Making quality control easy - INTI · PDF fileCepa de Referencia (ISO 11133) Microorganismo...

Making quality control easy

Materiales de referencia microbiológicos

26 de octubre 2011

1. ¿Qué es un material de referencia?

2. ¿Qué es un material de referencia certificado?

4. ¿Qué son los productos BACuali, BACuanti, BAControl, BACuanti PCR y BACuantiDNA desarrollados por Labaqua?

3. ¿Qué características principales tienen los materiales de referencia microbiológicosdesarrollados por Labaqua?

Preguntas más frecuentes

6. ¿Qué proporciona el uso de los materiales de referencia y materiales de referenciacertificados?

DNA desarrollados por Labaqua?

5. ¿Qué diferencia existe entre los diferentes materiales presentados por Labaqua?

7. ¿Qué vantajas presentan estos materiales frente a las cepas habituales procedentesde Colecciones de Cultivo?

Preguntas más frecuentes

10. ¿Es obligatoria la realización de todas estas actividades?

11. ¿Qué es validar un método de ensayo?

9. ¿En que actividades del laboratorio puedo emplear estos materiales?

8. ¿ Son los productos BACuali, BACuanti, BACuanti PCR, BAControl y BACuantitrazables con cepas de Colecciones de Cultivo?

12. ¿Cuales son los controles de calidad que debe efectuar un laboratorio?

13. ¿Cuales son los controles de calidad internos que debe realizar un laboratorio?

15. ¿Con que periodicidad debe un laboratorio realizar las actividades internas decontrol de calidad?

14. ¿Qué son los controles externos de calidad?

Material de Referencia (ISO 17025)

Material o substancia una o más de cuyas propiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida, o la asignación de valores materiales.

Materiales de Referencia

Material de Referencia Certificado (ISO 17025)

Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.

Cepa de Referencia (ISO 11133)

Microorganismo definido por lo menos al nivel de género y especie, catalogado y descrito según sus características y preferiblemente de origen conocido.

Cepa de Reserva (ISO 11133)

Cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de

Materiales de Referencia

Cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie de alícuotas de cultivos idénticos elaboradas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia.

Cepa de Trabajo (ISO 11133)

Subcultivos primarios obtenidos de una cepa de reserva, a fín de ser empleados en los ensayos pertinentes.

G-ENAC-04: Utilización de cepas de referencia

Un material de referencia debe ser:

• Representativo• Representativo

• Valor de la propiedad (Identidad)

• Homogéneo

• Estable

1. Ampolla conteniendo material liofilizado

2. Rotura de la ampolla con diamante

3. Rehidratación en medio líquido apropiado

4. Extensión en medio sólido apropiado

Material liofilizado clásico

5. Crecimiento y preparación de cepas de reserva

TIEMPO: 24-48 h


1. Preparación suspensión bacteriana

2. Preparación de diluciones seriadas

3. Incubación y recuento del título

TIEMPO: 24-48 h

Inconvenientes de los materiales de referencia microbiológicos

NECESIDAD DE NUEVOS MATERIALES DE REFERENCIA

- Estabilidad (microorganismos)

- Homogeneidad (bajas concentraciones)

Nuevos Materiales de Referencia

BACuanti BACualiBAControl

Objetivo

Desarrollo de un material de referencia microbiológicoGUÍA-ISO 34 “General requirements for the competence ofreference materials producers ”

-Fácil de preparar

-Homogéneo

-Estable

-Fácil de usar

-Aplicable a diferentes microorganismos

Guia ISO 35 e ISO 13528

Material de Referencia: Preparación I

� Comprobación de la identidad de la cepa mediante secuenciacióndel gen rDNA 16S

� Hidratación de la cepa de una Colección de Cultivos Tipo

del gen rDNA 16S

� Realización de la titulación del microorganismo

Material de Referencia: Preparación II

� Realización de los cálculos a partir del título obtenido

Pastillas de rango bajo (<2 log)

Pastillas de rango alto (>2 log)

