Manual de Lab Oratorio de Micologia

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO.

Laboratorio de Micologìa.

Catedrático:

Pablo Becerra Lara.

Manual de Laboratorio de

Micología.

Xalapa de Enríquez, Ver; a _____________________________

ÍNDICE.

LABORATORIO DE MICOLOGIA.UNIVERSIAD VERACRUZANA

FACULTAD DE Q.F.B.

Práctica 1. Examen en fresco……………………………………3

Práctica 2. Tinción de hongos…………………………………20

Práctica 3. Método de Burri…………………………………….32

Práctica 4. Cultivo de hongos………………………………….40

Práctica 5. Microcultivo…………………………………………57

Práctica 6. Género Cándida…………………………………….65

Práctica 7. Género Aspergillus…………………………………77

Práctica 8. Dermatofitos………………………………………...85

Práctica 9. Inmunología Micológica………………………….93

Práctica 10. Micosis Profundas………………………………108

Historia Clínica……………………………………………………110

PABLO BECERRA LARA. 2


FACULTAD DE Q.F.B.

PRACTICA 1.EXAMEN EN FRESCO.

OBJETIVO:

Que el alumno realice tinciones comunes de hongos y se entere de los métodos especiales que existen para tinciones de los mismos.

GENERALIDADES:

Existen sobre la tierra, aproximadamente, 2 millones de seres vivos, y entre 80, 000 y 100, 000 constituyen el grupo formado por los hongos. La mayoría de ellos son tan pequeños que pasan inadvertidos, pero poseen una capacidad extraordinaria de vivir a expensas de los otros seres; en algunos casos forman verdaderas simbiosis y en otros los parasitan definitivamente.

El hombre no está excluido del ataque de los hongos. Estos lo perjudican directamente cuando le causan una enfermedad e indirectamente cuando atacan plantas útiles o cultivos, objetos o artefactos costosos, arruinándolos definitivamente en muchos casos.

La agricultura se ve seriamente comprometida si no se combaten las micosis de las plantas, como el tizón del trigo y las papas, o no se impide la proliferación de diferentes tipos de hongos en sitios de almacenamiento por ejemplo silos trigueros, etc.

Muchos productos manufacturados, tales como telas, cueros, muebles y productos alimenticios, son atacados por los hongos que proliferan rápidamente, inutilizándolos parcial o totalmente. No existen productos biológicos y a veces minerales que no sean invadidos por los hongos. ¿Quién no ha observado soluciones salinas en los laboratorios que han sido invadidas por mohos? Especialmente las soluciones ácidas presentan crecimientos fúngicos en su superficie, no así las alcalinas.

La ganadería también tiene problemas de micosis que pueden ser superficiales como las tiñas o profundas como la histoplasmosis. También los animales faenados presentan buen sustrato para los



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hongos; ya que existe un extenso capítulo en la literatura micológica dedicado a las micosis de las carnes.

El hombre se ve afectado por los hongos cuando estos le provocan enfermedades que pueden ser leves como las dermatomicosis o graves como las paracoccidioidomicosis.

Hasta ahora hemos considerado el aspecto negativo de la actividad fúngica respecto del hombre, pero este también sabe utilizarla para su provecho como en la industria de los medicamentos y ciertos alimentos. ¿Quién no conoce el extraordinario aporte a la medicina con el advenimiento de los antibióticos? ¿Quién no gusta de un buen vino o cerveza o un sabroso queso Roquefort o Camemebert?

Características Generales de los Hongos

Todos son heterótrofos (quimioorganotróficos) por lo que tienen que alimentarse de materia orgánica preformada que utilizan como fuente de energía y de carbono.

Son eucariotas, es decir, presentan un núcleo diferenciado con membrana bien organizada.

Tiene una pared celular formada por quitina; esta pared es rígida, por lo que no pueden fagocitar alimentos sino que absorben nutrientes simples y solubles que obtienen al desintegrar polímeros mediante enzimas extracelulares llamadas despolimerasas.

La estructura fúngica consta de un complejo llamado talo o micelio (fig.1), que a su vez está constituido por múltiples filamentos o hifas (hyphomycetes o mohos) o, menos a menudo, por estructuras unicelulares o levaduras (blastomycetes); estas últimas se reproducen por gemación (Saccharomyces cerevisiae) y muy rara vez por fisión binaria (Schizosaccharomyces pombe), también son una excepción los Chytriomycetes, formados por células redondas grandes con rizoides, y los mohos mucilaginosos, que carecen de pared celular y pueden alimentarse por fagocitosis (Fig. 1).



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Fig 1. Estructura del talo o micelio de mohos y levaduras y de dos formas poco frecuentes.

Talo

Está constituido por dos partes: a) talo vegetativo que asegura el desarrollo, nutrición, fijación y edificación de la parte reproductora y b) talo reproductor donde se forman los órganos de reproducción. Puede estar representado por hifas, levaduras o pseudohifas (blastosporas que no se separan) (fig. 2).

Fig. 2. Fase micelial y de levadura con talo reproductor y vegetativo.

Si el talo está disociado, se producen colonias de levaduras de crecimiento rápido, consistencia cremosa y que se resiembra como las bacterias en puntos o estrías. Si el talo es filamentoso da lugar a colonias de mohos de crecimiento centrífugo, con filamentos aéreos entremezclados, mas o menos largos, o agrupados de manera compacta, con superficie glabra recubierta de vello fino, el crecimiento es lento salvo en hongos oportunistas.

Los hongos que tienen una fase parasitaria levaduriforme y una saprofítica micelial, y que en respuesta a cambios ambientales pasan



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de una fase de 20 a 25ªC a la fase de levadura a 37ªC o viceversa, se llaman dimorfos (fig. 1).

Modificaciones del Talo

Los hongos presentan diferencia en su forma y constitución, importantes para diferenciarlos: dilataciones o vesículas; órganos de resistencia o clamidosporas; órganos de fijación como rizoides y apressorium, hifas en espiral o tirabuzón; órganos nodulares formados por hifas torcidas en forma de nudo; hifas en raqueta, con un ensanchamiento en un extremo; candelabros fávicos (hifas en cuerno o asta) que estan dados por varias ramificaciones al final de una hifa; hifas pectinadas o en forma de peine; hifas peridiales, que son ensanchadas y multiseptadas con terminación en espiral (fig. 3) y acumulación de muchas hifas (esclerotre o esclerocio), cuyo objetivo es almacenar sustancias de reserva. Otras agregaciones miceliales son los coremios y sinemas (con órganos de fructificación y sin ellos, respectivamente) o estromas redondeados fértiles y asexuados como los picnidios, o sexuados como el apotecio (aspecto de copa), peritecio y cleistotecio (con ostiolo y sin él respectivamente.)

Fig. 3. Modificaciones microscópicas del talo

Biología

Para comprender los mecanismos biológicos de adaptación y de invasión de los hongos cuando producen una enfermedad al hombre, es necesario describir someramente los fundamentos de la biología de los mismos.



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A los hongos se les considera como plantas por que poseen membrana celulósica pero carecen de la función clorofílica que es la condición fundamental para ser incluidas dentro de los vegetales. Su nutrición es parecida a la de los animales, siendo heterotróficos como ellos, se reproducen mediante esporos y por eso se parecen a ciertos vegetales autotróficos como los helechos. Por lo tanto, participan de las características de los vegetales y de los animales.

Por su carácter de heterotróficos se ven obligados a alimentarse de sustancias orgánicas preformadas, viviendo muchos de ellos como saprofitos en el suelo, sobre las plantas, en aguas, etc., son los principales mineralizadores de sustancias orgánicas.

Otros son parásitos de plantas y animales, entre ellos el hombre; su adaptación al parasitismo obligatorio es la causa de muchas enfermedades leves o graves de dichos seres.

Algunos pueden vivir como parásitos y como saprofitos; entre ellos están algunos hongos que causan enfermedades al hombre por ejemplo los Dermatofitos, que han sido aislados del suelo en todas partes del mundo.

Desarrollo

Un esporo o un trozo de micelio germina y origina una prolongación que va creciendo apicalmente y forma ramificaciones. Este crecimiento se denomina micelio o cuerpo del hongo.

Cada célula de micelio consta de una pared, que encierra protoplasma y uno o varios núcleos (fig. 4). Dicho micelio mide algunos micrones, de 5 a 20 de diámetro. En cada una de las células que constituyen el micelio se producen enzimas que difunden hacia el medio externo simplificando el sustrato sobre el cual se encuentra el hongo y estas sustancias simplificadas difunden hacia al anterior de la célula donde participan en los procesos metabólicos del hongo.

Fig. 4. Esquema estructural de los hongos



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La célula fúngica tiene las características típicas de las eucariotas: un núcleo con cromosoma, una membrana nuclear y organelos citoplasmáticos, como las mitocondrias y el retículo endoplásmico (fig. 4). Normalmente, los hongos se encuentran en estado haploide aunque pueden formarse núcleos diploides por fusión nuclear, durante el proceso de la reproducción sexual. La estructura de la célula consiste en la pared celular (rígida) y la membrana citoplásmica, en la que predomina el ergosterol. Por el contrario, en las membranas de los mamíferos el esteroide predominante es el colesterol. La estructura química y antigénica de la pared celular es muy distinta a la de las células bacterianas ya que no contiene péptidoglucano ni ácidos teicoicos derivados del glicerol ni del ribitol, ni tampoco lipopolisacáridos. En su lugar se encuentra péptidomanano, glucano y quitina, asociados, muy estrechamente entre sí y a las proteínas estructurales.

Reproducción

Existen hongos unicelulares como las levaduras y pluricelulares como la gran mayoría, por ejemplo el moho del pan.

A partir de este micelio o talo que es el cuerpo del hongo (que puede ser uni o pluricelular) se producen los órganos reproductivos que pueden ser muy rudimentarios o más complejos según la especie.

Lógicamente un hongo unicelular se reproducirá mediante mecanismos simples, tales como la división directa por brotación o esquizogonia, mientras un Mucor (pluricelular) originará un aparato reproductor especializado denominado esporangio en el cual se formarán los esporos asexuados.

Esporas internas y externas y sus células productoras



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Micelio continuo y fructificación asexuada de Phycomycotes con esporangióforos, esporangios y esporangiosporos

ESQUEMAS DE REPRODUCCIÓN SEXUADA



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Reproducción sexuada de una levadura perfecta con formación de un asco con ascosporos en su interior. A, levaduras de polaridad opuesta. B, emisión de mamelón copulativo. C, formación del tubo

copulativo. D, plasmogamia y cariogamia. E, mitosis y formación de dos núcleos sexuados. F, formación de cuatro núcleos. G, formación

de cuatro ascosporos.



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Existen hongos que en determinado momento de su ciclo biológico se reproducen sexuadamente mediante la conjunción de micelios de distinta polaridad (plus + y minus -) o mediante verdaderos gametos diferenciados, tales como el anteridio y el oogonio, dando lugar a la formación de huevos o cigotos o esporos asexuados.

Como se ha enunciado anteriormente, la actividad biológica y la morfología que caracteriza a un hongo a lo largo de su ciclo biológico, son las bases sobre las cuales se asienta el reconocimiento o identificación de la especie.

REACTIVOS:

Solución aclarante : a. KOH (del 10 al 30%)b. NaOH (del 10 al 30%)

Función:

Con la utilización de la solución aclarante las proteínas, grasas y muchos polisacáridos del sustrato son solubilizados (hidrolizados) y los tejidos aparecen óptimamente claros. Las paredes celulares de la mayor parte de los hongos permanecen intactas a causa de la resistencia a los álcalis de los glucanos.

Material

PortaobjetosCubreobjetosAsa de platino o micromelPorta asa

Equipo

Mechero bunsenMicroscopio

Muestra biológica

Cualquier alimento u objeto que tenga hongos



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TÉCNICA:

1. Flamear y enfriar el asa2. Poner una gota de solución aclarante sobre un portaobjetos3. Tomar una asada de su muestra biológica y depositarla sobre la

gota de solución aclarante4. Cubrir la preparación con un cubreobjetos5. Flamear el asa6. Observar al microscopio la preparación con seco débil y seco

fuerte7. Anotar sus observaciones macroscópicas y microscópicas8. De la misma forma montar las preparaciones necesarias hasta

tener 50 observaciones.

NOTA. No olvide limpiar su mesa de trabajo antes y después de la práctica, así como también su microscopio y no depositar la basura en los lavabos.

OBSERVACIONES GENERALES:

CONCLUSIÓN:

GLOSARIO DE FIGURAS



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Talo unicelular: levaduras, candida, etc.

Talo plurcelular: onjunto de filamentos o hifas que se desarrolla a partir de un esporo y que constituye el cuerpo del hongo. Puede ser filamento continuo o tabicado.

Hifa: cada filamento que constituye el talo pluricelular o micelio

Micelio: sinónimo de talo

Pseudomicelio: crecimiento que caracteriza a ciertas especies de hongos levaduriformes cuando se desarrollan en condiciones determinadas.

Esporos: órganos de reproducción del hongo: pieden der sexuados o asexuados.

Endoesporos: cuando se originan dentro de un órgano de reproducción, ejemplo: esporangio.



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Esporangio: cuerpo de fructificación del micelio reproductivo de los Phycomycetes en el cual se originan esporos asexuados internos: endosporos.

Exoesporos: órganos de reproducción llamados también conidias, que se originan fuera de los cuerpos de fructificación o directamente en el micelio con o sin conidióforos.

Conidióforos. Parte del micelio de reproducción especializado para producir u originar las conidias.

Conidias: exoesporos

Microconidias: exoesporos pequeños de 3 a 6 micras, de forma variada.

Macroconidias: exoesporos grandes tabicados de 50 a 80 micras.

Tamaño comparativo entre macro y microconidias

Micelio en espiral o espirales: hifas enrolladas como si fuera un resorte.



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Macroconidia: desarrollo fúngico que se realiza para estudiar el aspecto morfológico macroscópico y también para observar la posible producción de un pigmento.

Ascosporos: esporos sexuados que se originan en un cuerpo de fructificaión denominado asco que caracteriza a los Ascomycetes.

Blastosporos: esporos asexuados originados por brotación o gemación.

Artrosporos: esporos asexuados originados por fragmentos de un talo o una hifa.

Clamidosporos: formas de resistencia que caracterizan a ciertos hongos entre los cuales figura Candida albicans.



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BIBLIOGRAFÍA:

Micología Médica, R. Arenas; Ed. Interamericana Mc Graw Hill.

Diagnóstico Micológico, Amadeo D´Alessandro; Ed. Panamericana

Microbiología Médica; J. C. Sherris; Ed. Doyma.

Tratado de Micología, B. D. Davis, R. Bulbecco, H. N. Eisen, H. S. Ginisberg; Ed. Salvat.

Xalapa, Ver., a ______________________________________

Vo. Bo.

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PRACTICA 2.

TINCIÓN DE HONGOS.

OBJETIVO:

Que el alumno realice tinciones comunes de hongos y se entere de los métodos especiales que existen para tinciones de los mismos.

GENERALIDADES:

COLORANTES.

Los colorantes han sido utilizados desde los tiempos más remotos, empleándose como tales diversas materias coloreadas procedentes de los reinos vegetal y animal, así como distintos minerales; pero desde mediados del siglo XIX, se han obtenido colorantes derivados del alquitrán de hulla, habiendo desplazado casi totalmente a las materias colorantes naturales.

El uso de los colorantes ha contribuido notablemente al progreso de la investigación y las técnicas de coloración se han ido perfeccionando a tal grado que hoy en día, además del estudio meramente morfológico de las estructuras biológicas, permite un examen más útil de la composición química de las mismas, así como el análisis de algunos importantes procesos funcionales de las células; todo esto ha sido posible gracias al conocimiento de la estructura química de las sustancias colorantes y de la afinidad de estas con determinados sustratos.

El estudio morfológico, microscópico, de los tejidos naturales y de las células que los constituyen, necesita casi siempre de la coloración, pues la observación de las imágenes por difracción que dan las preparaciones incoloras, sobre todo cuando, como ocurre en aquellas, que tienen sus partes constitutivas el mismo índice de refracción.

Sea por unión de grupos atómicos de afinidad química manifiesta, sea por transposición de ciertos átomos que originan transformaciones tautómeras, el hecho es que una coloración se verifica cuando la sustancia en cuestión absorbe tal intensidad, que no se decolora ya luego por un lavado con el disolvente que sirvió para preparar el reactivo tintóreo. A veces actúa el colorante directamente, otras, frecuentemente, precisan en cambio la acción previa o simultánea de otra sustancia llamada mordiente, que facilita la tinción de la materia en cuestión, formando con el colorante una combinación estable que se llama laca.



