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“Los efectos antioxidantes de la L-Carnitina bajo el efecto del estrés

oxidativo causado por inmovilización en ratones CD1”

RESUMEN

Actualmente nuestro estilo de vida nos expone a diversos estímulos, tales como los

fármacos, la exposición continúa al ruido, el tabaco, el alcohol y la inmovilización

que provocan estrés oxidativo. La oxidación es un proceso natural que ocurre

durante la respiración celular e interviene en la generación de energía, algunos de

sus productos son los radicales libres, normalmente la célula guarda un balance

entre la producción y eliminación de estos componentes mediante la acción de

moléculas denominadas antioxidantes, como la vitamina E, A, C, el Glutatión y L-

Carnitina que evitan daños en el organismo. Es por ello que se realizó un

experimento el cual consistió en inducir estrés mediante inmovilización a 15 ratones

CD1 y la administración de L-carnitina cada 24 horas durante 3 días, con el fin de

observar los daños tisulares causados por estrés oxidativo y comprobar el efecto

antioxidante de la L-carnitina en articulación, cerebro, corazón, hígado y riñón a

través de la técnica histológica de inclusión en parafina con ayuda de las tinciones

HE, Masson, y PASS. Los resultados obtenidos sugieren que el estrés oxidativo

provoca infiltración, vascularización, fibrosis y daño neuronal los cuales se ven

inhibidos por los efectos de la L-Carnitina pero necesita un tiempo para que el

tratamiento ejerza su acción antioxidante.

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INTRODUCCIÓN

Marco teórico

El oxígeno es un elemento que presenta un perfil con doble efecto fisiológico; es

esencial para el desarrollo de la vida aerobia y posee efectos tóxicos inherentes a

su estructura. Del oxígeno se derivan moléculas inestables denominadas radicales

libres que pueden causar daño a nivel celular, cuando se pierde el equilibrio entre

dichas moléculas y el sistema de defensa antioxidante que poseen los seres vivos

se genera el estrés oxidativo. Se ha demostrado que moléculas como la vitamina E,

A, C, el Glutatión y L-carnitina funcionan como antioxidantes [1]. Sin embargo,

algunas veces el organismo no puede restaurar este equilibrio por lo que los

radicales libres dañan los componentes celulares como lípidos y proteínas o incluso

ácidos nucleicos [2].

En los últimos años se ha tomado gran interés el estudio del estrés celular y

de los radicales libres en el campo de la medicina, con el fin de conocer a

profundidad los mecanismos de homeostasis y mejorar la calidad de vida del ser

humano [3]. Diversas investigaciones muestran que el estrés oxidativo promueve el

desarrollo de diversas enfermedades como el Alzheimer, diabetes mellitus, cirrosis

hepática, insuficiencia renal, cataratas, ateroesclerosis, hipertensión y osteoartritis

[3], por lo cual la presente investigación se enfoca en los siguientes órganos

articulaciones, cerebro, corazón, hígado y riñones.

Las articulaciones son las estructuras revestidas por cartílago hialino que

evita el roce directo entre dos huesos largos cuando se genera movimiento además

de servir como amortiguadores evitando daños ante el impacto. Dentro de las

características principales del cartílago articular encontramos que es avascular,

carece de pericondrio y no posee propiedades regenerativas [4]. Es debido a estas

características que cuando las articulaciones se someten a situaciones de estrés

pueden desarrollar diversas patologías como la osteoartritis, enfermedad en la cual

se ha encontrado que hay diversos tipos de daños como hendiduras que pueden

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llegar a extenderse formando fisuras verticales, lo que provoca la erosión del

cartílago dejando expuesto el hueso subcondral lo cual provoca un dolor intenso [5].

Histológicamente se observa que los condrocitos sufren apoptosis [6] y en un intento

de reparación, también se ha observado que coexisten otras zonas de proliferación

condrocitaria, con formación de clones o racimos e hipertrofia celular [7].

Por otro lado el cerebro es el órgano que percibe el ambiente y lo adapta al cuerpo;

el estrés da como resultado una remodelación de la arquitectura neuronal, dejando

resiliencia en la estructura del cerebro, es decir, la próxima vez que el individuo se

encuentre en una situación de riesgo será más fácil activar la misma respuesta,

también produce contracción dendrítica dificultando nuevas y diferentes conexiones

de las ya establecidas, e inhibe la neurogénesis. [8] Las estructuras más afectadas

son: La amígdala, el hipocampo y la corteza frontal [9], esta investigación se enfoca

en el hipocampo, que presenta daños significativos a nivel celular como núcleos

picnóticos (condensados) y atrofia neuronal. [10].