� Preparación y dispensación de una mezcla homogénea :“Caldo de mantenimiento” + suspensión bacteriana

Material de Referencia: Preparación III

� Proceso de estabilización (liofilización)

� Desemblistado y conservación a -18ºC

� Resultado: PASTILLA

� Desemblistado y conservación a -18ºC

Material de Referencia: Controles de calidad I

1. Reconstitución del Material de Referencia

2. Controles de esterilidad

� De cada cepa empleada

� De cada mezcla preparada

� De cada lote fabricado

Material de Referencia: Controles de calidad II

10 pastillas, 2 réplicas de cada pastilla

� ISO 13528: Statistical methods for use in proficiency testingby interlaboratory comparisons

T2/(I-1) ≤ 2� T: Test estadístico de Cochran (Heisterkamp et. al.,1993)

3. Homogeneidad

(Heisterkamp et. al.,1993)

� ANOVA

ss ≤ 0.3 σ

p-valor>0.05

(σ: desviación estándar diana)

Ejemplo 1:

Test T

Lote PCP11088

C. perfringens

Cápsula Réplica 1 Réplica 21 42 362 30 48 Media 39,53 40 46 Nº cápsulas 104 39 445 37 34 Limites6 44 37 T-1 (97.5%) T-1(2.5%)

Microorganismo: Clostridium perfringens (UFC/1 mL)Dilución: 1/10

ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA

HOMOGENEIDAD PASTILLAS (11/02/08) Lote PCP11028


Homogeneidad

7 41 43 T-1: 6,22 3,25 20,488 37 37 T-1/I(J-1): 0,579 41 39 T-2 (5%)10 38 36 T-2: 2,67 16,92

T-2/(I-1): 0,30

Media geométrica 39,2St. dev. (log) 0,027

RESULTADO: T-1T-2

HOMOGENEOHOMOGENEO

Análisis de varianza de un factor

RESUMENGrupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Fila 1 2 3,179551791 1,589775896 0,00224094Fila 2 2 3,158362492 1,579181246 0,02083248Fila 3 2 3,264817823 1,632408912 0,00184211Fila 4 2 3,234517284 1,617258642 0,00137225Fila 5 2 3,099680641 1,549840321 0,00067428Fila 6 2 3,211654401 1,6058272 0,00283135Fila 7 2 3,246252312 1,623126156 0,00021393Fila 8 2 3,136403448 1,568201724 0Fila 9 2 3,203848464 1,601924232 0,00023586Fila 10 2 3,136086097 1,568043049 0,00027568

Ejemplo 1: ANOVA, Homogeneidad Lote PCP11028 C. perfringens


ANÁLISIS DE VARIANZAOrigen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los cuadrados

F ProbabilidadValor crítico

para FEntre grupos 0,013184202 9 0,001464911 0,48000145 0,857775864 3,020382947Dentro de los grupos 0,030518894 10 0,003051889

Total 0,043703096 19

Ss= 0,028168937

Ss/sigma= 0,06 < 0.3

Cápsula Réplica 1 Réplica 21 10 132 9 13 Media 12,13 15 13 Nº cápsulas 104 17 155 12 14 Limites6 17 13 T-1 (97.5%) T-1(2.5%)7 6 10 T-1: 8,74 3,25 20,48

Microorganismo: Escherichia coli (UFC/1 mL)Dilución:

ESTUDIO DE MATERIAL DE REFERENCIA

ESTUDIO HOMOGENEIDAD PASTILLAS (08/02/07) Lote PEC08027Ejemplo 2:

Test T

Lote PEC08027

E. coli


Homogeneidad

7 6 10 T-1: 8,74 3,25 20,488 9 15 T-1/I(J-1): 0,799 8 8 T-2 (5%)10 17 7 T-2: 10,49 16,92

T-2/(I-1): 1,17


RESULTADO: T-1T-2

HOMOGENEOHOMOGENEO

Ejemplo 2: ANOVA, Homogeneidad Lote PEC08027 E. coliAnálisis de varianza de un factor

RESUMENGrupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Fila 1 2 2,11394335 1,05697168 0,00649154Fila 2 2 2,06818586 1,03409293 0,01275218Fila 3 2 2,29003461 1,14501731 0,00193118Fila 4 2 2,40654018 1,20327009 0,00147738Fila 5 2 2,22530928 1,11265464 0,00224094Fila 6 2 2,34439227 1,17219614 0,00678677Fila 7 2 1,77815125 0,88907563 0,02460843Fila 8 2 2,13033377 1,06516688 0,02460843Fila 9 2 1,80617997 0,90308999 0Fila 10 2 2,07554696 1,03777348 0,07424765


ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los

cuadradosF Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos 0,19622884 9 0,0218032 1,40534808 0,300849328 3,02038295Dentro de los grupos 0,15514451 10 0,01551445

Total 0,35137335 19

Ss= 0,05607474

Ss/sigma= 0,21 < 0.3

Pastilla Replica 1 Replica 21 39,07 37,842 36,1 37,23 Media 37,23 36,67 36,58 Nº Pastillas 104 35,74 37,715 39,92 36,51 Limites6 36,06 38 T-1 (97.5%) T-1(2.5%)7 36,48 38,02 T-1: 0,39 3,25 20,488 37,42 37,76 T-1/I(J-1): 0,04

Estudios de Homogeneidad (04/08/02) Lote PLPQ28036Microorganismo: Legionella pneumophila (ct/7.1 uL)

Ejemplo 3:

Test T

Lote PLPQ28036

L. pneumophila Q-PCR


Homogeneidad

8 37,42 37,76 T-1/I(J-1): 0,049 36,73 38,84 T-2 (5%)10 36,28 35,94 T-2: 0,28 16,92

T-2/(I-1): 0,03


Resultados: T-1T-2

HOMOGENEOHOMOGENEO

� Estudios previos:

� Temperatura de conservación: ambiente, 4ºC y –18ºC.

� Estabilidad medio plazo: Período de tiempo de 15-20 días

� Estabilidad largo plazo: 9 meses

Material de Referencia: Controles de calidad III

4. Estabilidad

Dos pastillas por triplicado durante X días

� Estudiado tanto por cultivo como por Q-PCR (L. pneumophila)

� Estudios estadísticos (ISO 13528):

� /X-Y/ < 0.4 σ (X:media homogeneidad; Y:media cada día

estudiado; σ:desviación estándar diana)

� L.pneumophila: Análisis de varianza (p-valor>0.05)

� Gráficas de evolución temporal

Escherichia coli

Temperatura de conservación

ESTABILIDAD LOTE PEC160

3.5

4

4.5

Conservar a –18ºC


4. Estabilidad

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154 161 168 175

DIAS

E.coli Tªamb.

E.coli Nevera

E. coliCongelador


ESTABILIDAD LOTE PCF25115

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

0 5 10 15

DIAS

Citrobacter f.

Lineal(Citrobacter f.)

Citrobacter freundii

Estabilidad a corto plazo


4. Estabilidad

y = 0,0045x + 5,16860 5 10 15

DIAS

ESTABILIDAD DIANA PCF25115

0,0000

0,0200

0,0400

0,0600

0,0800

0,1000

0,1200

0,1400

0,1600

0 4 7 11 15

/X-Y/0,4xSs

Estabilidad a largo plazo

ESTABILIDAD LOTE 160 PEF28084

2,5

3,0

3,5

4,0

E.faecium

Enterococcus faecium


4. Estabilidad

y = -0,0002x + 2,9436

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133140 147 154 161168 175

DIAS

E.faecium

Lineal(E.faecium)

Caducidad 6 meses

Estabilidad a largo plazo

Legionella pneumophila Lote PLP18065 Means and 95,0 Percent LSD Intervals

1,5

1,6

1,7

1,8

RE

SU

LTA

DO

S


4. Estabilidad

07

1421283842495763707784

Box-and-Whisker Plot

1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8

RESULTADOS

DIA

Sp-valor=0,5898

0 7 14 21 28 38 42 49 57 63 70 77 84

DIAS

1,4

RE

SU

LTA

DO

S

Estudios de certificación I

Condiciones:

- 7 laboratorios acreditados por ENAC

- 2 pastillas por triplicado

- mismas condiciones de ensayo

Microorganismo Medio cultivo Tiempo/ Temperatura incubaciónMicroorganismo Medio cultivo Tiempo/ Temperatura incubación

Escherichia coli Tergitol-7 agar 24 h a 37ºCCitrobacter freundii Tergitol-7 agar 24 h a 37ºCEnterococcus faecium Slanetz-Bartley agar 48 h a 37ºCClostridium perfringens TSC agar 24 h a 44ºC (Anaerobiosis)Legionella pneumophila BCYE-α 4 días a 37ºCStaphylococcus aureus Chapman manitol 48 h a 37ºCPseudomonas aeruginosa Agar Cetrimida 48 h a 37ºC

Resultados:

- fecha envío resultados

- boletín de resultados

- tratamiento estadístico (Guía ISO 35:

Certification of reference materials. General and

statistical principles)

LABORATORIO:

MICROORGANISMO:

LOTE:

12

BOLETÍN DE RESULTADOS (*)

RESULTADOS MEDIO ESPECÍFICO

RESULTADOS MEDIO GENERAL (en su caso)

PASTILLA UNIDADESRÉPLICA

R1 R2 R3

PASTILLA UNIDADESRÉPLICA

R1 R2 R3

Estudios de certificación II

� ¿Diferencias entre pastillas?

� ¿Diferencias entre réplicas?

� ¿Diferencias entre laboratorios?

12

NOTA: En caso de que los resultados correspondan a una dilución, indicar a cual corresponde.

OBSERVACIONES:

(*)Realizar tantas copias de este boletín como lotes s e hayan analizado

R1 R2 R3

Estudios de certificación III

PEF01028 (19/02/2008)

R1 R2 R3 R1 R2 R3Lab 1 1400 1600 2800 2000 3000 2600Lab 2 1980 1800 1740 1760 1940 1800Lab 3 1220 1740 1580 2140 1560 1800Lab 4 2200 2000 1600 2600 1400 1400Lab 5 2000 1800 1600 2000 1600 2000Lab 6 1600 1200 2000 2800 2600 2000Lab 7 1620 1880 1760 2080 2200 1960

Slanetz Bartley (ufc/pastilla)Pastilla 1 Pastilla 2

AMC Robust Statistics V1.0

ROBUST STATISTICS SUMMARYEstimate Estimate value ParametersMedian 3,263512308A15 mean 3,268905864 c=1.5: Convcrit=0.001H15 mean 3,271059179 c=1.5: Convcrit=0.001MAD 0,016808962MADe 0,024920982sMAD 0,024920982H15 Std Dev 0,029790253 c=1.5: Convcrit=0.001

¡¡¡Calcular la estadística robusta para obtener H15 mean y H15 Std Dev!!!

¡¡¡Asignar valor de n (Nº de laboratorios)!!!

Enterococcus faecium

X S3,3318 0,13643,2635 0,02313,2174 0,08113,2591 0,11093,2611 0,04763,2912 0,13593,2803 0,0483

TOTAL media robusta 3,271desviación estandard 0,030

Incertidumbre=s/raiz n 0,011 Intervalo confianza(I)=t*s/raiz n 0,02755238% 0,344 3,244

3,299

Valor medio/pastilla 1,87E+03Incertidumbre (%) 0,34

1,75E+031,99E+03

VALORES CERTIFICADO

Intervalo confianza

¡¡¡Asignar valor de t en la tabla, para (n-1)!!!