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Hay partidarios de una teoría química de la coloración, para los cuales se produce una verdadera sal por combinación del colorante con las sustancias que se tiñen; otros, creen en una teoría física, y no admiten en el proceso más que una fijación mecánica de las moléculas del colorante, como consecuencia de una serie de fenómenos de adsorción. Y, entre ambas concepciones, extremas y radicales, va tomando cuerpo una opinión, ya sustentada por UIT, y razonada por los investigadores de Van’t Hoff, en la que se admite que en el proceso de una coloración existe una selección sólida entre las sustancia por teñir y la materia colorante, es decir, que el color y las propiedades tintóreas están relacionadas con la presencia, en la molécula, de dos agrupaciones características llamadas cromóforo y auxócromo. Los primeros confieren a la molécula de la sustancia que los contienen, llamada cromógeno, la capacidad real o potencial de mostrarse coloreada, pues la presencia de un cromógeno provoca un efecto batocromo que no conduce siempre a la aparición de un color.

El cromóforo aunque sea coloreado, no es capaz de teñir; adquiere esta propiedad cuando se introducen en la molécula los grupos auxócromos.

Por si solos los auxócromos no están coloreados, pero cuando se hallan en presencia de cromóforos provocan efecto batocrómico que convierten a la sustancia coloreada en colorante.

Modernamente se ha podido comprobar que la adsorción de la luz de un determinado color por parte de un compuesto químico, y la cuantía de esta absorción, están íntimamente ligadas con el estado en que se encuentran los electrones que alcanzan entre sí los átomos que componen las moléculas.

Los grupos cromóforos poseen la capacidad de absorber la luz visible y los auxócromos son capaces de acentuar el color.

De acuerdo con esta exposición, se puede considerar como cromóforos a grupos que por sí solos resultan incoloros, la única condición es que su absorción de luz se desplace hacia el visible mediante la adición de un grupo intensificador conveniente.

Los colorantes atendiendo a su afinidad en la función tintórea pueden clasificar en básicos, ácidos, neutros e indiferentes, como se muestra en la tabla #1, que contiene los principales colorantes usados en las técnicas microscópicas.

Los colorantes básicos pueden clasificarse como sales cuya base posee color y el ácido es incoloro; en los colorantes ácidos ocurre al contrario, es la parte ácida la coloreada. Los colorantes



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básicos poseen afinidad por el núcleo de las células, y por eso fueron llamados también nucleares. Los colorantes ácidos, en cambio, se llaman citoplásmicos y se fijan preferentemente sobre el citoplasma.

En número menor, existen unos colorantes llamados neutros, en los cuales la base y el ácido son coloreados; estos colorantes, tienen gran importancia en hematología y entran en la categoría de los colorantes compuestos.

Finalmente se ha constituido el grupo de los colorantes indiferentes, que no son ácidos ni bases ni poseen grupos capaces de formar sales; son insolubles en agua y hay que usarlos en solución alcohólica o etérea.

Tabla #1.

Clasificación de los colorantes en base a su función tintórea.

Básicos.

Tionina.Cristal violeta.Violeta de genciana.Violeta de cresil.Violeta de metilo.Azul de toluidina.Azul de metileno.Azur de metileno.Verde brillante.Verde de metileno.Verde malaquita.Azul Nilo.Azul de cresil.Fascina básica.Safranina.Rojo neutro.Vesubina (Pardo bismarck)

Ácidos.

Ácido pícrico.Amarillo victoria.Amarillo naftol.Amarillo martines.Eosina.Fascina ácida.

Neutros. Picrato azul de metileno.Eosinato de azul de metileno.Eosinato de azur de metileno.Picrato de verde de metilo.Verde Diazina.

Indiferentes. Sudán IIIRojo escarlata.



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Por lo que respecta a procedimientos de tinción, tenemos tinciones simples, negativas y diferenciales.

En la técnica de tinción simple, el teñido de las bacterias se lleva a cabo aplicando exclusivamente una solución colorante. Los colorantes más comúnmente usados son la fucsina fenicada, azul de metileno, violeta de genciana o cristal violeta y la safranina.

La tinción en negativo es otro procedimiento que permite observar las células, no coloreadas destacándose bien perceptibles sobre el fondo de la extensión bien teñida en negro. La ventaja que presenta este procedimiento para el estudio de la morfología es que las células no reciben tratamiento físico o químico enérgico. Es muy apropiado para los organismos capsulados.

Los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre las células bacterianas o entre partes de una misma célula, se denominan técnicas de tinción diferencial. Son algo más complicadas que las de tinción simple por cuanto se expone la preparación a más de una solución colorante, o se emplean ciertos reactivos complementarios para la tinción. Las dos coloraciones más importantes son la de Gram y la de gérmenes ácido resistentes.

La tinción de Gram se basa en los constituyentes y permeabilidad de las paredes celulares de las bacterias para retener o no el cristal violeta, clasificándolas en gram negativas y gram positivas.

Se inicia con la aplicación de un colorante básico, posteriormente se aplica una solución de lugol. En este momento, todas las bacterias se tiñen de morado. A continuación, se trata con un agente decolorante (alcohol-acetona) y por último con el colorante de contraste; las células gram positivas retienen el colorante cristal violeta-yodo, permaneciendo color morado; por otra parte, las células gram negativas previamente decoloradas toman el colorante de contraste; esto se basa en el elevado contenido graso de las paredes celulares de los organismo gram negativos.

Las muestras experimentales muestran que, durante la práctica del procedimiento, el tratamiento alcohólico extrae las grasas aumentando la permeabilidad o la porosidad de la pared celular de los microbios gram negativos. El complejo cristal violeta-yodo se extrae así por el organismo gram negativo se decolora. Las paredes celulares de las bacterias gram positivas, a causa de su diferente composición, se deshidratan por el alcohol, el tamaño de los poros disminuye, se reduce la permeabilidad y el complejo cristal violeta-yodo no se extrae.



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Existen muchos métodos para teñir los hongos, algunos de los cuales son:

Hematoxilina.

La hematoxilina tiñe prácticamente todos los hongos; pero en muchos casos, el contraste en los cortes no es muy satisfactorio.

Tinción de Gram.

Antes del descubrimiento de otros métodos, el de Gram era el más difundido. Los cuerpos centrales de los hongos encapsulados como Criptococos y blastomices son fuertemente gram positivos. Las cápsulas de casi todos los hongos son gram positivos, pero pierden fácilmente su color si se utiliza acetona. El método de Gram permite encontrar casi todos los hongos en los tejidos (cándida, aspergilio, criptococos, histoplasmas, blastomices, actinomices.) Los micelios son gram positivos; las esporas son gram negativas y también gram negativos es Actinobacillus, Actinomycetem Comitans, que los acompañan con frecuencia.

Tinción de Giemsa.

La solución de Giemsa es excelente para Histoplasma capsulatum, y también puede emplearse para Criptococcus.

Tinción de Ziehl-Neelsen.

Tiñe algunas especies de Nocardia y microorganismos acidorresistentes, como N. Asteroides y N. Brasillensis. El micelio de A. Israelí no es ácido resistente, pero las esporas resisten a la decoloración con ácido al 1% hasta durante 30 segundos en la técnica de ziehl-Neelsen.

Metacromasia de las cápsulas.

Las cápsulas de Criptococcus Neoformans y de los Blastomices muestran tinciones metacromáticas (de rosa a violeta) con azul de toluidina (o tionina.)

Tinciones especiales.

Las cápsulas y las paredes de los hongos son ricas en polisacáridos, lo que permite aplicar varios métodos muy elegantes.

Técnica PAS de Hotchkiss-McManus.



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Es utilizada para cortes y frotis, por ejemplo de raspado de piel. Se puede emplear como colorante de contraste hematoxilina de Harris o PTAH de Mallory, durante 30 segundos a un minuto. N. B. Actinomyces y Nocardia se tiñen mal o no se tiñen con las técnicas de PAS, de Gridley y de Grocott; es preferible estudiarlos por el método de Gram.

Técnica de Bauer-Feulgen.

La gran cantidad de grupos aldehído en las paredes de quitina celulosa de los hongos permite aplicarles ácido crómico que destruye grupos aldehidógenos de muchos otros elementos de manera que disminuye la intensidad de fondo al aplicar la tinción de Schiff.

Azul anciano.

El azul anciano tiene gran afinidad por los carbohidratos ácidos, y se puede aprovechar para teñir las cápsulas de las bacterias y hongos; también puede combinarse con la técnica de PAS.

Tinción de Gridley para los hongos.

Es una modificación del método del ácido crómico-Schiff; en realidad constituye una combinación del método de Bauer-Schiff, que tiñe los conidios y esporas y del aldehído-fucsina de Gomori, que tiñe las hifas. Es excelente para estudiar las paredes del hongo. S pueden emplear cortes en parafina de cualquier tejido bien fijado.

TÉCNICAS, TINCIONES Y FÓRMULAS.

I. REACTIVOS Y COLORANTES.

Reactivos:

1.- KOH al 10%: KOH 10 grs. Agua destilada 90 ml.Uso: como solución aclarante para exámenes directos. Se puede preparar al 20%.2.- KOH glicerinado: KOH 10 grs. Glicerina 10 ml, agua destilada 80 ml.Uso como solución aclarante para exámenes directos; la ventaja de esta solución radica en que se evapora en menor proporción. 3.- NaOH-AzurParker: NaOH al 10% 90 ml. Tinta azul de Parker 10 ml.Uso: Como colorante para exámenes directos de pitiriasis versicolor e infecciones por Pytirosporum sp.4.- Lugol: KI 1 gr. Cristales de yodo (1°) 1.5 grs. Agua 100 ml.Uso: solución de contraste, para exámenes en fresco de exudados y secreciones.



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Colorantes:

5.- Azul algodón acético: Azul de algodón 0.5 grs. Ácido acético 3 ml. Agua destilada 97 ml.Uso: Como colorante de microcultivos.6.- Azul de lacto-fenol: Azul de algodón (de anilina) 0.05 grs. Glicerol 40 ml. Fenol (cristales) 20 grs. Ácido láctico 20 ml. Agua destilada 20 ml.Preparación: Disolver el fenol en ácido láctico, posteriormente se agrega agua y glicerol, calentando ligeramente; por último se adiciona el azul de algodón.Uso: Para exámenes directos de las cepas.7.- Azul de metileno: Azul de metileno 0.3 grs. Alcohol etílico (95%) 30 ml. Agua destilada 70 ml.Uso: como colorante de contraste en tinciones de AAR, o para exámenes directos de cepas.8.- Azul de tripano: azul de tripano 1 g. Agua destilada 100 ml.Uso: colorante de microcultivos.9.- Alcohol ácido (modificado Ziehl-Neelsen): ácido sulfúrico 0.5 ml. Agua destilada 99.5 ml.Uso: para tinción de ácido alcohol resistencia de actinomicetes (Nocardia)10.- Solución de cristal violeta: Solución A :Cristal violeta 2 g. Alcohol etílico 95% 20 ml. Solución B: oxalato de amonio 0.9 g. Agua destilada 80 ml.Preparación: mezclar solución A y B y dejar reposar por 24 horas; filtrarUso: Colorante de Gram.11.- Eritrocina: eritrosina 1 g. Alcohol etílico 1 ml. Agua destilada 98 ml.Preparación: disolver el colorante en alcohol etílico, posteriormente agregar el agua destilada.Uso: como colorante de microcultivos.12.- Fucsina básica o carbón fucsina: Solución A: solución básica 4 g. Alcohol etílico 20 ml. Solución B: fenol (cristales) 8 ml. Agua destilada 100 ml.Preparación: obtenga solución A, deje reposar 24 horas, posteriormente agregue solución B y filtre en papel.Uso: para tinción de AAR de microbacterias y Nocardia.13.- Solución de Giemsa: Giemsa 1 g. Glicerol 66 ml. Metanol absoluto 66 ml. Preparación: disolver el colorante en glicerol, calentar durante una hora a 60°C, posteriormente agregar el metanol y filtrar.Uso: para diversas tinciones.14.- Safranina: Solución A: safranina 0.25 g. Etanol 100 ml. Solución B: 10 ml de solución A. Agua destilada 90 ml.Uso: como colorante de Gram.



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15. - Colorante de Wright: colorante de Wright 0.30 g. Glicerol 3 ml. Metanol absoluto 97 ml.Preparación: mezclar el colorante en glicerol, y posteriormente agregar el metanol.Uso: para tinciones diversas.

II. TÉCNICAS Y TINCIONES.

1.- Examen directo con cinta adhesiva o Scotch

Esterilizar a la flama el asa micológica y dejar enfriar. Pegar al asa micológica un fragmento de cinta adhesiva

transparente. Introducir el asa con la cinta en tubos y cajas Petri, hasta

tocar la colonia a investigar por la parte adhesiva de la cinta.

Desprender el fragmento de la cinta adhesiva, con la ayuda de una aguja de disección, sobre un portaobjetos con una gota de colorante (azul de lactofeno o lugol)

Colocar una gota del mismo colorante sobre la cinta y posteriormente poner un cubreobjetos.

Si se quiere sellar la preparación, se coloca alrededor del cubreobjetos barniz de uñas.

2.- Siembra de microcultivos.

Material: cajas Petri estériles con 2 portaobjetos y triángulo de vidrio cada uno; medio de cultivo en caja Petri (Saboraud. PZ o papa dextrosa agar)

Fragmentar con la ayuda de un bisturí el medio de cultivo en cuadros de aproximadamente 1.5 X 1.5 cm.

Colocar 1 o 2 cubos del medio fragmentado sobre uno de los portaobjetos.

Sembrar el hongo a estudiar por los cuatro lados del medio de cultivo.

Colocar el segundo portaobjetos sobre el medio de cultivo.

Agregar a la caja Petri de 10 a 15 ml de agua glicerinada estéril (5%).

Sellar la caja Petri con cinta adhesiva. Incubar dependiendo el hongo a estudiar. Realizar tinción especial para el microcultivo.

3.- Tinción de microcultivos con azul de algodón acético.

Retirar el exceso de agar con la ayuda de un bisturí.



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Fijar la preparación con metanol hasta evaporación. Teñir con azul de algodón ácido por 15 min. Lavar ligeramente con agua destilada. Lavado con alcohol al 96%. Lavado con alcohol absoluto. Baño de xilol durante 5 minutos. Montar la laminilla con bálsamo de Canadá.

4.- Tinción de microcultivos con eritrocina.

Retirar el exceso de agar con ayuda de un bisturí. Fijar la preparación con etanol hasta evaporación. Teñir con eritrosina durante 10 a 15 minutos en emisiones

de baño de agua o por calentamiento directo a la flama. Retirar el exceso de colorante con etanol. Baño en acetona durante 10 minutos. Baño en xilol-acetona (1:2) durante 10 minutos. Baño en xilol durante 10 minutos. Montar la laminilla con bálsamo de Canadá.

5.- Tinción de Ziehl-Neelsen (para actinomicetos).

Fijar el frotis directamente a la llama Teñir con fucsina básica en vapores de agua durante 10

minutos Decolorar con alcohol ácido modificado (formula 1-9) Lavar ligeramente con agua destilada Teñir de contraste con azul de metileno durante 5

minutos Lavar ligeramente con agua y dejar secar

6.- Tinción de Gram. Fijar el frotis directamente a la llama Teñir con cristal violeta durante 1 minuto Decolorar con alcohol-cetona Lavar ligeramente con agua destilada Cubrir la preparación con lugol durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua Teñir de contraste con safranina durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua y dejar secar

7.- Tinción de tinta china para Cryptococcus sp. Fijar el frotis directamente a la planta Teñir con fucsina básica durante un minuto Lavar ligeramente con agua destilada Hacer un frontis con tinta china o nigrosina (como frotis

de sangre)



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Dejar secar

COLORACIÓN DE HONGOS EN TEJIDOS.

Colocar la muestra extraída o biopsia o punción, etc., en frasco con formol al 10.pasar a alcohol de 70° durante 24 horas (puede disminuirse en tiempo a 2 horas).

Chocar a continuación en alcohol de 95° durante 24 horas (puede dejarse 2 horas)

La siguiente etapa consiste en sumergir la pieza anatómica en alcohol abs. Durante 24 hora (puede disminuirse el tiempo a 2 horas)

Pasar luego la pieza por xilol durante 6 horas (si se siguió la técnica de las dos horas se puede dejar de 6 a 7 minutos.

Incluir luego en parafina (tacos) y realizar cortes histológicos con microtomo.

Pasar los cortes histológicos obtenidos por xilol y luego por alcohol absoluto para eliminar este y por alcohol de 95° para hidratar

En este omento los cortes están listos para realizar las distintas coloraciones. Se fijan con albúmina sobre un porta objetos limpio y se trata con alcohol de 95°.

