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CAPÍTULO I Origen y evolución de la mitocondria: ADN mitocondrial y

evolución humana

María Esther Gallardo y Rafael Garesse

Departamento de Bioquímica e Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” CSIC-UAM, Centro de Investigación Biomédica en Red en Enfermedades Raras (CIBERER), Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, España. egallardo@iib.uam.es

RESUMEN

La mayoría de las células eucariotas contienen mitocondrias que son vestigios de un suceso

endosimbionte ancestral que tuvo lugar hace aproximadamente 1.500-2.000 millones de años, cuando una bacteria con capacidad de utilizar oxígeno colonizó una célula protoeucariótica

huésped. Las comparaciones de secuencias sugieren que los parientes más cercanos de la

protomitocondria son las α-proteobacterias, bacterias gram-negativas que pueden existir como

bacterias libres, aunque la mayoría de los miembros de este grupo viven como simbiontes o parásitos de plantas y animales. En particular, se considera que las eubacterias más cercanas a la

mitocondria son miembros de la subdivisión rickettsia de las α-proteobacterias. Los análisis

filogenéticos realizados hasta este momento sugieren que todos los genomas mitocondriales

descienden de un ancestro común, lo que implica un origen monofilético de la mitocondria, es decir, que la mitocondria se originó una sola vez en la evolución. El primer genoma mitocondrial

que se secuenció en su totalidad fue el de Homo sapiens, en el año 1981. Este genoma presenta características únicas que le hacen particularmente interesante para ser utilizado en estudios de

evolución humana. Así, su análisis en poblaciones obtenidas de todo el mundo ha corroborado la hipótesis, inicialmente propuesta de acuerdo con evidencias fósiles, de un origen africano del

humano moderno (Homo sapiens).

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INTRODUCCIÓN

La mitocondria desempeña numerosas funciones metabólicas y reguladoras en las células eucarióticas, y es el orgánulo donde se genera la mayor parte del ATP mediante el sistema de fosforilación oxidativa. Hace aproximadamente 2.000 millones de años, la tensión de oxígeno ambiental de la atmósfera en la tierra aumentó muy rápidamente, lo que sugería que el origen de la mitocondria como orgánulo en los eucariotas primitivos estaba asociado con este suceso medioambiental (1). Sin embargo, durante los miles de millones de años anteriores a este incremento global de oxígeno, la atmósfera terrestre probablemente no fue la atmósfera fuertemente reductora sugerida por Oparin en 1957 (2). Durante la historia de la biosfera, el oxígeno era accesible en la atmósfera a bajos niveles y muy probablemente a niveles más altos localmente. Esta presencia continua de oxígeno es coherente con el origen ancestral de las oxidasas terminales características de la mitocondria. Las reconstrucciones filogenéticas basadas en las secuencias de citocromo c oxidasa y citocromo b están de acuerdo con la divergencia de las proto-mitocondrias a partir de las bacterias hace 1.500-2.000 millones de años. En consecuencia, el sistema respiratorio oxidativo, que se introdujo en los eucariotas mediante la mitocondria primitiva, ya fue un sistema enzimático ancestral.

La teoría endosimbionte del origen de la mitocondria se originó en el siglo diecinueve y fue Margulis quién en los años 70 la hizo resurgir cuando los métodos moleculares permitieron comprobar algunas de sus predicciones (3). Más tarde, el descubrimiento de los genomas mitocondriales y los resultados de reconstrucción filogenética empleando secuencias de rARN y de algunas proteínas mitocondriales reforzaron esta teoría según la cual las mitocondrias son descendientes de las bacterias aeróbicas que, de alguna forma, sobrevivieron a la endocitosis y se incorporaron en el citoplasma (4).

En este capítulo, se resumen los avances más recientes que se han publicado en el campo de la evolución de la mitocondria y su genoma. Aunque el origen de la mitocondria a partir de la endosimbiosis de una proteobacteria es algo muy aceptado en la actualidad, la naturaleza de la célula huésped, la complejidad metabólica del endosimbionte y la evolución posterior de la proto-mitocondria a la mitocondria actual son todavía objeto de debate y discusión. Asimismo, hasta hace unos años la información de la organización del genoma mitocondrial era escasa. El número de secuencias mitocondriales completas disponibles así como el intervalo filogenético comprendido por estos mtADNs era bastante

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limitado, con un fuerte sesgo hacia los animales y particularmente hacia los vertebrados. Esto ha dificultado mucho predecir cuál fue el genoma mitocondrial ancestral (genoma protomitocondrial) y, en particular, decidir que mtADNs contemporáneos se parecen más al estado ancestral. Sin embargo, con los avances en el campo de la investigación genómica mitocondrial, entre los que se incluye la introducción de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, el número de genomas mitocondriales secuenciados completamente ha aumentado considerablemente. La investigación del mtADN presente en taxones ancestrales e intermedios así como de organismos actuales ayudará a refinar las rutas y modos de evolución del mtADN.

