Maqueta JOR VITICULTURA 19

I Congreso Agroalimentario de Extremadura

ALMENDRALEJO

XLI Jornadasde VITICULTURA Y ENOLOGÍAde la Tierra de Barros

I Congreso Agroalimentario de Extremadura

Edita:Centro Universitario Santa AnaC/ IX Marqués de la Encomienda, nº 2AlmendralejoTel. 924 661 689http//www.univsantana.com

Ilustración de portada:© Vito Cano. Detalle del mural del mercado de abastos “Las mercedes”Almendarlejo (Badajoz)

Diseño original:

Tecnigraf S.A.

Maquetación: Virginia Pedrero

ISBN: 84-7930-109-0

D.L.:

Imprime: Impresal

Optimización y validación de un método de análisis de compuestos fenólicos en

uvas mediante cromatografía líquida de ultra-alta eficacia (uhplc-pda-fl)

GONZÁLEZ-DE-PEREDO, A.V.1

VÁZQUEZ-ESPINOSA, M. 1

ESPADA-BELLIDO, E. 1

BARBERO, G.F. 1

PIÑEIRO, Z. 2

PALMA, M. 1

1 Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Cádiz, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario (ceiA3), IVAGRO, 11510 Puerto

Real, Cádiz, España.2 IFAPA Rancho de la Merced, Carretera de Trebujena, km 3.2, Apdo. 589, Jerez de la

Frontera, Cádiz, España.

RESUMEN

La uva (Vitis vinifera L.) posee una fuerte actividad antioxi-dante principalmente asociada a su elevada composición fe-nólica. Conocer dicha composición es de gran interés tanto a nivel de salud de los consumidores como de calidad de la ma-teria prima y sus productos. Para ello, es necesario disponer de métodos analíticos eficientes para determinar con selectivi-dad y sensibilidad estos compuestos fenólicos. En este trabajo,

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C O M U N I C A C I O N E S

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se propone como alternativa a los métodos ya disponibles, la cromatografía líquida de ultra-alta eficacia (UHPLC) en fase reversa con detección de fluorescencia y matriz de fotodiodos. La UHPLC incorpora rellenos de partículas de diámetros in-feriores a 2 µm y altas presiones, proporcionando así separa-ciones en un menor tiempo, mayor resolución y sensibilidad. El método fue desarrollado ensayando distintos disolventes, gradientes, temperaturas de columna y flujos. Una vez optimi-zado, permitió la determinación y cuantificación de 27 de los principales compuestos fenólicos presentes en la uva en me-nos de 9 minutos. El método fue además validado presentando una excelente linealidad, límites de detección y cuantificación y precisión. Finalmente, el método desarrollado se aplicó en el análisis de muestras de uvas de vinificación y de mesa, tanto tintas como blancas.

Palabras claves: Flavonoides, fluorescencia, uvas, PDA, com-puestos fenólicos, UHPLC.

ABSTRACT

The grape (Vitis vinifera L.) has a strong antioxidant activity mainly associated with its high phenolic composition. Knowing this composition is of great interest both in terms of consumer health and the quality of the raw material and its products. For this reason, it is necessary to have efficient analytical methods to analyse with selectively and sensitively these phenolic com-pounds. In this paper, reverse phase ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) with fluorescence and pho-todiode array detection has been proposed as an alternative to the already available methods. The UHPLC incorporates particle fillings with diameters below 2 μm and high pressures, thus providing separations in a shorter time, higher resolution and sensitivity. The method was developed by testing diffe-rent solvents, gradients, column temperatures and flows. Once optimized, it allowed the determination and quantification of 27 of the main phenolic compounds present in the grape in less than 9 minutes. The method was also validated, showing excellent linearity, limits of detection and quantification and precision. Finally, the developed method was applied in the analysis of samples of wine grapes and table grapes, both whi-te and red.

Keywords: Flavonoids; Fluorescence, grapes, PDA, phenolic compounds, UHPLC.

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X L I J O R N A D A S D E V I T I C U L T U R A Y E N O L O G Í A T I E R R A D E B A R R O S

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1. INTRODUCCIÓN

En los últimos años ha habido un aumento del interés por parte de la po-blación en las sustancias naturales con actividad antioxidante (Tian et al., 2018). Esto se debe principalmente a que numerosos estudios científicos respaldan una relación positiva entre las sustancias antioxidantes y la pre-vención contra diversas enfermedades (He et al., 2016; Montoro et al., 2006). Como fuentes de antioxidantes naturales, las frutas se han convertido en una de las más importantes (Aidi Wannes et al., 2010). La uva (Vitis vinifera L.), una de las frutas con mayor producción a nivel mundial, presenta una elevada concentración en compuestos fenólicos y especialmente en flavo-noides, compuestos con una elevada actividad antioxidante. Su consumo, tal y como se comentó anteriormente, reduce la probabilidad de desarro-llar enfermedades crónicas, como problemas cardiovasculares, diabetes y cáncer (Samoticha, Wojdyło, Golis, 2017). Por otro lado, son uno de los pa-rámetros de calidad más importantes en los vinos existiendo una relación importante entre la cantidad y estructura de los compuestos fenólicos y el potencial enológico de la uva (Garrido and Borges, 2013) ya que influyen en el color, la estabilidad, el amargor y la astringencia de los vinos (Wojd-yło et al., 2018).