MÉTODO DE GRIDLEY

Oxidar con ácido crómico al 4% durante 1 hora Lavar con agua corriente durante 5 minutos Colocar durante 15 minutos e siguiente colorante:

Fucsina básica 1g y agua destilada hirviente 200ml Enfriar y agregar 2 gramos de metabisulfito de

potasio y 10 ml de HCl Dejar reposar 24 horas Agregar 0.5 g de carbón activado Agitar durante un minuto Filtrar con papel

Colocar en solución de: Metabisulfito de potasio al 10% 6 ml HCL 5ml Agua destilada c.b.p. 100ml

Durante dos minutos cambiando la solución 3 veces. Lavar con agua corriente durante 15 minutos Chocar los cortes en fucsina aldehídica de 15-20 minutos:

Fucsina básica 1gAlcohol de 70° 200 mlParaldehído 2ml HCl



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A temperatura ambiente durante 3 días hasta que se vuelva azul oscuro

Guardar el refrigerador Lavar con alcohol de 95° Lavar con agua corriente Contracolorear durante 2-5 minutos en:

Amarillo de metano 0.25g Agua estilada 100ml. Ácido acético glacial 0.25ml

Lavar con agua y pasar con xilol Montar con bálsamo de Canadá, colocando un cubre

objetos y observar a microscopioNOTA:

Los hongos aparecen de una coloración púrpura, el tejido conectivo, adquiere una tonalidad amarilla, y el tejido elástico y la mucina color azul

MÉTODO DE GOMORI

Desparafinar los cortes y pasarlos con alcohol absoluto y luego alcohol de 95°

Tratar con albúmina y fijarlos con alcohol de 95° Sumergir os cortes en ácido crómico al 5 % durante 1 hora Lavar con agua corriente durante 10 minutos Colocar en solución de bisulfito de sodio 1% durante 1 minuto Lavar con agua corriente durante 5 minutos y pasar luego por

agua destilada 3 veces. Es mejor sumergirlos en agua destilada durante horas

Colocar os preparados en solución argéntica durante 2 horas, manteniendo la temperatura a 45-50°C

Solución argéntica Nitrato de plata 5% 5 ml Urotropina 3% 10 ml Agitar hasta disolución del precipitado Conservar en el refrigerador

Lavar con agua destilado 2 o 3 veces Sumergir en cloruro de oro al 0.1% durante 5-10 minutos Tratar con solución de hiposulfito de sodio al 2% durante 2

minutos Lavar con agua rápidamente Deshidratar y montar con bálamo de Canadá, y observar al

microscopioNOTA: Los hongos se observan teñidos en negro sobre el fondo rojo

MÉTODO DE McMANUS-HOTCHKISS:



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Desparafinar con xilol y pasar por alcohol abs. Y de 95° Colocar el corte en ácido periódico al 1% durante 10min. Lavar con agua corriente Chocar el reactivo de Schiff 10 min Fucsina básica 0.1 g Alcohol de 95° 5 ml Agua 95ml Lavar con agua corriente Sumergir el portaobjetos en solución de: Hidrosulfito de zinc 1gr Ácido tartárico 0.5gr Agua 100ml

Durante 30 min. Lavar con agua corriente durante 1 minuto

Diferenciar con ácido pícrico en solución acuosa saturada durante 2 minutos.

Deshidratar y montar con bálsamo de Canadá y observar a microscopio

NOTA: Los hongos aparecen coloreados de un tono violáceo.

TÉCNICA:

Realizar una tinción simple, una de Gram y una de Ziehl-Neelsen, utilizando los colorantes y procedimientos adecuados.


CONCLUSIÓN:



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BIBLIOGRAFÍA:

Modificación a método de Tinción de Gram para la identificación de tricomonas en Exudados Vaginales, Tesis de Avendaño Moreno Consuelo; (1985)

Diagnóstico Micológico, Amadeo D´Alessandro; edit. Panamericana

Micología Médica Básica; A. Bonifaz; edit. Méndez Cervantes.

Métodos de laboratorio, Lynch; et al; edit. Interamericana; México 1965.

Xalapa, Ver., a _____________________________________

Vo. Bo.

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PRACTICA 3.MÉTODO DE BURRI.

OBJETIVO:

Que el alumno aprenda a utilizar el método de Burri, y lo utilice en el laboratorio en el diagnóstico de Cryptococosis.

GENERALIDADES:

El Cryptococcus neoformans es un hongo tipo levadura que causa Cryptococosis. Se presenta como cuerpo en forma de levadura de 5 a 20 micras de diámetro, que muestran gemación simple (ocasionalmente múltiple) y están rodeadas de una cápsula ancha de material gelatinoso. Esta cápsula esta constituida por polisacáridos como xilosa, manosa y ácido glucorónico, que determina su virulencia por medio de deterioro de la fagocitosis. En líquido cefalorraquídeo, estas estructuras no deben confundirse con glóbulos rojos o linfocitos; no tienen el índice de refracción de los primeros, y se distinguen de los segundos por la presencia de yemas.

La enfermedad se encuentra en el mundo entero y casi siempre ataca las meninges y el cerebro, aunque también se conocen lesiones del pulmón, la piel y los huesos. El microorganismo puede cultivarse del suelo, y se piensa que generalmente penetra al organismo por las vías respiratorias.

La clasificación clínica de la cryptococosis se divide como sigue:

Pulmonar (25%) Diseminada (visceral) (15%) Del SNC (45%) Ósea (5%)



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Cutánea (10%)

Patogenia.

La cryptococosis pulmonar se inicia por la inhalación de las levaduras, estas llegan hasta los alvéolos atravesando las vías respiratorias, generando así el primer contacto pulmonar, que la mayoría de veces cursa de manera subclínica o asintomático, no genera una respuesta inflamatoria tan intensa como lo hacen otros hongos o mico bacterias. C. neoformans, prolifera rápidamente si no existe una adecuada defensa celular, en especial células mononucleares (linfocitos, histiositos, etc.), esto explica porque los pacientes linfoma tozos son altamente susceptibles a la enfermedad. Si el proceso infeccioso no se detiene, los microorganismos fácilmente se diseminan por vía linfática y hematógena; con gran predilección hacia el SNC, en donde el LCR es además deficiente en un factor fungicida denominado factor anticriptococósico; en este sistema las lesiones se desarrollan en las meninges y afectan los nervio craneales, tallo cerebral y cerebelo; el cuadro que provoca es generalmente de una meningitis crónica. A partir de este foco puede diseminarse hacia otros órganos como vísceras, piel y huesos.

Las levaduras del C. neoformans pueden penetrar por vía cutánea, dando una cryptococosis primaria cutánea, que se inicia por la formación de un complejo primario similar al de la esporotricosis, es decir, se forma un chancro o lesión inicial, constituido por linfagitis y adenitis, éste puede involucrar por completo o formar una lesión granulo matosa, ulcerada o de aspecto acneiforme.

Todos los criptococos producen ureasa, pero no es el caso de las especies de Cándida. Los medios que contienen actidiona (ciclo heximida) inhiben el criptococos, pero carecen de efecto sobre el desarrollo de la Cándida.

Los criptococos no patógenos no crecen a 37ºC; un criptococo no patógeno frecuente, Rhodotorula, produce una colonia roja anaranjada pálida. Los ratones son sensibles a la infección de C. neoformans; la inoculación puede hacerse por vía intraperitonal o cerebral.

Frente a un caso sospechoso, siempre debe recurrirse a inoculación al animal.

Diagnóstico de Laboratorio.

Toma de muestra:



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Dependerá del tipo de tryptococosis, por lo que se puede manejar expectoración, lavado bronquial, LCR, exudados, biopsias, etc.

Examen directo:

Es de poca utilidad, por que mediante esta técnica no se hace evidente la cápsula; por lo tanto las levaduras fácilmente se confunden con Candida sp. u otros hongos levaduriformes.

Frotis:

A partir de las muestras LCR, esputo, etc., se realiza un frotis, se fija al calor y se agrega extendiendo una gota de tinta china o nigrosina.

MÉTODO DE BURRI:

Por refringencia con el microscopio se puede observar fácilmente el cuerpo de la levadura y el halo de la cápsula. En nuestra experiencia ponemos una gota de fucsina básica (de Zielhl-Neelsen) por minuto y posteriormente teñimos de contraste con tinta china; los resultados son buenos, obteniendo el cuerpo de la levadura de color rojo rosa, un halo blanco de la cápsula y el fondo de la preparación negro. Algunos autores reportan excelentes resultados con tinción de mucicarmín de Mayer, este colorante tiñe la cápsula en fracciones.

Cultivos:

Los medios de cultivos más útiles son Saboraud, extracto de levadura y BHI agar; nunca debe sembrarse en micosel, porque la ciclo eximida (actidione) inhibe a C. neoformans. El desarrollo se obtiene en dos a tres días a temperaturas ambiente de 0 a 37ºC.

Las colonias son limitada, mucoides, convexas, de color blanco amarillento y dan un aspecto de leche condensada, raras veces toman un color rosa pálido. Al microscopio se observan células levaduriformes de aproximadamente 4 a 8 micras de diámetro con blastosporas de la mitad de su tamaño, ambas con todo y la cápsula llegan a medir hasta 20 micras de diámetro.

Un medio de cultivo selectivo para C. neoformans, es a base de semillas de “negro” o “alpiste negro”, de donde genera colonias con pigmentos café-marrón, que se distinguen de otros géneros y especies.



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TÉCNICA:

Realizar una tinción simple, una de Gram y una de Ziehl-Neelsen, utilizando los colorantes y procedimientos adecuados.

Este método se utiliza especialmente para la observación en fresco de Cryptococcus capsulatum (neoformans).

Emplear como medio de contraste tinta china que debe ser de muy buena calidad y no debe hallarse contaminada por hongos levaduriformes.

1. Colocar una gota de tinta china sobre el portaobjetos.2. Agregar una gota de material por investigar, que

generalmente es líquido cefalorraquídeo o esputo, y mezclas con el asa.

3. Colocar el cubreobjetos y observar.4. Si el material fuera muy espeso, conviene diluir la tinta

china con una gota de agua.

REACTIVOS

Tinta china

Muestra biológica

Colonia de hongos

Material

Asa de platino o nicromelMechero bunsenPorta y cubreobjetos

Equipo

Microscopio




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CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA:

Micología Médica Básica, Bonifaz A.; 2ª reimpresión; Edit. Méndez; México 1994.

Métodos de Laboratorio, Lynch y col.Diagnóstico Micológico; Amadeo D’ Alessandro; Edit. Panamericana.

Xalapa, Ver., a ______________________________________



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Vo. Bo.

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PRACTICA 4.CULTIVO DE HONGOS.

OBJETIVO:

Que el alumno aprenda a cultivar hongos de interés clínico.

GENERALIDADES:

EXTRACCIÓN DE MATERIALES DE LA LESIÓN.

Los materiales necesarios son: pinzas, agujas, bisturí, espátulas, tijeras, portaobjetos, cajas de Petri, etc.

Realizar siempre una limpieza previa de la lesión con alcohol (nunca con alcohol yodado), porque los pacientes generalmente llegan hasta el analista ya medicados con cremas, ungüentos, etc.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE MICOSIS SUPERFICIALES.

Lesiones en piel (tiña, pedis, cruris y corporis): se hace un raspado cuidadoso de la lesión con el fin de retirar el mayor número de escamas y recibirlas en una caja Petri; es importante que el raspado se haga con cierta presión pero sin llegar a sangrar, ya que esto interfiere con la calidad de la muestra.

Lesiones en cabeza (tiña capitis): se hace una toma similar a la anterior pero un poco más persistente y enérgica con el fin de desprender suficiente escamas. Posteriormente se localizan los pelos parasitazos los cuales son cortos y



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están rodeados de un material blanquecino; con la ayuda de las pinzas de depilar son arrancados y depositados en la caja Petri.

Lesiones en uña (tiña unguis): las uñas aumentadas de volumen y deformadas tienen un aspecto blanquecino y pulverulento, por lo que la toma de este material es relativamente fácil, basta raspar con el bisturí la parte inferior de la uña y colectar la escamas en la caja Petri.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE MICOSIS SUBCUTÁNEAS.

Las enfermedades de este tipo incluyen la cromomicosis, micetoma o (maduromicosis), esporotricosis y rinosporodiosis, etc. Los especimenes mejor colectados de este grupo incluyen costras y sus provenientes de abscesos abiertos; del exudado de las lesiones; de fluidos aspirados de tractos séricos cerrados o abscesos por medio de jeringa; y tejido proveniente de la biopsia.

El organismo Rhinosporidium seeberi que causa la rinosporidiosis, no ha podido ser cultivado hasta ahora; sin embargo los raspados provenientes de raspados o biopsias deben ser examinados directamente o fijados para el examen histológico.

El material de esta micosis debe ser puesto en tubo o en frascos estériles adicionados de penicilina y estreptomicina y enviados enseguida al laboratorio para ser examinados al microscopio y sembrados en medio de cultivo adecuados según el tipo de micosis que se trate.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE MICOSIS SISTEMÁTICAS PROFUNDAS.

La micosis sistemática o profunda puede diagnosticarse en el laboratorio a partir de un examen de la pus o del exudado; del fluido espinal; de la saliva; de la médula ósea o sangre; o del material proveniente de abscesos, biopsias o autopsias. El examen directo, los cultivos y en algunos casos la inoculación animal deben hacerse a partir del material colectado.

ROTULO DE LAS MUESTRAS.

Todas las muestras que se obtienen para el diagnostico clínico deben contener la siguiente información:



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1. Nombre, edad y sexo del paciente.2. Número de identificación asignado al paciente o espécimen.3. Nombre del médico que manda a realizar el examen.4. Nombre de la institución donde se obtiene la muestra, si la

muestra se envía a otra.5. Tipo de material presentado y colectado.6. Enfermedad sospechada o alguna otra información pertinente.7. Resultados de cualquier prueba serológica o dérmica hecha.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS.

En todos los casos se practicará un examen microscópico directo de los materiales extraídos. Para ello, los pelos y escamas de piel o de uñas se colocarán sobre un portaobjetos limpio con una gota de hidróxido de sodio o potasio al 20-30%, se cubrirán con un cubreobjetos y se calentarán sobre la llama suave de un mechero, apretando suavemente con el dedo, tratando de disgregar el material. Luego se mirará al microscopio con el objetivo de 10 diámetros de aumento y después con el de 40.

SIEMBRAS.

Se utilizarán medios de cultivo de Sabouraud con y sin antibióticos.

Se siembran los trozos de pelos o escamas de piel (lo más pequeños posibles) y los medios de cultivos, utilizando para ellos dos tubos de Sabouraud glucosado con antibiótico.

Se esterilizará el gancho o asa, enfriándolo luego en el medio de cultivo, apoyándolo sobre la superficie del mismo. Luego se tocarán las escamas o pelos que, de esta manera quedarán adheridos. Se ubicarán estos trocitos sobre la superficie del agar, tratando de presionar suavemente con el asa para que penetren en el medio de cultivo. Se siembran de esta manera en la superficie del medio 5 o 6 trocitos del material quedando separados por un pequeño espacio. Se incubarán a 25°C durante 20 a 30 días. Si no se dispone de una estufa graduada a esta temperatura, se puede ubicar sobre la de 37°C, tapándolos con una caja de plástico o de vidrio para que pueda penetrar la luz ya que la pigmentación de algunos hongos puede verse interferida en su ausencia.

Todos los días se observará el posible desarrollo fúngico. No debe informarse como negativo un cultivo antes de los 30 días.

MEDIOS DE CULTIVO.



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Los medios de cultivo más utilizados o clásicos son el medio glucosado de Sabouraud y el medio de Sabouraud con antibióticos. Los medios de cultivo pueden ser de tres tipos: naturales, semisintéticos y sintéticos.

Los naturales están elaborados con leche, huevo, granos de cereales, levadura de cerveza y otros compuestos. Los semisintéticos, como el Sabouraud, aportan una fuente de carbono y nitrógeno. Los sintéticos tienen una composición química bien definida y se usan en investigación, no son de uso sistemático.

Se preparan fácilmente, los ingredientes se disuelven por separado en agua y se mezclan en un matraz erlenmeyer, se calientan 15 minutos a baño María y 5 a 6 minutos en el mechero, la solución se coloca en tubos y se procesa en autoclave a 110°C durante 15 a 20 minutos al sacarlos se colocan en posición inclinada para aumentar la superficie de cultivo. Pueden utilizarse cajas Petri, que deben llenarse después de esterilizar el medio.

Si se usa tapón de rosca no debe tapar herméticamente para facilitar la llegada de oxígeno o se pueden utilizar los tapones de algodón.

Todas las manipulaciones han de realizarse en el área esterilizada de la llama de un mechero Bunsen o en una campana de flujo laminar.

USO MEDIOS DE CULTIVOIdentificación de C. neoformans. Medio de alpiste negro agar.

Medio de agar dextrosa urea.Medio de Staib.

Esporulación de dermatofitos. Arroz agar.Producción de ascosporas (género saccharomices).

Agar para producción de ascosporas.

Transporte y revitalización. Sabouraud caldo.Medio selectivo de primoaislamiento para diversas levaduras

Biggy agar.Medio de coco.Medio V8 agar.