¿CÓMO SE ORIGINARON LAS MITOCONDRIAS?

Las mitocondrias parecen ser descendientes directos de un endosimbionte bacteriano que se estableció en una célula huésped amitocondriada. Sin embargo, todavía se sigue debatiendo si el huésped fue una arqueobacteria sin núcleo o una célula altamente compartimentalizada. Se ha discutido si el endosimbionte fue un organismo heterotrófico aunque también se ha propuesto un organismo con un metabolismo más versátil (5). En la actualidad, existen cada vez más evidencias que apoyan la idea de que el vehículo que introdujo el sistema respiratorio en los linajes eucariotas fue una α-proteobacteria (6). Incluso antes de tener datos de secuenciación, las evidencias bioquímicas indicaban que existe una relación cercana entre las mitocondrias y las α-proteobacterias (7). Por otra parte, los datos moleculares disponibles de la SSU rARN (del inglés, “small subunit ribosomal”) y de diversas proteínas apuntan hacia un origen monofilético de la mitocondria que surgió de un ancestro α-proteobacteriano. Esto implica que la mitocondria se originó sólo una vez en la evolución (6, 8). Sin embargo, dónde se localiza el endosimbionte en el árbol filogenético de las α-proteobacterias es todavía hoy materia de debate. Las reconstrucciones filogenéticas parecen indicar que miembros de la subdivisión rickettsia de las α-proteobacterias, un grupo de parásitos intracelulares, son los parientes más cercanos que se conocen de las mitocondrias (Figura 1) (1, 6).

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Existen dos observaciones que apoyan que el genoma mitocondrial (y, por lo tanto, la mitocondria per se) surgieron una única vez en la evolución. Primero, en cualquier

genoma mitocondrial (con pocas excepciones) los genes que tienen una función asignada son un subconjunto de aquellos identificados en el mtADN menos divergente (más parecido a una bacteria) descrito hasta la fecha, el del jacóbido flagelado Reclinomonas americana. Segundo, en ciertos casos, los agrupamientos génicos que codifican para proteínas mitocondriales retienen el orden de los genes de sus homólogos bacterianos. Estos agrupamientos presentan deleciones específicas de phyla que se explican simplemente como

Figura 1.- Imagen obtenida por microscopía electrónica de Rickettsia prowazekii

En la figura se muestra una fotografía obtenida por microscopía electrónica de Rickettsia prowazekii (obtenida en www.hgsc.bcm.tmc.edu), una bacteria aeróbica que es el agente etiológico de la fiebre tifoidea. Según la hipótesis endosimbiótica las mitocondrias proceden de bacterias aeróbicas (probablemente del grupo de las Rikettsias). Esta afirmación se puede hacer gracias a la comparación del genoma mitocondrial con el genoma completo de Rickettsia prowazekii (el genoma bacteriano más parecido a un genoma mitocondrial). Dicha comparación muestra semejanzas tanto en las secuencias como en la organización y disposición de sus genes.

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hechos ocurridos en un ancestro común de los genomas mitocondriales, posterior a su divergencia del ancestro bacteriano (9).

La teoría endosimbionte postula que las mitocondrias evolucionaron por dos mecanismos importantes: pérdida de genes y transferencia de los genes al genoma nuclear de la célula huésped. Por tanto, la marca filogenética del ancestro mitocondrial, la proto-mitocondria, debería ser identificada en el ADN nuclear de los eucariotas. De hecho, al menos 840 genes de eucariotas llevan la firma de las α-proteobacterias, caracterizada por una estrecha relación filogenética a nivel de secuencia. De ellos, alrededor de 200 forman parte del proteoma mitocondrial humano actual (10). Sin embargo, la mayoría de las proteínas proto-mitocondriales no se localizan en la mitocondria y se pueden encontrar en otros compartimentos eucarióticos, como las enzimas de la oxidación de ácidos grasos que se encuentran en los peroxisomas y otras enzimas implicadas en el metabolismo de la fructosa y la manosa que son citoplasmáticas (11).

ESTRUCTURA Y EVOLUCIÓN DE LOS GENOMAS MITOCONDRIALES

Hasta hace relativamente poco tiempo, la información disponible de la organización estructural de los genomas mitocondriales era escasa. El número de genomas mitocondriales secuenciados disponibles en las bases de datos era pequeño y el intervalo filogenético abarcado por los mismos bastante limitado, con un fuerte sesgo hacia un grupo de eucariotas filogenéticamente relacionados que comprendía animales vertebrados, hongos ascomicetos y angiospermas. Con una información tan limitada era difícil inferir información sobre el genoma mitocondrial ancestral (genoma protomitocondrial) y muchas preguntas claves acerca de la evolución mitocondrial sólo se podrían resolver ampliando el número de mtADNs secuenciados, de forma que incluyera una mayor cantidad y variedad de organismos (12). Afortunadamente, durante los últimos 15 años, el número de genomas mitocondriales conocidos y en particular el de protistas ha aumentado considerablemente. En el contexto de evolución mitocondrial los estudios de protistas son particularmente importantes porque este grupo comprende gran parte de la diversidad filogenética existente dentro de los eucariotas.

