Manual de Laboratorio de Micologia (1)

|||||UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO.

Laboratorio de Micologa.

ELABORADO POR Catedrtico: M. F. Abraham Soto Cid.

Manual de Laboratorio de Micologa.

Grupo:

Xalapa de Enrquez, Ver; a _____________________________

LABORATORIO DE MICOLOGIA. UNIVERSIAD VERACRUZANA FACULTAD DE Q.F.B.

NDICE.

Prctica 1. Examen en fresco3 Prctica 2. Tincin de hongos20 Prctica 3. Mtodo de Burri.32 Prctica 4. Cultivo de hongos.40 Prctica 5. Microcultivo57 Prctica 6. Gnero Cndida.65 Prctica 7. Gnero Aspergillus77 Prctica 8. Dermatofitos...85 Prctica 9. Inmunologa Micolgica.93 Prctica 10. Micosis Profundas108

PRACTICA 1. EXAMEN EN FRESCO.OBJETIVO: Que el alumno realice tinciones comunes de hongos y se entere de los mtodos especiales que existen para tinciones de los mismos. GENERALIDADES:

MC. Mara Edith Riao Snchez

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Existen sobre la tierra, aproximadamente, 2 millones de seres vivos, y entre 80, 000 y 100, 000 constituyen el grupo formado por los hongos. La mayora de ellos son tan pequeos que pasan inadvertidos, pero poseen una capacidad extraordinaria de vivir a expensas de los otros seres; en algunos casos forman verdaderas simbiosis y en otros los parasitan definitivamente. El hombre no est excluido del ataque de los hongos. Estos lo perjudican directamente cuando le causan una enfermedad e indirectamente cuando atacan plantas tiles o cultivos, objetos o artefactos costosos, arruinndolos definitivamente en muchos casos. La agricultura se ve seriamente comprometida si no se combaten las micosis de las plantas, como el tizn del trigo y las papas, o no se impide la proliferacin de diferentes tipos de hongos en sitios de almacenamiento por ejemplo silos trigueros, etc. Muchos productos manufacturados, tales como telas, cueros, muebles y productos alimenticios, son atacados por los hongos que proliferan rpidamente, inutilizndolos parcial o totalmente. No existen productos biolgicos y a veces minerales que no sean invadidos por los hongos. Quin no ha observado soluciones salinas en los laboratorios que han sido invadidas por mohos? Especialmente las soluciones cidas presentan crecimientos fngicos en su superficie, no as las alcalinas. La ganadera tambin tiene problemas de micosis que pueden ser superficiales como las tias o profundas como la histoplasmosis. Tambin los animales faenados presentan buen sustrato para los hongos; ya que existe un extenso captulo en la literatura micolgica dedicado a las micosis de las carnes. El hombre se ve afectado por los hongos cuando estos le provocan enfermedades que pueden ser leves como las dermatomicosis o graves como las paracoccidioidomicosis. Hasta ahora hemos considerado el aspecto negativo de la actividad fngica respecto del hombre, pero este tambin sabe utilizarla para su provecho como en la industria de los medicamentos y ciertos alimentos. Quin no conoce el extraordinario aporte a la medicina con el advenimiento de los antibiticos? Quin no gusta de un buen vino o cerveza o un sabroso queso Roquefort o Camemebert? Caractersticas Generales de los Hongos Todos son hetertrofos (quimioorganotrficos) por lo que tienen que alimentarse de materia orgnica preformada que utilizan como fuente de energa y de carbono.


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Son eucariotas, es decir, presentan un ncleo diferenciado con membrana bien organizada. Tiene una pared celular formada por quitina; esta pared es rgida, por lo que no pueden fagocitar alimentos sino que absorben nutrientes simples y solubles que obtienen al desintegrar polmeros mediante enzimas extracelulares llamadas despolimerasas. La estructura fngica consta de un complejo llamado talo o micelio (fig.1), que a su vez est constituido por mltiples filamentos o hifas (hyphomycetes o mohos) o, menos a menudo, por estructuras unicelulares o levaduras (blastomycetes); estas ltimas se reproducen por gemacin (Saccharomyces cerevisiae) y muy rara vez por fisin binaria (Schizosaccharomyces pombe), tambin son una excepcin los Chytriomycetes, formados por clulas redondas grandes con rizoides, y los mohos mucilaginosos, que carecen de pared celular y pueden alimentarse por fagocitosis (Fig. 1).

Fig 1. Estructura del talo o micelio de mohos y levaduras y de dos formas poco frecuentes. Talo Est constituido por dos partes: a) talo vegetativo que asegura el desarrollo, nutricin, fijacin y edificacin de la parte reproductora y b) talo reproductor donde se forman los rganos de reproduccin. Puede estar representado por hifas, levaduras o pseudohifas (blastosporas que no se


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separan) (fig. 2). Fig. 2. Fase micelial y de levadura con talo reproductor y vegetativo. Si el talo est disociado, se producen colonias de levaduras de crecimiento rpido, consistencia cremosa y que se resiembra como las bacterias en puntos o estras. Si el talo es filamentoso da lugar a colonias de mohos de crecimiento centrfugo, con filamentos areos entremezclados, mas o menos largos, o agrupados de manera compacta, con superficie glabra recubierta de vello fino, el crecimiento es lento salvo en hongos oportunistas. Los hongos que tienen una fase parasitaria levaduriforme y una saproftica micelial, y que en respuesta a cambios ambientales pasan de una fase de 20 a 25C a la fase de levadura a 37C o viceversa, se llaman dimorfos (fig. 1). Modificaciones del Talo Los hongos presentan diferencia en su forma y constitucin, importantes para diferenciarlos: dilataciones o vesculas; rganos de resistencia o clamidosporas; rganos de fijacin como rizoides y apressorium, hifas en espiral o tirabuzn; rganos nodulares formados por hifas torcidas en forma de nudo; hifas en raqueta, con un ensanchamiento en un extremo; candelabros fvicos (hifas en cuerno o asta) que estan dados por varias ramificaciones al final de una hifa; hifas pectinadas o en forma de peine; hifas peridiales, que son ensanchadas y multiseptadas con terminacin en espiral (fig. 3) y acumulacin de muchas hifas (esclerotre o esclerocio), cuyo objetivo es almacenar sustancias de reserva. Otras agregaciones miceliales son los coremios y sinemas (con rganos de fructificacin y sin ellos, respectivamente) o estromas redondeados frtiles y asexuados como los picnidios, o sexuados como el apotecio (aspecto de copa), peritecio y cleistotecio (con ostiolo y sin l respectivamente.)


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Fig. 3. Modificaciones microscpicas del talo Biologa Para comprender los mecanismos biolgicos de adaptacin y de invasin de los hongos cuando producen una enfermedad al hombre, es necesario describir someramente los fundamentos de la biologa de los mismos. A los hongos se les considera como plantas por que poseen membrana celulsica pero carecen de la funcin cloroflica que es la condicin fundamental para ser incluidas dentro de los vegetales. Su nutricin es parecida a la de los animales, siendo heterotrficos como ellos, se reproducen mediante esporos y por eso se parecen a ciertos vegetales autotrficos como los helechos. Por lo tanto, participan de las caractersticas de los vegetales y de los animales. Por su carcter de heterotrficos se ven obligados a alimentarse de sustancias orgnicas preformadas, viviendo muchos de ellos como saprofitos en el suelo, sobre las plantas, en aguas, etc., son los principales mineralizadores de sustancias orgnicas. Otros son parsitos de plantas y animales, entre ellos el hombre; su adaptacin al parasitismo obligatorio es la causa de muchas enfermedades leves o graves de dichos seres. Algunos pueden vivir como parsitos y como saprofitos; entre ellos estn algunos hongos que causan enfermedades al hombre por ejemplo los Dermatofitos, que han sido aislados del suelo en todas partes del mundo.


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Desarrollo Un esporo o un trozo de micelio germina y origina una prolongacin que va creciendo apicalmente y forma ramificaciones. Este crecimiento se denomina micelio o cuerpo del hongo. Cada clula de micelio consta de una pared, que encierra protoplasma y uno o varios ncleos (fig. 4). Dicho micelio mide algunos micrones, de 5 a 20 de dimetro. En cada una de las clulas que constituyen el micelio se producen enzimas que difunden hacia el medio externo simplificando el sustrato sobre el cual se encuentra el hongo y estas sustancias simplificadas difunden hacia al anterior de la clula donde participan en los procesos metablicos del hongo. Fig. 4. Esquema estructural de los hongos La clula fngica tiene las caractersticas tpicas de las eucariotas: un ncleo con cromosoma, una membrana nuclear y organelos citoplasmticos, como las mitocondrias y el retculo endoplsmico (fig. 4). Normalmente, los hongos se encuentran en estado haploide aunque pueden formarse ncleos diploides por fusin nuclear, durante el proceso de la reproduccin sexual. La estructura de la clula consiste en la pared celular (rgida) y la membrana citoplsmica, en la que predomina el ergosterol. Por el contrario, en las membranas de los mamferos el esteroide predominante es el colesterol. La estructura qumica y antignica de la pared celular es muy distinta a la de las clulas bacterianas ya que no contiene pptidoglucano ni cidos teicoicos derivados del glicerol ni del ribitol, ni tampoco lipopolisacridos. En su lugar se encuentra pptidomanano, glucano y quitina, asociados, muy estrechamente entre s y a las protenas estructurales. Reproduccin Existen hongos unicelulares como las levaduras y pluricelulares como la gran mayora, por ejemplo el moho del pan.


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A partir de este micelio o talo que es el cuerpo del hongo (que puede ser uni o pluricelular) se producen los rganos reproductivos que pueden ser muy rudimentarios o ms complejos segn la especie. Lgicamente un hongo unicelular se reproducir mediante mecanismos simples, tales como la divisin directa por brotacin o esquizogonia, mientras un Mucor (pluricelular) originar un aparato reproductor especializado denominado esporangio en el cual se formarn los esporos asexuados.

Esporas internas y externas y sus clulas productoras

Micelio continuo y fructificacin asexuada de Phycomycotes con esporangiforos, esporangios y esporangiosporos

ESQUEMAS DE REPRODUCCIN SEXUADA


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Reproduccin sexuada de una levadura perfecta con formacin de un asco con ascosporos en su interior. A, levaduras de polaridad opuesta. B, emisin de mameln copulativo. C, formacin del tubo copulativo. D, plasmogamia y cariogamia. E, mitosis y formacin de dos ncleos sexuados. F, formacin de cuatro ncleos. G, formacin de cuatro ascosporos.