Intervalo (media-I; media+I)

Certificados de análisis: Cuantitativos

Guía ISO 31: Contenido de Certificados de Materiales de ReferenciaDescripciónCódigo: L060046Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PCF05028Fecha de preparación: 05/02/08

Valor medio por pastilla, en las condiciones de análisis indicadas

Caducidad 6 meses

BACuanti

Fecha de preparación: 05/02/08Fecha de caducidad: 05/08/08

ResultadosPorcentaje del lote analizado: 10%Valor medio por pastilla: 2.06x103 ufcIncertidumbre: + 1.82%Intervalo de confianza 95%: 1.46x103 – 2.89x103 ufc


Certificados de análisis: Cuantitativos

Guía ISO 31: Contenido de Certificados de Materiales de ReferenciaDescripciónCódigo: L060046Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleada

Valor por pastilla, en las condiciones de ensayo del fabricante

Caducidad 6 meses

BAControl

pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PCF07028Fecha de preparación: 07/02/08Fecha de caducidad: 07/11/08

Resultados

Valor por pastillaobtenido por el fabricante: 8.87x103 ufc


DescripciónCódigo: L060031Microorganismo: Citrobacter freundii V318 precedente de NCTC 6272, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PCF25117Fecha de preparación: 25/11/07

Caducidad 9 meses

Certificados de análisis: Cualitativos

BACuali

Certificación de la identidad de la cepa suministradaFecha de preparación: 25/11/07Fecha de caducidad: 25/08/08

Control de calidadContaminación: CorrectoHomogeneidad: HomogéneoEstabilidad: Estable


la cepa suministrada

DescripciónCódigo: L060047Microorganismo: Legionella pneumophilaL2949 precedente de ATCC 33152, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: PLPQ21018Fecha de preparación: 21/01/08Fecha de caducidad: 21/01/09

Valor medio por pastilla, en las condiciones de análisis indicadas

Caducidad 12 meses

Certificados de análisis: Cuantitativos para PCR

BACuanti- PCR

ResultadosPorcentaje del lote analizado: 10%Valor medio por pastilla: 3.15x108 célulasIncertidumbre: + 0.98%Intervalo de confianza 95%: 1.84x108 – 5.37x108 células

Fecha de caducidad: 21/01/09condiciones de análisis indicadas

Conservar a temperatura ambiente

DescripciónCódigo: L060024Microorganismo: Legionella pneumophilaL2949 precedente de ATCC 33152, con menos de dos pases desde la cepa liofilizada empleadaLote: LN31018Fecha de preparación: 17/01/08Fecha de caducidad: 17/07/08

Caducidad 6 meses

Valor medio por vial, en las

Certificados de análisis: Cuantitativos para PCR

BACuanti- DNA

Fecha de caducidad: 17/07/08

ResultadosPorcentaje del lote analizado: 10%Valor medio por pastilla: 12 µg (2.8x109 unidades genómicas)Incertidumbre: + 2.6%Intervalo de confianza 95%: 11.32 - 12.70 µg/vial

Valor medio por vial, en las condiciones de análisis indicadas

Conservar a temperatura ambiente

Recepción del material Conservar a -18ºC Rasgar la bolsa de aluminio Extraer el dispositivo

Material de Referencia: Guía rápida de utilización (BACuanti/BACuali)

Extraer el dispositivo Romper precinto seguridad Girar siguiendo flecha Liberar la pastilla en 20 mL

Incubar 10 min. Suspensión bacteriana Tratar como una muestra Comparar con el valor certificado

Material de Referencia: Guía rápida de utilización (BAControl)

Recepción del material Conservar a -18ºCExtraer el vial

Romper precinto seguridadAdicionar 20 mL

Incubar 10 min. Tratar como una muestra

Materiales de referencia disponibles

BACuanti • Escherichia coli

• Citrobacter freundii

• Entrococcus faecium

• Clostridium perfringens

• Pseudomonas aeruginosa

• Staphylococcus aureus

• Legionella pneumophila

Material cuantitativo Material cuantitativo

BAControl

� Material cuantitativo

� Cada pastilla contiene un número determinado de células viables y cultivables

� Útil para la validación de métodos y controles de calidad cuantitativos

� Disponibilidad de rango bajo (<2log) y rango alto (>2log)


� Cada pastilla contiene un número determinado de células viables y cultivables

� Útil para el control de calidad rutinario (controles de proceso, gráficos de control, control de calidad de medios de cultivo, etc.)