Como resultado de este aumento paulatino de información registrado en la base de datos de genomas mitocondriales (GOBASE) los mtADNs se han podido dividir en dos

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tipos diferentes, designados como ancestrales y derivados (13). Un genoma mitocondrial ancestral se define como uno que ha retenido vestigios claros de su ancestro eubacteriano. Un ejemplo prototipo es el mtADN de 69034 pb de Reclinomonas americana. El patrón ancestral se caracteriza por: 1) la presencia de muchos genes adicionales comparado con un genoma mitocondrial animal; 2) genes de rARN que codifican para las subunidades de los rARNs 23S, 16S y 5S similares a eubacteria 3) un grupo completo o casi completo de genes de tARN; 4) empaquetamiento estrecho de la información genética en un genoma que consiste fundamentalmente en secuencia codificante sin intrones o con pocos intrones; 5) agrupamientos génicos parecidos a eubacterias y 6) un código genético estándar.

Los genomas mitocondriales derivados son aquellos que se alejan radicalmente de un

patrón ancestral sin que exista evidencia o con poca evidencia de características primitivas y con una divergencia estructural normalmente acompañada por una reducción sustancial del tamaño total. Los mtADNs de los hongos y de la mayoría de los animales se engloban en esta categoría, así como los mtADNs altamente atípicos de las algas verdes como Chlamydomonas y el grupo de protistas apicomplexa tales como Plasmodium (14). La evolución de estos genomas mitocondriales derivados ha sido marcada por: 1) una pérdida extensiva de los genes; 2) una marcada divergencia en el ADN ribosómico y la estructura del rARN; 3) una velocidad acelerada de divergencia de secuencia; 4) adopción de una estrategia de utilización de codones altamente sesgada y en algunos casos la eliminación de algunos codones e 5) introducción de asignaciones de codones no estándar. El motivo y la manera por la cual los genomas mitocondriales han evolucionado de forma tan distinta en los diferentes linajes eucariotas están empezando a ser elucidados gracias a que el número de genomas mitocondriales secuenciados ha aumentado considerablemente así como el abanico de especies incluidas en estos análisis.

Tamaño y forma de los genomas mitocondriales

Los análisis recientes mediante técnicas de biología molecular de los mtADNs en distintos organismos han revelado muchos aspectos interesantes e inesperados de estos genomas. Los mtADNs de organismos unicelulares varían enormemente en tamaño, forma y organización génica, teniendo algunos de los genes una organización y estructura que no se había observado previamente en genomas eucariotas o bacterianos. Por comparación, los mtADNs animales son sorprendentemente uniformes en estructura y contienen una extraordinaria compactación génica que permite una máxima explotación de su capacidad codificante.

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El genoma mitocondrial presenta una notable variación en conformación y tamaño así como en su contenido génico y organización estructural (8). El genoma mitocondrial de eucariotas superiores es una molécula de doble hebra circular, pero en eucariotas unicelulares se han identificado tres formas diferentes: círculos cerrados, moléculas lineales y agregados de círculos pequeños y grandes (Figura 2).

Los mtADNs circulares se encuentran en hongos, mohos, algas y algunos protozoos, los mtADNs lineales se han encontrado en algunos ciliados y en alguna levadura como Hansenula mrakii y los agregados, en los cinetoplastos de los Tripanosomátidos.

Figura 2.- Código genético estándar (dentro de la caja) y variaciones en el código genético mitocondrial (fuera)

AAA (Asn en platelmintos y equinodermos)

AUA (Met en la mayoría de los metazoos con excepción de equinodermos, planarias y celentéreos)

UGA (Trp en todos los animales)

AGA/AGG (Ser en la mayoría de los invertebrados; Gly en los procordados; Stop en vertebrados)

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El tamaño de los genomas mitocondriales en la mayoría de los phyla eucarióticos oscila entre 15-60 Kpb, siendo de menor tamaño en los organismos multicelulares. Sin embargo, existen excepciones como el caso de Plasmodium falciparum (el parásito de la malaria humana) que tiene un tamaño de 6 Kpb y del arroz (Oryza sativa) cuyo mtADN tiene un tamaño de 490 Kpb. La diferencia en tamaño podría ser el resultado de dos factores: 1) una tendencia evolutiva general hacia una reducción en el tamaño del genoma del orgánulo y 2) una reducción en la velocidad de la evolución del genoma del orgánulo cuando los linajes pasaron de unicelular a multicelular. Existen varias evidencias que sugieren que, en la evolución del mtADN, la reducción del genoma es un factor fundamental: 1) Parece que existe un continuo de tamaños de mtADN en los organismos unicelulares de grandes a pequeños. 2) Las reducciones en el tamaño del genoma a menudo van acompañadas por reducciones en el tamaño de los genes particularmente para los rARNs. 3) Los mtADNs de animales han perdido casi todas sus secuencias no codificantes lo que implica que han sido sometidas a una gran presión selectiva para la reducción del genoma.

