5. ¿QUÉ ES UN MARCADOR CELULAR? EXPLICAR BREVEMENTE LA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE (GFP).

Los marcadores celulares se encuentran en todas las células somáticas, son antígenos (proteínas) de superficie de todas las células, algunas de estas proteínas se encuentran solo en ciertos tipos de células, por ejemplo el CD16 es la proteína que se expresa específicamente en neutrófilos, células NK y macrófagos.

PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE

La proteína verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en inglés, Green Fluorescent Protein) es una proteína producida por la medusa Aequorea victoria , que emite bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible. El gen que codifica esta proteína, que ya ha sido clonado, se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador. El descubrimiento y estudio de GFP representó un enorme avance para los investigadores, amplía la capacidad del microscopio óptico, y otorga una nueva dimensión visible al ojo humano.Los descubrimientos relacionados a la GFP de Osamu Shimomura, Martin Chalfie, y Roger Y. Tsien merecieron el Premio Nobel de Química 2008, otorgado en partes iguales a los tres, "por el descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente.A pesar que la llamada química "verde" está de moda en la comunidad de químicos, ningún esfuerzo de los mismos ha podido igualar las reacciones que coordina un solo gen de esta medusa.

Las proteínas fluorescentes, entre las cuales se encuentra la GFP, son muy versátiles y se utilizan en diversos campos como la microbiología, ingeniería genética y fisiología. Permiten ver procesos previamente invisibles, como el desarrollo de neuronas, cómo se diseminan las células cancerosas, el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, el crecimiento de bacterias patogénicas, la proliferación del virus del SIDA, entre otros.Por ejemplo, células cancerosas permite seguir la evolución comparativa de las metástasis en presencia o ausencia de distintos fármacos. La GFP también tiene una importancia especial en la biología del desarrollo: si se introduce en un estadio temprano de un embrión, se puede seguir la evolución de las primeras células, estructuras y órganos.

6. DESCRIBA BREVEMENTE LA TÉCNICA DE FISH.FISH o hibridación fluorescente in situ es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así como de las anomalías que puedan presentar. Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética).

La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interface.

Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que son los más propensos a sufrir anomalías. Están relacionados a enfermedades como :

el síndrome de Patau (13), el síndrome de Edwards (18), el síndrome de Down (21), el síndrome de Turner (X) y el síndrome del superhombre (Y), entre otros.

Sin embargo, cómo son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta técnica. FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. En un principio se emplearon sondas de carácter radiactivo,

pero este tipo de marcaje fue reemplazado por los fluoróforos por mayor seguridad, eficacia y facilidad de detección. Protocolo básico: El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a las regiones específicas para las que han sido diseñadas. Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes denominados fluoróforos (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto). Por último se visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.

Aplicaciones: Esta técnica ha resultado ser muy útil en el campo de la medicina reproductiva, con aplicación en el diagnóstico genético preimplantatorio (DGP). Resulta una forma muy precoz de diagnóstico que, apoyándose en las técnicas de reproducción asistida, posibilita el estudio de embriones antes de ser transferidos al útero materno y, por consiguiente, antes de que se lleve a cabo la implantación embrionaria. Para el análisis de anomalías cromosómicas embrionarias, tanto numéricas como estructurales, puede utilizarse la técnica DGP-FISH. Para este fin se requiere una biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una célula del embrión en cultivo "in vitro". Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el núcleo en interfase y se hibrida con sondas específicas para el estudio cromosómico de la patología que se sospecha pueda estar presente en el embrión.