�Disponibilidad de rango bajo (<2log) y rango alto (>2log)


BACuali• Escherichia coli

• Citrobacter freundii

• Entrococcus faecium

• Clostridium perfringens

• Pseudomonas aeruginosa

• Staphylococcus aureus

• Legionella pneumophila• Legionella pneumophila

• Salmonella enterica subsp. enterica

� Material cualitativo

� Se certifica la identidad de la cepa suministrada

� Útil para la validación de métodos y controles de calidad cualitativos

BACuanti- PCR � Legionella pneumophila


� Cada pastilla contiene un número determinado de células inactivadas

� Útil para la validación de métodos moleculares y control de calidad del proceso analítico completo


analítico completo

� DNA liofilizado de Legionella pneumophila


� Cada vial contiene un número determinado de unidades genómicas

� Útil para la validación de métodos moleculares y control de calidad de la fase de amplificación por PCR

BACuanti- DNA

Materiales de Referencia: Ventajas

SENCILLEZ: la preparación del material es extremadamente simple, gracias al formato en pastilla que se suministra en un vial o en un dispositivo plástico estéril de muy fácil uso, que evita manipulaciones engorrosas

RAPIDEZ: el tiempo de reconstitución se reduce a 10 minutos

SEGURIDAD: al reducirse las manipulaciones al mínimo, se reduce el riesgo de contaminación

TRAZABILIDAD: las cepas empleadas son trazables a diferentes Colecciones de Cultivos tipoCultivos tipo

CALIDAD: el material va acompañado de una Guía Rápida de Uso y el correspondiente Certificado de Análisis

FLEXIBILIDAD: el material está disponible en dos rangos de concentraciones, baja (<2 log.) y alta (>2 log.)

SERVICIO: además de las especies disponibles en stock, se ofrece la posibilidad de preparar material de referencia a una concentración predefinida por el cliente

1. Ampolla conteniendo material liofilizado

2. Rotura de la ampolla con diamante

3. Rehidratación en medio líquido apropiado

4. Extensión en medio sólido apropiado

5. Crecimiento y preparación de cepas de reserva


TIEMPO: 24-48 h1. Preparación suspensión bacteriana

2. Preparación de diluciones seriadas

3. Incubación y recuento del título

TIEMPO: 24-48 h

1. Sacar del congelador

2. Abrir el sobre de aluminio/Extraer el vial de la caja

3. Abrir el dispositivo de dispensación/Desprecintar el vial

4. Servir una pastilla/Adicionar el agua

Material de referencia:BACuanti – BACuali - BAControl

4. Servir una pastilla/Adicionar el agua

5. Incubar a Tª ambiente 10 min.

6. Material preparado

TIEMPO: 15 min

TIEMPO: 48-96 h TIEMPO: 15 min

Uso de los materiales de referencia junto con los kits de

qPCR

www.ielab.es

KITS PARA CADA UNA DE LAS FASES DEL PROCESO

CONCENTRACIÓN DE MUESTRAS DE AGUA

EXTRACCIÓN & -Kit aguas limpias-Kit aguas sucias

Kits de diagnóstico molecular

PURIFICACION DE DNA

ANALISIS POR PCR

-Kit aguas sucias

- Confirmación bacteriológica por PCR- Detección cualitativa de Legionella- Detección cuantitativa de Legionella

KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO

1. KIT DE CONCENTRACIÓN DE MUESTRAS DE AGUA

2. KIT EXTRACCIÓN & PURIFICACIÓN DE DNA


- Membranas de filtración

- Tubos de recogida

- Tubos de concentración

AGUA LIMPIA AGUA SUCIA

KITS PARA CADA FASE DEL PROCESO

3. ANALISIS POR PCR

3.1. Confirmación bacteriológica por PCR

3.3. Kit de detección cuantitativa de Legionella spp . y


bacteriológica por PCR (confirmación simultánea de

hasta 10 especies)