Debido al gran interés actual por el estudio de los compuestos fenólicos y sobre todo por aquellos presentes en matrices de uvas, ha surgido la ne-cesidad de desarrollar métodos para la determinación simultánea de una amplia gama de estos compuestos. La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) ha sido una de las técnicas más utilizadas tradicionalmente (Fonta-na, Antoniolli y Bottini, 2016). Sin embargo, la complejidad de las muestras de uva puede implicar elevados tiempos de análisis, bajas resoluciones o altos límites de detección. (Luo et al., 2017; Wang and Huang, 2004). Existe por tanto, la necesidad de disponer de métodos cromatográficos nuevos que permitan suplir dichas limitaciones. En este estudio, la cromatogra-fía líquida de ultra-alta eficacia (UHPLC) ha sido la alternativa propuesta para el análisis de los compuestos fenólicos por sus relevantes ventajas. La técnica UHPLC permite realizar separaciones de alta resolución gracias al uso de partículas de fase sólida de diámetro inferior a 2 µm. Esto da lugar a una mayor resolución y sensibilidad en períodos de tiempo muy cortos (Tistaert, Dejaegher y Heyden, 2011).



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Aunque la UHPLC puede generar excelentes resultados por todas las pro-piedades anteriormente mencionadas, es necesario que el método desarro-llado tenga las características cromatográficas (temperatura de columna, flujo, gradiente, etc.) más óptimas para así separar de manera eficaz los compuestos. Los artículos encontrados en la literatura no suelen analizar más de 20 compuestos fenólicos en uvas y el tiempo de análisis es general-mente largo (Antoniolli et al., 2015; Fontana et al., 2016; Oliveira et al., 2018). Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue el desarrollo y validación de un método UHPLC-PAD-FL que permita identificar 27 compuestos fe-nólicos en uvas, en un solo análisis y en un tiempo corto. Además, el hecho de no necesitar de la espectrometría de masas es otra gran ventaja, pues esta técnica no suele estar disponible en la mayoría de bodegas y centros de investigación. Por último, se seleccionaron muestras reales de uvas para de-mostrar la aplicabilidad del método desarrollado a muestras de matriz real.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Material biológico

El material biológico empleado en este estudio, fue una amplia gama de variedades de uva, incluyendo uvas de mesa y de vino disponibles en el

“Rancho de la Merced”, Jerez de la Frontera, Cádiz (Los autores agradecen la financiación obtenida a través del proyecto “RTA2014-00083-C03-03”, co-financiado por INIA y fondos FEDER). La extracción de los compuestos fenólicos se realizó mediante extracción asistida por microondas (MAE). Se empleó un método desarrollado por Piñeiro et al., con ligeras modificacio-nes (Piñeiro et al., 2017) y un sistema de digestión por microondas Ethos One (Milestone Srl, Sorisole, Italia) empleando metanol acuoso acidificado y 70ºC de temperatura.

2.2. Disolventes y reactivos

Los estándares comerciales de ácido gálico, ácido protocatéquico, ácido caftárico, ácido p-hidroxibenzoico, procianidina B1, catequina, ácido vainí-llico, ácido clorogénico, procianidina B2, ácido siríngico, epigalocatequina galato (EGCg), ácido p-cumárico, ácido ferúlico, epicatequina galato (ECg), t-piceido, procianidina A2, quercetina 3-galactósido, quercetina 3-glu-

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cósido, quercetina 3-rhamnósido, t-resveratrol y

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–viniferina fueron obtenidos de Extrasynthese (Lyon, Francia). Los estándares de ácido cafeico, epicatequina, kaempferol, quercetina y miricetina fueron obtenidos de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). Todas las disoluciones estándar se prepararon en metanol y a partir de ellas, por dilución en metanol acuoso 50:50, se obtuvieron las rectas de calibrado de cada compuesto. Por otro lado, para el desarrollo y validación del método UHPLC, se empleó una disolución que contenía una mezcla de los 27 compuestos fenólicos. El metanol y el acetonitrilo, ambos de grado HPLC, fueron obtenidos de Panreac (Barcelona, España). El ácido acético se adquirió de Merck KGaA (Darmstadt, Ale-mania) y el agua Milli-Q se obtuvo mediante un sistema de purificación Millipore (Bedford, Massachusetts, Estados Unidos).