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Existen hongos que en determinado momento de su ciclo biolgico se reproducen sexuadamente mediante la conjuncin de micelios de distinta polaridad (plus + y minus -) o mediante verdaderos gametos diferenciados, tales como el anteridio y el oogonio, dando lugar a la formacin de huevos o cigotos o esporos asexuados. Como se ha enunciado anteriormente, la actividad biolgica y la morfologa que caracteriza a un hongo a lo largo de su ciclo biolgico, son las bases sobre las cuales se asienta el reconocimiento o identificacin de la especie. REACTIVOS: Solucin aclarante : a. KOH (del 10 al 30%) b. NaOH (del 10 al 30%) Funcin: Con la utilizacin de la solucin aclarante las protenas, grasas y muchos polisacridos del sustrato son solubilizados (hidrolizados) y los tejidos aparecen ptimamente claros. Las paredes celulares de la mayor parte de los hongos permanecen intactas a causa de la resistencia a los lcalis de los glucanos. Material Portaobjetos Cubreobjetos Asa de platino o micromel Porta asa Equipo Mechero bunsen Microscopio Muestra biolgica Cualquier alimento u objeto que tenga hongos


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TCNICA: 1. Flamear y enfriar el asa 2. Poner una gota de solucin aclarante sobre un portaobjetos 3. Tomar una asada de su muestra biolgica y depositarla sobre la gota de solucin aclarante 4. Cubrir la preparacin con un cubreobjetos 5. Flamear el asa 6. Observar al microscopio la preparacin con seco dbil y seco fuerte 7. Anotar sus observaciones macroscpicas y microscpicas 8. De la misma forma montar las preparaciones necesarias hasta tener 50 observaciones. NOTA. No olvide limpiar su mesa de trabajo antes y despus de la prctica, as como tambin su microscopio y no depositar la basura en los lavabos.

OBSERVACIONES GENERALES:


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Sustrato utilizado____________. Color del la colonia______________. Aspecto: ________________. Consistencia: _______________. Estructura: observada________________. 40 X.

Sustrato utilizado: __________. Color de la colonia: ______________. Aspecto: ________________. Consistencia: _________________. Estructura:______________________. 10 X.



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CONCLUSIN:

GLOSARIO


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Talo unicelular: levaduras, candida, etc.

Talo plurcelular: onjunto de filamentos o hifas que se desarrolla a partir de un esporo y que constituye el cuerpo del hongo. Puede ser filamento continuo o tabicado.

Hifa: cada filamento que constituye el talo pluricelular o micelio Micelio: sinnimo de talo Pseudomicelio: crecimiento que caracteriza a ciertas especies de hongos levaduriformes cuando se desarrollan en condiciones determinadas.

Esporos: rganos de reproduccin del hongo: pieden der sexuados o asexuados.

Endoesporos: cuando se originan dentro de un rgano de reproduccin, ejemplo: esporangio.


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Esporangio: cuerpo de fructificacin del micelio reproductivo de los Phycomycetes en el cual se originan esporos asexuados internos: endosporos.

Exoesporos: rganos de reproduccin llamados tambin conidias, que se originan fuera de los cuerpos de fructificacin o directamente en el micelio con o sin conidiforos.

Conidiforos. Parte del micelio de reproduccin especializado para producir u originar las conidias. Conidias: exoesporos Microconidias: exoesporos pequeos de 3 a 6 micras, de forma variada. Macroconidias: exoesporos grandes tabicados de 50 a 80 micras. Tamao comparativo entre macro y microconidias

Micelio en espiral o espirales: hifas enrolladas como si fuera un resorte.


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Macroconidia: desarrollo fngico que se realiza para estudiar el aspecto morfolgico macroscpico y tambin para observar la posible produccin de un pigmento. Ascosporos: esporos sexuados que se originan en un cuerpo de fructificain denominado asco que caracteriza a los Ascomycetes.

Blastosporos: esporos asexuados originados por brotacin o gemacin.

Artrosporos: esporos asexuados originados por fragmentos de un talo o una hifa.

Clamidosporos: formas de resistencia que caracterizan a ciertos hongos entre los cuales figura Candida albicans.

BIBLIOGRAFA:


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Micologa Mdica, R. Arenas; Ed. Interamericana Mc Graw Hill. Diagnstico Micolgico, Amadeo DAlessandro; Ed. Panamericana Microbiologa Mdica; J. C. Sherris; Ed. Doyma. Tratado de Micologa, B. D. Davis, R. Bulbecco, H. N. Eisen, H. S. Ginisberg; Ed. Salvat.

Xalapa, Ver., a

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Vo. Bo.

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PRACTICA 2. TINCIN DE HONGOS.OBJETIVO: Que el alumno realice tinciones comunes de hongos y se entere de los mtodos especiales que existen para tinciones de los mismos. GENERALIDADES: COLORANTES. Los colorantes han sido utilizados desde los tiempos ms remotos, emplendose como tales diversas materias coloreadas procedentes de los reinos vegetal y animal, as como distintos minerales; pero desde mediados del siglo XIX, se han obtenido colorantes derivados del alquitrn de hulla, habiendo desplazado casi totalmente a las materias colorantes naturales. El uso de los colorantes ha contribuido notablemente al progreso de la investigacin y las tcnicas de coloracin se han ido perfeccionando a tal grado que hoy en da, adems del estudio meramente morfolgico de las estructuras biolgicas, permite un examen ms til de la composicin qumica de las mismas, as como el anlisis de algunos importantes procesos funcionales de las clulas; todo esto ha sido posible gracias al conocimiento de la estructura qumica de las sustancias colorantes y de la afinidad de estas con determinados sustratos. El estudio morfolgico, microscpico, de los tejidos naturales y de las clulas que los constituyen, necesita casi siempre de la coloracin, pues la observacin de las imgenes por difraccin que dan las preparaciones incoloras, sobre todo cuando, como ocurre en aquellas, que tienen sus partes constitutivas el mismo ndice de refraccin. Sea por unin de grupos atmicos de afinidad qumica manifiesta, sea por transposicin de ciertos tomos que originan transformaciones tautmeras, el hecho es que una coloracin se verifica cuando la sustancia en cuestin absorbe tal intensidad, que no se decolora ya luego por un lavado con el disolvente que sirvi para preparar el reactivo tintreo. A veces acta el colorante directamente, otras, frecuentemente, precisan en cambio la accin previa o simultnea de MC. Mara Edith Riao Snchez 19


otra sustancia llamada mordiente, que facilita la tincin de la materia en cuestin, formando con el colorante una combinacin estable que se llama laca. Hay partidarios de una teora qumica de la coloracin, para los cuales se produce una verdadera sal por combinacin del colorante con las sustancias que se tien; otros, creen en una teora fsica, y no admiten en el proceso ms que una fijacin mecnica de las molculas del colorante, como consecuencia de una serie de fenmenos de adsorcin. Y, entre ambas concepciones, extremas y radicales, va tomando cuerpo una opinin, ya sustentada por UIT, y razonada por los investigadores de Vant Hoff, en la que se admite que en el proceso de una coloracin existe una seleccin slida entre las sustancia por teir y la materia colorante, es decir, que el color y las propiedades tintreas estn relacionadas con la presencia, en la molcula, de dos agrupaciones caractersticas llamadas cromforo y auxcromo. Los primeros confieren a la molcula de la sustancia que los contienen, llamada cromgeno, la capacidad real o potencial de mostrarse coloreada, pues la presencia de un cromgeno provoca un efecto batocromo que no conduce siempre a la aparicin de un color. El cromforo aunque sea coloreado, no es capaz de teir; adquiere esta propiedad cuando se introducen en la molcula los grupos auxcromos. Por si solos los auxcromos no estn coloreados, pero cuando se hallan en presencia de cromforos provocan efecto batocrmico que convierten a la sustancia coloreada en colorante. Modernamente se ha podido comprobar que la adsorcin de la luz de un determinado color por parte de un compuesto qumico, y la cuanta de esta absorcin, estn ntimamente ligadas con el estado en que se encuentran los electrones que alcanzan entre s los tomos que componen las molculas. Los grupos cromforos poseen la capacidad de absorber la luz visible y los auxcromos son capaces de acentuar el color. De acuerdo con esta exposicin, se puede considerar como cromforos a grupos que por s solos resultan incoloros, la nica condicin es que su absorcin de luz se desplace hacia el visible mediante la adicin de un grupo intensificador conveniente. Los colorantes atendiendo a su afinidad en la funcin tintrea pueden clasificar en bsicos, cidos, neutros e indiferentes, como se muestra en la tabla #1, que contiene los principales colorantes usados en las tcnicas microscpicas.


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Los colorantes bsicos pueden clasificarse como sales cuya base posee color y el cido es incoloro; en los colorantes cidos ocurre al contrario, es la parte cida la coloreada. Los colorantes bsicos poseen afinidad por el ncleo de las clulas, y por eso fueron llamados tambin nucleares. Los colorantes cidos, en cambio, se llaman citoplsmicos y se fijan preferentemente sobre el citoplasma. En nmero menor, existen unos colorantes llamados neutros, en los cuales la base y el cido son coloreados; estos colorantes, tienen gran importancia en hematologa y entran en la categora de los colorantes compuestos. Finalmente se ha constituido el grupo de los colorantes indiferentes, que no son cidos ni bases ni poseen grupos capaces de formar sales; son insolubles en agua y hay que usarlos en solucin alcohlica o etrea. Tabla #1. Clasificacin de los colorantes en base a su funcin tintrea. Tionina. Cristal violeta. Violeta de genciana. Violeta de cresil. Violeta de metilo. Azul de toluidina. Azul de metileno. Azur de metileno. Bsicos. Verde brillante. Verde de metileno. Verde malaquita. Azul Nilo. Azul de cresil. Fascina bsica. Safranina. Rojo neutro. Vesubina (Pardo bismarck) cido pcrico. Amarillo victoria. cidos. Amarillo naftol. Amarillo martines. Eosina. Fascina cida. Neutros. Picrato azul de metileno. Eosinato de azul de metileno. Eosinato de azur de metileno. Picrato de verde de metilo.