Primoaislamiento, conservación y producción de pigmentos de dermatofitos. Para esporulación de hongos dermatiáceos.

Medio Borelli.DTM agar.PZ + dextrosa al 1%.

Investigación de hidrólisis de caseína en actinomicetos.

Medio de caseína (actinomicetes).Medio para hidrólisis de caseína (Nocardia).

Investigación de carbohidratos. Medio para investigación de carbohidratos (zimogramas)

Primoaislamiento y conservación Sabouraud caldo.



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de diversos hongos. Sabouraud dextrosa agar.Papa peptona agar.Infusión de cerebro corazón agar. (M. mycetomatis y A. madurae)Harina de maíz agar.Extracto de levadura agar.Papa dextrosa agar.Medio de conservación.

Para estimulación de pigmento de A. pelletieri y T. violaceum.

Medio de coco.

Investigación de licuefacción de gelatina.

Gelatina.

Esporulación de diversos hongos. Harina de maíz agar.Papa dextrosa agar.Papa zanahoria agar.Papa peptona agar.

Formación de pseudomiceliso y clamidospora en el género Candida.

Harina de maíz + Tween 80.Papa zanahoria + Bilis de buey.Medio de cereal.Agar para clamidosporas.

Medio selectivo para hongos patógenos.

Micosel o micobiotic agar.Medio kurung (en su forma parasitaria)

Medio de producción de pigmento de T. Rubrum.

PZ + dextroza al 1%.

Primoaislamiento de actinomycetos anaeróbicos y microaerófilos.

Tioglicolato caldo.

Pruebas fisiológicas de actinomycetos.

Medio para la investigación de xantina, hipoxantina y tirosina.Medio Bennett.

Rehidratar cultivos desecados. Sabouraud caldo.Identificación de Aspergillus y Penicillium.

Medio Czapek.

Para cultivar Pytirosporum. Medio de Sabouraud con aceite de oliva.Medio para Pytirosporum con bilis de buey.Medio con ácido oleico y vitamina A.

Estimula la fructificación. Extracto de malta o cerveza.Para observar órganos perforadores presentes en T. Mentagrophytes.

Medio para penetración de pelos in vitro.Medio de agar dextrosa urea.

Observar producción de ureasa. Medio de agar dextrosa urea.Para el transporte de hongos. Medio de Stuarts.Identificación de micobacterias y Medio de Lowestein-Jensen



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actinomadura.Para la obtención de antígenos. Medio de Smith.

Agar para Clamidosporas.

Fórmula.

Sulfato de amonio 1 g Fosfato monopotásico 1 gAzul de trípano 0.1 gPolisacárido purificado 1 gAgar 1 gBiotina 1 gAgua destilada 1000 ml

Se suspenden 37 g del polvo deshidratado de la fórmula en el agua destilada y se deja remojar durante 15 minutos, se hierve durante 1 minuto agitando frecuentemente; se distribuye en los tubos y se esteriliza a 121°C durante 20 min.

Uso: estimula clamidosporas en C. albicans.

Agar para producción de ascosporas.

Fórmula

Acetato de potasio 10 gExtracto de levadura 2.5 g

Dextrosa 1 gAgar 20 gAgua 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Uso: producción de ascosporas (género saccharomyces).

Agar Sabouraud cicloheximida.

FórmulaSabouraud glucosado 1000 cm3

Cloranfenicol 500 mgCicloheximida 500 mg

Disolver la cicloheximida o actidiona en 10 cm3 de acetona, el cloranfenicol en 10 cm3 de alcohol. Agregar el medio ya fundido y esterilizar a ¾ de atm durante 20 minutos.

Uso: primoaislamiento y conservación de diversos hongos

Arroz agar.

Fórmula



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Arroz blanco molido 8 gAgua destilada 25 ml

Poner los ingredientes en matraz erlenmeyer y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Uso: para esporulación de dermatofitos.

Biggy agar.

Fórmula

Citrato de bismuto 5 gAmoniaco sulfito de sodio 3 gDextrosa 10 gExtracto de levadura 1 gGlicina 10 gCloranfenicol 0.5 gAgar 10 gAgua destilada 1000 ml

Hervir el medio 5 min y repartir en cajas Petri o tubos. No se debe esterilizar en autoclave.

Uso: medio selectivoo de primoaislamiento para diversas levaduras.

DTM agar (Dermatofite Test Medium).

Fórmula

Fitona 10 gDextrosa 10 g

Gentamicina 0.1 gCloranfenicol 0.1 gRojo de fenol 4 mlAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 980 ml

Los carbohidratos pueden ser: glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, galactosa, etc. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Uso: primoaislamiento de dermatofitos.

Preparación del indicador: se mezcla rojo de fenol 0.5 g; NaOH (0.1N) 15 ml; agua destilada 100 ml.

Extracto de levadura agar.

Fórmula

Extracto de levadura 1 gAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 1000 mlPh 6

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

Uso: primoaislamiento de diversos hongos.

Extracto de malta o cerveza.

FórmulaHarina de malta 200 mgAgua destilada 1000 ml



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Se coloca a 45°C luego se intenta elevar un °C por minuto hasta 70°C 10 min. Se verifica mediante coloración con yodo si ha desaparecido el almidón. Es necesario 70°C hasta que desaparezca todo el almidón. A continuación se filtra la mezcla y se agrega clara de huevo (1 por 2 lt). Se esteriliza a 125°C durante 45 min. Se afora a un lt y se esteriliza a 110°C.

Uso: estimula la fructificación.

Gelatina.

Fórmula

Gelatina 4 gAgua destilada 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

Uso: para investigación de licuefacción de gelatina en actinomycetos y hongos negros.

Harina de maíz agar (Corn meal agar)

Fórmula

Harina de maíz 40 gAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 121°C de 10 a 15 min.

Uso: medio de esporulación y conservación de diversos hongos

Harina de maíz + Tween 80.

Fórmula

Medio de harina de maíz 990 mlTween 80 10 ml

Esterilizar en autoclave a 121°C 15 min.

Uso: para formación de pseudomicelios y clamidosporas en el género Candida.

Nota: se le puede adicionar 1 ml de azul de trípano al 1%

Infusión de cerebro corazón agar (BHI).

Fórmula

Infusión de cerebro de ternero 200 gInfusión de corazón de res 250 gPeptona 10 gDextrosa 2 gCloruro de sodio 5 gFosfato disódico 2.5 gAgar bacteriológico 20 gAgua 1000 mlPh 7.4

Esterilizar en autoclave a 121°C 15 min.



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Uso: primoaislamiento de diversos hongos, en especial M. mycetomatis y A. madurae.

Medio con ácido oleico y vitamina A.

Fórmula

Sabouraud simple 6.5 gTween 80 1 mlÁcido oleico 10 gVitamina A 10 gotasCloramfenicol 0.5 gAgua destilada 100 ml

Uso: se usa para pytirosporum.

Medio agar dextrosa urea.

Fórmula

Dextrosa 1 g Peptona 1 gFosfato monopotásico 2 gUrea 20 gRojo fenol 0.012 gAgua destilada 1000 ml

Se disuelven. Filtran y esterilizan los ingredientes, se disuelven por separado 15 ml de agar en 900 ml de agua destilada y se esterilizan. Después de enfriar se añade la solución de urea.

Uso: para observar la producción de ureasa, por ejemplo en T. Mentagrophytes y C. neoformans.

Medio de alpiste negro agar.

Fórmula

*Alpiste negro o Níger pulverizado 70 gCloranfenicol 50 gAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 1000 ml

Remojar el alpiste negro en 1 lt de agua. Hervir 30 min.; posteriormente filtrar en gasa y papel filtro. Aforar a 1 lt de agua. Esterilizar en autoclave a 110°C por 15 minutos.Uso: medio de identificación de C. neoformans.

*Semilla de Guizotia abyssinica.

Medio de Bennet.

Fórmula

Extracto de levadura 19 gExtracto de carne 18 g NZ amida A 2 gCaseína para digestión 1 gGlucosa 10 gGelosa 15 gAgua destilada 1000 ml



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Uso: se utiliza para actinomycetos.

Medio de Borelli (lactrimel).

Fórmula

Harina de trigo 14 gLeche en polvo 14 gMiel 7 gAgar 20 gAgua destilada 1000 ml

Esterilizar en autoclave a 110°C por 10 minutos.

Uso: primoaislamiento, conservación y producción de pigmentos de dermatofitos. Para esporulación de hongos dematiáceos.

Medio de caseína.

Fórmula

Solución A Dextrosa 1 gAgar bacteriológico 2 gAgua destilada 50 mlSolución BLeche descremada 1.5 gAgua destilada 50 ml

Esterilizar en autoclave por separado a 110°C o 10 lb de presión por 10 min. Una vez estéril se deben mezclar a una temperatura próxima a 45°C, repartiendo en cajas Petri.

Uso: investigación de hidrólisis de caseína en actinomicetos.

Medio de cereal.

Fórmula

*Cerelac 14 gAgar 10 gAgua destilada 1000 ml

*Producto comercial que contiene harina de maíz, trigo, arroz, cebada, avena y extracto de malta.

Uso: estimula clamidosporas en C. albicans.

Medio de coco.

Fórmula

Agua de coco filtrada 100 mlPeptona 1 gAgar bacteriológico 2 gPh 5 Esterilizar en autoclave a 121°C 15 min.

Uso: aislamiento de diversos hongos levduriformes. Medio para estimulación de pigmento de A. pelletieri y T. violaceum.

Medio de conservación.

Fórmula

Peptona granulada 30-40 g



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Agar agar 20 gAgua destilada 1000 ml

Uso: no contiene azúcares; se utiliza para evitar eñ fenómeno de pleomorfismo. Es recomendable sobre todo en dermatofitos.

Medio de Czapek.

Fórmula

Nitrato de sodio 3 gSacarosa 30 gFosfato dipotásico 1 gCloruro de potasio 0.5 gSulfato de magnesio 0.5 gSulfato de hierro 0.01 gAgar 15 gAgua destilada 1000 ml

Uso: sirve para estudiar Aspergillus y Penicillium.

Medio de Kurung.

Fórmula

Fécula de papa 1 gAgua destilada 100 mlMezcla de huevo 150 mlEl agua con la fécula de papa (patata) se calienta en el mechero de Bunsen hasta que

la mezcla gelifica, entonces se esteriliza a 115°C por 15 min.

Se agita la mezcla de huevo (que contiene 100 ml de yemas y 40 ml de huevos enteros) en presencia de perlas de vidrio y se agrega bajo técnica estéril a la fécula de papa. El medio se reparte en tubos y se deja coagular inclinando a 90°C 1 hr.

Hoy se ha simplificado la preparación de los medios de cultivo al utilizar medios deshidratados a los que hay que añadir el volumen correcto de agua y esterilizar.

Uso: para conservar hongos patógenos en su forma parasitaria.

Medio de Löwenstein-Jensen.

FórmulaFosfato monopotásico 2. 4 gSulfato de magnesio 0.24 gCitrato de magnesio 0.6 gAsparagina 3.6 gGlicerina 12 mlAgua destilada 600 mlFécula de papa 30 mlHuevos frescos 1000 mlSol. verde de malaquita 20 ml

Las sales se disuelven por calentamiento y esta solución se distribuye en frascos que se esterilizan 30 min. a 110°C.



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En un recipiente de 3 lt con perlas de vidrio se ponen los 30 g de fécula de papa que se esterilizó 30 min a 120°C, y la solución previamente preparada. Enseguida se coloca el recipiente a baño María a 100°C y se agita continuamente hasta que el líquidose trona translúcido en alrededor de 15-20 min. Se deja 1 hr en alcohol de 90°, a continuación se rompe uno tras otro en un vaso de pp y se vierten en una probeta de 1 lt; se homogenizan con un agitador mecánico o varilla de cidrio y se filtran en una gasa.

Un litro de huevos se mezclan con un frasco de fécula y se le agregan 20 ml de verde de malaquita. La mezcla se deja en reposo una hora antes de distribuirse en los tubos o en las cajas de Legroux. El medio se coagula con un solo calentamiento de 40 min a 85°C.

Uso: se emplea para actinomycetos, micobacterias y Actinomadura.

Medio de Sabouraud con aceite de oliva.

El medio de Sabouraud con antibióticos se le agrega aceite de oliva al 10%. El aceite se esteriliza por separado y se le agrega al medio cuando se encuentra a 50°C y se vierte en los tubos o las cajas Petri.

Uso: para cultivar pityrosporum.

Medio de Smith.

Fórmula

Cloruro de amonio 7 gAsparagina 7 gFosfato dipotásico 1.31 gCitrato de sodio 0.90 gSulfato de magnesio 1.50 gCitrato férrico 0.30 gGlucosa 10 gGlicerina 25 cm3

Agua 1000 cm3

Distribuir y esterilizar a ¾ de atm durante 20 min.

Uso: para la obtención de antígenos.

Medio de Staib.

Fórmula

Guizotia abyssinica o ác. Cafeico 50 gglucosa 1 g creatinina 1 gKH2PO4 1 gAgar 15 g

Se hierve el polvo de las semillas de G. Abyssinica (alpiste negro) en 1000 ml de agua destilada durante 30 min., se filtra, y se afora el volumen a 1 lt con agua destilada. Se añaden los otros componentes, se esteriliza a 120°C por 20 min. El pH final debe ser de 5.5.

Uso: sirve para identificar C. neoformans, ya que adquiere



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un color café (marrón) oscuro en este medio.

Medio de Stuart.

Fórmula

Tioglicolato de sodio 1 gGlicerofosfato de sodio 10 gCloruro de calcio 100 mgAzul de metileno 0.02 mgAgua destilada 1000 mlPH 7.3

Uso: medio de transporte de hongos.

Medio para hidrólisis de caseína.

Fórmula 1Leche entera en polvo 4 gAgua destilada 500 mlSig. A

Agar 20 gAgua destilada 1000 mlSig. B

Se esterilizan ambas preparaciones. En una caja Petri se mezclan dos tubos de agar con uno de leche, se deja solidificar y se siembra la colonia problema.

Fórmula 2Dextrosa 1 gAgar bacteriológico 1.5 g

Agua destilada 50 mlSig. A

Leche descremada 1.5 gAgua destilada 50 mlSig. B

Se esterilizan por separado A y B a 10 libras por 10 min; se dejan enfriar a 45°C, se vacían en cajas Petri y se mezclan.

Medio para investigación de carbohidratos(zimograma).

Fórmula

Peptona 10 gNaCl 5 gNaOH 1N 1 mlCarbohidrato 20 gAgua destilada 1000 mlIndicador 1-2 gotas

Medio para investigación de xantina, hipoxantina y

tirosina

Fórmula

Agar nutritivo 23 gXantina o hipoxantina 4 gAgua destilada 1000 ml

Se esteriliza en autoclave a 121°C por 15 min.

Uso: para investigación de pruebas fisiológicas de actinomicetos.



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Nota: cuando se investiga tirosina se debe agregar 5 g de xantina o hipoxantina.

Medio para penetración de pelos in vitro.

Fórmula

Agua destilada 20 mlExtracto d levadura 10% 2-3 ml

En una caja Petri se colocan pelos rubios de niño prepúber, de 1 cm de long. esterilizados; se agrega la solución preparada, se inoculan las colonias para estudiar y se dejan transcurrir de 3-4 semanas.

Uso: sirve para observar órganos perforadores, que están presentes en T. mentagrophytes mas no en T. rubrum.

Medio para pithyrosporum con bilis de buey (dixon

modificado)

FórmulaAgar extracto de malta 50-60 gBilis de buey 20 gTween 40 10 mlGlicerina 2.5 mlAgua destilada 1000 ml

Se mezclan los componentes y se disuelven a baño María; se vierten en tubos y se esterilizan

20 min a 120°C. Se pueden añadir antibióticos bacterianos.

Medio V8 agar.

Fórmula

Filtrado de jugo V8 500 mlExtracto de levadura 10 gAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 500 ml

Se esterilizan en autoclave a 121°C por 15 min.

Uso: medio de aislamiento e identificación de levaduras.

Micosel o micobiotic agar (Sabouraud + antibióticos)

Fórmula

Medio de Sabouraud 100 mlActidione(cicloheximida) 400 mgCloranfenicol 500 mgPH 6.5

Los antibióticos se adicionan de la siguiente manera: el actidione en 1 ml de acetona y el cloranfenicol en 1 ml de alcohol etílico, ambos se agregan cuando el medio ha hervido por 1-2 min. Se esterilizan en autoclave a 121°C por 15 min.

Uso: medio selectivo para hongos patógenos.



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Nota: se le adiciona 10-15% de aceite de oliva o ácido oleico, se puede utilizar para el primoaislamiento de hongos lipofílicos (P. ovale y P. orbiculare)

Papa dextrosa agar(PDA).