2.3. Equipo de cromatografía líquida de ultra-alta eficacia

Los análisis se llevaron a cabo en un equipo ACQUITY UPLC® H-Class System (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, Estados Unidos) acoplado a un de-tector de matriz de fotodiodos (PAD eλ Detector) y a un detector de fluorescencia (FL Detector). El PDA se ajustó a un intervalo de longitudes de onda de 210-400 nm para el barrido 3D. No obstante, el análisis y cuantificación de cada compuesto fenólico se llevó a cabo a una longitud de onda fija (barrido 2D) en función de la longitud de onda de máxima absorbancia de cada compuesto (Tabla 1). En el caso del detector de FL, en función de los resultados obtenidos en un barrido 3D previo, se crearon 2 canales diferentes con unas longitudes de excitación (λex) y emisión (λem) concretas. Los detectores de FL suelen ser más sensibles y específicos que los de PDA. Por ello, usar el detector de FL en paralelo al PDA permite incrementar la sensibilidad en el análisis de dichos compuestos (Dias et al., 2010). La columna em-pleada fue de fase reversa, Acquity UPLC® BEH C18 (1,7 µm, 2,1 x 100 mm, Waters, Milford, Massachusetts, Estados Unidos). Todo el sistema fue controlado mediante el Software EmpowerTM 3 (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, Estados Unidos). Los compuestos estudiados fueron identificados en las muestras de uva por comparación de sus tiempos de retención y espectros de absorción con los de los estándares correspondientes.

2.4. Desarrollo y validación del método UHPLC

Para el desarrollo del método cromatográfico se realizaron diferentes prue-bas empleando siempre la disolución madre que contenía los 27 compues-tos fenólicos de interés. Dichas pruebas consistieron en probar distintos gradientes de agua/ácido acético (2% v/v, eluyente A) y acetonitrilo o metanol (con un 2% de ácido acético, eluyente B), distintas temperaturas (25-55 ºC), y distintos flujos (0,6–0,7- mL min-1). El criterio para seleccionar



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la mejor separación cromatográfica se basó en lograr propiedades cromato-gráficas óptimas: tiempo de retención (tR), resolución (Rs), factor de reten-ción (K) y selectividad (α). Una vez desarrollado el método, la validación del mismo se llevó a cabo teniendo en cuenta las recomendaciones propor-cionadas en la guía ICH Q2 (R1) (Ich 2005). Concretamente, se realizó un protocolo de validación para asegurar la apropiada linealidad, límites de detección (LODs) y límites de cuantificación (LOQs), precisión y robustez del método cromatográfico desarrollado.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Desarrollo del método UHPLC

Para el desarrollo y la validación del método UHPLC-PDA-FL, se inyectó una mezcla de 27 estándares de compuestos fenólicos (14 flavonoides, 10 ácidos fenólicos y 3 estilbenos) en el sistema UHPLC. Aunque el método UHPLC emplea un detector FL en paralelo para aumentar la sensibilidad, el desarrollo del método se centró en lograr la mejor separación de todos los componentes de interés utilizando el PDA. La procianidina A2 es el úni-co compuesto que no se separa adecuadamente mediante PDA, por lo tanto, en el método desarrollado únicamente se analiza en el canal de fluorescen-cia. La búsqueda de las condiciones cromatográficas más adecuadas tuvo como objetivo obtener picos cromatográficos bien resueltos, y con tiempos de separación y presión de columna no excesivamente altos.

3.1.1. Fase móvil

Para la selección de la fase móvil se probó tanto metanol como acetonitrilo, ambos acidificados con ácido acético, como disolvente B, ya que son dos de los más empleados en la cromatografía líquida de fase reversa. Aun-que ambos proporcionaron buenos resultados, se seleccionó finalmente el acetonitrilo debido a la menor viscosidad de este disolvente en compara-ción con el metanol. Esto genera presiones más bajas lo que permite a su vez poder trabajar con flujos más elevados y acortar el tiempo de análisis (Stipcovich et al., 2018). Además, el acetonitrilo presenta alta sensibilidad a longitudes de onda UV cortas, reduciendo el ruido propio de emplear un detector UV-Vis (Sganzerla et al., 2014).

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3.1.2 Gradiente de separación

Se llevaron a cabo varios experimentos de prueba y error. Los primeros gradientes que se probaron mostraron sobre todo dificultades en la sepa-ración de los derivados de quercetina (quercetina 3-galactósido, rutina y quercetina 3-glucósido). Estos compuestos tienen tiempos de retención y espectros UV-Vis muy similares, por lo que los gradientes no óptimos da-ban lugar a picos superpuestos, no siendo posible la correcta identificación. Finalmente, la mejor separación de los compuestos fenólicos se logró con el siguiente gradiente: 0,0 min, 0% B; 1,0 min, 0% B; 4,0 min, 5% de B; 6,0 min, 10% de B; 7,0 min, 20% de B; 7,2 min, 20% de B; 7,5 min, 40% de B; 8,0 min, 45% de B; 8,5 min, 50% de B; 9,0 min, 100% B; 12,0 min, 100% B; 13.0 min, 0% B. Este gradiente permite la separación correcta de los picos en menos de 9 minutos.