La capacidad codificante del mtADN varía desde los casi 100 genes que se identifican en jacobidos flagelados hasta sólo 5 en Plasmodium con un promedio a lo largo de los eucariotas que oscila entre 40-50 genes (15). Sin embargo, no existe una correlación entre el tamaño del mtADN y el contenido génico. De hecho, las diferencias en tamaño de los genomas mitocondriales son causadas fundamentalmente por variaciones en la longitud y organización de las regiones intergénicas que en algunos casos consisten en un elevado número de repeticiones en tándem. Otro determinante del tamaño de mtADN es la estructura génica: un producto génico puede ser codificado por fragmentos de ADN de longitud variable debido a la presencia de intrones de distinto tamaño (0,15-4 Kpb) y número (0 a >30). P. ej. en el hongo Podospora anserina, los intrones dan cuenta de hasta un

75% del tamaño total de mtADN (16).

Endosimbiosis y reducción del genoma

Cuando una bacteria inicia una relación endosimbionte con otra célula es esperable que alguno de los genes en el simbionte sea neutralizado por las actividades del huésped (17, 18). De hecho, el que sólo una pequeña fracción de las proteínas requeridas para la función mitocondrial estén codificadas por el genoma mitocondrial, implica una transferencia masiva de genes desde el endosimbionte original al genoma nuclear del huésped. En particular, genes que codifican factores de la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleótidos, glicolisis anaeróbica y transducción de señales tienen más probabilidades de ser

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eliminados del genoma del parásito dado que tales funciones pueden ser dispensables o complementadas por funciones del huésped (codificadas en el núcleo).

La comparación de los genomas mitocondriales de R. prowazekii (el “más mitocondrial”) y R. americana (el “más bacteriano”) ha permitido identificar genes adicionales en Rickettsia (834 frente a 62 genes) que se han perdido durante la evolución del genoma mitocondrial. Entre los genes de Rickettsia que no están en el mtADN actual se

encuentran aquellos que se definen como operacionales (genes implicados en biosíntesis de cofactores, metabolismo de ácidos grasos y fosfolípidos, metabolismo energético, división celular, etc.) y genes que codifican factores de replicación, transcripción y traducción del mtADN. En la mayoría de los casos, esta información genética perdida se encuentra depositada y expresada en la actualidad en el genoma nuclear.

El contenido génico relativamente bajo del mtADN comparado con los genomas eubacterianos conocidos, incluso los más pequeños, parece implicar una pérdida relativamente rápida y extensa o una transferencia de información genética en un estadio temprano en la evolución del genoma protomitocondrial. Las diferencias en el contenido génico entre los mtADNs existentes se explican mejor asumiendo una pérdida génica diferencial posterior a la divergencia del genoma protomitocondrial. De hecho, existen casos bien documentados en plantas de una transferencia relativamente reciente de información genética del genoma mitocondrial al nuclear, que incluye genes que codifican proteínas estructurales de la cadena respiratoria y genes que codifican proteínas ribosomales. La eliminación de genes del mtADN no es sólo un proceso evolutivo en curso sino que ciertos genes se han perdido en más de una ocasión. Por ejemplo, los genes que codifican proteínas ribosomales están ausentes en los genomas mitocondriales de Plasmodium y otros apicomplexa, Chlamidomonas y algas verdes relacionadas, animales y la

mayoría de los hongos, pero se infiere que han estado presentes en los mtADNs de los ancestros evolutivos intermediarios de estos linajes.

Existen diferentes mecanismos moleculares que median la modificación reductora de genomas: uno es el mecanismo de disminución en el cual se eliminan grupos cortos de nucleótidos, una manera lenta pero segura de eliminar secuencias de ADN. De hecho se han observado evidencias de este mecanismo en el genoma de Rickettsia: casi una cuarta parte del genoma de Rickettsia prowazekii es secuencia no codificante (6). El espectro mutacional de secuencias no codificantes de distintas especies de Rickettsia sugiere que el

modo de evolución dominante son deleciones cortas (19). Así, las secuencias no codificantes no esenciales pueden salir del genoma debido a pequeñas deleciones. Un

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mecanismo de eliminación de secuencias más drástico es la recombinación intracromosómica en secuencias repetidas. En condiciones experimentales, este tipo de recombinación es el

mecanismo más frecuente de aparición de deleciones a gran escala en bacterias y se pueden detectar en la descendencia de los genomas delecionados (1).