Fórmula

Pulpa de papa 20 gDextosa 20 gAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 1000 ml


Uso: para primocultivo, conservación y esporulación de diversos hongos.

Papa peptona agar.

Fórmula

Pulpa de papa 20 gPeptona 10 gAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 1000 ml


Uso: medio de esporulación y conservación de diversos hongos.

Papa zanahoria agar (P-Z agar).

Fórmula

Pulpa de zanahoria 20 g

Pulpa de papa 20 gAgar bacteriológico 20

gAgua destilada 1000 ml

Las pulpas maceradas se hierven a fuego lento por 1 hr. Posteriormente se filtran en gasa y se le adiciona al filtrado la cantidad respectiva de agua para completar a 1 lt. Se esterilizan en autoclave a 121°C durante 15 min.

Uso: medio de conservación y de esporulación.

Papa zanahoria bilis de buey.

Al medio anterior se le agrega 15% de bilis de buey.

Uso: estimula clamidosporas en Candida albicans.

PZ + dextrosa al 1%.

FórmulaPZ 990 mlAgar bacteriológico 20 gDextrosa 10 gPH 5.6

Se esteriliza en autoclave a 121°C por 15 min.

Uso: medio de esporulación y conservación de dermatofitos.



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Medio de producción de pigmento de T. rubrum.

Saboraud dextrosa agar.

Fórmula

Dextrosa 20 gPeptona 10 gAgar bacteriológico 20 gAgua destilada 1000 mlPH 6.5

Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min.

Uso: medio rutinario para el primoaislamiento y conservación de diversos hongos.

Sabouraud caldo.

Fórmula

Dextrosa 20 gPeptona 10 gAgua destilada 1000 mlPH 6.5

Se esterilizan en autoclave a 121°C durante 15 min.

Uso: primoaislamiento, transporte y revitalización de diversas cepas.

Tioglicolato caldo.

FórmulaTripticase 20 g

Cloruro de sodio 5 gFosfato monobásico de K 2 gTioglicolato de sodio 1 gAgua destilada 1000 ml

Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min.Uso: para el primoaislamiento de actinomicetos anaeróbicos y microaerófilos.


EXAMEN EN FRESCO

NEGATIVO

POSITIVO

MUESTRA MUESTRA

MACROCOLONIASIEMBRA

EXAMEN EN FRESCO

RESIEMBRA

TINCIONES

MACROCOLONIA

EXAMEN EN FRESCO

ZIMOGRAMA REPORTE


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REACTIVOS

Solución salinaSolución de KOH al 30%

Muestra biológica

Colonia de hongos

Material


Equipo

Microscopio

TÉCNICA:

Se ejemplifica en el siguiente diagrama:

Nota: en algunas ocasiones se realizan pruebas especiales.



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CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA:

Diagnóstico Micológico; Amadeo D’ Alessandro; Edit. Panamericana. Micología Médica ilustrada, R. Arenas; Ed. Interamerica Mc Graw Hill. Micología Médica Básica, Bonifaz A.; 2ª reimpresión; Edit. Méndez. Laboratorio Clínico; Martha P. Díaz Resendiz; IMSS México 1978. Manual de Micología Médica; Cristina Gamboa León; UV. Xalapa, Ver,

1988.

Xalapa, Ver., a ____________________________________________

Vo. Bo.

PRACTICA 5.



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MICROCULTIVO.

OBJETIVO:

Que el alumno aprenda a realizar microcultivos, y los sepa emplear en la diferenciación de los hongos.

GENERALIDADES:

Las micosis son las enfermedades causadas por distintas especies de hongos. Estas afecciones pueden ser superficiales y profundas.

Las micosis o dermatomicosis son procesos infectocontagiosos producidos por distintos agentes micóticos que fundamentalmente invaden piel y/o sus anexos. No tienen carácter maligno y, en la mayoría de los casos, solo afecta la estética.

Por lo general no hay repercusión sistémica y las lesiones aparecen como procesos inflamatorios superficiales ante los cuales el organismo puede responder, entre otras maneras, con la formación de anticuerpos reagínicos o células específicamente sensibilizadas, revelables mediante reacciones de hipersensibilidad cutánea. Generalmente no se evidencian anticuerpos fijadores de complemento ni precipitinas o aglutininas. El grado de inflamación va desde una reacción nula, como en el caso de la pitiriasis versicolor, hasta reacciones graves como el querion.

Las micosis profundas pueden localizarse en dermis, músculos, huesos, pulmones, hígado, cerebro, mucosas, etc. Se observan lesiones inflamatorias y destructivas con la consiguiente difusión de los parásito a través del sistema hemático o linfático o por continuidad. En este caso el organismo infectado responde a la agresión originando anticuerpos específicos, fijadores del complemento, precipitinas, aglutininas, etc.

La mayoría de las micosis profundas revisten de tal gravedad que en muchos casos llevan al paciente a la muerte.

CLASIFICACIÓN DE LOS EUMYCETES.

Diferentes autores han trabajado arduamente tratando de ordenar sistemáticamente las distintas especies de hongos. A continuación se



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transcribirá una clasificación tentativa del ordenamiento lógico de los hongos.

CLASES SUBCLASES ÓRDENES GÉNEROS

Phycomicetes Archimycetes Chytridiales ChytridiumMicelio continuo.Los unicelulares no se reproducen por brotación.Esporos asexuados en esporangios.

Oomycetes Peronosporales

Peronospora

Zigomycetes Mucorales Mucor

Ascomycetes Hemiascomycetes Endomycetales

Saccharomyces

Micelio tabicado.Los unicelulares se reproducen por brotación o esquizogonia.Esporos sexuados internos en ascos.

Euascomycetes Eurotiales Aspergillus

Basidiomycetes Heterobasidiomycetes

Ustilanginales Ustilago (carbón)

Micelio tabicado.Esporos sexuados externos sobre ábsides.

Homobasidiomycetes

Agaricales Agaricus

DEUTEROMYCETES

Mycelia fructignea Moniliales Fusarium

Micelio tabicado.Los unicelulares se reproducen por brotación o esquizogonia.No se conoce reproducción sexuada.

Mycelia sterilia Mycelia sterilia

Sclerotium

TERMINOLOGÍA DE LAS MICOSIS.



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La denominación de las micosis varía según el criterio adoptado para clasificarlas: localización del proceso, hongo que se aísla de la lesión y la designación que utiliza la literatura médica.

De acuerdo con la localización del proceso, la enfermedad micótica puede denominarse: dermatomicosis, micosis pulmonares o neumomicosis, onicomicosis, otomicosis, etc.

De acuerdo al nombre del hongo responsable de la lesión se denomina: aspergilosis, tricofitosis, coccidioidomicosis, candidiasis, etc., cuando los agentes son Aspergillus, Trichophyton, Coccidioides y Candidas, respetivamente.

En el caso de la terminología médica se emplean las siguientes denominaciones: tiñas, pie de atleta, querion, piedras, etc.

MICROCULTIVOS.

Se realizan para estudiar los detalles de la estructura de los hongos que debido a las observaciones comunes se destrozan y desaparecen por acción de los ganchos y de las agujas.

TÉCNICA:

1. Se preparan placas de Petri con un papel secante en su interior.2. Se coloca un porta y un cubreobjetos y se esteriliza.3. Se prepara una caja Petri con Sabouraud y una vez coagulado y

frío se cortan pequeños trozos cuadrangulares que se colocan asépticamente sobre el portaobjetos dentro de la placa.

4. Se toma el hongo en estudio con un gancho y se siembra sobre el trocito de agar Sabouraud y también en los costados del mismo.

5. Se coloca el cubreobjetos con una pinza previamente flameada, sobre la superficie del agar.

6. Se humedece con agua estéril el papel secante y se incuba a 28°C.7. Una vez desarrollado el hongo se saca el cubreobjetos que lleva

adherido el crecimiento fúngico, se coloca sobre un portaobjeto con una gota de colorante Gueguen o Lactofenol y se saca el trocito de Sabouraud con una pinza colocando luego una gota de colorante y un cubreobjeto nuevo, obteniendo así dos preparaciones listas para estudiar. Pueden bordearse con esmalte de uñas, conservándose un largo tiempo.

PABLO BECERRA LARA.

b

d

a

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a) Portaobjetos.b) Cubreobjetos.c) Zonas de siembra.d) Medio de cultivo.

A partir de un alimento que contenga hongos, realizar un

microcultivo, después de la observación de crecimiento:

a) Observar el microcultivo completo.b) Quitar el cubreobjetos y colocarlo sobre un porta limpio y

observar, yc) Quitar el cuadrito de agar y sobre el portaobjetos colocar

un cubreobjeto limpio y observar.LÁMINA 1.

Técnica de microcultivo.

A. Uso de tubo de prueba estéril para obtener bloques de agar para la técnica de microcultivo.

B. Preparación de una cámara húmeda estéril usando una placa de Petri que contiene agar simple al 2% sobre un portaobjetos estéril.

C. Método alternativo de preparar un microcultivo. Se colocan discos de papel filtro en el fondo de la caja Petri y el portaobjetos se apoya en varillas de vidrio. Los discos de papel filtro se mantienen húmedos con agua estéril durante el periodo de incubación.

D. Colocación del bloque de agar en la preparación de un microcultivo. Obsérvese que se han inoculado pequeñas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar.

E. Inoculación de la superficie de un bloque de agar en la preparación de un microcultivo. Obsérvese que se han inoculado pequeñas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar.

F. Colocación de un portaobjetos estéril sobre la superficie del bloque de agar inoculando antes de la incubación.

G. Aspecto de un microcultivo típico luego del periodo de incubación apropiado. Obsérvese el crecimiento micelial por debajo de la superficie de los cubreobjetos.

PABLO BECERRA LARA.

cc

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H. Colocación del cubreobjetos recogido del bloque de agar microcultivado en un agota de lactofenol-azul de anilina en un portaobjetos para examen microscópico.



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LÁMINA 1.



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REACTIVOS

Muestra biológica

Colonia de hongos

Material


Equipo

Microscopio


CONCLUSIÓN:



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BIBLIOGRAFÍA:

Micología Practicas de Laboratorio, Koneman Roberts; Edit. Médica Panamericana.

Diagnóstico Micológico, Amadeo D’ Alessandro; Edit. Panamericana.

Xalapa, Ver., a ________________________________________

Vo. Bo.

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PRACTICA 6.GÉNERO CÁNDIDA.

OBJETIVO:

Que el alumno se familiarice con las especies del género Cándida, comprenda a este género como Hongos Oportunistas y sea capaz de diagnosticar candidiasis en el laboratorio de análisis clínicos.

GENERALIDADES:

HONGOS OPORTUNISTAS.

Se denomina así a ciertos hongos saprófitos que en algunas oportunidades invaden el organismo humano o de otros animales, gracias a determinados factores predisponentes del huésped. Los saprófitos que se aíslan de ciertas enfermedades son: Mucor, Absidia, Rhizopus, Aspergillus, Cephalosporium, etc.

Los que viven saprofiticamente y además cohabitan en mucosas o piel como Candida, Cryptococcus, Geotrichum, son aislados, frecuentemente; en ciertos pacientes que ofrecen condiciones favorables para su proliferación, tales como los tratados con drogas antineoplásicas, corticoides, antibióticos y los que presentan disproteinemia o debilidad orgánica generalizada.

Para realizar un diagnóstico correcto de una micosis producida por un hongo oportunista hay que extremar todos los cuidados posibles, pues podría tratarse de una contaminación accidental de los materiales o muestras extraídas y procesadas; por lo tanto deben tenerse muy en cuenta:

a) Hallazgo del mismo tipo de parásito en muestras extraídas con varios días de intervalo.

b) Desarrollo del mismo hongo en todos los sembrados.c) Pruebas serológicas positivas.



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d) Estudio de las causas predisponentes.e) Mejoría o curación con el tratamiento adecuado.CANDIDOSIS.

DEFINICIÓN

Micosis primaria o secundaria ocasionada por levaduras endógenas y oportunistas del género Cándida, especialmente C. albicans. Las manifestaciones clínicas son localizadas, diseminadas o sistémicas; pueden afectar piel, mucosas, estructuras profundas y órganos internos. Las alteraciones histopatológicas varían desde inflamación mínima hasta supuración o granuloma. La evolución es aguda, subaguda o crónica.

ETIOPATOGENIA

Los agentes causales son las levaduras anascosporadas. Se han descrito 81 especies, de las cuales al menos siete causan enfermedades en seres humanos. El género Candida, en sentido amplio, es dimorfo. Las especies más comunes son:

Candida albicans.Candida guilliermondii.Candida parapsilosis.Candida kruseii.Candida tropicalis.Candida pseudotropicalis.Candida stellatoidea.

C. albicans se ha dividido en varios biotipos, y por sus características antigénicas, en los grupos (serotipos) A y B.

Estos hongos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, pero C. albicans solo se encuentra como endosaprófito del tubo digestivo de mamíferos y aves. En seres humanos son comensales de la cavidad bucal, tubo digestivo y mucosa vaginal. La mayor parte de las levaduras también s encuentran en la piel sana, excepto C. albicans y C. tropicalis, que se llegan a aislar de región perianal, peribucal y dedos.

Hay resistencia natural a la infección, pero no está bien definida, quizás depende de factores inhibidores, concentraciones séricas elevadas de hierro, potenciales de óxido-reducción y competencia entre



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levaduras por nutrimentos. Es probable que los neutrófilos sirvan como defensa primaria contra invasión y diseminación. La infección ocurre a partir de un foco endógeno y en pocas ocasiones, del medio externo. Los hongos actúan como oportunistas y se convierten en patógenos cuando hay alteraciones de inmunidad celular, como inmunodeprimidos; a consecuencia de cambios fisiológicos de la flora normal. La forma congénita puede ocurrir por invasión ascendente con afección de la membrana corioalantoidea. En la candidosis mucocutánea crónica los linfocitos T pierden su capacidad para reaccionar contra el estímulo antigénico general o contra antígenos específicos de Candida.

La candidosis puede ser enfermedad ocupacional o transmitirse por contacto sexual. Los factores predisponentes son múltiples y muchas veces combinarse.

FACTORES QUE PREDISPONEN A CANDIDOSIS.ESTADOS FISOLÓGICO. ENFERMEDADES DEBILITANTES

Infancia y vejez. Neoplasias.Embarazo. Infecciones.

Infección por VIH.FACTORES LOCALES. MEDICAMENTOS Y OTROS

TRATAMIENTOSHumedad. Anticonceptivos.Oclusión cutánea. Antibióticos de amplio espectro.Prótesis. Glucocorticoides.Heridas y quemaduras. Inmunosupresores.Hemostasis. Citotóxicos.

Radioterapia.ENDOCRINOPATÍAS Y

ENFERMEDADES METABÓLICASINTERVENCIONES QUIRÚRGICAS

Diabetes. Cirugía.Obesidad. Hiperalimentación parenteral.Hiperuricemia. Cateterismo.Insuficiencia tiroidea. Traqueostomía.Deficiencia de hierro. Drogas por vía IV.Poliendocrinopatía.

La gravedad de la infección depende sobretodo de las alteraciones primarias del huésped más que de las propiedades patógenas del hongo. El microorganismo causal más frecuente y virulento es C.



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albicans, son menos patógenas C. stellatoidea y C. tropicalis. En pacientes con SIDA se encuentra con mayor frecuencia C. albicans serotipo B, pero al parecer no son cepas en particular virulentas.

Candida es una levadura con la capacidad para producir filamentos. La fase de levadura está relacionada con la fase saprofítica y con la iniciación de lesiones clínicas; en cambio, la fase micelial se relaciona con la forma parasitaria e invasora , a la inversa de casi todos los hongos dimorfos.

Las levaduras se adhieren, por medio de mananas, al epitelio antes de invadirlo; se ha encontrado en la pared celular una glicoproteína ácida que es el componente antigénico de mayor importancia; también se ha encontrado una candidotoxina que in vitro es tóxica para células animales e in vivo produce eritema.

Las anormalidades de los linfocitos T se acompañan de deficiencia de linfocinas activadoras de macrófagos y por consiguiente, de fagocitosis inadecuada.

En la patogénesis de candidosis vaginal se ha señalado la posibilidad de mutaciones fenotípicas hacia sepas de mayor virulencia. Los factores de virulencia incluyen: mayor capacidad de adherencia, producción de proteasas y formación de tubos germinativos.

CUADRO CLÍNICO

Se desconoce el periodo de incubación. En la boca (muguet o algodoncillo) puede ser difusa y limitarse a una sola región y afectar el velo del paladar, carrillos y encías; hay enrojecimiento y placas mucosas blanquecinas y adherentes que dan el aspecto de natas de leche, son asintomáticas o se acompañan de sensación de quemadura, sequedad de boca y sabor metálico. La evolución es aguda o crónica.

Según el aspecto, se han descrito diferentes formas clínicas: a) seudomembranosa; b) lengua negra vellosa; c) atrófica aguda o crónica; d) hiperplasia romboidal media; e) erosiva o dolorosa.