3.2. Kit de detección cualitativa de Legionella spp . y L. pneumophila

L. pneumophila

� CONTROLES POSITIVO & NEGATIVO

� CONTROL INTERNO POSITIVO

KITS DE DETECCIÓN CUALITATIVA DE

Legionella spp. y L. pneumophila

DescriptionCode: I060002Specificity: Legionella pneumophilaBatch: CLN11068Manufacturing date: 11/June/2008

Analysis conditionsMethod: amplification by PCR and electroforesis in agarose gel analysisThermocycler: GeneAmp PCR System9700, Applied Biosystems


Manufacturing date: 11/June/2008Expiry date: 11/Dec/2008Number of tests : 70

Applied BiosystemsAmplification program: Denaturation at 95ºC 4 min, 35 cycles of 95ºC 30 s., 58ºC 30 s., 72ºC 1 min. and final extesion at 72ºC 10 min.

Quality controlsPositive control amplification: rightNegative control amplification: rightInternal positive control amplification: right

KITS DE DETECCIÓN CUANTITATIVA DE Legionella spp. y L. pneumophila

Quality controls

Used fungible materialTaqMan Environmental Master Mix, Internal positive control (plamidic DNA), primers, probe and Legionella spp. ATCC 33152 DNA as

DescriptionCode: ED000864Specificity: Legionella spp.Batch: QLS030909

Analysis conditionsMethod: amplification by “real time” PCR Thermocycler: 7500 Real-Time PCR System, Applied Biosystems


Quality controlsPositive control amplification: rightNegative control amplification: rightInternal positive control amplification: right

and Legionella spp. ATCC 33152 DNA as positive controlBatch: QLS030909

Manufacturing date: 08/June/2009Expiry date: 08/March/2010Number of tests : 70

Applied BiosystemsAmplification program: 50ºC 2 min, 95ºC 10 min. and 42 cycles of 95ºC 15 s. and 60ºC 1 min.

Dispensar la pastilla en un tubo con 4 mL de

agua estéril

Ejemplo de aplicación: Legionella pneumophila

Incubar durante 10 min a Tª ambiente

Analizar como una muestra de rutina

RMPreparación de la

muestra de trabajo cuantitativa

Control de proceso en qPCR

ConcentraciónEluciónExtracción/Purificación

de DNA

Analisis por qPCR

� El Control de Calidad Interno permite establecer laTasa de Recuparación del proceso completo dePCR (concentración de muestra, extracción/purificación de DNA, etc.)� El uso de RM ayuda en la Validación de métodosPCR methods, porque facilita la preparación demuestras cuantitativas y la determinación de laExactitud y Precisión del método.


Control de proceso en qPCR

Proceso completo

(6.72x104 células/pastilla)

Análisis directo

(1.49x105 células/pastilla)

Exactitud y Precisión del método.

Ct=-3,028 log[DNA]]]] +39,6148

R²= 0,94743 r= -0,9733

Rectas de calibrado

CURVA ESTANDAR

40

50

STANDARD CURVE

Curva de calibrado


Certificación Multisector0

10

20

30

40

0 2 4 6 8 10

Log Nº copies

Ct

ConcentratciónPreparación de la

muestra de trabajo

cuantitativa

Incubar durante 10 min a Tª ambiente

Routine qPCR control

Dispensar la pastilla en un tubo con 4 mL de

agua estéril

BACuanti-PCR

Analizar como una muestra de

rutina

RM


EluciónExtración/purificación de DNAAnalysis por qPCR

BACuanti-DNA

PTs, Materiales de Referencia y Kits qPCR:

1. Facilitan la aplicación de métodos normalizados y validados.

2. Ahorra tiempo de implementación.

3. Ofrecen un sistema rápido y fácil de implementar sistemas intenos

Conclusiones

y externos de control de la calidad.

Phone +34 966 10 55 01Fax +34966 10 55 03

[email protected]

Making quality control easy - INTI · PDF fileCepa de Referencia (ISO 11133) Microorganismo...

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