Plantas y animales: Rutas distintas de evolución del genoma mitocondrial

Desde un punto de vista genómico los mtADNs de plantas se encuentran entre los menos estudiados debido a que el número de genomas mitocondriales secuenciados es más pequeño. Una explicación es el gran tamaño que tienen dichos genomas, como por ejemplo, las 366924 pb del genoma mitocondrial de Arabidopsis thaliana. Sin embargo, a pesar de su tamaño, los mtADNs de plantas de tierra tienen una capacidad codificante y un contenido génico similares a otros mtADNs mucho más pequeños como es el caso de los protistas.

La mayor parte de los mtADNs de plantas, aunque sometidos a una reorganización acelerada del genoma, han mantenido características ancestrales que dan testimonio de sus orígenes bacterianos. Entre ellas, la existencia de vestigios de estructuras de rARN similares a los de bacterias, un código genético estándar y agrupamientos génicos similares a los de bacterias. La evolución del genoma mitocondrial de las plantas parece estar gobernado por una tendencia hacia un aumento en el tamaño del genoma y una fluidez recombinacional que resulta en variaciones del genoma dentro de distintas cepas de la misma especie. Sorprendentemente, la evolución de los mtADNs de plantas y animales ha tenido lugar de forma muy diferente. Los mtADNs animales son pequeños (en torno a 16000 pb) y tienen, en general, genes sin intrones que se organizan de un modo compacto en ambas cadenas de ADN. Con pocas excepciones, estos mtADNs contienen los mismos 37 genes, que codifican para las subunidades grande y pequeña de los rARNs, 13 proteínas estructurales de los complejos de la cadena respiratoria y 22 tARNs organizados en un orden que está muy bien conservado dentro de los phyla, aunque sin ningún agrupamiento reconocible similar a los bacterianos. No está claro si el tamaño reducido se estableció de forma concomitante con la evolución de las primeras formas de los animales, o si estos genomas mitocondriales se parecen a los de sus predecesores evolutivos (los cianoflagelados). Esta incertidumbre parte del hecho de que entre las secuencias completas disponibles pocas son de animales inferiores. Las filogenias de animales basadas únicamente en datos de secuencia fallan muchas veces a la hora de generar la topología de un árbol filogenético consistente (incluso cuando se usan secuencias mitocondriales completas). Esta falta de consistencia es la consecuencia de una tasa mutacional alta y variable en los mtADNs de animales, que tiene como consecuencia una sobresaturación mutacional de los sitios, una disminución de la

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señal filogenética y, potencialmente, la predicción de topologías de árbol incorrectas. Por el contrario, las comparaciones del orden de los genes mitocondriales son una herramienta poderosa para inferir relaciones evolutivas en los animales, porque las reorganizaciones en los genomas mitocondriales animales son sucesos excepcionalmente raros que es poco probable que hayan ocurrido independientemente en linajes separados. Una aproximación del orden génico obviamente se restringe sólo a los casos donde tales diferencias se observen realmente; por ese motivo no se puede implementar en mamíferos, en los que los genes mitocondriales se organizan siempre del mismo modo (20).

Origen y evolución del código genético

La vida se fundamenta en la extraordinaria capacidad que tienen las células para traducir la información contenida en sus genomas en la información de sus proteomas. El código genético es el que determina cómo se traducen los codones (triplete de nucleótidos) en aminoácidos. Durante unos años se pensaba que este código era universal. Sin embargo, desde el descubrimiento de la reasignación de codones en los genes mitocondriales humanos hasta hoy se han publicado una gran variedad de desviaciones del código genético estándar en bacterias, arqueas, genomas nucleares eucarióticos y especialmente en los genomas de los orgánulos, existiendo un total de más de 20 códigos alternativos (21).

Existen tres teorías principales para explicar el origen y estructura del código genético: la teoría estereoquímica, la teoría adaptativa y la teoría de la coevolución (22).

La teoría estereoquímica postula que las asignaciones codon/aminoácido son determinadas por afinidades físico-químicas entre los aminoácidos y los ácidos nucleicos.

La teoría adaptativa postula que la evolución del código genético está dirigida fundamentalmente por fuerzas selectivas que minimizan el efecto de errores en la síntesis de proteínas de origen mutacional o de mala lectura del mARN.

Finalmente, la teoría de la coevolución postula que la estructura del código genético refleja directamente la evolución de las rutas de biosintésis de aminoácidos. Esta teoría asume que el número de aminoácidos que existió en la tierra prebiótica era pequeño (unos 10) y que los otros aminoácidos se derivaron de los prebióticos a partir de procesos biosintéticos.

Los escenarios evolutivos descritos, en particular para la teoría de la coevolución sugieren la existencia de tres momentos críticos en el desarrollo del código genético. Una

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fase inicial que se caracteriza por la incorporación de los aminoácidos prebióticos (Gly, Ala, Ser, Asp, Glu, Val, Leu, Ile, Pro y Thr). Un paso intermedio que implica la incorporación de 7 aminoácidos adicionales derivados de los prebióticos por biosíntesis: Phe, Tyr, Arg, His, Trp, Lys, y Met y una fase final donde se incorporaron al código genético los cinco aminoácidos cuya síntesis es dependiente de tARN o es mediada por rutas biosintéticas no canónicas (Asn, Gln, Cys, selenocisteína (Sec) y pirrolisina (Pyl)).