Así mismo, el estrés oxidativo contribuye a la acumulación de lipoproteínas de baja

densidad LDL que transforma a los macrófagos en células lipídicas reduciendo su

motilidad y propicia que se acumulen en el espacio subendotelial, convirtiéndolas

en células espumosas formándose así la placa ateromatosa. Posteriormente las

células del músculo liso migran hacia la capa subendotelial que con la

hipercolesterolemia promueve la adhesión de los leucocitos abundantes causando

la inflamación en la pared cardiaca dañando las miofibras que puede generar una

fibrosis. [11].

En hígado y riñón los radicales libres pueden inducir a la formación de sustancias

proinflamatorias y algunas células endoteliales del sinusoide pueden producir

moléculas de adhesión, facilitando la necrosis hepática y renal [12]. Los principales

daños histológicos causados al hígado por el estrés oxidativo es la apoptosis de los

hepatocitos, que pueden mostrar inflamación y picnosis; en casos más severos se

puede presentar cariolisis (disolución completa de la cromatina), en los sinusoides

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hepáticos se congestionan hemorragias extensas. [13] Mientras que en los riñones

el glomérulo es más sensible al estrés oxidativo que cualquier otro segmento de la

nefrona ya que la hiperlipoproteinemia, asociado principalmente con LDL afecta los

capilares glomerulares. La glomerulopatía inducida por las lipoproteinas ha sido

caracterizada por una progresión rápida del daño renal y el desarrollo de la

gloméruloesclerosis. Subsecuentemente la oxidación de las LDL por las células

mesenguiales puede ocurrir y, de este modo, se activa la ruta hacia la apoptosis de

las células endoteliales y mesengiales, efecto inhibido por los antioxidantes.

En diversas investigaciones se ha demostrado que la L-carnitina funciona como

antioxidante la cual es una sustancia natural expresada químicamente como L-

trimetil-1,3-hidroxil amonio betanoato [1] un aminoácido de origen no proteico que

es sintetizado en el hígado por aminoácidos esenciales lisina y metionina, facilita la

β oxidación de las cadenas largas de ácidos grasos y actúa como cofactor en el

transporte de grupos acilgrasos hacia la membrana interna mitocondrial realizando

la función de remover los grupos acilgrasos tóxicos de la mitocondria y estabiliza las

membranas celulares además de proteger las enzimas del estrés provocado [1, 14-

18]

Objetivos generales

Identificar los daños que produce el estrés oxidativo a través de la descripción de

imágenes histológicas además de comprobar la efectividad de la L-carnitina como

antioxidante de la misma manera.

Objetivos específicos

Identificar los daños presentes en articulaciones, cerebro, corazón, hígado, riñones

y a su vez comparar las imágenes histológicas de los individuos tratados con L-

Carnitina.

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Problema:

Como sociedad y específicamente la comunidad estudiantil estamos expuestos a

diversas situaciones que nos pueden generar estrés es por ello que decidimos

investigar respecto a este tema y analizar los daños histológicos. Además de

proponer una posible solución administrando un antioxidante y comparar los

resultados.

Hipótesis

La respuesta ante una situación de estrés causada por inmovilización puede

provocar cambios estructurales dañinos en las articulaciones, cerebro, corazón,

hígado y riñones, el antioxidante L-carnitina puede ser capaz de disminuir estos

cambios adversos; que se reflejarán en las imágenes obtenidas.

DESARROLLO

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Para la investigación se contó con 15 ratones CD1 de 25 g aproximadamente,

obtenidos del Bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza; se les

permitió el libre consumo de agua y de alimento (Purina), con un ciclo de 12h de luz

y 12h de oscuridad, contaron con una semana de ambientación. Se dividieron en 3

grupos; el primero fue Control (n=3), el segundo grupo fue sometido a inmovilización

(n=6), al tercer grupo se le administró L-carnitina y también se inmovilizó (n=6). Se

hicieron 3 sacrificios uno cada 24hrs tomando 5 animales, un control, dos

estresados por inmovilización y dos con L-carnitina. Dando un total de 24h, 48h y

72h. Como se muestra en la siguiente tabla:

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Antioxidante e Inmovilización

Los ratones fueron inoculados vía intraperitoneal, con una dosis de 0.0625ml a cada

ratón de los grupos experimentales, 2hr. antes de la inmovilización la cual se llevó

a cabo en un horario de las 12hr. hasta las 14 hr., se repitió este proceso cada 24h

para los grupos restantes, es decir, 48hr. y 72hr.