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Verde Diazina. Sudn III Rojo escarlata. Por lo que respecta a procedimientos de tincin, tenemos tinciones simples, negativas y diferenciales. Indiferentes. En la tcnica de tincin simple, el teido de las bacterias se lleva a cabo aplicando exclusivamente una solucin colorante. Los colorantes ms comnmente usados son la fucsina fenicada, azul de metileno, violeta de genciana o cristal violeta y la safranina. La tincin en negativo es otro procedimiento que permite observar las clulas, no coloreadas destacndose bien perceptibles sobre el fondo de la extensin bien teida en negro. La ventaja que presenta este procedimiento para el estudio de la morfologa es que las clulas no reciben tratamiento fsico o qumico enrgico. Es muy apropiado para los organismos capsulados. Los procedimientos de coloracin que ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas o entre partes de una misma clula, se denominan tcnicas de tincin diferencial. Son algo ms complicadas que las de tincin simple por cuanto se expone la preparacin a ms de una solucin colorante, o se emplean ciertos reactivos complementarios para la tincin. Las dos coloraciones ms importantes son la de Gram y la de grmenes cido resistentes. La tincin de Gram se basa en los constituyentes y permeabilidad de las paredes celulares de las bacterias para retener o no el cristal violeta, clasificndolas en gram negativas y gram positivas. Se inicia con la aplicacin de un colorante bsico, posteriormente se aplica una solucin de lugol. En este momento, todas las bacterias se tien de morado. A continuacin, se trata con un agente decolorante (alcohol-acetona) y por ltimo con el colorante de contraste; las clulas gram positivas retienen el colorante cristal violeta-yodo, permaneciendo color morado; por otra parte, las clulas gram negativas previamente decoloradas toman el colorante de contraste; esto se basa en el elevado contenido graso de las paredes celulares de los organismo gram negativos. Las muestras experimentales muestran que, durante la prctica del procedimiento, el tratamiento alcohlico extrae las grasas aumentando la permeabilidad o la porosidad de la pared celular de los microbios gram negativos. El complejo cristal violeta-yodo se extrae as por el organismo gram negativo se decolora. Las paredes celulares de las bacterias gram positivas, a causa de su diferente composicin, se deshidratan por el alcohol, el tamao de los poros disminuye, se reduce la permeabilidad y el complejo cristal violeta-yodo no se extrae. MC. Mara Edith Riao Snchez 22


Existen muchos mtodos para teir los hongos, algunos de los cuales son: Hematoxilina. La hematoxilina tie prcticamente todos los hongos; pero en muchos casos, el contraste en los cortes no es muy satisfactorio. Tincin de Gram. Antes del descubrimiento de otros mtodos, el de Gram era el ms difundido. Los cuerpos centrales de los hongos encapsulados como Criptococos y blastomices son fuertemente gram positivos. Las cpsulas de casi todos los hongos son gram positivos, pero pierden fcilmente su color si se utiliza acetona. El mtodo de Gram permite encontrar casi todos los hongos en los tejidos (cndida, aspergilio, criptococos, histoplasmas, blastomices, actinomices.) Los micelios son gram positivos; las esporas son gram negativas y tambin gram negativos es Actinobacillus, Actinomycetem Comitans, que los acompaan con frecuencia. Tincin de Giemsa. La solucin de Giemsa es excelente para Histoplasma capsulatum, y tambin puede emplearse para Criptococcus. Tincin de Ziehl-Neelsen. Tie algunas especies de Nocardia y microorganismos acidorresistentes, como N. Asteroides y N. Brasillensis. El micelio de A. Israel no es cido resistente, pero las esporas resisten a la decoloracin con cido al 1% hasta durante 30 segundos en la tcnica de ziehlNeelsen. Metacromasia de las cpsulas. Las cpsulas de Criptococcus Neoformans y de los Blastomices muestran tinciones metacromticas (de rosa a violeta) con azul de toluidina (o tionina.) Tinciones especiales. Las cpsulas y las paredes de los hongos son ricas en polisacridos, lo que permite aplicar varios mtodos muy elegantes.


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Tcnica PAS de Hotchkiss-McManus. Es utilizada para cortes y frotis, por ejemplo de raspado de piel. Se puede emplear como colorante de contraste hematoxilina de Harris o PTAH de Mallory, durante 30 segundos a un minuto. N. B. Actinomyces y Nocardia se tien mal o no se tien con las tcnicas de PAS, de Gridley y de Grocott; es preferible estudiarlos por el mtodo de Gram. Tcnica de Bauer-Feulgen. La gran cantidad de grupos aldehdo en las paredes de quitina celulosa de los hongos permite aplicarles cido crmico que destruye grupos aldehidgenos de muchos otros elementos de manera que disminuye la intensidad de fondo al aplicar la tincin de Schiff. Azul anciano. El azul anciano tiene gran afinidad por los carbohidratos cidos, y se puede aprovechar para teir las cpsulas de las bacterias y hongos; tambin puede combinarse con la tcnica de PAS. Tincin de Gridley para los hongos. Es una modificacin del mtodo del cido crmico-Schiff; en realidad constituye una combinacin del mtodo de Bauer-Schiff, que tie los conidios y esporas y del aldehdo-fucsina de Gomori, que tie las hifas. Es excelente para estudiar las paredes del hongo. S pueden emplear cortes en parafina de cualquier tejido bien fijado. TCNICAS, TINCIONES Y FRMULAS. I. Reactivos: 1.- KOH al 10%: KOH 10 grs. Agua destilada 90 ml. Uso: como solucin aclarante para exmenes directos. Se puede preparar al 20%. 2.- KOH glicerinado: KOH 10 grs. Glicerina 10 ml, agua destilada 80 ml. Uso como solucin aclarante para exmenes directos; la ventaja de esta solucin radica en que se evapora en menor proporcin. 3.- NaOH-AzurParker: NaOH al 10% 90 ml. Tinta azul de Parker 10 ml. Uso: Como colorante para exmenes directos de pitiriasis versicolor e infecciones por Pytirosporum sp. 4.- Lugol: KI 1 gr. Cristales de yodo (1) 1.5 grs. Agua 100 ml. Uso: solucin de contraste, para exmenes en fresco de exudados y secreciones. Colorantes: REACTIVOS Y COLORANTES.


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5.- Azul algodn actico: Azul de algodn 0.5 grs. cido actico 3 ml. Agua destilada 97 ml. Uso: Como colorante de microcultivos. 6.- Azul de lacto-fenol: Azul de algodn (de anilina) 0.05 grs. Glicerol 40 ml. Fenol (cristales) 20 grs. cido lctico 20 ml. Agua destilada 20 ml. Preparacin: Disolver el fenol en cido lctico, posteriormente se agrega agua y glicerol, calentando ligeramente; por ltimo se adiciona el azul de algodn. Uso: Para exmenes directos de las cepas. 7.- Azul de metileno: Azul de metileno 0.3 grs. Alcohol etlico (95%) 30 ml. Agua destilada 70 ml. Uso: como colorante de contraste en tinciones de AAR, o para exmenes directos de cepas. 8.- Azul de tripano: azul de tripano 1 g. Agua destilada 100 ml. Uso: colorante de microcultivos. 9.- Alcohol cido (modificado Ziehl-Neelsen): cido sulfrico 0.5 ml. Agua destilada 99.5 ml. Uso: para tincin de cido alcohol resistencia de actinomicetes (Nocardia) 10.- Solucin de cristal violeta: Solucin A :Cristal violeta 2 g. Alcohol etlico 95% 20 ml. Solucin B: oxalato de amonio 0.9 g. Agua destilada 80 ml. Preparacin: mezclar solucin A y B y dejar reposar por 24 horas; filtrar Uso: Colorante de Gram. 11.- Eritrocina: eritrosina 1 g. Alcohol etlico 1 ml. Agua destilada 98 ml. Preparacin: disolver el colorante en alcohol etlico, posteriormente agregar el agua destilada. Uso: como colorante de microcultivos. 12.- Fucsina bsica o carbn fucsina: Solucin A: solucin bsica 4 g. Alcohol etlico 20 ml. Solucin B: fenol (cristales) 8 ml. Agua destilada 100 ml. Preparacin: obtenga solucin A, deje reposar 24 horas, posteriormente agregue solucin B y filtre en papel. Uso: para tincin de AAR de microbacterias y Nocardia. 13.- Solucin de Giemsa: Giemsa 1 g. Glicerol 66 ml. Metanol absoluto 66 ml. Preparacin: disolver el colorante en glicerol, calentar durante una hora a 60C, posteriormente agregar el metanol y filtrar. Uso: para diversas tinciones. 14.- Safranina: Solucin A: safranina 0.25 g. Etanol 100 ml. Solucin B: 10 ml de solucin A. Agua destilada 90 ml. Uso: como colorante de Gram. 15. - Colorante de Wright: colorante de Wright 0.30 g. Glicerol 3 ml. Metanol absoluto 97 ml. Preparacin: mezclar el colorante en glicerol, y posteriormente agregar el metanol.


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Uso: para tinciones diversas. II. TCNICAS Y TINCIONES.

1.- Examen directo con cinta adhesiva o Scotch

Esterilizar a la flama el asa micolgica y dejar enfriar. Pegar al asa micolgica un fragmento de cinta adhesiva transparente. Introducir el asa con la cinta en tubos y cajas Petri, hasta tocar la colonia a investigar por la parte adhesiva de la cinta. Desprender el fragmento de la cinta adhesiva, con la ayuda de una aguja de diseccin, sobre un portaobjetos con una gota de colorante (azul de lactofeno o lugol) Colocar una gota del mismo colorante sobre la cinta y posteriormente poner un cubreobjetos. Si se quiere sellar la preparacin, se coloca alrededor del cubreobjetos barniz de uas.

2.- Siembra de microcultivos. Material: cajas Petri estriles con 2 portaobjetos y tringulo de vidrio cada uno; medio de cultivo en caja Petri (Saboraud. PZ o papa dextrosa agar) Fragmentar con la ayuda de un bistur el medio de cultivo en cuadros de aproximadamente 1.5 X 1.5 cm. Colocar 1 o 2 cubos del medio fragmentado sobre uno de los portaobjetos. Sembrar el hongo a estudiar por los cuatro lados del medio de cultivo. Colocar el segundo portaobjetos sobre el medio de cultivo. Agregar a la caja Petri de 10 a 15 ml de agua glicerinada estril (5%). Sellar la caja Petri con cinta adhesiva. Incubar dependiendo el hongo a estudiar. Realizar tincin especial para el microcultivo. 3.- Tincin de microcultivos con azul de algodn actico.

Retirar el exceso de agar con la ayuda de un bistur. Fijar la preparacin con metanol hasta evaporacin. Teir con azul de algodn cido por 15 min. Lavar ligeramente con agua destilada. Lavado con alcohol al 96%. Lavado con alcohol absoluto.


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Bao de xilol durante 5 minutos. Montar la laminilla con blsamo de Canad.

4.- Tincin de microcultivos con eritrocina.

Retirar el exceso de agar con ayuda de un bistur. Fijar la preparacin con etanol hasta evaporacin. Teir con eritrosina durante 10 a 15 minutos en emisiones de bao de agua o por calentamiento directo a la flama. Retirar el exceso de colorante con etanol. Bao en acetona durante 10 minutos. Bao en xilol-acetona (1:2) durante 10 minutos. Bao en xilol durante 10 minutos. Montar la laminilla con blsamo de Canad.