Variaciones en el código genético mitocondrial y evolución animal

En las mitocondrias existen varios codones no universales y sus significados dependen de la especie (Figura 2). Además, las estructuras de los tARNs que descifran los codones a veces están truncadas. Estos aspectos parecen estar relacionados con el acortamiento de los genomas mitocondriales que tuvo lugar durante la evolución de la mitocondria. De hecho, es posible que durante el origen endosimbióntico de la mitocondria se generaran los aspectos característicos de los sistemas de traducción mitocondriales tales como variaciones del código genético, estructuras de rARN y tARN inusualmente truncadas (como se ha mencionado anteriormente), mecanismos de reconocimiento unilaterales de tARNs por las aminoacil-tARN sintetasas, factores de elongación, ribosomas y compensación estructural y funcional por proteínas grandes, de segmentos de ARN truncados en tARNs y rARNs, en sistemas de traducción mitocondrial, (23).

Al considerar la evolución del código genético en las mitocondrias de animales la hipótesis de captura de codones basada en la presión AT propuesta en 1989 por Osawa y Jukes ha resultado de gran utilidad (24). La captura de codones significa que cualquier codón puede ser leído por el correspondiente tARN, pero si surge un tARN competidor o un factor de liberación que tenga una mayor afinidad por el codón que el tARN original el codón será leído por el competidor. Por lo tanto, dicho codón sería reasignado o capturado. También es importante considerar que los tARNs se restringen a 22-23 especies y que no se importan desde el citoplasma en casi todas las mitocondrias de metazoos (25).

La prevalencia de alteraciones en el código genético en las mitocondrias subraya otro aspecto importante de la evolución del código genético, concretamente que el tamaño del proteoma impone una fuerte presión negativa en la reasignación de codones. Esto se ha demostrado mediante estudios de genómica comparativa a gran escala que muestran una correlación negativa entre el número de alteraciones del código genético y el número de genes codificados en el mtADN. Este principio se ilustra con claridad en mitocondrias humanas donde sólo 13 de las alrededor de 900 proteínas son codificadas por su genoma.

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Dado que las proteínas nucleares se sintetizan en el citoplasma usando el código genético estándar y se transportan a la mitocondria utilizando un sistema de traslocación mediado por un péptido señal, su síntesis se escapa de la interrupción causada por la reasignación de codones mitocondriales. Esto está de acuerdo con la hipótesis de minimización del genoma que postula que la velocidad de replicación impone una fuerte presión negativa en el genoma mitocondrial que conduce a una selección de los genomas de tamaño pequeño.

En resumen, los datos disponibles en la actualidad indican que el bajo uso y la no asignación de codones, la presión del genoma G+C, la minimización del genoma, el pequeño tamaño del proteoma y la desaparición de tARNs juegan un papel crítico en la evolución del código genético. Curiosamente, las mitocondrias de plantas escapan de alguna manera a los efectos de la evolución y mantienen el código genético estándar (22, 26).

EL ADN MITOCONDRIAL Y LA EVOLUCIÓN HUMANA

El primer genoma mitocondrial que se secuenció en su totalidad fue el de Homo sapiens en el año 1981 (27). El mtADN humano es una molécula circular de doble cadena, de 16569 pb de tamaño que codifica para 13 subunidades del sistema de fosforilación oxidativa, 2 ARNs ribosómicos (rARN) y 22 ARNs de transferencia (tARNs) (Figura 3). Este ADN presenta características únicas que le hacen particularmente interesante para ser utilizado en estudios de evolución humana:

1) Alto número de copias

El mtADN está presente en alto número de copias en las células humanas. Esta propiedad facilita su obtención y hace del mtADN la molécula de elección para ciertas aplicaciones en medicina forense. Sin embargo, esta propiedad también complica los estudios de genética poblacional, dado que las múltiples copias del genoma mitocondrial dentro de un individuo no tienen por qué ser todas idénticas. La existencia de distintos tipos de mtADN dentro de un mismo individuo se conoce como heteroplasmia.

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2) Herencia Materna

El mtADN tiene un patrón de herencia materna, lo que ha facilitado a los investigadores estudiar los diferentes linajes a lo largo del tiempo destacando el ancestro materno de una población sin los efectos de la herencia biparental y recombinación inherentes al ADN nuclear. Sin embargo, existe un caso descrito en la bibliografía de un hombre con una intolerancia al ejercicio severa que presentaba un mtADN muscular de origen predominantemente paterno (28). Desde hace varios años se sabe que las mitocondrias de los espermatozoides son destruidas selectivamente en el oocito y se ha demostrado que el mtADN paterno es marcado para su destrucción en el oocito por ubiquitinación (29, 30). Esto indica que el caso de herencia paterna descrito podría ser consecuencia de un fallo en el reconocimiento y eliminación de las moléculas paternas de mtADN y que por tanto podría ser un fenómeno extremadamente raro. Este hecho ha sido corroborado dado que investigaciones posteriores en más pacientes no han revelado ningún caso más de herencia paterna (31, 32, 33). Por lo tanto, hasta este momento se considera que el mtADN se hereda por vía materna lo que resulta muy interesante para estudios de evolución humana.

