bp
of the mitocondrial DNA control region. Different mitochondrial haplotypes were obtained
for European mink (AA, AB), polecat (AC, AD) and American mink (BC) after digestion of
amplicons with Rsa I and Msp I restriction enzymes. Other mustelid species show different
restriction patterns with this technique. The procedure provides, with reliable accuracy,
species distinction using non-invasive genetic samples, which could be very useful for
monitoring these mustelid species, and for studying their interactions without interfering
with natural populations.
2. An enriched genomic DNA library of European mink provided novel polymorphic
microsatellites. They are very useful for studying of population genetic structure and
diversity of European minks, as well as, for assessing hybridization process between
European minks and polecats.
3. Both mitochondrial and nuclear (microsatellite) genetic data confirm low levels
of genetic variability for European mink. The Eastern European region (northeast: Russia,
Belarus and Estonia; southeast: Romania) is characterised with the highest genetic
diversity.
4. The Western populations (France and Spain) show low values of genetic
polymorphism at nuclear level, being monomorphic for the mitocondrial DNA control
region. It could be the result of founder events, possibly, followed by genetic
depauperation. This is consistent with both, a leptokurtic colonization of the species
174 CAPÍTULO 5
throughout Central Europe to France, and an anthropic introduction of the species in
France, followed by its expansion towards Spain.
5. Although genetic differentiation of European mink is statistically supported by
all tested genetic analyses, no significant geographic structure was inferred among
regions. Genetic variation is mostly found among and within sampled regions
(northeastern, southeastern and western Europe).
6. All genetic analyses strongly supported genetic differentiation among
populations when individuals were grouped according to river drainage basins (Severnaya
or North Dvina, Volga and Zapadnaya or West Dvina rivers in the Northeast, Danube river
in Southeast and Charentes, Garonne and Adour and Ebro and Cantabrian rivers in West
Europe). Nevertheless, no significant geographic structure was detected
7. The performed genetic tests suggest that European mink suffered recent
bottleneck processes throughout Europe. This is consistent with the reported overall
demographic decline of the species occurred during the last centuries.
8. According to genetic and ecological criteria, the European mink populations can
be considered a single Evolutionary Significant Unit (ESU). Nevertheless, for current
management strategies, European mink populations of three geographical regions
(northeast, southeast and west) should be considered as different Management Units
(MUs).
9. The new developed molecular tools allow identification of hybrids between
European minks and polecats. These tools include the analyses of mitochondrial
(maternally inherited) and Y chromosome (paternally inherited) DNA sequences, as well
as, genotyping with microsatellites. These molecular markers also permit quantifying
hybridization rate in natural populations, identifying hybridization direction, and
discovering instances of cryptic hybridization.
10. Bayesian clustering approaches show that interspecific hybridization is
restricted to first generation hybrid class (F1) and backcrosses (BxII) between F1 hybrids
and pure polecats. All detected F1 hybrids resulted from crosses between European mink
females and polecat males. Female F1 hybrids are fertile. Concerning males, F1 hybrids
seem to follow the Haldane’s rule (i.e. heterogametic individuals are absent, rare or
sterile) or to present different alternative reproductive isolation barriers which avoid
backcross between male European mink-polecat hybrids and polecat female.