5.- Tincin de Ziehl-Neelsen (para actinomicetos).

Fijar el frotis directamente a la llama Teir con fucsina bsica en vapores de agua durante 10 minutos Decolorar con alcohol cido modificado (formula 1-9) Lavar ligeramente con agua destilada Teir de contraste con azul de metileno durante 5 minutos Lavar ligeramente con agua y dejar secar

6.- Tincin de Gram. Fijar el frotis directamente a la llama Teir con cristal violeta durante 1 minuto Decolorar con alcohol-cetona Lavar ligeramente con agua destilada Cubrir la preparacin con lugol durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua Teir de contraste con safranina durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua y dejar secar 7.- Tincin de tinta china para Cryptococcus sp. Fijar el frotis directamente a la planta Teir con fucsina bsica durante un minuto Lavar ligeramente con agua destilada Hacer un frontis con tinta china o nigrosina (como frotis de sangre) Dejar secar COLORACIN DE HONGOS EN TEJIDOS.


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Colocar la muestra extrada o biopsia o puncin, etc., en frasco con formol al 10.pasar a alcohol de 70 durante 24 horas (puede disminuirse en tiempo a 2 horas). Chocar a continuacin en alcohol de 95 durante 24 horas (puede dejarse 2 horas) La siguiente etapa consiste en sumergir la pieza anatmica en alcohol abs. Durante 24 hora (puede disminuirse el tiempo a 2 horas) Pasar luego la pieza por xilol durante 6 horas (si se sigui la tcnica de las dos horas se puede dejar de 6 a 7 minutos. Incluir luego en parafina (tacos) y realizar cortes histolgicos con microtomo. Pasar los cortes histolgicos obtenidos por xilol y luego por alcohol absoluto para eliminar este y por alcohol de 95 para hidratar En este omento los cortes estn listos para realizar las distintas coloraciones. Se fijan con albmina sobre un porta objetos limpio y se trata con alcohol de 95.

MTODO DE GRIDLEY

Oxidar con cido crmico al 4% durante 1 hora Lavar con agua corriente durante 5 minutos Colocar durante 15 minutos e siguiente colorante: Fucsina bsica 1g y agua destilada hirviente 200ml Enfriar y agregar 2 gramos de metabisulfito de potasio y 10 ml de HCl Dejar reposar 24 horas Agregar 0.5 g de carbn activado Agitar durante un minuto Filtrar con papel Colocar en solucin de: Metabisulfito de potasio al 10% 6 ml HCL 5ml Agua destilada c.b.p. 100ml Durante dos minutos cambiando la solucin 3 veces. Lavar con agua corriente durante 15 minutos Chocar los cortes en fucsina aldehdica de 15-20 minutos: Fucsina bsica 1g Alcohol de 70 200 ml Paraldehdo 2ml HCl A temperatura ambiente durante 3 das hasta que se vuelva azul oscuro Guardar el refrigerador Lavar con alcohol de 95 Lavar con agua corriente


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Contracolorear durante 2-5 minutos en: Amarillo de metano 0.25g Agua estilada 100ml. cido actico glacial 0.25ml Lavar con agua y pasar con xilol Montar con blsamo de Canad, colocando un cubre objetos y observar a microscopio

NOTA: Los hongos aparecen de una coloracin prpura, el tejido conectivo, adquiere una tonalidad amarilla, y el tejido elstico y la mucina color azul MTODO DE GOMORI Desparafinar los cortes y pasarlos con alcohol absoluto y luego alcohol de 95 Tratar con albmina y fijarlos con alcohol de 95 Sumergir os cortes en cido crmico al 5 % durante 1 hora Lavar con agua corriente durante 10 minutos Colocar en solucin de bisulfito de sodio 1% durante 1 minuto Lavar con agua corriente durante 5 minutos y pasar luego por agua destilada 3 veces. Es mejor sumergirlos en agua destilada durante horas Colocar os preparados en solucin argntica durante 2 horas, manteniendo la temperatura a 45-50C Solucin argntica Nitrato de plata 5% 5 ml Urotropina 3% 10 ml Agitar hasta disolucin del precipitado Conservar en el refrigerador Lavar con agua destilado 2 o 3 veces Sumergir en cloruro de oro al 0.1% durante 5-10 minutos Tratar con solucin de hiposulfito de sodio al 2% durante 2 minutos Lavar con agua rpidamente Deshidratar y montar con blamo de Canad, y observar al microscopio NOTA: Los hongos se observan teidos en negro sobre el fondo rojo

MTODO DE McMANUS-HOTCHKISS:

Desparafinar con xilol y pasar por alcohol abs. Y de 95 Colocar el corte en cido peridico al 1% durante 10min. Lavar con agua corriente Chocar el reactivo de Schiff 10 min Fucsina bsica 0.1 g


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Alcohol de 95 5 ml Agua 95ml Lavar con agua corriente Sumergir el portaobjetos en solucin de: Hidrosulfito de zinc 1gr cido tartrico 0.5gr Agua 100ml Durante 30 min. Lavar con agua corriente durante 1 minuto Diferenciar con cido pcrico en solucin acuosa saturada durante 2 minutos. Deshidratar y montar con blsamo de Canad y observar a microscopio

NOTA: Los hongos aparecen coloreados de un tono violceo. TCNICA: Realizar una tincin simple, una de Gram y una de ZiehlNeelsen, utilizando los colorantes y procedimientos adecuados. OBSERVACIONES GENERALES:


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Tincin simple:

Sustrato utilizado____________. Color del la colonia______________. Aspecto: ________________. Consistencia: _______________. Colorante utilizado_______________ Estructura: observada________________. 40 X.

Sustrato utilizado: __________. Color de la colonia: ______________. Aspecto: ________________. Consistencia: _________________. Colorante utilizado_______________ Estructura:______________________. 10 X.




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CONCLUSIN:

BIBLIOGRAFA:


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Modificacin a mtodo de Tincin de Gram para la identificacin de tricomonas en Exudados Vaginales, Tesis de Avendao Moreno Consuelo; (1985) Diagnstico Micolgico, Amadeo DAlessandro; edit. Panamericana Micologa Mdica Bsica; A. Bonifaz; edit. Mndez Cervantes. Mtodos de laboratorio, Lynch; et al; edit. Interamericana; Mxico 1965. Xalapa, Ver., a _____________________________________

Vo. Bo. ______________________________


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PRACTICA 3. MTODO DE BURRI.OBJETIVO: Que el alumno aprenda a utilizar el mtodo de Burri, y lo utilice en el laboratorio en el diagnstico de Cryptococosis. GENERALIDADES: El Cryptococcus neoformans es un hongo tipo levadura que causa Cryptococosis. Se presenta como cuerpo en forma de levadura de 5 a 20 micras de dimetro, que muestran gemacin simple (ocasionalmente mltiple) y estn rodeadas de una cpsula ancha de material gelatinoso. Esta cpsula esta constituida por polisacridos como xilosa, manosa y cido glucornico, que determina su virulencia por medio de deterioro de la fagocitosis. En lquido cefalorraqudeo, estas estructuras no deben confundirse con glbulos rojos o linfocitos; no tienen el ndice de refraccin de los primeros, y se distinguen de los segundos por la presencia de yemas. La enfermedad se encuentra en el mundo entero y casi siempre ataca las meninges y el cerebro, aunque tambin se conocen lesiones del pulmn, la piel y los huesos. El microorganismo puede cultivarse del suelo, y se piensa que generalmente penetra al organismo por las vas respiratorias. La clasificacin clnica de la cryptococosis se divide como sigue: Pulmonar (25%) Diseminada (visceral) (15%) Del SNC (45%) sea (5%) Cutnea (10%)

Patogenia. La cryptococosis pulmonar se inicia por la inhalacin de las levaduras, estas llegan hasta los alvolos atravesando las vas respiratorias, generando as el primer contacto pulmonar, que la mayora de veces cursa de manera subclnica o asintomtico, no genera una respuesta inflamatoria tan intensa como lo hacen otros hongos o mico bacterias. C. neoformans, prolifera rpidamente si no existe una adecuada defensa celular, en especial clulas mononucleares (linfocitos, histiositos, etc.), esto explica porque los pacientes linfoma tozos son


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altamente susceptibles a la enfermedad. Si el proceso infeccioso no se detiene, los microorganismos fcilmente se diseminan por va linftica y hematgena; con gran predileccin hacia el SNC, en donde el LCR es adems deficiente en un factor fungicida denominado factor anticriptococsico; en este sistema las lesiones se desarrollan en las meninges y afectan los nervio craneales, tallo cerebral y cerebelo; el cuadro que provoca es generalmente de una meningitis crnica. A partir de este foco puede diseminarse hacia otros rganos como vsceras, piel y huesos. Las levaduras del C. neoformans pueden penetrar por va cutnea, dando una cryptococosis primaria cutnea, que se inicia por la formacin de un complejo primario similar al de la esporotricosis, es decir, se forma un chancro o lesin inicial, constituido por linfagitis y adenitis, ste puede involucrar por completo o formar una lesin granulo matosa, ulcerada o de aspecto acneiforme. Todos los criptococos producen ureasa, pero no es el caso de las especies de Cndida. Los medios que contienen actidiona (ciclo heximida) inhiben el criptococos, pero carecen de efecto sobre el desarrollo de la Cndida. Los criptococos no patgenos no crecen a 37C; un criptococo no patgeno frecuente, Rhodotorula, produce una colonia roja anaranjada plida. Los ratones son sensibles a la infeccin de C. neoformans; la inoculacin puede hacerse por va intraperitonal o cerebral. Frente a un caso sospechoso, siempre debe recurrirse a inoculacin al animal. Diagnstico de Laboratorio. Toma de muestra: Depender del tipo de tryptococosis, por lo que se puede manejar expectoracin, lavado bronquial, LCR, exudados, biopsias, etc. Examen directo: Es de poca utilidad, por que mediante esta tcnica no se hace evidente la cpsula; por lo tanto las levaduras fcilmente se confunden con Candida sp. u otros hongos levaduriformes.