3.1.3 Temperatura de la columna

El siguiente paso fue estudiar el efecto de la temperatura de la columna en la separación de los compuestos fenólicos. Para ello, se incrementó gra-dualmente la temperatura de 25 a 55 ºC en intervalos de 10 ºC. Se obtu-vieron mejores resultados a medida que la temperatura aumentaba. Una vez verificado que el método funcionaba mejor a mayores temperaturas, se realizaron nuevas pruebas a 42, 46, 49, 52 y 55 ºC. Como sucedía en el caso anterior, se obtuvieron picos más estrechos y mejores resoluciones a ma-yores temperaturas. Concretamente, a 43 y 47 ºC no se alcanzaba la correc-ta separación del ácido cafeico, vainíllico y clorogénico, superponiendose dichos picos. Estas temperaturas también daban lugar a una separación deficiente de la quercetina 3-galactósido, rutina y quercetina 3-glucósido. Por todas estas razones, se seleccionó una temperatura de 55 ºC. Al ser ésta elevada, reduce la viscosidad de la fase móvil y a su vez la presión de la columna, uno de los problemas más comunes en el análisis de UHPLC (Guillarme, Ruta, Rudaz y Veuthey, 2010). No se ensayaron temperaturas más altas porque, según recomendaciones del fabricante, podían acortar la vida de la columna.

3.1.4. Flujo de separación

Partiendo de un flujo de disolventes inicial de 0,6 mL min-1, se llevaron a cabo varios experimentos aumentando el flujo de 0,6 a 0,75 mL min-1 en in-



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tervalos de 0,05 mL min-1. Con ninguno de los flujos se consiguió la perfecta resolución y cuantificación de todos los compuestos, lo cual es frecuente en muestras complejas con un gran número de componentes. Por ejemplo, a 0,7 y 0,75 mL min-1 se lograba una mejor separación de la quercetina 3-ga-lactósido, la rutina y la quercetina 3-glucósido, sin embargo, los picos de epicatequina y el kaempferol se superponían con los picos adyacentes en el cromatograma. Con respecto a 0,6 y 0,65 mL min-1, aunque la resolución de los tres derivados de quercetina era algo menor, no aparecía ningún pico superpuesto en el cromatograma. Finalmente, teniendo en cuenta todas es-tas ventajas y desventajas, se seleccionó un flujo de 0,6 mL min-1 ya que permitía la separación de todos los picos.

3.2. Características y validación del método cromatográfico

Finalmente, el método cromatográfico desarrollado es el siguiente: 0 min, 0% B; 1 min, 0% B; 4 min, 5% B; 6 min, 10% B; 7 min, 20% B; 7,2 min, 20%; 7,5 min, 40% B; 8 min, 45% B; 8,5 min, 50% B; 9 min, 100% B; 12 min, 100% B; 13 min, 0% B, con un flujo de 0,6 mL min-1, una temperatura de la colum-na de 55 ºC y un volumen de inyección de 3 µL. El tiempo total de análisis, incluyendo el regreso a las condiciones iniciales de análisis (0% B) y el reequilibrado, es de 13 min, mientras que la separación de los compuestos se logra en un tiempo inferior a 9 min. Los cromatogramas obtenidos con el método se recogen en la Figura 1 y las propiedades cromatográficas en la Tabla 2. Una vez desarrollado el método cromatográfico se llevó a cabo su validación, evaluándose la linealidad, límite de detección (LOD) y cuantifi-cación (LOQ), precisión y robustez.

3.2.1. Linealidad

La linealidad del método cromatográfico desarrollado fue evaluada me-diante los coeficientes de determinación (R2) de las curvas de calibrado ob-tenidas para los compuestos fenólicos. Estos coeficientes, (Tabla 3), mues-tran valores iguales o superiores a 0,9990 por lo que se puede afirmar que el método desarrollado muestra una buena linealidad en el rango estudia-do para todos los compuestos y ambos detectores, al ser los valores muy próximos a uno.

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3.2.2. Límites de detección y cuantificación

Los LODs y LOQs del método cromatográfico desarrollado fueron estima-dos como 3 y 10 veces la relación entre la desviación estándar del blanco y la pendiente de la curva de calibrado respectivamente (Tabla 3). Tanto los valores de LODs como los de LOQs son bastante bajos, del orden de los ppm, lo cual coincide con resultados encontrados en la bibliografía (Fonta-na et al., 2016). Tal y como se comentó anteriormente los compuestos anali-zados haciendo uso del detector FL presentan LODs y LOQs más bajos que cuando son analizados mediante PDA. Esto es sobre todo interesante para el caso de la epicatequina y la catequina, que presentan un LOQ en PDA superior al del resto de compuestos, el cual se reduce bastante cuando los estudiamos por FL, permitiéndonos cuantificarlos aunque estén presenten en muy bajas concentraciones en las uvas.