La queilitis angular afecta las comisuras bucales, se manifiesta por un triángulo de base externa, constituido por eritema y fisuras, hay descamación fina o grandes escamas blanquecinas de aspecto micáceo.



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En la vaginitis se presenta inflamación, leucorrea blanquecina, espesa y grumosa; prurito intenso, sobre todo premenstrual y extensión de las lesiones a vulva y periné. La mucosa vaginal muestra placas blanquecinas, amarillentas o seudomembranosas.

Los intertrigos son primarios o por extensión de una localización en mucosas; afectan pliegues, como los axilares, submamarios, inguinales, surco interglúteo, espacios interdigitales de manos y pies. Se caracterizan por eritema, descamación y piel macerada, bordes marcados por un collarete de escamas y lesiones satélite papulares, vesiculares o pustulosas, prurito y dolor. La forma neonatal se presenta como muguet o con lesiones vesiculares o pustulosas diseminadas que afectan sobre todo el tronco, aparecen desde el nacimiento y curan solas en una a cuatro semanas; en ocasiones persisten varios meses.

En adictos a drogas predominan las lesiones foliculares en cabeza y cara; también hay formas secundarias grandes en quemados.

La paroniquia es una inflamación periungueal dolorosa, a veces con salida de pus a la presión; después sobreviene la afección ungueal. Hay onicólisis, o engrosamiento y deformación de la uña, presencia de estrías transversales y cambios de color que van del blanco amarillento al verde, café (marrón) o negro.

La candidosis mucocutánea crónica se inicia en la lactancia o la niñez; se relaciona con anormalidades genéticas: agenesia o displasia del timo, con agammaglobulinemia o sin ella y la consecuente disfunción linfocitaria, defectos de la función de leucocitos, endocrinopatías. Puede ser idiopática o acompañar a una deficiencia de zinc. Cuando se presenta en adultos afecta a mayores de 35 años de edad y se relaciona con enfermedades malignas internas.

Candida puede afectar cualquier tejido, incluso huesos y articulaciones. Las manifestaciones clínicas dependen del órgano afectado.

La froma sistémica es grave y puede afectar aparato urinario y riñones, endocardio, meninges e incluso produce queratitis.



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Las formas alérgicas no están bien estudiadas; pueden ser candídides, que a veces son lesiones vesiculares en manos, o se manifiestan por urticaria, eccema, asma y gastritis.

CLASIFICACIÓN DE LAS CANDIDOSIS.

Bucal. Digestiva. Mucocutánea Vaginitis y balanitis. Bronquial y pulmonar.Localizada Intertrigos. Cutánea Paroniquia y onicomicosis. Vesiculopustular y folicular.

Candidosis mucocutánea crónica (CMCC) Diseminada y profunda Granuloma candidósico.

Aparato genitourinario y riñones. Endocarditis.Sistémica Meningitis. Septicemia. Candidemia iantrógena.

Candídides.Alérgica Eccema. Asma. Gastritis.

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO

Materiales:

El estudio se realiza sobre escamas de piel, uñas, esputos, pus, flujo vaginal.



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Examen microscópico directo:

Entre porta y cubreobjeto se observan pus, esputo, flujo, etc. Pueden realizarse coloraciones como la de Gram, ya que las levaduras son gram positivas.

Los raspados de piel y uñas se colocan sobre el portaobjeto con una gota de NaOH al 30%, calentando suavemente al mechero para aclarar el material corneo de la piel. Se observarán las levaduras brotantes y, frecuentemente seudomicelio.

Cultivo:

Las siembras se realizarán en Sabouraud glucosado con y sin antibióticos. Las levaduras ya aparecen formando una colonia blanquecina y cremosa a las 24-48 horas de incubación a 28° y 37°C.

Reconocimiento de las especies:

La Candida es una levadura imperfecta que no produce ascosporos en el bloque de yeso; sembrada en agar harina de maíz o medios especiales que se pueden adquirir en el comercio, origina seudomicelio, lo que no sucede con las levaduras perfectas. En este medio la C. albicans produce clamidosporas que son característicos de esta especie. Existen medios de cultivos diferenciales para las distintas especies de Candida.

Incubando a 37°C una suspensión de levaduras en estudio en 0.5 cm3 de suero humano inactivado, después de 2 a 4 horas la C. albicans y la C. stellatoidea forman filamentos, mientras que las otras especies no lo hacen.

Otra reacción bioquímica es la reducción de sales de trifeniltetrazolio, incorporadas al Sabouraud glucosado al 0.10% (previa esterilización a ¾ de atmósfera durante 20 minutos), sembrando por estrías en el tubo e incubando 24 a 48 horas a 28°C.

La reducción de estas sales por las distintas especies de Candida da colores que van desde el blanco (C. albicans) hasta el rojo violáceo (C. tropicalis).

Se realiza también la prueba bioquímica de fermentación de azúcares (zimograma). Se prepara un caldo base con agregado de un



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indicador (púrpura de bromocresol en alcohol al 1.6%) al ⅟1000, colocando campanitas de Durham invertidas en el medio de cultivo. Cuando se carecen de éstas pueden utilizarse las tapitas de ampollas usadas que las suplen perfectamente y son mucho más económicas.

Los azúcares por utilizar son glucosa, sacarosa, maltosa y lactosa al 1%. Estos se agregan al medio de cultivo y se esterilizan a de atm durante 15 minutos. También se pueden esterilizar previmente por filtración o agregando cloroformo a la solución del azúcar (concentrada). Se agita y se deja reposar 24 horas. Luego se agrega asépticamente con pipeta estéril a cada tubo el volumen de solución madre de cada azúcar que permita obtener una concentración final de 1% en el medio.

Se siembran las levaduras en estudio y se incuban a 37°C durante 48-72 horas. La acidificación del medio se revela por el viraje del indicador del violeta al amarillo, y la fermentación, por el desprendimiento de gas que se acumula en las campanitas.

CARACTERES BIOQUÍMICOS DE LAS ESPECIES DE CANDIDA.

ESPECIES SEUDOMICELIO

CLAMIDOSPORAS

FILAMENTO EN SUERO

TETRAZOLIO

ZIMOGRAMAGLUCOSA

SACAROSA

MALTOSA

LACTOSA

C. ALBICANS + + + Blanco AG A AG OC. stellatoidea + + + Rosado AG A AG OC. tropicalis + - + Rojo-

violáceo

AG AG AG O

C. pseudotropicalis

± - + Rosado AG AG O AG

C. guillier mondii + - - Rojo AG AG O OC. kruseii + - - Blanco AG O O OC. parapsilosis + - - Blanco AG O O O

AG: ácido y gas.A: ácido.O: no hay acidificación ni producción de gas.

Reacción intradérmica:



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Se usa muy poco, ya que la gran mayoría de las personas reaccionan positivamente a la intradermorreacción de la Candida, aun no estando enfermas. Por lo tanto, no debe utilizarse, pues no ofrece ninguna seguridad en cuanto al resultado. Puede ser útil en procesos alérgicos aplicando el antígeno en forma decreciente para desensibilizar.

Técnicas inmunológicas:

La aglutinación tiene poco valor. La técnica de fijación del complemento es más segura, pero presenta el inconveniente de dar reacciones cruzadas con antígenos de Histoplasma, Blastomyces dermatitidis y Coccidioides immitis.

Las reacciones de inmunodifusión son las más seguras y demuestran la presencia de precipitinas séricas en casos de candidiasis sistémicas.GLOSARIO

Agenesia: Desarrollo incompleto.

Balanitis: Inflamación del glande del pene o del clítoris.

Comisuras: Región en donde se unen estructuras tales como labios, párpados.

Intertigios: Erupción eritematosa de la piel por fricción de partes adyacentes.

Onicolisis: Lento proceso de desprendimiento de uña del lecho ungueal, comenzando por el borde libre y progresando gradualmente hacia la raíz.

Periungueal: Alrededor de la uña.

Quelitis: Inflamación de los labios.

Queratitis: Inflamación de la córnea.



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Ungueal: Relativo a las uñas.

Urticaria: Trastorno cutáneo caracterizado por aparición de ronchas con prurito intenso y centros elevados, por lo general blancos, con eritema.

TÉCNICA:

Realizar un examen en fresco, tinción de Gram y prueba de filamento en suero a las cepas de las diferentes especies del género Candida que les proporcione el preparador, así como también resembrar dichas especies para conocer tiempos de crecimiento y características coloniales.

Nota: si se tiene un paciente con posible Candidiasis, tomar la muestra y realizar un cultivo.

REACTIVOS

Muestra biológica

Flujo vaginal.

Material

Hisopo estéril.Mechero bunsenPorta y cubreobjetos

Equipo

Microscopio



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CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA:

Micología Médica, R. Arenas; Ed. Interamericana; Pág. 223-232.



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Vo. Bo.

______________________________________PRACTICA 7.

GÉNERO ASPERGILLUS.

OBJETIVO:

Que el alumno conozca las diferentes especies del género Aspergillus, sus colonias, sus estructuras y las micosis que pueden ocasionar para poder identificarlas en el laboratorio.

GENERALIDADES:

IDENTIFICACIÓN DE MOHOS HIALINOS DE CRECIMIENTO RÁPIDO.

Incluyendo cuatro especies de Aspergillus, se tienen 14 especies de mohos hialinos que abarcan la mayoría de este grupo de hongos que pueden encontrarse en el laboratorio clínico. Los saprófitos hialinos pueden dividirse en los siguientes subgrupos, basados en diferencias en el aspecto microscópico de sus elementos de fructificación:

SAPRÓFITOS HIALINOSGÉNEROS. TIPO DE SUBGRUPO AL QUE

PERTENECENAspergillus. Los conidióforos terminan en vesículas

dilatadas; conidias sostenidos en cadenas (catenulados) acrógenamente desde las puntas de fiálides que cubren partes o toda la superficie de la vesícula.

Penicillium.Paecilomyces.Scopulariopsis.

Conidióforos libremente ramificados; conidios que nacen desde los ápices de anélidos o fiálides que nacen de métulas que forman un “penicilio”.

Acremonium.Trichoderma.

Conidióforos únicos; conidios sostenidos en cabezuelas,



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Gliocadium.Fusarium.

generalmente en la punta de conidióforos rectos o ensanchados.

Chrysosporium.Sepedonium.Scedosporium (Monosporium)Apiospermun (Pseudalles cheria boydii)

Conidióforos únicos, sosteniendo cada uno un conidio solitario.

El género Aspergillus que pertenece al subgrupo de los conidióforos que terminan en vesículas dilatadas es que trataremos a continuación.

Las especies de Aspergillus son los mohos de crecimiento rápido que se encuentran mas frecuentemente en laboratorios clínicos y deben considerarse en la identificación diferencial de cualquier moho hialino de crecimiento rápido.

Microscópicamente, el género se caracteriza por cadenas de conidios pequeñas u ovales a esféricas sostenidas en cadenas en las puntas de las fiálides radialmente ubicadas sobre la superficie del ápice dilatado del conidióforo denominado vesícula.

Algunas especies de Aspergillus, sobre todo A. glaucus y A. nidulans, pueden reproducirse sexualmente en medios de cultivos y pueden verse cleistotecios. También rara vez se ven células de Hülle que son estructuras hialinas esféricas de origen desconocido.

Afortunadamente el microbiólogo sólo necesita familiarizarse cabalmente con las características de tres especies que son clínicamente significativas: A. fumigatus, A. Níger y A. flavus. Una cuarta especie, A. terreus se está recuperando con frecuencia cada vez mayor de muestras clínicas, ya que basados en diferencias de pigmentación de las colonias, tamaño y longitud de las cadenas y otros criterios, Raper y Fenel, han clasificado a los Aspergillus en 18 grupos.

Las especies de Aspergillus están amplimente distribuidas en la naturaleza donde actúan como saprófitos comunes en granos, hojas, suelos y desperdicios.

Los conidios se dispersan y el hombre más comúnmente se infecta por inhalación de esporas transportadas por el aire.



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Dentro de las patologías que causa su presencia, es común su diseminación a vísceras y particularmente al SNC de los enfermos de SIDA, así como la localización del mismo en ganglios linfáticos, senos, corazón, tiroides y piel.

A continuación se da un resumen de las características de las 4 especies de Aspergillus de mayor importancia clínica.

ESPECIES.

CARACTERÍSTICAS

MACROSCÓPICAS

CARACTERÍSTICAS

MICROSCÓPICAS

MATERIAL BIOLÓGIC

O

PATOGÉNESIS

A.fumigatus.

Crece en 2-6 días en medio sin cicloheximida.La colonia crece con borde evidente, es vellosa y blanca durante el crecimiento precoz y luego se hace aterciopelada y granulosa.Color verde a gris por producción de conidios pigmentados.El reverso de la colonia tienen un color verde a crema.

Las hifas son hialinas y tabicadas.La longitud de los conidióforos es moderada y tiene una célula pie característica en su base.Las vesículas tienen forma de cúpula y la mitad está cubierta por fiálides desde las cuales salen cadenas de conidias globulosas equinuladas de 2-3µ de diámetro.El cultivo tolera temperatura de 45°C.

Depende del tipo de la lesión.

Causa infecciones oportunistas en el hombre, incluyendo : enfermedades pulmonares granulomatosas, broncopulmonares alérgicas diseminadas.La forma diseminada se ve en pacientes inmunocomprometidos

A. níger.Comienza como colonia blanca que se vuelve amarilla y desaroolla efecto pimienta negra en la superficie (se pueden vovlver negras con el tiempo).El reverso de la colonia es color gamuza o crema.Conidias negras y rugosas.

Las hifas son tabicadas y los conidióforos son largos y lisos.Las vesículas son esféricas y dan origen a métulas y fiálides que se oscurecen.

Se obtiene de lesiones supurativas costrosas del “oído de nadador”.

Es una causa común de las lesiones cavitarias en pulmones o senos paranasales.Se encuentra en alto porcentaje en casos de otomicosis.



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A. flavus.Las colonias crecen en 5 días a 25°C.Colonias habitualmente amarillas.

Vesículas globosas y redondas.Fiálides solas o con métulas.Conidias elípticas a esféricas amarillas con el tiempo de tornan equinuladas.Presencia de numerosos eosinófilos y cristales de Charcot-Leyden en esputo.

Se obtiene de esputo o de tapones mucosos bronquiales.

Es causa común de Aspergilosis pulmonar alérgica.Causa enfermedad diseminada en huéspedes inmunocomprometidos

A. terreus.La colonia crece en 5 días a 25°C.Aparece de color canela-beige o marrón algodonosa con pliegues radiales o irregulares.Produce esporulación y se hace granuloso.

Vesículas pequeñas de 15µ en forma de cúpula y sostienen métulas con una hilera de fiálides.Producen aleuriosporas únicas en hifas sumergidas.Sus conidias miden aproximadamente 2-3µ de diámetro.

Depende del tipo de la lesión.

Es agente causal de casos de endocarditis y enfermedad broncopulmonar.Se ha informado de casos de osteomielitis y casusa infección poliponasal, ganglio linfático cervical, meninges y enfermedad diseminada.Causa oticomicosis en Japón y Formosa.

ESQUEMAS:

a) Cabeza con frutos. Esporulación de densos racimos de conidias oscuras en la superficie de la vesícula (A. níger) .

b) Cabeza con frutos, muestra métulas y una hilera de fiálides con conidias en sus puntas (A. níger).

c) Cabeza con frutos. Obsérvese la vesícula claviforme, una sola hilera de fiálides con esporulación limitada a la mitad de dos tercios superiores de la superficie de la vesícula. (A. fumigatus).

d) Cabeza con frutos, muestra fiálides que se originasn en dos tercios superiores de la superficie de la vesícula. (A. fumigatus).



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e) Cabeza con frutos, muestra métulas y una hilera de fiálides que produce conidias a partir de la circunferencia de la superficie de la vesícula ( A. flavus).

f) Cabezas con frutos y aleuriosporas clásicas de la especie A. terreus.

g) Vesícula y cleistotecio que muestra forma sexual y asexual de reproducción de A. terreus.

h) Células esféricas de Hülle producidas por A. terreus.

TÉCNICA:



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a) Observar las colonias de las diferentes especies de Aspergillus que se proporcionen en el laboratorio.

b) Realizar un examen en fresco a las especies de Aspergillus que le proporcionen en el laboratorio.

REACTIVOS

Muestra biológica

Exudado ótico.

Material

Hisopo estéril.Mechero bunsenPorta y cubreobjetos

Equipo

Microscopio




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CONCLUSIÓN:

NOTA: Recuerde que el género Aspergillus esporula demasiado, MUCHO CUIDADO.

BIBLIOGRAFÍA:

Micología Práctica de Laboratorio, Koneman Roberts; Ed. Médica Panameriacana.

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Vo. Bo.

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PRACTICA 8.DERMATOFITOS.