Frotis:


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A partir de las muestras LCR, esputo, etc., se realiza un frotis, se fija al calor y se agrega extendiendo una gota de tinta china o nigrosina. MTODO DE BURRI: Por refringencia con el microscopio se puede observar fcilmente el cuerpo de la levadura y el halo de la cpsula. En nuestra experiencia ponemos una gota de fucsina bsica (de Zielhl-Neelsen) por minuto y posteriormente teimos de contraste con tinta china; los resultados son buenos, obteniendo el cuerpo de la levadura de color rojo rosa, un halo blanco de la cpsula y el fondo de la preparacin negro. Algunos autores reportan excelentes resultados con tincin de mucicarmn de Mayer, este colorante tie la cpsula en fracciones. Cultivos: Los medios de cultivos ms tiles son Saboraud, extracto de levadura y BHI agar; nunca debe sembrarse en micosel, porque la ciclo eximida (actidione) inhibe a C. neoformans. El desarrollo se obtiene en dos a tres das a temperaturas ambiente de 0 a 37C. Las colonias son limitada, mucoides, convexas, de color blanco amarillento y dan un aspecto de leche condensada, raras veces toman un color rosa plido. Al microscopio se observan clulas levaduriformes de aproximadamente 4 a 8 micras de dimetro con blastosporas de la mitad de su tamao, ambas con todo y la cpsula llegan a medir hasta 20 micras de dimetro. Un medio de cultivo selectivo para C. neoformans, es a base de semillas de negro o alpiste negro, de donde genera colonias con pigmentos caf-marrn, que se distinguen de otros gneros y especies. TCNICA: Realizar una tincin simple, una de Gram y una de Ziehl-Neelsen, utilizando los colorantes y procedimientos adecuados. Este mtodo se utiliza especialmente para la observacin en fresco de Cryptococcus capsulatum (neoformans). Emplear como medio de contraste tinta china que debe ser de muy buena calidad y no debe hallarse contaminada por hongos levaduriformes. 1. Colocar una gota de tinta china sobre el portaobjetos.


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2. Agregar una gota de material por investigar, que generalmente es lquido cefalorraqudeo o esputo, y mezclas con el asa. 3. Colocar el cubreobjetos y observar. 4. Si el material fuera muy espeso, conviene diluir la tinta china con una gota de agua. REACTIVOS Tinta china Muestra biolgica Colonia de hongos Material Asa de platino o nicromel Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio



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Examen en Fresco: Sustrato: _________________ Color:___________________ Aspecto: _________________ Consistencia:____________________ Estructura: ___________________ Mtodo de Burri: Sustrato: __________________ Color: ___________________ Aspecto:__________________ Consistencia ____________ Estructura: ___________________ 40X 40X

Examen en Fresco: Sustrato: _________________ Color:___________________ Aspecto: _________________ Consistencia:____________________ Estructura: ___________________ 40X


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Mtodo de Burri: Sustrato: __________________ Color: ___________________ Aspecto:__________________ Consistencia ____________ Estructura: ___________________ 40X

Una muestra positiva se observara:

C. neoformans CONCLUSIN:


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BIBLIOGRAFA: Micologa Mdica Bsica, Bonifaz A.; 2 reimpresin; Edit. Mndez; Mxico 1994. Mtodos de Laboratorio, Lynch y col. Diagnstico Micolgico; Amadeo D Alessandro; Edit. Panamericana. Xalapa, Ver., a ______________________________________

Vo. Bo.

PRACTICA 4. CULTIVO DE HONGOS.OBJETIVO: Que el alumno aprenda a cultivar hongos de inters clnico. GENERALIDADES: EXTRACCIN DE MATERIALES DE LA LESIN. Los materiales necesarios son: pinzas, agujas, bistur, esptulas, tijeras, portaobjetos, cajas de Petri, etc.


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Realizar siempre una limpieza previa de la lesin con alcohol (nunca con alcohol yodado), porque los pacientes generalmente llegan hasta el analista ya medicados con cremas, ungentos, etc. OBTENCIN DE MUESTRAS DE MICOSIS SUPERFICIALES.

Lesiones en piel (tia, pedis, cruris y corporis): se hace un raspado cuidadoso de la lesin con el fin de retirar el mayor nmero de escamas y recibirlas en una caja Petri; es importante que el raspado se haga con cierta presin pero sin llegar a sangrar, ya que esto interfiere con la calidad de la muestra. Lesiones en cabeza (tia capitis): se hace una toma similar a la anterior pero un poco ms persistente y enrgica con el fin de desprender suficiente escamas. Posteriormente se localizan los pelos parasitazos los cuales son cortos y estn rodeados de un material blanquecino; con la ayuda de las pinzas de depilar son arrancados y depositados en la caja Petri. Lesiones en ua (tia unguis): las uas aumentadas de volumen y deformadas tienen un aspecto blanquecino y pulverulento, por lo que la toma de este material es relativamente fcil, basta raspar con el bistur la parte inferior de la ua y colectar la escamas en la caja Petri.

OBTENCIN DE MUESTRAS DE MICOSIS SUBCUTNEAS. Las enfermedades de este tipo incluyen la cromomicosis, micetoma o (maduromicosis), esporotricosis y rinosporodiosis, etc. Los especimenes mejor colectados de este grupo incluyen costras y sus provenientes de abscesos abiertos; del exudado de las lesiones; de fluidos aspirados de tractos sricos cerrados o abscesos por medio de jeringa; y tejido proveniente de la biopsia. El organismo Rhinosporidium seeberi que causa la rinosporidiosis, no ha podido ser cultivado hasta ahora; sin embargo los raspados provenientes de raspados o biopsias deben ser examinados directamente o fijados para el examen histolgico. El material de esta micosis debe ser puesto en tubo o en frascos estriles adicionados de penicilina y estreptomicina y enviados enseguida al laboratorio para ser examinados al microscopio y sembrados en medio de cultivo adecuados segn el tipo de micosis que se trate.


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OBTENCIN PROFUNDAS.

DE

MUESTRAS

DE

MICOSIS

SISTEMTICAS

La micosis sistemtica o profunda puede diagnosticarse en el laboratorio a partir de un examen de la pus o del exudado; del fluido espinal; de la saliva; de la mdula sea o sangre; o del material proveniente de abscesos, biopsias o autopsias. El examen directo, los cultivos y en algunos casos la inoculacin animal deben hacerse a partir del material colectado. ROTULO DE LAS MUESTRAS. Todas las muestras que se obtienen para el diagnostico clnico deben contener la siguiente informacin: 1. 2. 3. 4. Nombre, edad y sexo del paciente. Nmero de identificacin asignado al paciente o espcimen. Nombre del mdico que manda a realizar el examen. Nombre de la institucin donde se obtiene la muestra, si la muestra se enva a otra. 5. Tipo de material presentado y colectado. 6. Enfermedad sospechada o alguna otra informacin pertinente. 7. Resultados de cualquier prueba serolgica o drmica hecha. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS. En todos los casos se practicar un examen microscpico directo de los materiales extrados. Para ello, los pelos y escamas de piel o de uas se colocarn sobre un portaobjetos limpio con una gota de hidrxido de sodio o potasio al 20-30%, se cubrirn con un cubreobjetos y se calentarn sobre la llama suave de un mechero, apretando suavemente con el dedo, tratando de disgregar el material. Luego se mirar al microscopio con el objetivo de 10 dimetros de aumento y despus con el de 40. SIEMBRAS. Se utilizarn medios de cultivo de Sabouraud con y sin antibiticos. Se siembran los trozos de pelos o escamas de piel (lo ms pequeos posibles) y los medios de cultivos, utilizando para ellos dos tubos de Sabouraud glucosado con antibitico.


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Se esterilizar el gancho o asa, enfrindolo luego en el medio de cultivo, apoyndolo sobre la superficie del mismo. Luego se tocarn las escamas o pelos que, de esta manera quedarn adheridos. Se ubicarn estos trocitos sobre la superficie del agar, tratando de presionar suavemente con el asa para que penetren en el medio de cultivo. Se siembran de esta manera en la superficie del medio 5 o 6 trocitos del material quedando separados por un pequeo espacio. Se incubarn a 25C durante 20 a 30 das. Si no se dispone de una estufa graduada a esta temperatura, se puede ubicar sobre la de 37C, tapndolos con una caja de plstico o de vidrio para que pueda penetrar la luz ya que la pigmentacin de algunos hongos puede verse interferida en su ausencia. Todos los das se observar el posible desarrollo fngico. No debe informarse como negativo un cultivo antes de los 30 das. MEDIOS DE CULTIVO. Los medios de cultivo ms utilizados o clsicos son el medio glucosado de Sabouraud y el medio de Sabouraud con antibiticos. Los medios de cultivo pueden ser de tres tipos: naturales, semisintticos y sintticos. Los naturales estn elaborados con leche, huevo, granos de cereales, levadura de cerveza y otros compuestos. Los semisintticos, como el Sabouraud, aportan una fuente de carbono y nitrgeno. Los sintticos tienen una composicin qumica bien definida y se usan en investigacin, no son de uso sistemtico. Se preparan fcilmente, los ingredientes se disuelven por separado en agua y se mezclan en un matraz erlenmeyer, se calientan 15 minutos a bao Mara y 5 a 6 minutos en el mechero, la solucin se coloca en tubos y se procesa en autoclave a 110C durante 15 a 20 minutos al sacarlos se colocan en posicin inclinada para aumentar la superficie de cultivo. Pueden utilizarse cajas Petri, que deben llenarse despus de esterilizar el medio. Si se usa tapn de rosca no debe tapar hermticamente para facilitar la llegada de oxgeno o se pueden utilizar los tapones de algodn. Todas las manipulaciones han de realizarse en el rea esterilizada de la llama de un mechero Bunsen o en una campana de flujo laminar. USO Identificacin de C. neoformans. MEDIOS DE CULTIVO Medio de alpiste negro agar. Medio de agar dextrosa urea. Medio de Staib. 43



Esporulacin de dermatofitos. Produccin de ascosporas (gnero saccharomices). Transporte y revitalizacin. Medio selectivo de primoaislamiento para diversas levaduras Primoaislamiento, conservacin y produccin de pigmentos de dermatofitos. Para esporulacin de hongos dermaticeos. Investigacin de hidrlisis de casena en actinomicetos.

Arroz agar. Agar para produccin ascosporas. Sabouraud caldo. Biggy agar. Medio de coco. Medio V8 agar. Medio Borelli. DTM agar. PZ + dextrosa al 1%.

de

Medio de casena (actinomicetes). Medio para hidrlisis de casena (Nocardia). Investigacin de carbohidratos. Medio para investigacin de carbohidratos (zimogramas) Primoaislamiento y conservacin Sabouraud caldo. de diversos hongos. Sabouraud dextrosa agar. Papa peptona agar. Infusin de cerebro corazn agar. (M. mycetomatis y A. madurae) Harina de maz agar. Extracto de levadura agar. Papa dextrosa agar. Medio de conservacin. Para estimulacin de pigmento de Medio de coco. A. pelletieri y T. violaceum. Investigacin de licuefaccin de Gelatina. gelatina. Esporulacin de diversos hongos. Harina de maz agar. Papa dextrosa agar. Papa zanahoria agar. Papa peptona agar. Formacin de pseudomiceliso y Harina de maz + Tween 80. clamidospora en el gnero Papa zanahoria + Bilis de buey. Candida. Medio de cereal. Agar para clamidosporas. Medio selectivo para hongos Micosel o micobiotic agar. patgenos. Medio kurung (en su forma parasitaria) Medio de produccin de pigmento PZ + dextroza al 1%. de T. Rubrum. Primoaislamiento de actinomycetos Tioglicolato caldo. anaerbicos y microaerfilos. Pruebas fisiolgicas de Medio para la investigacin de actinomycetos. xantina, hipoxantina y tirosina. Medio Bennett.