3.2.3. Precisión

La precisión se estudió en términos de repetibilidad y precisión intermedia considerando el tiempo de retención, área de pico, anchura de pico, altura de pico y resolución de pico. Se llevaron a cabo un total de 21 análisis indepen-dientes, 9 análisis de la misma muestra el mismo día y 12 análisis más, reparti-dos en los siguientes dos días consecutivos. De esta manera, se puede evaluar la precisión intermedia mediante el análisis del coeficiente de variación (CV) de los 21 datos de tiempo de retención, área, anchura, resolución y altura de pico, y la repetibilidad mediante la media de los CV de los datos analizados el mismo día (Tabla 3). Todo los CV obtenidos son inferiores a 5%, pudiéndose afirmar que el método cromatográfico desarrollado presenta una buena reso-lución para todos los compuestos y mediante ambos detectores, ya que suele considerarse un 10% como máximo error permitido (Shabir 2003).

3.2.4. Robustez

La robustez del método se evaluó al variar un 5% la temperatura de colum-na, el flujo y el volumen de inyección en relación al tiempo de retención, el área del pico y la resolución. Cada parámetro fue evaluado en tres niveles diferentes y por cada nivel se llevaron a cabo un total de cuatro repeticio-nes. Los resultados se muestran en la Tabla 4, donde diferentes letras en la misma fila significan que hay diferencias significativas de acuerdo con la prueba t, suponiendo varianzas equivalentes (p-valor < 0.05). Excepto



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por algunos compuestos el método desarrollado fue robusto al variar el volumen de inyección en términos de tiempo de retención y resolución. El área no se tuvo en cuenta porque varía en función del volumen de muestra inyectada. Sin embargo, con respecto a los otros parámetros (temperatura de la columna y flujo), el método desarrollado fue muy sensible y suscep-tible a variaciones. Por estas razones, estos parámetros deben controlarse y se debe incluir una declaración de precaución junto con la información del método (Shabir 2003). No obstante, un buen equilibrado y acondiciona-miento del equipo permite obtener la buena resolución y separación que el método ha demostrado poder alcanzar.

3.3. Aplicación a muestras reales

Una vez desarrollado el método UHPLC-PDA-FL, se llevó a cabo un estu-dio adicional para cuantificar los compuestos fenólicos presentes en varias variedades de uvas con el fin de demostrar la aplicabilidad del método en el análisis de matrices reales. Las variedades de uvas analizadas fueron: Albariño (blanca, vinifcación), Mencía (tinta, vinificación), Gewurtztrami-ner (blanca, vinificación), Chardonnay (blanca, vinificación), Flame Seed-less (tinta, uva de mesa), Malbec (tinta, vinificación), Merlot (tinta, vinifica-ción), Graciano (tinta, vinificación), Farryali (tinta, uva de mesa), Cabernet Sauvignon (tinta, vinificación), Sultanina (blanca, uva de mesa), Prunella (blanca, uva de mesa) y Red Ohanes (tinta, uva de mesa). Específicamente, se identificaron 17 compuestos fenólicos en las muestras de uva (Tabla 5). Los otros compuestos fenólicos no aparecen en las muestras, ya sea porque no son características de las variedades o porque aparecen en concentra-ciones muy bajas. Se identificaron 10 flavonoides, 4 ácidos fenólicos y 2 es-tilbenos, siendo por tanto los flavonoides los principales compuestos iden-tificados. Los flavonoides son los compuestos fenólicos más abundantes en uvas y vinos, mientras que los no flavonoides se encuentran en niveles más bajos (Teixeira et al., 2013). Dentro de los flavonoides, se identificaron flavonoles y flavan-3-oles. Respecto a los flavonoles, se detectaron simul-táneamente varios glucósidos de quercetina (quercetina 3-galactósido, y quercetina 3-rhamnósido), concordando estos resultados con los de otras investigaciones (Hsu et al., 2009). Con respecto a los favan-3-oles, se iden-tificaron catequina y epicatequina. Estos compuestos son los flavan-3-oles más abundantes en la naturaleza, en gran parte responsables del sabor ca-racterístico del vino (Garrido y Borges, 2013). En general, las variedades

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blancas analizadas presentan una concentración fenólica más baja que las variedades tintas, no obstante, tienen una concentración alta de ácido caf-tárico. Los ácidos hidroxicinámicos y sus ésteres tartáricos, como el caftári-co, son la principal clase de fenólicos en los vinos blancos (Andreja Vanzo et al., 2007).

Los resultados indican que el método de UHPLC propuesto es aplicable para el análisis de compuestos fenólicos en muestras de uvas. Esto es de gran interés, porque permite caracterizar las variedades según su composi-ción fenólica. Esta caracterización permitirá definir su uso en vinificación o en mesa y seleccionar las variedades de uvas con las mejores características para la producción de vinos con propiedades organolépticas interesantes y propiedades beneficiosas para la salud.