3) Ausencia de Recombinación

Otro principio de antropología molecular que se ha considerado un dogma desde hace años es la ausencia de recombinación en el mtADN. Sin embargo, desde el año 1999 existen varios estudios, basados en análisis estadísticos y filogenéticos de secuencias de mtADN, que tratan de demostrar, sin éxito, la presencia de recombinación en el mtADN humano. Recientemente, se ha publicado un caso de recombinación del mtADN en el único paciente conocido que presentaba mtADN materno y paterno (31). Aquí, la recombinación ocurría en aproximadamente 0,7% del mtADN total presente en el tejido muscular del paciente. Este hecho indica que la recombinación en el mtADN es posible porque las mitocondrias poseen una recombinasa funcional, aunque no está claro en qué medida las mitocondrias presentes en una célula son capaces de fusionarse e intercambiar ADN.

4) Tasa Mutacional

La tasa de mutación del mtADN es varios órdenes de magnitud superior que la de los genes nucleares, con una frecuencia estimada de 0,017 x 10-6 sustituciones por sitio y año para el genoma completo (excluyendo la región de control donde la tasa mutacional es mayor). Sin embargo, existen discrepancias entre las estimaciones de la tasa mutacional del mtADN basadas en comparaciones filogenéticas o en pedigrís. Debido a que un número

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significativo de las mutaciones observadas en pedigrís han surgido recientemente y probablemente no se habrán fijado, la estimación de la tasa mutacional basada en comparaciones filogenéticas (que representa mutaciones que han alcanzado una frecuencia apreciable en la población) es preferible para estudios de evolución más antiguos, mientras que la estimación de la frecuencia mutacional basada en pedigrís es aconsejable para estudios de historia reciente (34, 35). Alternativamente, Hasegawa et al., mostraron que un modelo que incluya la velocidad de variación en la región de control del mtADN daría una estimación de la edad del ancestro de mtADN humano que sería la mitad de la obtenida cuando se asume una tasa mutacional sencilla (36).

Figura 3.- Mapa del ADN mitocondrial humano

El ADN mitocondrial humano (HmtADN) es una molécula circular de doble cadena, de 16569 bp

de longitud que codifica para 13 subunidades del sistema OXPHOS (ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6, COI, COII, COIII, ATP6, ATP8), 2 rARNs (rARN12S, rARN16S) y 22

tARNs.

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Variantes genéticas del mtADN humano

Los estudios iniciales de variación del mtADN humano, se han basado en análisis por RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphisms”). Sin embargo, con la llegada reciente de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento cada vez es más común secuenciar el genoma mitocondrial completo, incluso para estudios poblacionales (37). Los árboles filogenéticos obtenidos mediante secuenciación de genomas mitocondriales completos proporcionan una mejor resolución que los árboles que se basan únicamente en el análisis de la región hipervariable del mtADN. Sin embargo, no está claro si merece la pena el esfuerzo y el costo de secuenciar el genoma completo dado que se pueden analizar mutaciones puntuales informativas mediante RFLP, o como se ha mostrado recientemente mediante SNaPshot. Una alternativa interesante podría ser el combinar secuencias de la región de control con secuencias parciales de la zona codificante del mtADN.

Existen dos aproximaciones básicas para utilizar el mtADN en estudios de evolución humana: la aproximación basada en linajes y la aproximación basada en la población. La

aproximación basada en linajes estudia la historia de los linajes de mtADN, llamados haplogrupos, mientras que la aproximación basada en la población estudia la prehistoria de poblaciones individuales, de regiones geográficas o de migraciones de la población empleando grupos de poblaciones humanas como unidad de estudio y aplicando métodos de genética poblacional a los datos obtenidos (38). Los haplogrupos representan grupos relacionados de secuencias mitocondriales que son definidos por polimorfismos compartidos y que presentan una especificidad regional. Un problema derivado de la utilización de una aproximación basada en linajes es que sólo esclarece la historia de los haplogrupos en sí mismos y no proporciona una visión de la historia de las poblaciones individuales en las que están presentes (39).

Para estudiar la prehistoria de las poblaciones humanas, es imprescindible utilizar métodos estadísticos que examinen las relaciones poblacionales, por ejemplo el cálculo de valores de distancias genéticas y la representación de relaciones poblacionales en árboles o representaciones de escala multidimensional (40). Afortunadamente cada vez hay más estudios que avalan la utilización de una aproximación basada en genética de poblaciones para analizar tanto afiliaciones de haplogrupos como afinidades poblacionales. Aunque los datos de secuencia de la región hipervariable del mtADN por sí mismos no sirven para revelar todos los haplogrupos, la alta frecuencia mutacional de este segmento asegura un número suficiente de sitios polimórficos para los análisis de genética poblacional.