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Rehidratar cultivos desecados. Identificacin de Aspergillus Penicillium. Para cultivar Pytirosporum.

Sabouraud caldo. y Medio Czapek.

Medio de Sabouraud con aceite de oliva. Medio para Pytirosporum con bilis de buey. Medio con cido oleico y vitamina A. Estimula la fructificacin. Extracto de malta o cerveza. Para observar rganos perforadores Medio para penetracin de pelos in presentes en T. Mentagrophytes. vitro. Medio de agar dextrosa urea. Observar produccin de ureasa. Medio de agar dextrosa urea. Para el transporte de hongos. Medio de Stuarts. Identificacin de micobacterias y Medio de Lowestein-Jensen actinomadura. Para la obtencin de antgenos. Medio de Smith.

Agar para Clamidosporas. Frmula. Sulfato de amonio 1g Fosfato monopotsico 1g Azul de trpano 0.1 g Polisacrido purificado 1g Agar 1g Biotina 1g Agua destilada 1000 ml Se suspenden 37 g del polvo deshidratado de la frmula en el agua destilada y se deja remojar durante 15 minutos, se hierve durante 1 minuto agitando frecuentemente; se distribuye en los tubos y se esteriliza a 121C durante 20 min.

Uso: estimula clamidosporas en C. albicans. Agar para produccin de ascosporas. Frmula Acetato de potasio Extracto de levadura Dextrosa Agar Agua 10 g 2.5 g 1g 20 g 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Uso: produccin de ascosporas (gnero saccharomyces).


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Agar Sabouraud cicloheximida. Frmula Sabouraud glucosado 1000 cm3 Cloranfenicol 500 mg Cicloheximida 500 mg Disolver la cicloheximida o actidiona en 10 cm3 de acetona, el cloranfenicol en 10 cm3 de alcohol. Agregar el medio ya fundido y esterilizar a de atm durante 20 minutos. Uso: primoaislamiento y conservacin de diversos hongos Arroz agar. Frmula Arroz blanco molido Agua destilada 8g 25 ml Los carbohidratos pueden ser: glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, galactosa, etc. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Uso: primoaislamiento dermatofitos. de Uso: medio selectivoo de primoaislamiento para diversas levaduras. DTM agar (Dermatofite Test Medium). Frmula Fitona Dextrosa Gentamicina Cloranfenicol Rojo de fenol Agar bacteriolgico Agua destilada 10 g 10 g 0.1 g 0.1 g 4 ml 20 g 980 ml

Poner los ingredientes en matraz erlenmeyer y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Uso: para esporulacin dermatofitos. Biggy agar. Frmula Citrato de bismuto 5g Amoniaco sulfito de sodio 3g Dextrosa 10 g Extracto de levadura 1g Glicina 10 g Cloranfenicol 0.5 g Agar 10 g Agua destilada 1000 ml Hervir el medio 5 min y repartir en cajas Petri o tubos. No se debe esterilizar en autoclave. de

Preparacin del indicador: se mezcla rojo de fenol 0.5 g; NaOH (0.1N) 15 ml; agua destilada 100 ml. Extracto de levadura agar. Frmula Extracto de levadura Agar bacteriolgico Agua destilada Ph 1g 20 g 1000 ml 6

Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: primoaislamiento diversos hongos. de

Extracto de malta o cerveza.


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Frmula Harina de malta Agua destilada

Uso: medio de esporulacin y conservacin de diversos hongos 200 mg 1000 ml Harina de maz + Tween 80. Frmula Medio de harina de maz 990 ml Tween 80 10 ml Esterilizar en autoclave a 121C 15 min. Uso: para formacin de pseudomicelios y clamidosporas en el gnero Candida. Nota: se le puede adicionar 1 ml de azul de trpano al 1% Infusin de cerebro corazn agar (BHI). 4g 1000 ml Frmula Infusin de cerebro de ternero 200 g Infusin de corazn de res 250 g Peptona 10 g Dextrosa 2g Cloruro de sodio 5g Fosfato disdico 2.5 g Agar bacteriolgico 20 g Agua 1000 ml Ph 7.4 Esterilizar en autoclave a 121C 15 min. 40 g 20 g 1000 ml Uso: primoaislamiento de diversos hongos, en especial M. mycetomatis y A. madurae. Medio con cido oleico y vitamina A. Frmula

Se coloca a 45C luego se intenta elevar un C por minuto hasta 70C 10 min. Se verifica mediante coloracin con yodo si ha desaparecido el almidn. Es necesario 70C hasta que desaparezca todo el almidn. A continuacin se filtra la mezcla y se agrega clara de huevo (1 por 2 lt). Se esteriliza a 125C durante 45 min. Se afora a un lt y se esteriliza a 110C. Uso: estimula la fructificacin. Gelatina. Frmula Gelatina Agua destilada

Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: para investigacin de licuefaccin de gelatina en actinomycetos y hongos negros. Harina de maz agar (Corn meal agar) Frmula Harina de maz Agar bacteriolgico Agua destilada

Esterilizar en autoclave a 121C de 10 a 15 min.


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Sabouraud simple Tween 80 cido oleico Vitamina A Cloramfenicol Agua destilada

6.5 g 1 ml 10 g 10 gotas 0.5 g 100 ml

agua. Esterilizar en autoclave a 110C por 15 minutos. Uso: medio de identificacin de C. neoformans. *Semilla de Guizotia abyssinica. Medio de Bennet.

Uso: se usa para pytirosporum. Frmula Medio agar dextrosa urea. Frmula Dextrosa Peptona Fosfato monopotsico Urea Rojo fenol Agua destilada 1g 1g 2g 20 g 0.012 g 1000 ml Extracto de levadura 19 g Extracto de carne 18 g NZ amida A 2g Casena para digestin 1g Glucosa 10 g Gelosa 15 g Agua destilada 1000 ml Uso: se actinomycetos. utiliza para

Se disuelven. Filtran y esterilizan los ingredientes, se disuelven por separado 15 ml de agar en 900 ml de agua destilada y se esterilizan. Despus de enfriar se aade la solucin de urea. Uso: para observar la produccin de ureasa, por ejemplo en T. Mentagrophytes y C. neoformans. Medio de alpiste negro agar. Frmula *Alpiste negro pulverizado Cloranfenicol Agar bacteriolgico Agua destilada o Nger 70 g 50 g 20 g 1000 ml

Medio de Borelli (lactrimel). Frmula Harina de trigo Leche en polvo Miel Agar Agua destilada 14 g 14 g 7g 20 g 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 110C por 10 minutos. Uso: primoaislamiento, conservacin y produccin de pigmentos de dermatofitos. Para esporulacin de hongos dematiceos. Medio de casena. Frmula

Remojar el alpiste negro en 1 lt de agua. Hervir 30 min.; posteriormente filtrar en gasa y papel filtro. Aforar a 1 lt de

Solucin A Dextrosa Agar bacteriolgico

1g 2g


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Agua destilada Solucin B Leche descremada Agua destilada

50 ml Frmula 1.5 g 50 ml Peptona granulada Agar agar Agua destilada 30-40 g 20 g 1000 ml

Esterilizar en autoclave por separado a 110C o 10 lb de presin por 10 min. Una vez estril se deben mezclar a una temperatura prxima a 45C, repartiendo en cajas Petri. Uso: investigacin de hidrlisis de casena en actinomicetos. Medio de cereal. Frmula *Cerelac Agar Agua destilada 14 g 10 g 1000 ml

Uso: no contiene azcares; se utiliza para evitar e fenmeno de pleomorfismo. Es recomendable sobre todo en dermatofitos. Medio de Czapek. Frmula Nitrato de sodio Sacarosa Fosfato dipotsico Cloruro de potasio Sulfato de magnesio Sulfato de hierro Agar Agua destilada 3g 30 g 1g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 15 g 1000 ml

*Producto comercial que contiene harina de maz, trigo, arroz, cebada, avena y extracto de malta. Uso: estimula clamidosporas en C. albicans. Medio de coco. Frmula Agua de coco filtrada 100 ml Peptona 1g Agar bacteriolgico 2g Ph 5 Esterilizar en autoclave a 121C 15 min. Uso: aislamiento de diversos hongos levduriformes. Medio para estimulacin de pigmento de A. pelletieri y T. violaceum. Medio de conservacin.

Uso: sirve para estudiar Aspergillus y Penicillium. Medio de Kurung. Frmula Fcula de papa 1g Agua destilada 100 ml Mezcla de huevo 150 ml El agua con la fcula de papa (patata) se calienta en el mechero de Bunsen hasta que la mezcla gelifica, entonces se esteriliza a 115C por 15 min. Se agita la mezcla de huevo (que contiene 100 ml de yemas y 40 ml de huevos enteros) en presencia de perlas de vidrio y se agrega bajo tcnica estril a la fcula de papa. El medio se


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reparte en tubos y se deja coagular inclinando a 90C 1 hr. Hoy se ha simplificado la preparacin de los medios de cultivo al utilizar medios deshidratados a los que hay que aadir el volumen correcto de agua y esterilizar. Uso: para patgenos parasitaria. conservar en su hongos forma

mecnico o varilla de cidrio y se filtran en una gasa. Un litro de huevos se mezclan con un frasco de fcula y se le agregan 20 ml de verde de malaquita. La mezcla se deja en reposo una hora antes de distribuirse en los tubos o en las cajas de Legroux. El medio se coagula con un solo calentamiento de 40 min a 85C. Uso: se emplea para actinomycetos, micobacterias y Actinomadura. Medio de Sabouraud con aceite de oliva. El medio de Sabouraud con antibiticos se le agrega aceite de oliva al 10%. El aceite se esteriliza por separado y se le agrega al medio cuando se encuentra a 50C y se vierte en los tubos o las cajas Petri. Uso: para cultivar pityrosporum. Medio de Smith. Frmula Cloruro de amonio 7g Asparagina 7g Fosfato dipotsico 1.31 g Citrato de sodio 0.90 g Sulfato de magnesio 1.50 g Citrato frrico 0.30 g Glucosa 10 g Glicerina 25 cm3 Agua 1000 cm3 Distribuir y esterilizar a de atm durante 20 min. Uso: para antgenos. la obtencin de