4. CONCLUSIONES

Se ha desarrollado un método UHPLC-PDA-FL rápido y reproducible para la separación de una amplia gama de compuestos fenólicos. El método de-sarrollado proporciona un ahorro sustancial de tiempo, y en consecuencia de disolventes y costos en comparación con los métodos descritos en la bibliografía. Además, se obtuvo una alta repetibilidad y precisión inter-media (CV < 5%) para el ancho, la altura, el área y la resolución de pico. Las condiciones que proporcionaron esta separación eficiente fueron una temperatura de columna de 55 ºC, un flujo de 0,6 mL min-1 y el uso de acetonitrilo acidificado como disolvente B. El método se aplicó con éxito a diferentes variedades de uva, permitiendo analizar y cuantificar los com-puestos fenólicos más característicos en las muestras. Por lo tanto, se pue-de concluir que la combinación de las mejoras cromatográficas de UHPLC con las condiciones experimentales optimizadas, da como resultado una mejora del rendimiento cromatográfico en comparación con los métodos convencionales. El método UHPLC propuesto podría ser muy útil en in-dustrias y bodegas para el análisis de compuestos fenólicos en muestras de uvas reales y probablemente en otras matrices naturales, donde el método desarrollado puede resultar útil como referencia inicial.



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__________________________ C U S A __________________________


207

Figura 1. Cromatogramas de compuestos fenólicos obtenidos con el méto-do desarrollado: (A) empleando PDA (λ = 280 nm); (B) Empleando primer canal de FL; (C) Empleando segundo canal de FL. 1- ácido gálico, 2- ácido protocatéquico, 3- ácido caftárico, 4- ácido p-hidroxibenzoico, 5- procianidi-na B1, 6- catequina, 7- ácido cafeico, 8- ácido vainillico, 9- ácido clorogénico, 10- procianidina B2, 11- ácido siríngico, 12- EGCG, 13- epicatequina, 14- áci-do p-cumárico, 15- ácido ferúlico, 16- ECG, 17- t-piceido, 18- Procianidina A2, 19- quercetina 3-galactósido, 20- rutina, 21- quercetina 3-glucósido, 22- quercetina 3-rhamnosido, 23- kaempferol, 24- t-resveratrol, 25- quercetina, 26- ε-viniferina y 27- miricetina.



208



210

Tabla 1. Características del análisis de compuestos fenólicos y rango de concentraciones.

PDA

COMPUESTOS FENÓLICOS

ΛMÁXIMA ABSORBANCIA

(NM)

ΛCUATIFICACIÓN (NM)

RANGO (PPM)

Ácido protocatequico 259,0

259

0,3-12,9

Ácido p-hidroxibenzoico 254,2 0,3-14,7

Ácido vainíllico 260,2 0,3-13,7

Ácido gálico 270,8

280

0,2-10,2

Procianidina B1 275,6 5,4-31,9

Catequina 278,0 0,3-12,1

Procianidina B2 275,6 0,6-29,3

Ácido siríngico 274,4 0,3-13,2

EGCg 274,4 0,3-14,2

Epicatecquina 278,0 0,4-17,0

ECg 291,1 0,3-13,4

t-Piceido 286,3 0,2-9,7

Ácido p-cumárico 309,0309

0,3-13,3

t-Resveratrol 304,2 0,2-9,1

Ácido cafeico 322,1

320

0,8-15,5

Ácido clorogénico 324,5 0,3-13,9

Ácido caftárico 326,9 0,3-15,4

Ácido ferúlico 322,1 0,3-13,5

ε-Viniferina 324,5 0,3-14,3

__________________________ C U S A __________________________


211

Quercetina 3-galactósido 355,1

350

0,3-13

Rutina 355,1 0,2-11,5

Quercetina 3-glucósido 355,1 0,3-14,6

Quercetina 3-rhamnósido 347,9 0,2-11,8

Kaempferol 371,9

370

26,8-79,7

Quercetina 371,9 0,3-14,2

Miricetina 371,9 0,3-14,2

Detector de fluorescencia

Compuestos fenólicos

λexcitación

(nm)

λemisión

(nm)

Rango

(ppm)

Procianidina B1 250 395 1,3-31,9

ECg 250 395 1,6-26,9

Procianidina A2 250 395 0,2-11,4

Catequina 310 403 0,3-12,1

Epicatequina 310 403 0,4-16,9

t-Piceido 290 310 0,2-9,7

t-Resveratrol 290 310 0,04-9,1

ε-Viniferina 290 310 0,1-31,8



212

PDA


Tiempo de

retención (min)

Anchura (sec)