OBJETIVO:

Que el alumno identifique y aísle un dermatofito, a partir de la muestra de un paciente del cual se sospeche de la presencia de una micosis superficial.

GENERALIDADES:

Las dermatofitosis o comúnmente llamadas tiñas, son exclusivamente cutáneas, que afectan tejidos con queratina (cabellos, uñas, epidermis).

Las dermatofitosis o tiñas se dividen dependiendo de la región anatómica en donde se presentan:

Tinea capitis Tiña de la cabeza.Tinea pedis Tiña de los pies.Tinea cruris Tiña de la ingle.Tinea unguium Tiña de las uñas.Tinea corporis Tiña del cuerpo.Tinea barbae Tiña de la barba.Tinea manun Tiña de las manos.

Los dermatofitos son un grupo de hongos que se reproducen asexualmente por macro y microconidios, y están comprendidos en tres géneros.

1. Microsporum. Se presentan en pelo, piel y raramente en uñas.2. Epidermophyton. Se presenta en piel, raramente en uñas y

nunca en pelo.3. Trichophyton. Se presenta en pelo, piel y uñas.

A continuación se presentan dos tablas para identificación de dermatofitos:


LABORATORIO DE MICOLOGIA.

Pablo Becerra Lara



Pablo Becerra Lara HONGOS PRODUCTORES DE TIÑAS.

GÉNERO ESPECIE. ASPECTO MACROS-

CÓPICO DE LAS

COLONIAS.

ASPECTO MICROSCÓPICO LOCALIZACIÓN

macroconidias microconidias hifas

Microsporum canis Colonia lanosa, algodonosa que crece sobre toda la superficie del medio y le transmite un color naranja.

En forma de nave hasta con tres septos y únicas, abundantes, típicas para su identificación.

No hay No tienen característica especial.

Cabeza.Cara.Cuerpo.Pies.

Otras especies importantes:M. audounii.M. gypseum.


CÓPICO DE LAS

COLONIAS.



Ephydermo-phyton

Flocossum Colonia radiada pegada al medio de color verde limón

Romas en su extremidad rectal, con 1-2 septos y se presentan en racimos de 2-3 Son abundantes.

No hay No tienen característica especial.A veces en racimos de plátanos.

Ingles.Pies.


CÓPICO DE LAS

COLONIAS.



Trichophyton tonsurans Colonia café claro, aspecto duro, acartonado y cerebriforme.

No hay. Piriformes que crecen en forma correspondiente, una frente a otra.

Se bifurcan en ángulo recto al filamento principal y sobre estas están las esporitas

Cabeza.Cara.Cuerpo.Pies.



Pablo Becerra Lara


CÓPICO DE LAS

COLONIAS.



Trichophyton rubrum Colonias algodonosas que crecen en todo el medio. Primero dan coloración roja en extremos que después se difunde al medio.

Regularmente no hay, solo cuando son viejas existen en forma de salchicha.

Piriformes y escasas, prácticamente el no encontrar nada es característico de este hongo.

No tienen ninguna característica para identificar-las

Cuerpo.Manos.Pies.Ingles.


CÓPICO DE LAS

COLONIAS.



Trichophyton Mentagro-phytes

Colonias blancas, aspecto pulverulento que crecen invadiendo todo el medio.

Regularmente no hay, cuando son viejas existen escasas en forma de salchicha y lápiz.

Redondas, pequeñas, en racimos y abundantes.

En forma de espiral, típica para la identifica-ción.

Cuerpo.Manos.Pies.Ingles.

TÉCNICA:

c) Realizar una toma de muestra de un paciente que se sospeche de micosis superficial.

d) Aislar el dermatofito e identificarlo.e) Realizar un examen en fresco.

REACTIVOS

Muestra biológica

Uñas, pelos, escamas parasitadas.



Pablo Becerra Lara

Material

Mechero bunsenPorta y cubreobjetosMedio de cultivo: Sabouraud.KOH del 10-30%.Solución salina.

Equipo

Microscopio


CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA:

Micología Médica Básica, A. Bonifaz; Méndez editores, S.A.; México, D.F.

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Vo. Bo.

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Pablo Becerra Lara

PRACTICA 9.INMUNOLOGÍA Y MICOSIS.

OBJETIVO:

Que el alumno adquiera conocimientos acerca de los procesos inmunológicos que se presentan en una micosis.

INTRODUCCIÓN:

La información que se dispone sobre la respuesta inmunitaria sobre los hongos productores de micosis es muy limitada. Publicaciones recientes se concretan a decir que la inmunidad en las micosis es primordialmente mediada por células y que, aunque se detectan fácilmente anticuerpos IgM e IgG específicos, estos no tienen ningún papel protector.

El factor huésped desempeña un papel principal en el desarrollo de la mayoría de las infecciones fúngicas. La existencia de un estado de inmunocompetencia es esencial para evitar o disminuir el impacto de la micosis.

Se conoce la existencia de una inmunidad natural así como el desarrollo de una respuesta inmune específica frente a los antígenos fúngicos en la mayoría de las micosis.

GENERALIDADES:

INMUNIDAD NATURAL O INNATA.

La integridad cutáneo mucosa constituye una primera barrera a la penetración de hongos patógenos o inicialmente saprobios. La ruptura del manto cutáneo o mucoso, como sucede en las heridas, quemaduras, etc., abren una vía de entrada a los hongos ambientales, principalmente a los endosaprobios, como Candida albicans.

Otros factores de inmunidad natural son la función normal de los granulocitos y macrófagos, así como de los linfocitos natural killer. El suero humano normal tienen una conocida actividad funguicida: la



Pablo Becerra Lara activación de la vía alternativa del complemento y los reactantes de fase aguda también son mecanismos defensivos de la infección fúngica.

La respuesta inmediata a una agresión microbiana es la inflamación aguda, que es consecuencia de alteraciones vasculares con atracción de leucocitos. Los reactantes de fase aguda comprenden la ferritina y los componenetes del complemento, la falta de antitripsina, el fibrinógeno y la haptoglobina, así como la PCR; esta PCR junto con el complemento son las proteínas de fase aguda que se relacionan directamente con la eliminación de los microorganismos.

Los mecanismos de inmunidad natural o innnata son eficaces para proteger frente algunos hongos débilmente patógenos, tales como los cigomicetos, especies de Aspergillus, etc.

Los leucocitos neutrófilos humanos intervienen activamente para eliminar los hongos patógenos primarios y también diversos oportunistas. La actividad de éstos leucocitos sólo es posible si se asocia a otros factores defensivos del huésped como son los factores defensivos del huésped como son los factores séricos o reactantes de fase aguda.

Los linfocitos natural killers, han demostrado tener efectos funguicidas sobre algunos hongos como el Criptococos y las Candidas.

PAPEL DE LOS LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES.

El mecanismo mediante el cual los hongos fagocitados por los PMN llegan a ser destruidos actúa a través de la vía de la mieloperoxidasa que proporciona la mayor actividad funguicida. Otros mecanismos son las proteínas cotiónicas y la lisozima.

En la C. albicans los PMN pueden fagocitar y destruir las levaduras pero no tienen la misma habilidad en el caso de las pseudohifas difícilmente fagocitables si están muy desarrolladas. Se han observado rosetas de PMN y de monocitos alrededor de levaduras con gruesa cápsula.

INMUNIDAD HUMORAL EN LAS MICOSIS.

Los hongos y sus productos extracelulares constituyen una importante fuente de antígenos capaces de despertar una respuesta inmunohumoral. Se ha podido demostrar en numerosas micosis primarias y oportunistas la presencia de anticuerpos específicos de clase



Pablo Becerra Lara IgG, IgM, IgE e incluso IgA El predominio de una u otra clase de inmunoglobulinas depende del antígeno, el estado del huésped, la forma clínica y fase evolutiva de la micosis. Sin embargo, no se ha podido demostrar su papel como efectores de una protección frente a la infección.

Las inmunoglobulinas y el complemento parecen desempeñar un papel protector pero éste no sería directo ni primordial, sino asociado a la actividad celular de PMN y macrófagos.

La existencia de complejos inmunes es común en algunas formas clínicas de micosis cono en la Candidosis mucocutánea crónica. Los factores bloqueantes (unión anticuerpos-mananos) podrían ser los responsables de una disminución la blastogénesis de los linfocitos.

Los anticuerpos del tipo IgE se encuentran muy relacionados con las reacciones de hipersensibilidad inmediata a los hongos.

INMUNIDAD CELULAR EN LAS MICOSIS.

Una de las primeras observaciones sobre la inmunidad en las micosis fue la existencia de pruebas cutáneas de tipo retardado (tuberculina) como consecuencia de la inoculación intradérmica de extractos de micelio o del medio de cultivo de diversos hongos, tricofitina, candidina, etc.

Este tipo de respuesta cutánea corresponde a una respuesta inmune de mediación celular, la cual se acentúa o desaparece en los casos de diseminación de la micosis o bien de estados terminales. Se acepta que el papel de la inmunidad celular desempeña un papel importante en los mecanismos de protección frente a la infección micótica.

La anergia cutánea en las micosis es específica y reversible, y puede ser explicada por uno o más de los siguientes mecanismos; linfocitaria (inmunocomplejos linfoquinas de los linfocitos T supresores); aumento de los linfocitos T supresores o bien de una alteración en la circulación de los linfocitos.

Se ha demostrado la importancia de ciertos factores raciales y genéticos en el desarrollo y evolución de las micosis; las coccidioidomicosis es un ejemplo de factores genéticos e inmunológicos relacionados con la evolución de la infección.



Pablo Becerra Lara INMUNOTERAPIA ESPECÍFICA EN LAS MICOSIS.

El desarrollo de vacunas y su empleo con la finalidad protectora, se conoce experimentalmente en diversas micosis, en particular, en las dermatofitosis, candidosis, etc. En la práctica sólo se preparan vacunas con hongos blastosporados generalmente Candida y otros levaduriformes.

La aplicación de estos tratamientos en el hombre no ha demostrado ser eficaz, excepto en el caso de algunas alergias respiratorias.

PREPARACIÓN DE ALERGENOS MICÓTICOS.

Para la obtención de alergenos provenientes de hongos atmosféricos se debe realizar lo siguiente:

1. Aislar el hongo del medio ambiente y clasificarlos. 2. Sembrar en el caldo Sabouraud las especies aisladas.

Incubar a 28°C hasta que le crecimiento del hongo forme una película en la superficie.

3. Desecar en un desecador de cloruro de calcio.4. Pulverizar.

Existen distintas soluciones extractoras que pueden ser utilizadas:

SOLUCIÓN DE COCA.

Cloruro de sodio 0.5 gFenol 0.4 gBicarbonato de sodio 0.275 gAgua destilada 100 cm3

Debe hacerse burbujear anhídrido carbónico hasta que no haya viraje a rojo, utilizando solución de fenolftaleína.

SOLUCIÓN DE STIER-HOLLISTER.

Glicerina pura 4.6 gCloruro de sodio 0.4 gAgua destilada c.s.p. 100 cm3

Hacer una extracción cualquiera de las soluciones extractoras utilizando el hongo pulverizada a razón de 5 g de polvo para 100 cm3 de



Pablo Becerra Lara solución extractora. Realizar la extracción durante 4-6 días. Pasar luego por filtro Seitz.

Deberá valorarse el extracto alergénico dosado el nitrógeno. La solución para pruebas intradérmicas deberá contener 0.01 mg de nitrógeno/cm3.

Cuando son soluciones para el tratamiento de sensibilizantes deberán hacerse soluciones del alérgeno ¹⁄1000 en solución fisiológica.

SUSPENSIONES DE HONGOS PARA PRUEBAS INTRADÉRMICAS.

Levadurina, blastomicetina.

1. Cultivar los hongos en agar Saboraud.2. Realizar una suspensión homogénea en solución fisiológica

(turbidez comparada con los tubos 3 o 4 de la escala de Mc Farland)

3. Dejar reposar en la heladera para separar los grumos más gruesos.

4. Calentar a 60°C durante una hora.5. Repetir la operación durante 3 días.6. Agregar mertiolate al ¹⁄10000.7. Controlar la esterilidad.8. Distribuir en ampolletas.

Esporotriquina.

1. Utilizar varias cepas de Sporotrichum schenckii.2. Emplear el medio de Saboraud glucosado con cistina 50 mg.3. Cultivar en estufa a 37°C durante 10 días.4. Suspender el cultivo en solución fisiológica y operar de acuerdo

con la técnica descrita anteriormente.5. Verificar la dilución más conveniente para enfermos de

esporotricosis.

Paracoccidioidina II.

1. Cultivar varias cepas de P. brasillensis en agar sangre a 37°C durante 15 días.

2. Realizar una suspensión en una solución fisiológica fenolada al 0.5%, agitando periódicamente el recipiente que contiene perlas de vidrio.



Pablo Becerra Lara 3. Calentar luego la suspensión a 80°C durante media hora por 3

días sucesivos.4. La suspensión madre debe diluirse al 5% en solución fisiológica

fenolada para poder ser utilizada en la prueba intradérmica.

FILTRADOS.

Histoplasmina, Coccidioidina, Paracoccidioidina, etc.

1. Cultivar las cepas de los distintos hongos en el medio de Smith, sin pepetona durante 2-3 meses, mantenidas a temperatura ambiente. Se aconseja utilizar balones o erlenmeyer que ofrezcan una superficie amplia.

2. Filtrar por Seitz.3. Agregar mertiolate al ¹⁄10000.4. Deberá verificarse el poder del antígenno en un lote de cobayos

infectados con el hongo cuyo filtrado se estudia y, basándose en esto se realizará la dilución conveniente.

5. También se ensayará el filtrado en enfermos portadores de la micosis correspondiente.

6. Deberá recordarse que son reacciones tardías y que la lectura se realizará a las 24 y 48 horas.

Tricofitina.

1. Preparar el caldo de Saboraud glucosado al 2% con 1% de peptona y 0.5% de extracto de levadura.

2. Distribuir en frascos que ofrezcan una superficie amplia.3. Esterilizar a ¾ de atm durante 20 minutos.4. Sembrar los dermatofitos (M. canis, T. mentagrophytes, T.

rubrum, E. floccosum, etc.) en la superficie del líquido.5. Cultivar a temperatura ambiente durante 1-2 meses.6. Filtrar.7. concentrar al décimo al vacío a temperatura 40°C.8. Dializar.9. Agregar ácido fenólico al 0.2%.

Para preparar las pruebas intradérmicas se utiliza el antígeno diluido al 1%. Para emplearlo como agente terapéutico o desensibilizante usarlo diluido al 1%.



Pablo Becerra Lara

ANTÍGENO POLISACÁRIDO DEL P. BRASILLENSIS (PARA REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO).

1. Sembrar el P. brasillensis en agar Sabouraud enriquecido con vitaminas, extracto de carne y extracto de levadura.

2. Cultivar el preparado a 37°C durante 2 meses.3. Suspender el crecimiento fúngico en solución fisiológica.4. Centrifugar la suspensión.5. Lavar 3 veces con acetona y 3 veces con éter.6. Realizar una suspensión de las células en solución de Veronal

(pH 7.3-7.4) al 15% aproximadamente.7. La solución sobrenadante es el antígeno.8. Realizar prueba de esterilidad.9. Distribuir y mantener en heladera. Se aconseja conservar el

antígeno en frasco tipo penicilina.

PREPARACIÓN DE VACUNAS.

1. Aislar E Identificar bien las muestras de los hongos blastosporados (generalmente Candida).

2. Sembrar en agar Sabouraud glucosado e incubar a temperatura ambiente a 37°C.

3. Suspender el crecimiento fúngico en solución fisiológica estéril en un frasco que contenga perlas de vidrio, previamente esterilizado.

4. Agregar para disgregar los posibles grumos que existan.5. Agregar 5 gotas de lugol doble para cada 10 cm3 de

suspensión.6. Dejar actuar una hora.7. Decolorar luego con solución de hiposulfito de sodio al 10%

(bastan algunas gotas).8. Diluir la suspensión hasta que sea comparable al tubo 2 o 3

de la escala de Mc Farland, utilizando solución fisiológica.9. Realizar controles de esterilidad para hongos, bacterias

aerobias y anaerobias.10. Agregar mertiolate cuya concentración final sea de ¹⁄20000, o

tricresol al 0.3%.11. Distribuir en frascos con tapón de goma. Se aconseja preparar

un frasco de vacuna a partir de la vacuna original diluyendo 1 cm3 de esta en 9 cm3 de solución fisiológica para ser usada en primer término al iniciar la serie vacunante, pues en algunos casos no se puede usar la vacuna original porque produce reacciones violentas.



Pablo Becerra Lara 12. Rotular el frasco No. 1 (dilución ¹⁄10) y el número 2 (vacuna

que origina una turbidez parecida a los tubos 2 y 3 de la escala de Mc Farland).