Medio de Lwenstein-Jensen. Frmula Fosfato monopotsico 2. 4 g Sulfato de magnesio 0.24 g Citrato de magnesio 0.6 g Asparagina 3.6 g Glicerina 12 ml Agua destilada 600 ml Fcula de papa 30 ml Huevos frescos 1000 ml Sol. verde de malaquita 20 ml Las sales se disuelven por calentamiento y esta solucin se distribuye en frascos que se esterilizan 30 min. a 110C. En un recipiente de 3 lt con perlas de vidrio se ponen los 30 g de fcula de papa que se esteriliz 30 min a 120C, y la solucin previamente preparada. Enseguida se coloca el recipiente a bao Mara a 100C y se agita continuamente hasta que el lquidose trona translcido en alrededor de 15-20 min. Se deja 1 hr en alcohol de 90, a continuacin se rompe uno tras otro en un vaso de pp y se vierten en una probeta de 1 lt; se homogenizan con un agitador


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Medio de Staib. Frmula Guizotia abyssinica o c. Cafeico 50 g glucosa 1g creatinina 1g KH2PO4 1g Agar 15 g Se hierve el polvo de las semillas de G. Abyssinica (alpiste negro) en 1000 ml de agua destilada durante 30 min., se filtra, y se afora el volumen a 1 lt con agua destilada. Se aaden los otros componentes, se esteriliza a 120C por 20 min. El pH final debe ser de 5.5. Uso: sirve para identificar C. neoformans, ya que adquiere un color caf (marrn) oscuro en este medio. Medio de Stuart. Frmula

Agar Agua destilada Sig. B

20 g 1000 ml

Se esterilizan ambas preparaciones. En una caja Petri se mezclan dos tubos de agar con uno de leche, se deja solidificar y se siembra la colonia problema. Frmula 2 Dextrosa Agar bacteriolgico Agua destilada Sig. A Leche descremada Agua destilada Sig. B 1g 1.5 g 50 ml 1.5 g 50 ml

Se esterilizan por separado A y B a 10 libras por 10 min; se dejan enfriar a 45C, se vacan en cajas Petri y se mezclan. Medio para investigacin de carbohidratos(zimograma). Frmula

Tioglicolato de sodio 1g Glicerofosfato de sodio 10 g Cloruro de calcio 100 mg Azul de metileno 0.02 mg Agua destilada 1000 ml PH 7.3 Uso: medio de transporte de hongos. Medio para hidrlisis de casena. Frmula 1 Leche entera en polvo Agua destilada Sig. A 4g 500 ml

Peptona NaCl NaOH 1N Carbohidrato Agua destilada Indicador

10 g 5g 1 ml 20 g 1000 ml 1-2 gotas

Medio para investigacin de xantina, hipoxantina y tirosina Frmula Agar nutritivo Xantina o hipoxantina Agua destilada 23 g 4g 1000 ml


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Se esteriliza en autoclave 121C por 15 min. Uso: para investigacin pruebas fisiolgicas actinomicetos.

a Medio V8 agar. de de Frmula Filtrado de jugo V8 Extracto de levadura Agar bacteriolgico Agua destilada 500 ml 10 g 20 g 500 ml

Nota: cuando se investiga tirosina se debe agregar 5 g de xantina o hipoxantina. Medio para penetracin de pelos in vitro. Frmula Agua destilada 20 ml Extracto d levadura 10% 2-3 ml En una caja Petri se colocan pelos rubios de nio prepber, de 1 cm de long. esterilizados; se agrega la solucin preparada, se inoculan las colonias para estudiar y se dejan transcurrir de 3-4 semanas. Uso: sirve para observar rganos perforadores, que estn presentes en T. mentagrophytes mas no en T. rubrum. Medio para pithyrosporum con bilis de buey (dixon modificado) Frmula Agar extracto de malta 50-60 g Bilis de buey 20 g Tween 40 10 ml Glicerina 2.5 ml Agua destilada 1000 ml Se mezclan los componentes y se disuelven a bao Mara; se vierten en tubos y se esterilizan 20 min a 120C. Se pueden aadir antibiticos bacterianos.

Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min. Uso: medio de aislamiento e identificacin de levaduras. Micosel o micobiotic agar (Sabouraud + antibiticos) Frmula Medio de Sabouraud 100 ml Actidione(cicloheximida) 400 mg Cloranfenicol 500 mg PH 6.5 Los antibiticos se adicionan de la siguiente manera: el actidione en 1 ml de acetona y el cloranfenicol en 1 ml de alcohol etlico, ambos se agregan cuando el medio ha hervido por 1-2 min. Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min. Uso: medio selectivo hongos patgenos. para

Nota: se le adiciona 10-15% de aceite de oliva o cido oleico, se puede utilizar para el primoaislamiento de hongos lipoflicos (P. ovale y P. orbiculare) Papa dextrosa agar(PDA). Frmula


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Pulpa de papa Dextosa Agar bacteriolgico Agua destilada

20 g 20 g 20 g 1000 ml

Uso: medio de conservacin y de esporulacin. Papa zanahoria bilis de buey. Al medio anterior se le agrega 15% de bilis de buey. Uso: estimula clamidosporas en Candida albicans. PZ + dextrosa al 1%.

Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min. Uso: para primocultivo, conservacin y esporulacin de diversos hongos. Papa peptona agar. Frmula Pulpa de papa Peptona Agar bacteriolgico Agua destilada 20 g 10 g 20 g 1000 ml

Frmula PZ Agar bacteriolgico Dextrosa PH

990 ml 20 g 10 g 5.6 a

Se esteriliza en autoclave 121C por 15 min.

Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min. Uso: medio de esporulacin y conservacin de diversos hongos. Papa zanahoria agar (P-Z agar).

Uso: medio de esporulacin y conservacin de dermatofitos. Medio de produccin de pigmento de T. rubrum. Saboraud dextrosa agar. Frmula

Frmula Pulpa de zanahoria Pulpa de papa Agar bacteriolgico Agua destilada 20 g 20 g 20 g 1000 ml

Dextrosa Peptona Agar bacteriolgico Agua destilada PH

20 g 10 g 20 g 1000 ml 6.5 a

Las pulpas maceradas se hierven a fuego lento por 1 hr. Posteriormente se filtran en gasa y se le adiciona al filtrado la cantidad respectiva de agua para completar a 1 lt. Se esterilizan en autoclave a 121C durante 15 min.

Se esteriliza en autoclave 121C durante 15 min.

Uso: medio rutinario para el primoaislamiento y conservacin de diversos hongos. Sabouraud caldo.


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Frmula Dextrosa Peptona Agua destilada PH 20 g 10 g 1000 ml 6.5

Se esterilizan en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: primoaislamiento, transporte y revitalizacin de diversas cepas. Tioglicolato caldo. Frmula Tripticase 20 g Cloruro de sodio 5g Fosfato monobsico de K 2g Tioglicolato de sodio 1g Agua destilada 1000 ml Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: para el primoaislamiento de actinomicetos anaerbicos y microaerfilos.


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LABORATORIO DE MICOLOGIA. UNIVERSIAD VERACRUZANA FACULTAD DE Q.F.B

REACTIVOS Solucin salina Solucin de KOH al 30% Muestra biolgica Colonia de hongos Material Asa de platino o nicromel Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio TCNICA: Se ejemplifica en el siguiente diagrama: EXAMEN EN FRESCO MUESTRA POSITIVO NEGATIVO MUESTRA

SIEMBRA

MACROCOLONIA

RESIEMBRA EXAMEN EN FRESCO REPORTE

TINCIONES

MACROCOLONIA

ZIMOGRAMA EXAMEN EN FRESCO

Nota: en algunas ocasiones se realizan pruebas especiales.


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Examen directo de la muestra: Sustrato: _________________ Color:___________________ Aspecto: _________________ Consistencia:____________________ Estructura: ___________________ Exmen en fresco: 40X


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Sustrato: __________________ Color: ___________________ Aspecto:__________________ Consistencia ____________ Estructura: ___________________ 40X

Examen directo de la muestra: Sustrato: _________________ Color:___________________ Aspecto: _________________ Consistencia:____________________ Estructura: ___________________ Exmen en fresco: Sustrato: __________________ Color: ___________________ Aspecto:__________________ Consistencia ____________ Estructura: ___________________ 40X 40X

Tincin de Gram.

Tincin de Zielh-Neelsen.


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Estructura:Hifa muy delgada y Esporas Gram CONCLUSIN:

Estructura: hifa muy delgada y Esporas no AAR

BIBLIOGRAFA: Diagnstico Micolgico; Amadeo D Alessandro; Edit. Panamericana. Micologa Mdica ilustrada, R. Arenas; Ed. Interamerica Mc Graw Hill. Micologa Mdica Bsica, Bonifaz A.; 2 reimpresin; Edit. Mndez. Laboratorio Clnico; Martha P. Daz Resendiz; IMSS Mxico 1978. Manual de Micologa Mdica; Cristina Gamboa Len; UV. Xalapa, Ver, 1988. Xalapa, Ver., a ____________________________________________ Vo. Bo.