Factor de retención Selectividad Resolución

Ácido gálico 0,81 8,53 0,68 - -Ácido

protocatéquico 1,48 14,43 2,08 3,04 3,57

Ácido caftárico 1,75 34,19 2,62 1,26 0,60Ácido

p-hidroxibenzoico 2,51 35,12 4,21 1,60 1,32

Procianidina B1 3,31 10,99 5,86 1,39 1,55Catequina 3,48 13,40 6,22 1,06 1,90

Ácido cafeico 3,83 8,29 6,95 1,12 1,94Ácido vainíllico 4,08 8,01 7,47 1,07 0,88

Ácido clorogénico 4,32 20,99 7,97 1,07 1,54Procianidina B2 4,74 14,18 8,84 1,11 2,15c

Ácido siríngico 5,19 20,15 9,77 1,11 1,57EGCG 5,27 5,68 9,94 1,02 1,09

Epicatequina 5,56 6,72 10,52 1,06 1,21Ácido p-cumárico 5,73 11,23 10,89 1,03 1,16

Ácido ferúlico 7,04 20,45 13,61 1,25 4,96ECG 7,16 8,30 13,85 1,02 0,52

t-Piceido 7,29 5,23 14,12 1,02 1,16Quercetina

3-galactósido 7,62 3,64 14,81 1,05 0,96

Rutina 7,64 2,83 14,86 1,00 0,36Quercetina 3-glucósido 7,70 4,43 14,98 1,01 0,98

Quercetina 3-rhamnósido 8,03 5,36 15,65 1,04 3,97

Kaempferol 8,14 5,55 15,89 1,02 1,64t-Resveratrol 8,20 4,06 16,01 1,01 0,68

Tabla 2. Propiedades cromatográficas del método UHPLC-PDA-FL desarrollado.

__________________________ C U S A __________________________


213

Quercetina 8,45 6,83 16,54 1,03 2,76

ε-Viniferina 8.54 7.38 16.71 1.01 0.70

Miricetina 8.63 3.18 16.90 1.01 1.03Detector de fluorescencia


Tiempo de

retención (min)

Anchura (sec)

Factor de retención Selectividad Resolución

Procianidina B1 3,30 8 5,84 - -ECg 7,29 5 14,23 2,42 36,87

Procianidina A2 7,55 3 24,67 1,04 3,97Catequina 3,30 11 5,84 - -

Epicatequina 5,35 2 10,11 1,73 19,00t-Piceido 7,27 3 14,08 1,39 46,00

t-Resveratrol 8,15 3 15,91 1,13 17,59

ε-Viniferina 8,45 4 16,53 1,04 5,14



214

Tab

la 3

. Par

ámet

ros

de la

val

idac

ión

del m

étod

o U

HPL

C-P

DA

-FL

desa

rrol

lado

.

PDA

Cur

va d

e ca

libra

doR

2LO

D

(ppm

)LO

Q

(ppm

)

Tiem

po

rete

nció

nÁ

rea

de p

ico

Res

oluc

ión

pico

Rep

*P.

I**R

ep*

P.I**

Rep

*P.

I**

Áci

do g

álic

oY

= 3

0593

x +

1463

.30.

9999

0.01

460.

0486

0.11

0.56

0.19

2.33

--

Áci

do

prot

ocat

équi

coy

= 34

822x

+

9115

.20.

9992

0.04

250.

1417

0.11

0.84

0.29

1.87

0.53

1.37

Áci

do c

aftá

rico

y =

1678

4x +

91

15.2

0.99

920.

0273

0.09

100.

151.

090.

321.

720.

774.

43

Áci

do

hidr

oxib

enzo

ico

y =

9265

5x +

30

156

0.99

950.

0171

0.05

710.

110.

890.

211.

930.

831.

52

Proc

iani

dina

B1

y =

3081

.7x

- 11

267

0.99

950.

2810

0.93

670.

121.

611.

111.

621.

342.

15

Cat

equi

nay

= 79

54.5

x +

3702

.50.

9994

0.22

940.

7647

0.14

1.32

0.31

0.87

1.71

4.91

Áci

do c

afei

coy

= 43

997x

+

1535

50.

9999

0.01

930.

0643

0.11

1.02

0.75

2.92

1.49

2.27

Áci

do v

ainí

llico

y =

1901

7x +

96

02.1

0.99

910.

0569

0.18

960.

110.

991.

643.

561.

314.

03

Áci

do c

loro

géni

coy

= 26

134x

+

1141

50.

9995

0.08

930.

2976

0.18

1.15

0.18

1.87

2.18

4.86

Proc

iani

dina

B2

y =

2684

.9x

+ 40

16.4

0.99

990.

1707

0.56

890.

341.

040.

542.

112.

303.

36

Áci

do s

irín

gico

y =

3607

5x +

16

719

0.99

920.

0832

0.27

720.

310.

900.

321.

451.

012.

17

__________________________ C U S A __________________________


215

EGC

gy

= 19

86.2

x –

674.

560.

9990

0.53

041.