13. Iniciar la serie con el frasco 1 inyectando 0.10 cm3por vez hasta llegar a 1 0.5 cm3. Proseguir con esta medida hasta terminar el frasco 1 (también se puede llegar a 1 cm3). Se sigue de la misma manera con el frasco 2.

14. La frecuencia de las inyecciones es de 2 por semana.

TÉCNICAS SEROLÓGICAS.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.

Son de mucha utilidad en algunas afecciones micóticas pues facilitan la evaluación del curso de la enfermedad, permitiendo con su ayuda confirmar las mismas y pronosticar con cierta seguridad, en algunos casos la evolución de la enfermedad.

En todas las técnicas usadas los materiales son: sueros de los enfermos y antígenos de los agentes patógenos que se investigan.

Los sueros en todos los casos deberán ser frescos, recién extraídos o conservados en el refrigerador, congelados. Las diluciones de los mismos se harán siempre en el momento de ser empleadas.

PREPARACIÓN DE LOS ANTÍGENOS.

Los antígenos pueden ser dos tipos:

1. Antígenos somáticos (celulares):

Provienen de la trituración de los micelios o levaduras. Estas se obtienen cultivando el hongo en medios líquidos por agitación, incubando a temperatura ambiente. La duración de la incubación es de 10 días para A. fumigatus y 48 horas para Candida. En el caso de Histoplasma, Paracoccidioides, etc., la duración de la incubación varía pues depende del crecimiento del hongo ya que aquellos tardan más tiempo en desarrollarse.

Luego se rompen las células mediante procedimientos que dependen de las disponibilidades del laboratorista. Se usan recipientes estériles con perlas de vidrio agitando mecánicamente o a mano por periodos si no se dispone de un agitador. Lo mejor sería emplear aparato



Pablo Becerra Lara ultrasónicos. Se centrifugan los materiales obtenidos y el sobrenadante se dializa, concentra y liofiliza.

2. Antígenos metabólicos:

Se consiguen a partir de filtrados de los cultivos en medios líquidos que han sido incubados a 27°C durante 30 días. Los líquidos así obtenidos se separan del crecimiento fúngico por filtración, se les dializa y se concentran y liofilizan. La concentración del material activo varía de 30 a 100 mg/ml.

Los antígenos aspergilarios y los de Candida se emplean en la concentración de 50 mg/ml para la reacción de inmunodifusión (Ouchterlony) y de 100 mg para la inmunoelectroforesis.

Para la técnica de electrosinéresis las concentraciones utilizadas son: 100, 50 y 25 mg/ml.

TÉCNICA DE LA DOBLE DIFUSIÓN.

La reacción de precipitación se efectúa mediante la utilización de placas Petri (Ouchterlony) n las cuales se formará una capa gelosa. Sobre la superficie del medio se depositará una gota de antígeno y un gramo del suero en estudio que difundirá a través del mismo. Al encontrarse el antígeno con los anticuerpos de suero se formarán líneas opacas de precipitación que se pueden observar claramente.

El medio se prepara con gelosa purificada a una concentración de 1% utilizando como solvente una solución buffer de Veronal 0.025 M a pH 8.2. Se le adiciona mertiolate ¹⁄5000 (concentración final) como conservador.

Si se usa un agar común deberá ser purificado mediante varios lavados con agua destilada. El espesor de la placa de gelosa deberá ser de 5 mm.

Cuando se utilizan cajas de Petri de 10 cm de diámetro se usarán 15 ml del medio y si las cajas son de 5 cm de diámetro se emplearán 8 ml.

Una vez frío el medio, mediante un sacabocado se practicará una perforación central de unos 12 mm que se destinarán para contener el suero del enfermo. Alrededor de la perforación central y una distancia de 1 cm, se excavan otros agujeros de 9 mm de diámetro y en ella se



Pablo Becerra Lara ubicarán los antígenos. Para placas de 10 cm se pueden practicar hasta 6 excavaciones laterales y 3 para cajas de 5 cm.

Este ensayo puede ser realizado utilizando portaobjeto, cubierto con una capa de agar del mismo espesor y realizando todas las operaciones ya descritas. Es conveniente porque permite economizar medio y cajas Petri.

Cuando los antígenos y anticuerpos difunden, si corresponden y están en relaciones óptimas, originan líneas o bandas bien visibles de precipitación. Si las concentraciones son equivalentes, la banda de precipitación estará situada aproximadamente en la distancia media entre los dos reservorios. Cuando la banda de precipitación esta más cerca de uno de los componentes de la reacción es menor y será justamente aquella más cercana al reservorio.

TÉCNICA DEL GRADIENTE.

Últimamente se ha adoptado esta técnica que ofrece resultados más fieles semicuantitativos.

Se prepara una placa de gelosa de la misma manera descrita anteriormente. Se practica un surco central de 3 cm de longitud por 2 mm de ancho y se hacen perforaciones de 5 mm de diámetro a lo largo del surco y en ambos lados. Las dos primeras se hacen a una distancia de 2 mm, las segundas a 3 mm, las terceras a 4 mm y las cuartas a 5 mm del reservorio central, el cual contendrá el suero del enfermo, y los agujeros laterales los antígenos correspondientes. Las bandas de precipitación aparecerán más nítidas con algunos de los sueros a una distancia que varía según la concentración de anticuerpos de cada uno de ellos.

Lectura de resultados.

Las placas se colocan en un recinto de 15-20°C y se les observa luego de 1, 2, 5 y 7 días.

La precipitación se produce bajo forma de una o varias bandas opacas en la zona comprendida entre el antígeno y el suero. Las bandas finas en líneas rectas o ligeramente curvas no presentan problemas de especificidad sobre todo si hay varias. Las falsas reacciones aparecen bajo forma de nubes irregulares (banda difusa); ellas pueden deberse principalmente a contaminaciones del suero, hemólisis o lipemia (anillo circular alrededor del reservorio del suero). La presencia de sustancia C



Pablo Becerra Lara n ciertos antígenos fúngicos y de la proteína C de ciertos enfermos, puede conducir a la formación de bandas de precipitación no específicas que desaparecen por la acción del citrato de sodio al 5%.

TÉCNICA DE INMUNOELECTROFORESIS EN GELOSA.

Se utilizan láminas de vidrio (portaobjetos) de 75 X 25 mm, formando sobre ella un depósito de gelosa de 2 mm de espesor. La gelosa purificada se prepara al 1% en un tampón de veronal sódico (pH 8.2) y de fuerza iónica de 0.05, adicionado de mertiolate a una concentración final de ¹⁄10000.

Se marca una perforación (canaleta) central a lo largo de la lámina, de 65 X 2 mm de ancho, sin retirar del agar. A ambos lados de la canaleta y a una distancia de 3 a 4 mm se practicarán con un sacabocas dos perforaciones redondas de 2 mm de diámetro. En estos reservorios se colocan los antígenos.

Así preparado el portaobjetos se le ubica en el aparato de electroforesis. Realizando las conexiones pertinentes se efectúa la corrida electroforética bajo un potencial de 5 voltios por cm en los extremos de la lámina durante 30 minutos.

Finalizada la operación se coloca el suero del enfermo quitando previamente el agar de la canaleta central y se ubica al portaobjetos en una cámara húmeda durante 24 a 48 horas, tiempo necesario para que se forme el inmunocomplejo y su precipitación.

Al cuarto día la lámina se sumerge en una solución de citrato de sodio al 5% durante 24 horas para disolver eventuales precipitados no específicos que se puedan formar entre la sustancia C de ciertos antígenos fúngicos y la proteína C de los sueros de los enfermos de diversas afecciones no micóticas. Las lecturas se realizarán al quinto día.

Se puede fotografiar o colorear con Amidoschwart después de un lavado con solución fisiológica durante 24 horas, cambiando la solución cada 12 horas. Luego se enjuaga con agua y se cubre el portaobjetos con un papel filtro, dejándolo hasta que se seque a temperatura ambiente o a 50°C. Se sumerge el colorante durante una hora y se decolora con ácido acético al 2-5% en metanol al 50%. Se seca y se conserva.

TÉCNICA DE ELECTROSINÉRESIS.



Pablo Becerra Lara Recientemente el método de electroforesis desarrollado por

Bussard, combina, la electroforesis y la precipitación inmunológica entre el antígeno fúngico y el suero que contiene los anticuerpos antifúngicos sobre un gel de agarosa, siendo una técnica más sensible y que permite un rápido resultado a las 2-4 horas.

En condiciones técnicas elegidas (soportes, tampón) las gammaglobulinas son dirigidas hacia el cátodo, mientras que el antígenos hacia el ánodo. El encuentro entre los dos constituyentes de la reacción se traduce en una precipitación que se obtiene hacia el final de la migración.

El dispositivo experimental consiste en una cámara de electroforesis y un rectificador de corriente.

Se usan portaobjetos (75 X 25mm) individualmente o en grupos de 6 en cuadros de poliestireno. Se mojan las láminas de gelosa al 1% en agua destilada, se secan y luego se cubren con gelosa purificada o agarosa al 1% en un tampón de veronal sódico. Esta capa debe tenr alrededor de 2 mm de espesor.

Con sacabocado especial se hacen agujeros. Las tres perforaciones destinadas a diferentes concentraciones de antígeno están en el lado del cátodo (-) y las tres destinadas al suero están en el ánodo (+) separadas por 6 mm de distancia. Miden 2 mm de diámetro y recibirán un volumen de 20µl cada una. Los antígenos metabólicos (filtrados de cultivo) y los antígenos somáticos (triturados de micelio) se utilizan a una concentración de 100, 50 y 25 mg/ml en agua destilada. El tiempo de migración es de 90 min para una tensión de 5 V/ cm. La lectura se hace inmediatamente pues en ciertos casos se pueden observar desde la finalización de la migración, 1 o más anticuerpos. En ausencia de bandas de precipitación inmediata en el preparado es necesario recurrir a la coloración con azul de Coomassie, procedida de lavados sucesivos de solución fisiológica y agua destilada (24 horas). Seguidamente se deseca.

REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA.

Los trabajos de Coombs demuestran que es sumamente importante el marcado de anticuerpos con isocianato de fluoresceína para ubicar a los antígenos bacterianos o virales sobre los cortes de tejido. La aplicación a la micología médica es reciente.



Pablo Becerra Lara El método directo emplea un suero inmune o inmunológico

extraído de este suero, conjugadas al fluorocromo. El suero se agrega sobre la lámina donde se halla ubicado el antígeno del (el hongo) que puede estar preparado bajo la forma de frotis o cortes histológicos. La reacción Ag-Ab se produce y la localización del hongo sobre el preparado se visualiza a la luz fluorescente.

El método indirecto con la técnica de “capas múltiples” o en “sándwich” es la que más se usa.

Para detectar un hongo sobre la lámina se agrega un suero humano o animal que, lógicamente debe contener anticuerpos “antihongos”; luego se adiciona un suero antiglobulinas humanas masrcadas con isotiocianato de fluoresceína.

Si la fluoresceína persiste después del lavado, la reacción Ag-Ab se produjo.

Técnica:

Preparación del frotis: Se usan portaobjetos delgados, muy limpios; con un diamante se trazan círculos de 1 cm de diámetro y distantes algunos centímetros.

Los frotis de levaruas, Criptococcis, Histoplasma, etc., se efectúan con suspensiones estandarizadas (4-5 levaduras por campo). La fijación de los frotis, después de la desecación, se hace con una o dos inmersiones en acetona.

Sueros: Los sueros de los enfermos, conservados a –20°C, adicionados de mertiolate ¹⁄5000 (concentración final), son diluidos en el momento del uso mediante la siguiente solución: cloruro de sodio 8.5 g, fosfato disódico con 12 H2O 2.7 g, fosfato monosódico con 2 H2O 0. 4 g, agua destilada c.s.p. 1000 cm3 (pH 7.2).

Se utilizan diluciones de suero según la progresión geométrica de la razón 2. Se deposita 0.05 ml de cada dilución sobre los círculos del frotis del portaobjetos. Estos se mantiene en contacto con el suero del paciente durante 30 minutos dentro de una cámara húmeda (puede ser una caja Petri). Se lava el exceso de dilución de suero con la solución tampón ¹⁄100 de suero fluorescente antiglobulina humana. Se coloca en una caja húmeda durante 30 min. Luego se lavan las láminas con solución tampón.



Pablo Becerra Lara Se monta el preparado con una solución de fosfato disódico con 12

H2O 3.222 g, fosfato monosódico con 2 H2O 0.136 g, glicerina 80 ml agua destilada 20 ml.

El examen se practica con luz UV y, preferentemente, con un microscopio con fondo oscuro. Cada reacción debe tener un testigo negativo y uno positivo.

La inmunofluorescencia permite obtener en las micosis humanas títulos mas elevados de anticuerpos que las reacciones de fijación del complemento, son del orden ¼, 1/8, 1/16 y como máximo 1/64. Estos títulos pueden, a veces, alcanzar y hasta sobrepasar a aquellos observados con las reacciones de aglutinación, cuya utilización es posible en algunas micosis.

OBSERVACIÓN:

CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA:



Pablo Becerra Lara Diagnóstico micológico, Amadeo D’Alessandro; Ed. Panameriacana. Micología Médica Básica; A. Bonifaz; Ed. Méndez Cervantes.

Xalapa, Ver., a ____________________________________________

Vo. Bo.

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PRACTICA 10.MICOSIS PROFUNDAS.

COMPARACIÓN Y CRÍTICA DE LOS TRABAJOS SOBRE MICOSIS PROFUNDAS “MICOSIS PROFUNDAS 1” Y “MICOSIS PROFUNDAS

(GRUPO 802)”



Pablo Becerra Lara

Xalapa, Ver., a ______________________________________________

Vo. Bo.

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PRACTICA 11.

HISTORIA CLÍNICA

FORMATO DE UNA HISTORIA CLINICA

IDENTIFICACIÓN DEL PACIENTE

Nombre: Silvia Cuevas IrissonEdad: 41 añosSexo: FemeninoDirección: Avenida Puerto de Veracruz ·21, Col. El Pireo, C.P. 92360,

San Rafael, Veracruz.Ocupación: Ama de Casa, Costurera.

DATOS DE LA LESIÓN



Pablo Becerra Lara Entrevista: Cree que la micosis pudo haber sido originada por

haber hacer el aseo de un criadero de puercos durante mucho tiempo. Según el Dr. F. Becerra López fue debido a una crisis de nervios, lo que hacia que la señora se rascara de la rodilla para abajo. Se untaba alcohol.

Medicamentos usados: Microrgan 500mg, caja con 14 tabletas., una cada 12 horas; Daflón 500mg grageas, dos juntas en cada comida; Neurobion 1000 ampolletas, una caja, vía IM, una cada tres días; Acifur comprimidos 200mg, una cada 5 horas por 10 días; Alin, tomaba 6 pastillas, al siguiente día 5 y sucesivamente hasta llegar a media pastilla, descansaba 15 días y comenzaba de nuevo. Dejó estos tratamientos por presentar mareos intensos y debilidad.

Se ha sometido a tratamientos alternativos como baños con agua – vinagre, agua – carbonato, baños de sol. Tomó un preparado de composición desconocida, con lo que aparentemente tuvo una ligera mejoría.

Tratamiento actual: Sporanox 15D, combinada con la pomada Barmicin compuesto (Betametasona, clotrimazol y gentamicina).

Suspendió el tratamiento 20 dìas antes de la toma de muestra.

Tiempo de aparición: Un año aproximadamente.

Características de la lesión: Micosis comenzada en pie derecho, que posteriormente comenzó en pie izquierdo. Se manifiesta como una resequedad que avanza hasta formársele llagas y grietas con apariencia llorosa y con pus.

Localización: Piel de planta del pie.

DATOS DE LABORATORIO

Examen en fresco: POSITIVOCultivo: Medio: Sabouraud Temperatura: Ambiente Tiempo de crecimiento: 10 días Colonia: Blanca, aterciopelada. Microcultivo: No se realizó Tinción de Gram: Gram negativo. Tinción de Zielh-Nelssen No AAR



Pablo Becerra Lara

RESULTADO

Se identificó Trichophyton mentagrophytes

FÁRMACOS RECOMENDADOS

Medidas locales

Crema de Miconazol al 2%, crema o loción de clotrimazol al 1%, crema de ketoconazol al 2%, crema o loción de econazol al 1%, crema de ciclopitrox al 1%, crema de oxiconazol, crema o gel de naftifina al 1%, crema de butenafina y de terbinafina al 1%.

El tratamiento debe continuarse 1 – 2 semanas después de la remisión clínica.

Medidas sistémicas

Griseofulvina 250 o 500 mg dos veces al día, durante 2 – 4 semanas, itraconazol en dosis de 200mg al día durante dos semanas o 400mg diarios por una semana; terbinafina, 250mg al día por 2 – 4 semanas.

Atte

NOMBRE DEL ALUMNO


Manual de Lab Oratorio de Micologia

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