Para la inmovilización se adaptaron tubos falcón de 50ml, realizando una abertura

para la respiración y otra para la cola, con el fin de que el ratón no se moviera de

colocaron rectángulos de vinilo en la parte inferior.

Sacrificio 24h 48h 72h

Control 1 1 1

Estresados 2 2 2

L-carnitina. 2 2 2

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Obtención y procesamiento de las muestras

Los individuos fueron sacrificados mediante una dislocación cervical y se procedió

a la obtención de los órganos de acuerdo a la técnica Virchow , los cuales se fijaron

24 hrs. con formol al 3.7 % (Manual AFIP), se deshidrató con alcoholes graduales

50%, 60%, 70%, 80%, 96%, 96% 100%, 100%, se aclaró con 2 cambios de xilol, la

infiltración se llevó a cabo con 2 cambios de parafina líquida , una hora cada cambio

de acuerdo a la técnica de inclusión en parafina, se incluyeron en parafina, se

cortaron a 5 μm con un micrótomo de rotación (con excepción del cerebro que se

cortó a 7 μm) y se colocaron en un baño de flotación a 46°C con grenetina. Se le

aplicaron la técnica de HE en los cortes de articulación, cerebro e hígado, Masson

en corazón y PASS en riñón. Posteriormente se observaron al microscopio óptico y

se capturaron las imágenes.

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RESULTADOS

Cambios histológicos en tejido articular tras el estrés inducido por inmovilización. Las imágenes muestran los cóndilos de los individuos, en sus tres grupos, en las imágenes A, D y G se muestran los grupos control donde se observa una placa de crecimiento alineada y aun no hay una deformación de las articulaciones. En B, E y H son las imágenes del grupo estresado por inmovilización, se empieza a observar la vascularización del tejido óseo, el desacomodo de la placa de crecimiento y en la articulación se empieza a observar la hipertrofia de los condrocitos sin embargo en la imagen H se puede suponer que existe muerte celular y osteoporosis debido a los grandes espacios que destacan. Por ultimo en el grupo tratado por el antioxidante con las imágenes C, F, I se logra ver una mejoría en el cartílago articular ya que disminuye la vascularización y la placa articular se observa continua a comparación del grupo estresado, sin embargo, en el tejido óseo no presenta una mejoría, al contrario, debido a la hipertrofia celular avanzada podemos suponer una osificación

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Cambios histológicos en tejido neuronal tras el estrés inducido por inmovilización. La imagen

a, d, g, se observa que no hay alteraciones tisulares, las células son redondas claras y

tienen un nucléolo definido. En la imagen b, c se observa que las células se oscurecieron y

se atrofiaron, es decir, ya no son redondas. En la imagen e se observa atrofia neuronal,

condensación del núcleo y oscurecimiento de la célula. En la imagen f se nota una mejora

con respecto a la e. En la imagen h se denotan la mayoría de las neuronas atrofiadas,

oscuras y con el núcleo condensado. En la imagen i se perciben neuronas entre claras y

oscuras, algunas están atrofiadas pero en su mayoría mantienen la forma redonda.

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Cambios histológicos en tejido cardiaco tras el estrés inducido por inmovilización. El imagen

B se observa una infiltración, la cual no muestra la imagen C a comparación de la imagen A; la

imagen E presenta una fibrosis e infiltración mayor que la imagen G, tomando como referencia D;

en el grupo I se puede apreciar una fibrosis general e infiltraciones superiores a las demás imágenes;

la fibrosis que presentan las imágenes C,G,J se mantuvieron similares y no presentan cambios

estructurales considerables a comparación de los grupos que no recibieron el antioxidante.

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Cambios histológicos en tejido hepático tras el estrés inducido por inmovilización. En A, D y G se observan los grupos control, con vascularización normal y con los cordones de hepatocitos manteniendo su forma. En B, C, E, F, H y I se observa una alta vascularización comparada con A, D y G. En B no se observa un cambio en los cordones de hepatocitos comparado con A y C. En E se observa un cambio mínimo en los cordones de hepatocitos comparado con D y F. En H se observa un cambio importante en los cordones de hepatocitos comparado con G y I, se logran observar más espacios en blanco.