7681

0.32

0.90

1.73

4.86

4.66

4.90

Epic

ateq

uina

y =

8084

x +

5275

.90.

9993

0.15

450.

5150

0.35

0.89

3.48

4.64

1.89

3.56

Áci

do p

-cum

áric

oy

= 12

3268

x +

3806

90.

9994

0.06

120.

2042

0.26

0.76

1.73

2.21

3.96

4.61

Áci

do fe

rúlic

oy

= 66

739x

+

2572

20.

9990

0.12

710.

4238

0.39

0.55

0.30

1.92

2.07

3.35

ECg

y =

2549

0x +

67

57.3

0.99

970.

0680

0.22

650.

280.

401.

512.

333.

444.

62

t-Pi

ceid

oy

= 65

789x

+

1575

20.

9997

0.04

560.

1520

0.18

0.30

0.34

2.96

3.20

4.43

Que

rcet

ina

3-ga

lact

ósid

oy

= 27

155x

+

6685

.10.

9999

0.04

460.

1488

0.22

0.31

0.41

2.70

3.06

4.73

Rut

ina

y =

3135

9x +

77

62.2

0.99

960.

0957

0.31

890.

260.

340.

801.

923.

524.

21

Que

rcet

in

3-gl

ucós

ido

y =

2528

6x +

65

89.1

0.99

940.

0544

0.18

120.

270.

340.

842.

941.

744.

16

Que

rcet

in

3-rh

amnó

sido

y =

3278

5x +

89

35.9

0.99

940.

0528

0.17

610.

360.

450.

442.

964.

424.

56

Kae

mpf

erol

y =

1439

9x –

40

3945

0.99

960.

0833

0.27

780.

330.

423.

644.

503.

664.

99

t-R

esve

ratr

oly

= 12

4798

x +

3064

50.

9998

0.01

160.

0313

0.25

0.33

0.37

1.91

3.72

4.86

Que

rcet

ina

y =

6342

0x -

2054

40.

9990

0.02

440.

0814

0.22

0.30

0.52

1.04

3.20

4.12

ε-V

inife

rina

y =

5381

2x +

15

145

0.99

990.

0750

0.25

000.

240.

330.

391.

593.

073.

88



216

Mir

icet

ina

y =

3864

2x +

23

552

0.99

910.

0119

0.03

950.

270.

343.

103.

204.

404.

81

Det

ecto

r de

Fl

Proc

iani

dina

B1

y =

3242

x -

1351

60.

9991

0.18

700.

8790

0.37

1.53

4.07

4.19

--

ECg

y =

2549

0 x

+ 67

57.3

0.99

970.

0521

0.11

600.

240.

481.

773.

932.

162.

30

Proc

iani

dina

A2

y =

7016

.1 x

+

4038

.30.

9990

0.19

300.

9790

0.18

0.33

3.19

4.51

4.32

4.62

Cat

equi

nay

= 40

7267

x +

23

5473

0.99

900.

1729

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171.

341.

223.

21-

-

Epic

ateq

uina

y =

6556

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+

3659

340.

9991

0.02

850.

1527

0.32

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1.22

0.22

1.60

2.76

t-Pi

ceid

oy

= 30

0000

00

x –

1000

0000

0.99

950.

0151

0.05

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240.

390.

020.

041.

052.

44

t-R

esve

ratr

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= 10

0000

00

x - 2

0000

000

0.99

900.

0102

0.02

100.

230.

350.

010.

051.

552.

31

ε-V

inife

rina

y =

1000

0000

x

- 100

0000

000.

9992

0.01

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0.44

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2.46

4.26

* Coe

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la R

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(Rep

.) (%

) (n

= 9)

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(P.I)

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n =

21).

__________________________ C U S A __________________________


217

Tab

la 4

. Aná

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de

la r

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o U

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-

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do

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Proc

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dina

B1

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1,90

c

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do c

afei

co-

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4a3,

832b

-84

3951

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-

__________________________ C U S A __________________________


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-

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226

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--

-

__________________________ C U S A __________________________


227

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Proc

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A2

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-

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14a.

b5.

18b



228

Tab

la 5

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0,1

__________________________ C U S A __________________________


229

Que

rcet

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3

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80,

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00,

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0,1

± 0,

00,

2 ±

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± 0,

10,

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0,1

± 0,

10,

1 ±

0,0

0,1

± 0,

0

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± 1,

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±

1,2

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± 0,

01,

8 ±

0,0

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±

2,3

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± 1,

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1 ±

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0,1

0,2

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6 ±

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± 0,

01,

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±

3,0

5,5

± 1,

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8 ±

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,0

± 0,

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±

2,3

16,1

±

1,0

16,3

±

1,9

13,3

±

3,8

24,8

±

0,8

59,5

±

5,2

59,3

±

3,2

13,0

±

1,3

43,8

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0,0

17,2

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0,9

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1,7

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Maqueta JOR VITICULTURA 19

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