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PRACTICA 5. MICROCULTIVO.OBJETIVO: Que el alumno aprenda a realizar microcultivos, y los sepa emplear en la diferenciacin de los hongos. GENERALIDADES: Las micosis son las enfermedades causadas por distintas especies de hongos. Estas afecciones pueden ser superficiales y profundas. Las micosis o dermatomicosis son procesos infectocontagiosos producidos por distintos agentes micticos que fundamentalmente invaden piel y/o sus anexos. No tienen carcter maligno y, en la mayora de los casos, solo afecta la esttica. Por lo general no hay repercusin sistmica y las lesiones aparecen como procesos inflamatorios superficiales ante los cuales el organismo puede responder, entre otras maneras, con la formacin de anticuerpos reagnicos o clulas especficamente sensibilizadas, revelables mediante reacciones de hipersensibilidad cutnea. Generalmente no se evidencian anticuerpos fijadores de complemento ni precipitinas o aglutininas. El grado de inflamacin va desde una reaccin nula, como en el caso de la pitiriasis versicolor, hasta reacciones graves como el querion. Las micosis profundas pueden localizarse en dermis, msculos, huesos, pulmones, hgado, cerebro, mucosas, etc. Se observan lesiones inflamatorias y destructivas con la consiguiente difusin de los parsito a travs del sistema hemtico o linftico o por continuidad. En este caso el organismo infectado responde a la agresin originando anticuerpos especficos, fijadores del complemento, precipitinas, aglutininas, etc. La mayora de las micosis profundas revisten de tal gravedad que en muchos casos llevan al paciente a la muerte. CLASIFICACIN DE LOS EUMYCETES. Diferentes autores han trabajado arduamente tratando de ordenar sistemticamente las distintas especies de hongos. A continuacin se


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transcribir una clasificacin tentativa del ordenamiento lgico de los hongos. CLASES SUBCLASES RDENES GNEROS Phycomicetes Archimycetes Micelio continuo. Los unicelulares no Oomycetes se reproducen por brotacin. Zigomycetes Esporos asexuados en esporangios. Ascomycetes Hemiascomycetes Micelio tabicado. Los unicelulares se Euascomycetes reproducen por brotacin o esquizogonia. Esporos sexuados internos en ascos. Basidiomycetes Chytridiales Chytridium

Peronosporales Peronospora Mucorales Mucor

Endomycetales Saccharomyces Eurotiales Aspergillus

Heterobasidiomycetes Ustilanginales

Ustilago (carbn)

Micelio tabicado. Esporos sexuados Homobasidiomycetes Agaricales Agaricus externos sobre bsides. DEUTEROMYCETES Mycelia fructignea Moniliales Fusarium Micelio tabicado. Los unicelulares se Mycelia sterilia Mycelia sterilia Sclerotium reproducen por brotacin o esquizogonia. No se conoce reproduccin sexuada. TERMINOLOGA DE LAS MICOSIS. La denominacin de las micosis vara segn el criterio adoptado para clasificarlas: localizacin del proceso, hongo que se asla de la lesin y la designacin que utiliza la literatura mdica.


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De acuerdo con la localizacin del proceso, la enfermedad mictica puede denominarse: dermatomicosis, micosis pulmonares o neumomicosis, onicomicosis, otomicosis, etc. De acuerdo al nombre del hongo responsable de la lesin se denomina: aspergilosis, tricofitosis, coccidioidomicosis, candidiasis, etc., cuando los agentes son Aspergillus, Trichophyton, Coccidioides y Candidas, respetivamente. En el caso de la terminologa mdica se emplean las siguientes denominaciones: tias, pie de atleta, querion, piedras, etc. MICROCULTIVOS. Se realizan para estudiar los detalles de la estructura de los hongos que debido a las observaciones comunes se destrozan y desaparecen por accin de los ganchos y de las agujas. TCNICA: 1. Se preparan placas de Petri con un papel secante en su interior. 2. Se coloca un porta y un cubreobjetos y se esteriliza. 3. Se prepara una caja Petri con Sabouraud y una vez coagulado y fro se cortan pequeos trozos cuadrangulares que se colocan aspticamente sobre el portaobjetos dentro de la placa. 4. Se toma el hongo en estudio con un gancho y se siembra sobre el trocito de agar Sabouraud y tambin en los costados del mismo. 5. Se coloca el cubreobjetos con una pinza previamente flameada, sobre la superficie del agar. 6. Se humedece con agua estril el papel secante y se incuba a 28C. 7. Una vez desarrollado el hongo se saca el cubreobjetos que lleva adherido el crecimiento fngico, se coloca sobre un portaobjeto con una gota de colorante Gueguen o Lactofenol y se saca el trocito de Sabouraud con una pinza colocando luego una gota de colorante y un cubreobjeto nuevo, obteniendo as dos preparaciones listas para estudiar. Pueden bordearse con esmalte de uas, conservndose un largo tiempo. d b c c a


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a) b) c) d)

Portaobjetos. Cubreobjetos. Zonas de siembra. Medio de cultivo.

A partir de un alimento que contenga hongos, realizar un microcultivo, despus de la observacin de crecimiento: Observar el microcultivo completo. Quitar el cubreobjetos y colocarlo sobre un porta limpio y observar, y c) Quitar el cuadrito de agar y sobre el portaobjetos colocar un cubreobjeto limpio y observar. LMINA 1. Tcnica de microcultivo. A. B. C. Uso de tubo de prueba estril para obtener bloques de agar para la tcnica de microcultivo. Preparacin de una cmara hmeda estril usando una placa de Petri que contiene agar simple al 2% sobre un portaobjetos estril. Mtodo alternativo de preparar un microcultivo. Se colocan discos de papel filtro en el fondo de la caja Petri y el portaobjetos se apoya en varillas de vidrio. Los discos de papel filtro se mantienen hmedos con agua estril durante el periodo de incubacin. Colocacin del bloque de agar en la preparacin de un microcultivo. Obsrvese que se han inoculado pequeas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar. Inoculacin de la superficie de un bloque de agar en la preparacin de un microcultivo. Obsrvese que se han inoculado pequeas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar. Colocacin de un portaobjetos estril sobre la superficie del bloque de agar inoculando antes de la incubacin. Aspecto de un microcultivo tpico luego del periodo de incubacin apropiado. Obsrvese el crecimiento micelial por debajo de la superficie de los cubreobjetos. Colocacin del cubreobjetos recogido del bloque de agar microcultivado en un agota de lactofenol-azul de anilina en un portaobjetos para examen microscpico. a) b)

D.

E.

F. G. H.


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LMINA 1.


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REACTIVOS Muestra biolgica Colonia de hongos Material Asa de platino o nicromel Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio OBSERVACIONES GENERALES:


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Examen ___________________ Sustrato: _________________ Color:___________________ Aspecto: _________________ Consistencia:____________________ Estructura: ___________________ Exmen en fresco: Sustrato: __________________ Color: ___________________ Aspecto:__________________ Consistencia ____________ Estructura: ___________________ 40X 40X

Examen ___________________ Sustrato: _________________ Color:___________________ Aspecto: _________________ Consistencia:____________________ Estructura: ___________________ Exmen en fresco: 40X


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Sustrato: __________________ Color: ___________________ Aspecto:__________________ Consistencia ____________ Estructura: ___________________ 40X

Tinciones: Tincin de Gram Tincin de Zielh-Neelsen

40 X Estructura: Hifas tabicadas Gram +

40 X Estructura: Hifas tabicadas AAR

Microcultivo:

Microcultivo completo


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40 X Estructura: hifas tabicadas. Preparacin en portaobjetos Preparacin en cubreobjetos.

40 X Estructura: Hifas tabicadas CONCLUSIN:

40 X Estructura: Hifas tabicadas


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BIBLIOGRAFA: Micologa Practicas de Laboratorio, Koneman Roberts; Edit. Mdica Panamericana. Diagnstico Micolgico, Amadeo D Alessandro; Edit. Panamericana.

Xalapa, Ver., a

________________________________________

Vo. Bo.


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PRACTICA 6. GNERO CNDIDA.OBJETIVO: Que el alumno se familiarice con las especies del gnero Cndida, comprenda a este gnero como Hongos Oportunistas y sea capaz de diagnosticar candidiasis en el laboratorio de anlisis clnicos. GENERALIDADES: HONGOS OPORTUNISTAS. Se denomina as a ciertos hongos saprfitos que en algunas oportunidades invaden el organismo humano o de otros animales, gracias a determinados factores predisponentes del husped. Los saprfitos que se aslan de ciertas enfermedades son: Mucor, Absidia, Rhizopus, Aspergillus, Cephalosporium, etc. Los que viven saprofiticamente y adems cohabitan en mucosas o piel como Candida, Cryptococcus, Geotrichum, son aislados, frecuentemente; en ciertos pacientes que ofrecen condiciones favorables para su proliferacin, tales como los tratados con drogas antineoplsicas, corticoides, antibiticos y los que presentan disproteinemia o debilidad orgnica generalizada. Para realizar un diagnstico correcto de una micosis producida por un hongo oportunista hay que extremar todos los cuidados posibles, pues podra tratarse de una contaminacin accidental de los materiales o muestras extradas y procesadas; por lo tanto deben tenerse muy en cuenta: a) b) c) d) e) Hallazgo del mismo tipo de parsito en muestras extradas con varios das de intervalo. Desarrollo del mismo hongo en todos los sembrados. Pruebas serolgicas positivas. Estudio de las causas predisponentes. Mejora o curacin con el tratamiento adecuado. MC. Mara Edith Riao Snchez 69


CANDIDOSIS. DEFINICIN Micosis primaria o secundaria ocasionada por levaduras endgenas y oportunistas del gnero Cndida, especialmente C. albicans. Las manifestaciones clnicas son localizadas, diseminadas o sistmicas; pueden afectar piel, mucosas, estructuras profundas y rganos internos. Las alteraciones histopatolgicas varan desde inflamacin mnima hasta supuracin o granuloma. La evolucin es aguda, subaguda o crnica. ETIOPATOGENIA Los agentes causales son las levaduras anascosporadas. Se han descrito 81 especies, de las cuales al menos siete causan enfermedades en seres humanos. El gnero Candida, en sentido amplio, es dimorfo. Las especies ms comunes son: Candida albicans. Candida guilliermondii. Candida parapsilosis. Candida kruseii. Candida tropicalis. Candida pseudotropicalis. Candida stellatoidea. C. albicans se ha dividido en varios biotipos, caractersticas antignicas, en los grupos (serotipos) A y B. y por sus

Estos hongos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, pero C. albicans solo se encuentra como endosaprfito del tubo digestivo de mamferos y aves. En seres humanos son comensales de la cavidad bucal, tubo digestivo y mucosa vaginal. La mayor parte de las levaduras tambin s encuentran en la piel sana, excepto C. albicans y C. tropicalis, que se llegan a aislar de regin perianal, peribucal y dedos. Hay resistencia natural a la infeccin, pero no est bien definida, quizs depende de factores inhibidores, concentraciones sricas elevadas de hierro, potenciales de xido-reduccin y competencia entre levaduras por nutrimentos. Es probable que los neutrfilos sirvan como defensa primaria contra invasin y diseminacin. La infeccin ocurre a partir de un foco endgeno y en pocas ocasiones, del medio externo. Los hongos actan como oportunistas y se convierten en patgenos cuando hay alteraciones


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de inmunidad celular, como inmunodeprimidos; a consecuencia de cambios fisiolgicos de la flora normal. La forma congnita puede ocurrir por invasin ascendente con afeccin de la membrana corioalantoidea. En la candidosis mucocutnea crnica los linfocitos T pierden su capacidad para reaccionar contra el estmulo antignico general o contra antgenos especficos de Candida. La candidosis puede ser enfermedad ocupacional o transmitirse por contacto sexual. Los factores predisponentes son mltiples y muchas veces combinarse.

FACTORES QUE PREDISPONEN A CANDIDO

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