Control Estresado Estresado con L-Carnitina

24h

48h

72h

c

c

b a

d e f

g h i

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Control Estresado Estresado con L-Carnitina

24h

48h

72h

Cambios histológicos en tejido renal tras el estrés inducido por inmovilización. En las

imágenes b, e, h muestran el grupo experimental en el cual podemos observar glomerulonefritis,

glomeruloesclerosis, vascularización y daños tubulointersticiales, estos daños son más drásticos

conforme el individuo se mantiene en estrés, en las imágenes c, f, i se observan estructuras celulares

similares a las imágenes del grupo control a, d, g.

b a

d e f

g h i

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ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN

Los cambios histológicos que observamos en las articulaciones nos permiten

suponer que tras el periodo de inmovilización se desarrolla un proceso parecido al

de la osteoartritis dada la vascularización y la presencia de muy pocos condrocitos

por lo que podríamos decir que hubo muerte celular, además se observa la

deformación de la placa de crecimiento y la hipertrofia de los condrocitos lo que nos

podría indicar un desajuste en la homeostasis del hueso provocando una osificación

temprana. Adicionalmente, observamos que hay otras zonas de proliferación de

condrocitos formando clones como respuesta ante el daño, dato que coincide con

lo reportado por como Saito y colaboradores [19]. Con el tratamiento con L-carnitina

observamos una disminución de estos daños, por lo que podemos sugerir que la L

Carnitina en las articulaciones si tienen un efecto antioxidante.

En el cerebro se encontraron cambios como núcleos condensados atrofiamiento

neuronal debido a un proceso de adaptación a radicales libres. En el grupo de 24h

con L-Carnitina no se presentan cambios contra los daños del estrés sin embargo

en los grupos de 48h y 72h se contemplaron una mejora con respecto a los grupos

estresados correspondientes.

En el corazón el estrés oxidativo causa infiltraciones y la excesiva deposición de

fibras colágenas que probablemente evolucionan a una atrofia muscular cardiaca

por lo que la estructura celular de las miofibrillas se ve dañada afectando su eficaz

función. Una exposición excesiva de estrés oxidativo causado por inmovilización

muestra claramente un aumento de las lesiones.

El uso de antioxidantes reduce la actividad de los Radicales Libres [1] por lo que la

estructura de las miofibrillas no se ve alterada considerablemente y por lo tanto

presentan menor cantidad de infiltraciones y edema.

La aplicación de L-carnitina como antioxidante presenta resultados favorables para

el tratamiento contra el estrés oxidativo en las miofibrillas, Sin embargo los efectos

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secundarios del tratamiento con L-carnitina a largo plazo no se han estudiado

detenidamente. Estudios demuestran que la L-carnitina usada como tratamiento en

enfermedades coronarias ayuda a un menor deterioro en las arterias causando una

mejora en la enfermedad [20].

En el hígado se observó una alta vascularización causada por el estrés oxidativo en

donde la L-Canitina no influyó para que se redujera la vascularización ya que en los

individuos tratados con el antioxidante la vascularización sigue siendo alta. De la

misma manera en los individuos estresados de 72 hrs. Se observó una necrosis

hepática aunque no tan severa, mientras que en los de 48 y 24 hrs. sólo se observan

muy pequeñas zonas de necrosis. La L-carnitina funcionó como antioxidante al

proteger al hígado, ya que en los individuos tratados no se observan zonas con

necrosis. El inducir estrés oxidativo por inmovilización causa un daño lento al hígado

ya que sólo en los individuos estresados de 72 hrs. se llegó a observar un cambio

importante, otras formas de estrés como los medicamentos afectan más rápido al

hígado [13, 20].

En los grupos estresados se encontró una estructura de los glomérulos parecida a

la glomerulonefritis y glomeruloesclerosis así como alteraciones túbulo-intersticiales

principalmente en el túbulo proximal. Estos daños tisulares no fueron tan graves en

el grupo tratado con L-carnitina mostrando una morfología semejante al grupo

Control. Esto concuerda con estudios anteriores en los que se ha reportado que el

estímulo oxidativo puede causando daños en la barrera glomerular y en los túbulos

proximales se muestran daños túbulo-intersticiales debido a la lipoperoxidación [1].

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CONCLUSIONES

Los datos obtenidos permiten concluir que el estrés oxidativo causa daños celulares

y tisulares en articulaciones, cerebro, corazón, hígado y riñón tales como,

vascularización, infiltración, fibrosis, daño neuronal y osteoartritis. Los resultados

indican que el tratamiento con L-Carnitina protege a nivel celular y tisular,

disminuyendo el exceso de radicales libres manteniendo la homeostasis, sin

embargo es necesario que haya transcurrido un cierto lapso de tiempo para que el

efecto antioxidante de la L-Carnitina muestre el resultado esperado.

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