CAPÍTULO  I   25  

Filogenia del mtADN y el origen de las mujeres: “La Eva mitocondrial”

En el año 1987, el grupo de Alan Wilson publicó un artículo seminal titulado: “Mitochondrial ADN and human evolution” (41). Desde entonces, la genética ha jugado un papel muy relevante en el estudio de la evolución humana durante los últimos dos millones de años. En este trabajo los autores presentan un estudio genético basado en polimorfismos de sitios de restricción de 147 muestras de mtADN humano cuyos orígenes maternos procedían de cinco regiones geográficas distintas del mundo (41). Utilizando el método de reconstrucción filogenética de máxima parsimonia estimaron el árbol de los 133 haplogrupos mitocondriales resultantes (42). Los datos y análisis posteriores demostraron, que a pesar de los errores metodológicos en este trabajo, había datos correctos entre los que se incluyen que la raíz del árbol filogenético mitocondrial está en África y que todas las ramas del árbol eran relativamente cortas lo que implica un ancestro común mitocondrial reciente. Este ancestro fue denominado en los entornos populares “Eva mitocondrial”. La “Eva mitocondrial” recibe su nombre del libro del Génesis (en la Biblia) y según la genética humana, fue una mujer africana que, en la evolución humana, correspondería al ancestro común femenino más reciente que poseía las mitocondrias de las cuales descienden todas las de la población humana actual. De sus observaciones, Alan Wilson y colaboradores concluyeron que sus datos estaban de acuerdo con un modelo de evolución humana (en inglés, “out of Africa replacement model”) según el cual el ancestro común más reciente del mtADN se localizó en África hace aproximadamente 150.000 años. Además, los análisis directos del mtADN de fósiles de Neandertales y sus contemporáneos no sugieren que exista una contribución del mtADN de Neandertal a la especie humana moderna (43, 44).

Otra importante aportación de los estudios del mtADN ha sido una mejor comprensión de las migraciones que determinaron las poblaciones humanas, tales como las personas del Nuevo Mundo (45) la colonización del Pacífico (46), la migración inicial a Nueva Guinea y Australia (47) y el asentamiento en Europa (48). Sin embargo, muchos de los estudios genéticos de evolución humana presentan errores metodológicos ya que el mtADN es un locus único y sólo refleja la historia materna de una población. La historia de un solo locus podría no reflejar con exactitud la historia de una población por los efectos del azar o por la selección actuando en ese locus. Esto indica que los datos de variación en el mtADN necesitan ser complementados por los llamados estudios multiloci (49).

A pesar de que en el futuro el mtADN probablemente se utilizará menos como marcador único para elucidar la historia de la evolución humana, su análisis seguirá siendo muy importante para numerosos estudios. Entre ellos, para discernir los efectos

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socioculturales que podrían influir en la evolución humana, tales como la poliginia (matrimonio con varias mujeres), los efectos de la matrilocalidad frente patrilocalidad o la estratificación social causada por el sistema de castas (50, 51). Además, gracias a su elevado número de copias el análisis del mtADN es crucial en estudios de ADNs antiguos. De hecho, dependiendo de la edad del fósil estudiado puede suceder que éste sólo tenga mtADN y por lo tanto el análisis de este genoma sería la única forma de obtener información de poblaciones antiguas (52).

Asimismo, el mtADN se utiliza en determinadas aplicaciones forenses, entre ellas, para la identificación de víctimas, que de otro modo no podrían ser identificadas (víctimas de guerra o terrorismo), si los familiares por vía materna están vivos para poder establecer comparaciones. Finalmente, el mtADN se está utilizando cada vez más en las historias genéticas personalizadas. Esto es, la utilización del testado genético para investigar genealogías individuales entre los que se incluyen por ejemplo el trazado de los orígenes de ancestros de inmigrantes y esclavos. Sin embargo, no debe olvidarse que el mtADN comprende sólo 0,0006% del genoma humano total y que aunque su análisis ha sido y será muy informativo para entender la historia y la evolución de la población humana, cuando se trata de ahondar en ancestros genéticos personales sería recomendable tener información adicional del resto del genoma.

AGRADECIMIENTOS

M.E.G. es postdoctoral senior del Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBERER). La investigación de nuestro laboratorio está financiada por el Instituto de Salud Carlos III (PI070167 PI10/00703), el Ministerio de Ciencia e Innovación (PLE2009-0144) y la Comunidad de Madrid (GEN-0269/2006).

ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico mtADN ADN mitocondrial rARN ARN ribosómico tARN ARN de transferencia

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SSU rARN Subunidad pequeña del ARN ribosómico RFLP Del inglés, “Restriction Fragment Length

Polymorphism” pb pares de bases OXPHOS Fosforilación oxidativa

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